Summary
Aluminiumsfolie ble mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene til Spodoptera litura for å hindre sammensmelting av testis. Prosedyren inkluderer frysing, festing, desinfeksjon, snitt, plassering av barrieren, suturering, postoperativ fôring og inspeksjon. Denne tilnærmingen gir en metode for å forstyrre vevsdannelse.
Abstract
I stedet for å bruke genetiske metoder som RNA-interferens (RNAi) og gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/CRISPR-assosiert endonuklease Cas9, ble en fysisk barriere mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene til Spodoptera litura for å studere virkningen av denne mikrokirurgien på veksten og reproduksjonen. Etter å ha satt inn aluminiumsfolie mellom testiklene, fortsatte insektsmelting under metamorfose normalt. Insektvekst og utvikling ble ikke bemerkelsesverdig endret; Imidlertid endret antall sædbunter hvis testikler fusjon ble stoppet av mikrokirurgi. Disse funnene antyder at blokkering av testikkelfusjon kan påvirke mannlig reproduksjonsevne. Metoden kan videre brukes til å avbryte kommunikasjon mellom organer for å studere funksjonen til spesifikke signalveier. Sammenlignet med konvensjonell kirurgi krever mikrokirurgi bare frysebedøvelse, noe som er å foretrekke fremfor karbondioksidbedøvelse. Mikrokirurgi minimerer også operasjonsområdet og letter sårheling. Valg av materialer med spesifikke funksjoner trenger imidlertid videre undersøkelser. Unngå vevsskade er avgjørende når du gjør snitt under operasjonen.
Introduction
Fusjon er et vanlig fenomen i vev eller organutvikling. Eksempler er dorsal lukking og thoraxlukking i Drosophila1 og ganemorfogenese, nevral tube morfogenese og hjertemorfogenese hos mus og kylling2. CRISPR og RNAi har blitt brukt til å undersøke genenes roller i prosessen med fusjon2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) er et skadelig polyfagisk som er utbredt i tropiske og subtropiske områder i Asia, inkludert Kina4,5,6. Den brede fordelingen av S. litura er delvis tilskrevet sin kraftige reproduktive evne, som er relevant for gonadutvikling. Mannlig infertilitet er en tilnærming for å kontrollere dette. Som vist i den skjematiske figuren av testikkelstruktur, er testiklene omsluttet av testikkelhylsen, inkludert den eksterne hylsen (peritonealhylse) og indre basal lamina. Basal lamina strekker seg internt for å danne follikulær epitel og skiller det indre området av testis i fire kamre kalt follikler (figur 1).
I folliklene utvikler spermatogonia seg til spermatozoa etter mitose og meiosis, og deretter er spermatozoa i sperm sacs justert i samme retning for å danne sædbunter7. Under spermatogenese skiller de primære spermatocyttene seg i eupyrene sædceller eller apyren sædceller. Spermatocytter i larvalfasen utvikler seg til eupyren sæd med en lang hale koblet til et hode av en langstrakt kjerne; disse kan gjødsle egg. Omvendt utvikler spermatocytter i midt-pupalfasen til apyren sæd med en kassert kjerne; disse sædcellene hjelper overlevelse, bevegelse og befruktning av eupyren sperm9,10. Den sjette dagen av puppen er perioden der testiklene har rikelig eupyren og apyrene sædbunter.
Figur 1: Skjematisk diagram over testikkelstrukturen til Lepidoptera insekter11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Testikkelfusjon forekommer i de fleste insekter av Lepidoptera-ordren11,12, spesielt i de artene som er landbruksskade skadedyr. Testikkelfusjon refererer til et par testikler som vokser bilateralt i larvefasen, nærmer seg og holder seg til hverandre, og til slutt integreres i en enkelt gonad11. I Spodoptera litura skjer det under metamorfose fra larvalen til puppetrinnet. Fra dag 1 av den femte instar (L5D1) til dag 4 av den sjette instar (L6D4), vokser testiklene gradvis i størrelse, og fargen blir lysegul fra elfenbenshvit. Den blir svak rød når den når prepupalfasen (L6D5 til L6D6). To bilaterale symmetriske testikler nærmer seg hverandre i forberedelsesfasen, smelter sammen til en og vri mot urviseren (doralvisning) for å produsere en enkelt testis i pupal- og voksenfasene11. Dette fenomenet forekommer ikke i silkeorm, som har betydelig økonomisk betydning og har blitt tammet i 5000 år13. Dermed antas det at testiklenes fusjon forbedrer reproduktiv evne.
