Summary
A folha de alumínio foi microsurgicamente inserida entre os testículos de Spodoptera litura para obstruir a fusão de testis. O procedimento inclui congelamento, fixação, desinfecção, incisão, colocação da barreira, sutura, alimentação pós-operatória e inspeção. Essa abordagem fornece um método para interferir na formação de tecidos.
Abstract
Em vez de usar métodos genéticos como a interferência de RNA (RNAi) e agrupar regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9, uma barreira física foi microsurgicamente inserida entre os testículos de Spodoptera litura para estudar o impacto desta microcirurgia em seu crescimento e reprodução. Após inserir papel alumínio entre os testículos, a fusão de insetos durante a metamorfose prosseguiu normalmente. O crescimento e o desenvolvimento de insetos não foram notavelmente alterados; no entanto, o número de pacotes de esperma mudou se a fusão de testículos fosse interrompida pela microcirurgia. Esses achados implicam que o bloqueio da fusão testicular pode influenciar a capacidade de reprodução masculina. O método pode ser aplicado ainda mais para interromper a comunicação entre órgãos para estudar a função de vias de sinalização específicas. Em comparação com a cirurgia convencional, a microcirurgia requer apenas uma anestesia congelante, que é preferível à anestesia de dióxido de carbono. A microcirurgia também minimiza a área do local da cirurgia e facilita a cicatrização da ferida. No entanto, a seleção de materiais com funções específicas precisa ser aprofundada. Evitar lesões teciduais é crucial ao fazer incisões durante a operação.
Introduction
A fusão é um fenômeno comum no desenvolvimento de tecidos ou órgãos. Exemplos incluem fechamento dorsal e fechamento do tórax em Drosophila1 e morfogênese do paladar, morfogênese do tubo neural e morfogênese cardíaca em camundongos e frango2. CRISPR e RNAi têm sido aplicados para investigar os papéis dos genes no processo de fusão2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) é uma praga polifagosa prejudicial que é amplamente distribuída em áreas tropicais e subtropicais da Ásia, incluindo China4,5,6. A ampla distribuição da S. litura é parcialmente atribuída à sua poderosa capacidade reprodutiva, que é relevante para o desenvolvimento da gônada. A infertilidade masculina é uma abordagem para controlar esta praga. Como mostrado na figura esquemática da estrutura testicular, os testículos são incluídos pela baia testicular, incluindo a baáta externa (baia peritoneal) e a lamina basal interna. A lamina basal se estende internamente para formar o epitélio folicular e separa a área interna dos testículos em quatro câmaras chamadas folículos (Figura 1).
Nos folículos, a espermatogonia se desenvolve em espermatozoides após mitose e meiose, e então os espermatozoides nos sacos de esperma se alinham na mesma direção para formar espermatozoides7. Durante a espermatogênese, os espermatotozóides primários se diferenciam em espermatozoides eupyrenos ou espermatozoides apirenos. Os espermatotozóides na fase larval desenvolvem-se em esperma de eupirrena com uma cauda longa conectada a uma cabeça de um núcleo alongado; estes podem fertilizar ovos. Por outro lado, os espermatocitotas na fase de pupal médio desenvolvem-se em espermatozoides apirene com um núcleo descartado; esses espermatozoides auxiliam na sobrevivência, movimento e fertilização do esperma eupyreno9,10. O sexto dia da pupa é o período durante o qual os testículos têm abundantes pacotes de esperma de eupirrena e apirena.
Figura 1: Diagrama esquemático da estrutura testicular dos insetos Lepidoptera11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A fusão testicular ocorre na maioria dos insetos da ordem Lepidoptera11,12, especialmente nas espécies que são pragas agrícolas. A fusão testicular refere-se a um par de testículos crescendo bilateralmente na fase larval, aproximando-se e aderindo uns aos outros, eventualmente integrando-se em uma única gônada11. Em Spodoptera litura, acontece durante a metamorfose da larval ao estágio pupal. Do primeiro dia do 5º instar (L5D1) ao 4º dia da 6ª instar (L6D4), o par de testículos cresce gradualmente em tamanho, e a cor fica amarelo claro do branco-marfim. Torna-se vermelho fraco à medida que atinge a fase prepupal (L6D5 a L6D6). Dois testículos simétricos bilaterais se aproximam durante o estágio prepupal, fundem-se em um, e torcem no sentido anti-horário (visão doral) para produzir um único testículo nas fases pupal e adulta11. Esse fenômeno não ocorre em bichos-da-seda, que têm considerável importância econômica e foram domesticados por 5000 anos13. Assim, supõe-se que a fusão dos testículos melhora a capacidade reprodutiva.
Para determinar a significância da fusão testicular Spodoptera litura , é importante investigar os efeitos do bloqueio do processo. Neste protocolo, a folha de alumínio foi microsurgicamente inserida entre os testículos para mantê-los separados, e foram estudadas as consequentes mudanças no desenvolvimento dos insetos e seus testículos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Criação e manutenção de insetos
- Cultura as larvas Spodoptera litura em câmaras de simulação ambiental com uma dieta artificial até chegarem ao 4º dia da 6ª instar (L6D4). Selecione larvas masculinas quando os vermes entrarem no primeiro dia do 6º instar (L6D0) com base na estrutura em forma de triângulo inverso no oitavo abdômen14.
NOTA: As técnicas de criação e manutenção de larvas foram publicadas anteriormente4,14.
2. Preparação pré-úrgica
- Corte a folha de alumínio em pedaços retangulares com cantos arredondados (1 mm x 2 mm, Figura 2).
- Esterilize a plataforma de cirurgia e itens relacionados (superfície de mesa, microscópio, geladeira, caixa de insetos, bandeja de cera, pinos e rosca) pulverizando 75% de álcool em sua superfície e limpando-os.
- Esterilize ferramentas cirúrgicas (incluindo a folha de alumínio) com um esterilizador a vapor de alta pressão por 30 minutos, e coloque-as em um forno de aquecimento e secagem a 120 °C.
- Certifique-se de que os operadores usem roupas de laboratório limpas, máscaras cirúrgicas e luvas estéreis.
3. Colocação microcirúrgica de uma barreira entre os testículos
NOTA: O fluxo geral de trabalho é o seguinte: Congelamento → Fixação → Desinfecção → Incisão → Colocação da Barreira → Suturing→ Alimentação e Inspeção Pós-Operatória
- Coloque larvas masculinas (L6D4) no gelo por 10-30 minutos para mantê-las anestesiadas durante a operação.
- Coloque uma larva na bandeja de cera com o lado dorsal para cima e, em seguida, fixe a cabeça e a cauda da larva com pinos e fios, mostrando a área cirúrgica que é a superfície dorsal no segmento 9º corpo (Figura 3A).
- Desinfete a área cirúrgica aplicando 3% de tintura de iodo com cotonete na epiderme (9º segmento corporal), seguido de 70% de álcool para remover o iodo (Figura 3B).
NOTA: Concentre-se na larva através de ajuste grosseiro e fino do microscópio cirúrgico (Figura 3C). Coloque a bandeja de cera em um prato de cultura maior cheio de gelo para manter a anestesia. - Faça uma incisão de 2 mm de comprimento na epiderme dorsal do 9º segmento corporal. Em seguida, use um cotonete estéril para remover qualquer hemoglifo e corpos de gordura que vazem e obtenha uma visão clara da área cirúrgica.
NOTA: É importante evitar o coração durante o procedimento. Isso pode ser feito fazendo com que a incisão seja ligeiramente próxima à linha média do segmento do 9º corpo ou na articulação entre os segmentos do 9º e 10º corpo para evitar que os testículos apaguem devido à pressão interna larval. Ao usar o bisturi, faça uma fenda vertical com a lâmina primeiro (Figura 4A), e depois gire-a 45° em direção à epiderme antes de cortar uniforme e continuamente através da epiderme (Figura 4B). - Use pinças cirúrgicas para inserir um pedaço de papel alumínio entre os testículos (Figura 5).