For å bestemme betydningen av Spodoptera litura testikkelfusjon, er det viktig å undersøke effekten av å blokkere prosessen. I denne protokollen ble aluminiumsfolie mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene for å holde dem skilt, og de påfølgende endringene i utviklingen av insekter og deres testikler ble studert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektoppdrett og vedlikehold
- Kultur Spodoptera litura larver i miljøsimuleringskamre med et kunstig kosthold til de når dag 4 av den sjette instar (L6D4). Velg mannlige larver når ormene kommer inn i den første dagen av den sjette instar (L6D0) basert på den omvendte trekantformede strukturen på den åttende magen14.
MERK: Larver oppdretts- og vedlikeholdsteknikker ble publisert tidligere4,14.
2. Presurgisk forberedelse
- Trim aluminiumsfolien i rektangulære stykker med avrundede hjørner (1 mm x 2 mm, figur 2).
- Steriliser operasjonsplattformen og relaterte gjenstander (bordoverflate, mikroskop, isboks, insektboks, voksbrett, pinner og tråd) ved å sprøyte 75% alkohol på overflaten og tørke dem ned.
- Steriliser kirurgiske verktøy (inkludert aluminiumsfolie) med en høytrykks dampsterilisator i 30 minutter, og legg dem i en varme- og tørkeovn ved 120 °C.
- Sørg for at operatørene bruker rene laboratorieklær, kirurgiske masker og sterile hansker.
3. Mikrokirurgisk plassering av en barriere mellom testiklene
MERK: Den generelle arbeidsflyten er som følger: Frysing → Festing → Desinfeksjon → snitt → Barriereplassering → Suturing→ Postoperativ fôring og inspeksjon
- Plasser mannlige larver (L6D4) på is i 10-30 min for å holde dem bedøvet under operasjonen.
- Legg en larve på voksbrettet med dorsalsiden opp, og fest deretter hodet og halen på larven med pinner og tråder, som viser det kirurgiske området som er dorsaloverflaten på det niende kroppssegmentet (figur 3A).
- Desinfiser det kirurgiske området ved å påføre 3% jodtinktur med en bomullspinne på epidermis (9. kroppssegment), etterfulgt av 70% alkohol for å fjerne jod (figur 3B).
MERK: Fokuser på larven gjennom grov og fin justering av det kirurgiske mikroskopet (figur 3C). Legg voksbrettet på en større kulturrett fylt med is for å holde anestesi. - Lag et 2 mm langt snitt på dorsal epidermis av det niende kroppssegmentet. Deretter bruker du en steril bomullspinne for å fjerne eventuelle lekkende hemolymfe og fettlegemer og få en klar utsikt over det kirurgiske området.
MERK: Det er viktig å unngå hjertet under prosedyren. Dette kan gjøres ved å gjøre snittet litt ved siden av midtlinjen i det niende kroppssegmentet eller ved leddet mellom 9. Når du bruker skalpellen, lag en vertikal spalte med bladet først (figur 4A), og vri den deretter 45° mot epidermis før du jevnt og kontinuerlig skjærer gjennom epidermis (figur 4B). - Bruk kirurgisk pinsett til å sette inn et stykke aluminiumsfolie mellom testiklene (figur 5).
- På slutten av operasjonen, lukk snittet for å unngå infeksjon, og la larvene komme seg etter operasjonen.
- Lukk epidermis med en løpende sutur (figur 6).
- Bruk en nåleholder og kirurgisk pinsett til å knytte en kirurgisk firkantet knute, som krever to motstående speilbilde enkle knuter (figur 6D,E).
- Bruk saks til å kutte overflødig sutur fra løkkehalene, og la en 2 mm tråd ligge igjen.
- Etter suturering legger du forsiktig larven i oppdrettsboksen og opprettholder dem i et rent miljøsimuleringskammer. Fortsett å observere larver.
MERK: Såret slutter å lekke hemolymfe, og larvene gjenoppretter gradvis etter operasjonen. Ormene fortsetter å fullføre sin metamorfose.
Figur 2: Fysisk barriere tilberedt med aluminiumsfolie (1 mm x 2 mm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Før snitt. (A) Fikse larven. (B) Desinfeksjon av epidermis av det kirurgiske området. (F) Utfører kirurgi under mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Snitt. (A) Skjær larvene vertikalt med bladet. (B) Drei bladet 45° mot epidermis før du skjærer gjennom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sette inn den fysiske barrieren (aluminiumsfolie) mellom testiklene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Suturing. (A) Sett inn kanylen. (B) Trekk ut kanylen. (C) Trekk ut og klem nålen. (D) Bind den første enkle knuten. (E) Bind den motstående speilbildede enkle knuten. (F) Klipp overflødig suturtråd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektene av mikrokirurgi på Spodoptera litura vekst og utvikling
Mikrokirurgien etterlot et 2 mm langt sår på dorsal larval epidermis som til slutt sluttet å lekke hemolymfe og helbredet. Larvene gikk gjennom prepupal og pupal stadier og eclosed, noe som indikerer at mikrokirurgi ikke hadde noen stor innvirkning på vekst og utvikling. Når larvene smeltet inn i pupper, ble suturtrådene kassert sammen med epidermis. Det var ingen åpenbare forskjeller i utseendet på puppene som gjorde og ikke gjennomgikk kirurgi. Etter eklosjon parret voksne kvinner vellykket med de voksne hannene som tidligere ble operert, noe som resulterte i befruktede egg og klekkelarver (figur 7).
Figur 7: Spodoptera litura Utvikling etter mikrokirurgi. (A) Mannlig larve på L6D4. (B) L6D4 larve umiddelbart etter operasjonen. (C) Pre-pupa (L6D6). (D) P0, den røde pilen indikerer plasseringen av operasjonen; den gule pilen viser den kasserte epidermis med suturtråd. (E) Parring voksne. (F) Egg og klekkede larver fra en kvinnelig voksen parring med en mann som gjennomgikk kirurgi. Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Larvene gikk gjennom puppetrinnet og eclosed etter mikrokirurgisk plassering av aluminiumsfolie mellom testiklene. Detaljerte resultater etter denne operasjonen er publisert tidligere11. Selv om barrieren stoppet testiklene fra å fusjonere i noen larver, gjennomgikk de fleste larver testikkelfusjon under larval til pupal metamorfose.
I denne forskningen ble enkeltpersoner gruppert etter tre behandlinger: Eksperimentell (Exp), Sham-operasjon (Ctl-sham), og ingen operasjon (Ctl). Individer i Exp-gruppen gjennomgikk mikrokirurgi for å sette inn en fysisk barriere, og testiklene deres forble skilt under puppet og voksenstadier. Individer i Ctl-sham-gruppen gjennomgikk samme mikrokirurgi; Deres testikler ble imidlertid ikke blokkert og smeltet sammen av ukjente grunner. Ctl-gruppen inneholdt larver som vokste naturlig uten kirurgi; deres to testikler smeltet normalt sammen under prepupal scenen.
Mikrokirurgigruppen inneholdt to undergrupper: larver som gjennomgikk mikrokirurgi for å plassere en barriere mellom de to testiklene (gruppe A) og de som gjennomgikk mikrokirurgi for å fjerne en testis (Gruppe B: venstre testis fjernet i gruppe B-1; høyre test er fjernet i gruppe B-2). Tabell 1 viser antall operasjonslarver, larvedødelighet, antall pupper, prosentandel av pupering, antall voksne, prosentandeler av voksenoppblomstring, prosentandeler av vellykket parring og prosentandeler av vellykkede operasjoner i ulike grupper. Gruppe A inkluderer larver som gjennomgikk mikrokirurgi for å sette inn en barriere mellom testiklene. Suksessen til denne prosedyren kunne bare bestemmes etter disseksjon, som er da de ble videre delt inn i Exp- og Ctl-sham-gruppene.
Som vist i figur 8 var larvedødeligheten litt høyere i den kirurgiske gruppen, mens prosentandelen av pupering, voksen fremvekst og vellykket parring var litt lavere i den kirurgiske gruppen enn kontrollgruppen. Imidlertid var ingen av forskjellene vesentlig forskjellige, noe som indikerer at mikrokirurgien ikke påvirket veksten og utviklingen av Spodoptera litura larver.
| Gruppe | Antall larver | Larvaldødelighet/% | Antall pupper | Prosentandel av pupering/% | Antall voksne | Prosentandel av voksen fremvekst/% | Prosentandel av vellykket parring/% | Prosent av vellykket operasjon/% | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Mikrokirurgi gruppe B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Mikrokirurgi gruppe B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Gjennomsnitt av mikrokirurgigruppen (middelverdi± SD) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| Kontrollgruppe 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Kontrollgruppe 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Kontrollgruppe 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Kontrollgruppe 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Gjennomsnitt av kontrollgruppe (middelverdi± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9,5 | N | |||||
Tabell 1: Effekten av mikrokirurgi på Spodoptera litura utvikling. Mikrokirurgigruppene B-1 og B-2 gjennomgikk mikrokirurgi for å fjerne ensidige testis (venstre i mikrokirurgigruppe B-1 og høyre i mikrokirurgigruppe B-2). Merk: Mikrokirurgigrupper A-1 til A-8 gjennomgikk mikrokirurgi for å sette inn en barriere mellom testiklene; Mikrokirurgigruppene B-1 og B-2 gjennomgikk mikrokirurgi for å fjerne ensidige testis (venstre i mikrokirurgigruppe B-1 og høyre i mikrokirurgigruppe B-2); satsene og prosentene er gitt som Gjennomsnittlig ± SD. Stjerner indikerer at individene i gruppen ble dissekert på puppetrinnet, og det var ingen statistikk over antall voksne, prosentandel av voksen fremvekst eller prosentandel av vellykket parring; N angir ingen data.