- No final da cirurgia, feche a incisão para evitar infecções, e permita que as larvas se recuperem da cirurgia.
- Feche a epiderme com uma sutura em execução (Figura 6).
- Use um suporte de agulha e pinças cirúrgicas para amarrar um nó quadrado cirúrgico, exigindo dois nós simples de imagem espelhada (Figura 6D,E).
- Use uma tesoura para cortar o excesso de sutura das caudas do laço, deixando um fio de 2 mm para trás.
- Após a sutura, coloque delicadamente a larva na caixa de criação e mantenha-as em uma câmara de simulação ambiental limpa. Continue observando as larvas.
NOTA: A ferida pára de vazar hemoglifo, e as larvas se recuperam gradualmente após a cirurgia. Os vermes continuam a completar sua metamorfose.
Figura 2: Barreira física preparada usando papel alumínio (1 mm x 2 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Antes da incisão. (A) Fixação da larva. b Desinfecção da epiderme da área cirúrgica. (C) Fazendo cirurgia sob o microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Incisão. (A) Corte as larvas verticalmente com a lâmina. (B) Gire a lâmina 45° em direção à epiderme antes de cortar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Inserção da barreira física (folha de alumínio) entre os testículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Sutura. (A) Insira a agulha. (B) Retire a agulha. (C) Retire e aperte a agulha. (D) Amarre o primeiro nó simples. (E) Amarre o nó simples com imagens espelhadas opostas. (F) Corte o excesso de sutura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os efeitos da microcirurgia no crescimento e desenvolvimento da Spodoptera litura
A microcirurgia deixou uma ferida de 2 mm de comprimento na epiderme larval dorsal que eventualmente parou de vazar hemoglifo e se curou. As larvas passaram por estágios prepupal e pupal e foram fechadas, indicando que a microcirurgia não teve grande impacto no crescimento e desenvolvimento. Quando as larvas se fundiram em pupas, os fios de sutura foram descartados junto com a epiderme. Não houve diferenças óbvias no aparecimento da pupae que fez e não foi submetida a cirurgia. Após o encerramento, as fêmeas adultas acasalaram com sucesso com os machos adultos previamente operados, resultando em ovos fertilizados e larvas de eclosão (Figura 7).
Figura 7: Desenvolvimento de Spodoptera litura após microcirurgia. (A) Larva masculina em L6D4. (B) Larva L6D4 imediatamente após a cirurgia. (C) Pré-pupa (L6D6). (D) P0, a seta vermelha indica a localização da cirurgia; a seta amarela mostra a epiderme descartada com fio de sutura. (E) Adultos de acasalamento. (F) Ovos e larvas eclodidas de uma fêmea adulta acasalando com um macho que foi submetido a cirurgia. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As larvas passaram pelo estágio pupal e foram fechadas após a colocação microcirúrgica da folha de alumínio entre os testículos. Resultados detalhados após esta operação foram publicados anteriormente11. Embora a barreira tenha impedido os testículos de se fundirem em algumas larvas, a maioria das larvas sofreu fusão testicular durante a larval à metamorfose pupal.
Nesta pesquisa, os indivíduos foram agrupados por três tratamentos: Experimental (Exp), Operação Sham (Ctl-sham) e sem operação (Ctl). Os indivíduos do grupo Exp foram submetidos a microcirurgia para inserir uma barreira física, e seus testículos permaneceram separados durante as etapas pupal e adulta. Indivíduos do grupo CTL-sham foram submetidos à mesma microcirurgia; no entanto, seus testículos não foram bloqueados e fundidos por razões desconhecidas. O grupo ctl continha as larvas que cresciam naturalmente sem cirurgia; seus dois testículos fundidos normalmente durante a fase prepupal.