Figur 8: Påvirkningen av mikrokirurgi på Spodoptera litura vekst og utvikling av (n ≥ 6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Påvirkningen av mikrokirurgi på antall sædbunter av Spodoptera litura
Mikrokirurgi ble utført for å sette inn en fysisk barriere for å stoppe testiklene fusjon eller fjerne ensidig testis i Spodoptera litura. Eupyren og apyren sædbunter ble regnet for å beregne prosentandelen av eupyren sædbunter på den sjette dagen av puppetrinnet. Personene ble gruppert etter behandling, som beskrevet ovenfor. Antallet sædbunter (eupyren sædbunter, apyren sædbunter og totalt) var betydelig lavere i Exp-gruppen enn i Ctl-sham- og Ctl-gruppene. Gjennomsnittlig antall eupyren sædbunter fra to separerte testikler i Exp-gruppen var 2082 ± 599. I Ctl-sham- og Ctl-gruppene med smeltede testikler varierte antall eupyren sædbunter fra 4652 til 6200.
Antall apyrene sædbunter i Exp-gruppen var 1602 ± 703, mens det varierte fra 3299 til 4632 i Ctl-Sham- og Ctl-gruppene. Totalt antall sædbunter i Exp-gruppen var 3684 ± 985; Det varierte fra 9284 til 10832 i Ctl-Sham- og Ctl-gruppene. Dermed varierte prosentandelene av eupyren sædbunter fra 50% til 60%, uten signifikante forskjeller mellom alle tre gruppene. Figur 9 viser at når fusjon forhindres, reduseres mengden eupyren og apyren sædbunter, mens prosentandelen av eupyren sædbunter var uendret.
Figur 9: Antall sædceller og prosentandeler av eupyren sædbunter i forskjellige grupper. (A) Antall sædbunter i Exp-gruppen var betydelig lavere enn i Ctl-sham- og Ctl-gruppene. (B) Prosentandelen av eupyren sædbunter var ikke signifikant forskjellig mellom de tre gruppene. Stjerne indikerer en signifikant forskjell sammenlignet med Ctl. P < 0,05, Gjennomsnittlig ± SD (n ≥5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter å ha fjernet en ensidig testis av larver, ble antall eupyren og apyren sædbunter talt for å beregne prosentandelen av eupyren sædbunter på den sjette dagen av puppetrinnet. Antallet eupyren og apyren sædbunter varierte fra henholdsvis 1286 til 1638 og 720 til 850, noe som betyr at det totale antallet varierte fra 2006 til 2488, tilsvarende en eupyren sædbuntprosent på 63% til 65%. Figur 10 viser at antall sædceller gikk betydelig ned etter ensidig fjerning av testis (redusert med 60% til 70%), uten mye innflytelse på prosentandelen av eupyrene sædbunter.
Figur 10: Antall sædbunter og prosentandeler av eupyrene sædbunter etter fjerning av ensidige testis. (A) Antall sædbunter i pupper som gjennomgikk ensidig fjerning av testis var signifikant forskjellig mellom de tre gruppene (henholdsvis venstre og høyre testis fjernet i mikrokirurgigruppe B-1 og mikrokirurgigruppe B-2) (B ) Prosentandelen av eupyren sædbunter i pupper som gjennomgikk ensidig testis fjerning var ikke signifikant forskjellig sammenlignet med Ctl. Stjernen indikerer en signifikant forskjell sammenlignet med Ctl. P < 0,05, Gjennomsnittlig ± SD (n ≥8). Kontrollgruppe = ingen kirurgi, testiklene smeltet naturlig under prepupalstadiet; Ctl-Sham gruppe = operasjon mislykket og testikler smeltet sammen etter mikrokirurgi; Exp. Group = mikrokirurgi utført for å sette inn en fysisk barriere mellom de to testiklene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etter mikrokirurgisk hindring av testikler fusjon i Spodoptera litura, reduserte antall sædbunter, noe som støttet hypotesen om at denne fusjonen er gunstig for reproduktiv evne. Kirurgisk manipulasjon har blitt brukt til å studere den fysiologiske utviklingen av insekter siden tidlig på 1900-tallet. For å avgjøre om kranialnerven er regulert av insektmetamorfose, utførte noen forskere prosedyrer som ligasjon og halshugging på forskjellige insekter (inkludert Rhodnius prolixus av Hemiptera, Lymantria dispar av Lepidoptera)15,16. Prosessen med halshugging innebærer å fjerne hodet med en skalpell, desinfeksjon med antibiotika og parafinvoksforsegling av såret etter operasjonen17. Etter ekstraksjon og transplantasjon av prothoracic kjertlene i Bombyx mori, ble såret forseglet med parafinvoks18. Imidlertid er de uunngåelige konsekvensene av disse konvensjonelle behandlingene infeksjon og høy dødelighet, noe som gjør det vanskelig å analysere den fysiologiske tilstanden i de sene stadiene av utviklingen av insektet.
Derfor ble denne protokollen designet for å sikre en minimal invasiv kirurgi utført under mikroskopet for å minimere såret. Videre, sammenlignet med karbondioksidbedøvelse, er frysing av bedøvelse mer gjennomførbar og praktisk. Aluminiumsfolie, brukt som obstruksjon, ble kuttet i en størrelse på 1 mm x 2 mm, et område som tilsvarer mellomrommet mellom testiklene. Etter mikrokirurgi faller suturtrådene av med tidlig epidermis under smelting, slik at metamorfose og utvikling kan fortsette normalt. Reproduksjonsresultatene tyder på at vellykket mikrokirurgi ikke påvirket insektutviklingen betydelig. Når testiklene ikke fusjonerte, var antallet totale, eupyren og apyren sædbunter betydelig lavere enn de i Ctl-gruppen. Disse resultatene indikerer at mannlig reproduktiv evne påvirkes av testikler fusjon. Vurdering av sædcellekvalitet og vitalitet har forskjellige indekser og metoder hos ulike dyr, inkludert sperm akrosomal status hos pattedyr19, sædmotilitet20, mitokondrieaktivitet21, plasmamembranintegritet22 og andre markører23,24 . På grunn av insekters unike sædcelleutvikling, må fremtidige studier undersøke endringer i reproduksjonsevne (parring, inkubasjon25).
Kritiske trinn i denne protokollen krever spesiell oppmerksomhet for å sikre pålitelige resultater. Unngåelse av skade på andre vev er viktig når du gjør snittene. For det andre må valget av barrierematerialet være basert på dets ikke-giftige og sterile egenskaper og mangel på skarpe grenser. Til slutt ble snittet lukket med en løpende sutur og en kirurgisk firkantet knute, etterfulgt av forsegling i operasjonsområdet for effektivt å forhindre postoperativ infeksjon. Operasjoner på insektets indre struktur som transplantasjon, ekstraksjon og påføring av legemidler kan fortsatt utføres, etterfulgt av forsegling i det kirurgiske området.
Høye suksessrater krever dyktige ferdigheter, og denne teknikken har noen ulemper. For det første er det ikke effektivt, da operasjonene gjøres en etter en, på grunn av hvilken individuell variasjon er uunngåelig. Foreløpige studier viste at når du bruker medisinske venøse transfusjonsrør, gummimembraner, absorberende perler og tannmaterialer for å skille testene, var resultatene ikke så vellykkede som forventet. Dessuten er teknikken ikke vellykket når sperren er i drift. Mulige årsaker til en redusert kirurgisk suksessrate inkluderer barrieren som glir av når insekter beveger seg, krymper, smelter og omorganiserer organer under prepupalfasen. Alternativt kan aluminiumsfolie settes inn for nær smøremiddelet, noe som får barrieren til å flyte bort. Derfor bør et passende materiale optimaliseres ytterligere.
Til tross for begrensningene i mikrokirurgi, gir det en metode for å oppnå foreløpige resultater om biologiske fenomener før du etablerer et transgent modellsystem. Sweeney og Waterson analyserte rid utvikling i chick embryoer ved å sette inn tantal folie blokker26, mens Wilde og Logan brukte aluminium folie som en ugjennomtrengelig barriere for å studere rollen som retinoinsyre signalering i induksjon og påfølgende initiering av for- og hindlimbs27. I hvirvelløse Spodoptera litura muliggjør dette mikrokirurgi vellykket normal ormvekst og utvikling, og gir en måte å studere fysiologiske fenomener på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) og et åpent tilskudd fra State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (No.: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