O grupo de microcirurgia continha dois subgrupos: larvas submetidas a microcirurgia para colocar uma barreira entre os dois testículos (Grupo A) e aqueles submetidos à microcirurgia para remover um testículo (Grupo B: o teste esquerdo é removido no Grupo B-1; o teste direito é removido no Grupo B-2). A Tabela 1 mostra os números de larvas de operação, taxas de mortalidade larval, número de pupas, percentual de pupação, número de adultos, percentuais de emergência adulta, percentuais de acasalamento bem sucedido e percentuais de operações bem sucedidas em diferentes grupos. O Grupo A inclui larvas submetidas a microcirurgia para inserir uma barreira entre os testículos. O sucesso deste procedimento só pôde ser determinado após a dissecação, que é quando eles foram ainda mais divididos nos grupos Exp e Ctl-sham.
Como mostrado na Figura 8, a taxa de mortalidade larval foi ligeiramente maior no grupo cirúrgico, enquanto os percentuais de pupação, emergência adulta e acasalamento bem sucedido foram ligeiramente menores no grupo cirúrgico do que o grupo controle. No entanto, nenhuma das diferenças foi significativamente diferente, indicando que a microcirurgia não influenciou significativamente o crescimento e o desenvolvimento de larvas de litura Spodoptera .
| Grupo | Número de Larvas | Taxa de Mortalidade Larval/% | Número de Pupaé | Percentual de Pupação/% | Número de Adultos | Percentual de Emergência adulta/% | Percentual de acasalamento bem-sucedido/% | Percentual de Operação Bem-sucedida/% | |||||
| Grupo de microcirurgia A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Grupo de microcirurgia A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Grupo de microcirurgia B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Grupo de microcirurgia B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Média do Grupo de Microcirurgia (média± SD) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45,8±16.3 | 43±20,8 | 25.8±18.5 | |||||
| Grupo de Controle 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Grupo de Controle 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Grupo de Controle 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Grupo de Controle 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Grupo de Controle 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Grupo de Controle 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Média do Grupo de Controle (média± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96,4±2,7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9,5 | N | |||||
Tabela 1: Os efeitos da microcirurgia no desenvolvimento da Spodoptera litura. Os grupos de microcirurgia B-1 e B-2 foram submetidos a microcirurgia para retirada de testis unilaterais (esquerda no Grupo B-1 de Microcirurgia e direita no Grupo B-2). Nota: Os grupos de microcirurgia A-1 a A-8 foram submetidos à microcirurgia para inserir uma barreira entre os testículos; Os grupos de microcirurgia B-1 e B-2 foram submetidos à microcirurgia para retirada de testis unilaterais (esquerda no Grupo B-1 de Microcirurgia e direita no Grupo B-2); as taxas e percentuais são dadas como Média ± SD. Asteriscos indicam que os indivíduos do grupo foram dissecados na fase pupal, e não houve estatísticas sobre o número de adultos, percentual de emergência adulta ou percentual de acasalamento bem sucedido; N não indica dados.
Figura 8: A influência da microcirurgia no crescimento e desenvolvimento de Spodoptera litura de (n ≥ 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A influência da microcirurgia no número de espermatozoides de Spodoptera litura
A microcirurgia foi realizada para inserir uma barreira física para parar a fusão de testículos ou remover testis unilaterais em Spodoptera litura. Pacotes de esperma de eupyrene e apyrene foram contados para calcular a porcentagem de espermatozoides eupirrenas no sexto dia do estágio pupal. Os indivíduos foram agrupados pelo tratamento, conforme descrito acima. O número de pacotes de espermatozoides (pacotes de esperma eupyrene, pacotes de esperma apyrene e total) foram significativamente menores no grupo Exp do que nos grupos Ctl-sham e Ctl. O número médio de feixes de esperma de eupyrena de dois testículos separados no grupo Exp foi 2082 ± 599. Nos grupos Ctl-sham e Ctl com testículos fundidos, o número de espermatozoides eupiresvariou de 4652 a 6200.
O número de pacotes de esperma apyrene no grupo Exp foi de 1602 ± 703, enquanto variou de 3299 a 4632 nos grupos Ctl-Sham e Ctl. O total de espermatozoides no grupo Exp foi de 3684 ± 985; Variou de 9284 a 10832 nos grupos Ctl-Sham e Ctl. Assim, os percentuais de espermatozoides eupires variaram de 50% a 60%, sem diferenças significativas entre os três grupos. A Figura 9 mostra que, quando a fusão é prevenida, a quantidade de espermatozoides eupyrene e apyrene diminuiu, enquanto a porcentagem de espermatozoides eupirenas foi inalterada.
Figura 9: O número de pacotes de espermatozoides e percentuais de feixes de esperma de eupyrena em diferentes grupos. (A) O número de feixes de esperma no grupo Exp foi significativamente menor do que nos grupos Ctl-sham e Ctl. (B) Os percentuais de espermatozoides eupires não foram significativamente diferentes entre os três grupos. O asterisco indica uma diferença significativa quando comparado com Ctl. P < 0,05, Média ± SD (n ≥5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Após a remoção de um testíase unilateral das larvas, foram contados os números de espermatozoides eupyrene e apyrene para calcular a porcentagem de espermatozoides eupires no sexto dia do estágio pupal. O número de espermatozoides eupyrene e apyrene variou de 1286 a 1638 e 720 a 850, respectivamente, o que significa que o número total variou de 2006 a 2488, correspondendo a uma porcentagem do espermatozoide eupyrene de 63% a 65%. A Figura 10 mostra que o número de espermatozoides diminuiu significativamente após a remoção unilateral do testis (reduzida em 60% para 70%), sem muita influência no percentual de espermatozoides eupires.
Figura 10: Os números de feixes de espermatozoides e percentuais de feixes de esperma eupirena após a remoção de testígenos unilaterais. (A) Os números de espermatozoides em pupas que foram submetidos à remoção unilateral de testis foram significativamente diferentes entre os três grupos (testis esquerdo e direito removidos em Microcirurgia Grupo B-1 e Microcirurgia Grupo B-2, respectivamente) (B ) O percentual de feixes de esperma de eupires em pupas que foram submetidos à remoção unilateral do testis não foi significativamente diferente em relação ao CTL. O asterisco indica uma diferença significativa em relação ao Ctl. P < 0,05, Média ± SD (n ≥8). Grupo controle = sem cirurgia, os testículos fundidos naturalmente durante a fase prepupal; Grupo CTL-Sham = operação sem sucesso e testículos fundidos após microcirurgia; Grupo Exp. = microcirurgia realizada para inserir uma barreira física entre os dois testículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Depois de obstruir microsurgicamente a fusão de testículos em Spodoptera litura, o número de espermatozoides diminuiu, o que apoiou a hipótese de que essa fusão é benéfica para a capacidade reprodutiva. A manipulação cirúrgica tem sido usada para estudar o desenvolvimento fisiológico de insetos desde o início do século XX. Para determinar se o nervo craniano é regulado pela metamorfose de insetos, alguns pesquisadores realizaram procedimentos como ligadura e decapitação em diferentes insetos (incluindo Rhodnius prolixus de Hemiptera, Lymantria dispar of Lepidoptera)15,16. O processo de decapitação envolve a remoção da cabeça com um bisturi, desinfecção com antibióticos e selagem de cera de parafina da ferida após a operação17. Após a extração e transplante das glândulas protorácicas de Bombyx mori, a ferida foi selada com cera de parafina18. No entanto, as consequências inevitáveis desses tratamentos convencionais são a infecção e uma alta taxa de mortalidade, o que dificulta a análise do estado fisiológico durante os estágios finais do desenvolvimento do inseto.
Portanto, este protocolo foi projetado para garantir uma cirurgia minimamente invasiva feita sob o microscópio para minimizar a ferida. Além disso, em comparação com a anestesia de dióxido de carbono, a anestesia congelante é mais viável e conveniente. A folha de alumínio, usada como obstrutivo, foi cortada em um tamanho de 1 mm x 2 mm, uma área equivalente ao espaço entre os testículos. Após a microcirurgia, os fios de sutura caem com a epiderme precoce durante a fusão, permitindo que a metamorfose e o desenvolvimento prossigam normalmente. Os resultados da reprodução sugerem que a microcirurgia bem sucedida não influenciou significativamente o desenvolvimento de insetos. Quando os testículos não se fundiram, os números de espermatozoides totais, eupyrene e apyrene foram significativamente menores do que os do grupo Ctl. Esses resultados indicam que a capacidade reprodutiva masculina é afetada pela fusão de testículos. A avaliação da qualidade e vitalidade das células espermatozoides tem diferentes índices e métodos em vários animais, incluindo o estado acrosomal do esperma em mamíferos19, motilidade do esperma20, atividade mitocondrial21, integridade da membrana plasmática22 e outros marcadores23,24 . Devido ao desenvolvimento único de células espermatozoides dos insetos, estudos futuros precisam examinar mudanças na capacidade de reprodução (acasalamento, incubação25).
Passos críticos neste protocolo requerem atenção especial para garantir resultados confiáveis. Evitar lesões em outros tecidos é importante na hora de fazer as incisões. Em segundo lugar, a seleção do material de barreira deve basear-se em suas propriedades nãotóxicas e estéreis e na falta de limites afiados. Por fim, a incisão foi fechada com uma sutura em funcionamento e um nó cirúrgico quadrado, seguido de vedação na área cirúrgica para prevenir efetivamente a infecção pós-operatória. Ainda podem ser realizadas operações na estrutura interna do inseto, como transplante, extração e aplicação de medicamentos, seguidas de vedação na área cirúrgica.
Altas taxas de sucesso exigem habilidades proficientes, e essa técnica tem algumas desvantagens. Em primeiro lugar, não é eficiente, pois as operações são feitas uma a uma, devido à qual a variação individual é inevitável. Estudos preliminares mostraram que, ao utilizar tubos de transfusão venosa médica, diafragmas de borracha, contas absorventes e materiais dentários para separar os testículos, os resultados não foram tão bem sucedidos quanto o esperado. Além disso, a técnica não é bem sucedida quando o obstrutivo está à deriva. As possíveis razões para uma redução da taxa de sucesso cirúrgica incluem a barreira escorregando quando os insetos se movem, encolhem, molt e reorganizam órgãos durante a fase prepupal. Alternativamente, a folha de alumínio pode ser inserida muito perto do intestino lubrificante, fazendo com que a barreira flutue para longe. Portanto, um material adequado deve ser ainda mais otimizado.
Apesar das limitações da microcirurgia, fornece um método para obter resultados preliminares sobre fenômenos biológicos antes de estabelecer um sistema modelo transgênico. Sweeney e Waterson analisaram o desenvolvimento de embriões de filhotes inserindo blocos de papel alumínio tântalo26, enquanto Wilde e Logan usaram papel alumínio como uma barreira impermeável para estudar o papel da sinalização de ácido retinóico na indução e subsequente iniciação de fore e hindlimbs27. Na invertebrada Spodoptera litura, esta microcirurgia permite com sucesso o crescimento e o desenvolvimento normal de vermes, fornecendo uma maneira de estudar fenômenos fisiológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) e uma bolsa aberta do Laboratório Estadual de Biologia do Genoma da Bicho-Da-Seda da Universidade do Sudoeste (No.: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
