Summary
Aluminiumfolie sattes mikrokirurgiskt in mellan testikelerna i Spodoptera litura för att hindra fusionen av testikel. Förfarandet omfattar frysning, fixering, desinfektion, snitt, placering av barriär, suturering, postoperativ utfodring och inspektion. Detta tillvägagångssätt ger en metod för att störa vävnadsbildning.
Abstract
Istället för att använda genetiska metoder som RNA-interferens (RNAi) och grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade endonuclease Cas9, sattes en fysisk barriär mikrokirurgiskt in mellan testikel av Spodoptera litura för att studera effekten av denna mikrokirurgi på dess tillväxt och reproduktion. Efter att ha infogat aluminiumfolie mellan testikerna fortsatte insektssmältning under metamorfos normalt. Insektstillväxt och utveckling ändrades inte anmärkningsvärt; Antalet spermiebuntar ändrades dock om testiklar fusion stoppades av mikrokirurgin. Dessa resultat innebär att blockera testikel fusion kan påverka manliga reproduktionsförmåga. Metoden kan tillämpas ytterligare för att avbryta kommunikationen mellan organ för att studera funktionen hos specifika signalvägar. Jämfört med konventionell kirurgi kräver mikrokirurgi endast frysning av bedövning, vilket är att föredra framför koldioxidestetisering. Mikrokirurgi minimerar också området för operationsplatsen och underlättar sårläkning. Valet av material med specifika funktioner behöver dock undersökas ytterligare. Att undvika vävnadsskada är avgörande när man gör snitt under operationen.
Introduction
Fusion är ett vanligt fenomen i vävnads- eller organutveckling. Exempel inkluderar dorsala stängning och bröstkorg stängning i Drosophila1 och gommen morfogenes, neurala röret morfogenes och hjärtat morfogenes hos möss och kyckling2. CRISPR och RNAi har tillämpats för att undersöka genernas roller i fusionsprocessen2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) är ett skadligt polyfag skadedjur som är utbredd i tropiska och subtropiska områden i Asien, inklusive Kina4,5,6. Den breda fördelningen av S. litura tillskrivs delvis dess kraftfulla reproduktiva förmåga, vilket är relevant för gonadutveckling. Manlig infertilitet är ett tillvägagångssätt för att bekämpa detta skadedjur. Som visas i den schematiska figuren testikelstruktur omges testiklarna av testikelslidan, inklusive den yttre manteln (peritonealslida) och inre basal lamina. Den basala laminan sträcker sig invändigt för att bilda follikulärt epitel och separerar testikelns inre område i fyra kammare som heter folliklar (figur 1).
I folliklarna utvecklas spermatogonia till spermatozoa efter mitos och meios, och sedan justerar spermatozoerna i spermasäckarna i samma riktning för att bilda spermier7. Under spermatogenes skiljer sig de primära spermatocyterna i eupyrenspermatrar eller apyrenspermas. Spermatocyter i larvfasen utvecklas till eupyrensperma med en lång svans ansluten till ett huvud av en långsträckt kärna; dessa kan befrukta ägg. Omvänt utvecklas spermatocyter i mitten av pupalfasen till apyrensperma med en kasserad kärna; dessa spermier hjälper överlevnad, rörelse och befruktning av eupyren sperm9,10. Den 6: e dagen av poppan är den period under vilken testikarna har rikliga eupyrene och apyrene spermiebuntar.
Bild 1: Schematiskt diagram över testikelstrukturen hos Lepidoptera insekter11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Testikelfusion förekommer i de flesta insekter i Lepidoptera-ordningen11,12, särskilt hos de arter som är jordbruksskadedjur. Testikelfusion avser ett par testiklar som växer bilateralt i larvfasen, närmar sig och följer varandra och så småningom integreras i en enda gonad11. I Spodoptera litura händer det under metamorfos från larven till pupalstadiet. Från dag 1 av den 5: e instar (L5D1) till dag 4 av den 6: e instar (L6D4) växer testikeparet gradvis i storlek och färgen blir ljusgul från elfenbensvit. Det blir svagt rött när det når prepupalfasen (L6D5 till L6D6). Två bilaterala symmetriska testiklar närmar sig varandra under prepupalstadiet, smälter till en och vrider motsols (doral view) för att producera en enda testikel i pupal- och vuxenfaserna11. Detta fenomen förekommer inte i silkesmaskar, som har betydande ekonomisk betydelse och har tämjts i 5000 år13. Det antas således att testikeernas fusion förbättrar reproduktionsförmågan.
För att bestämma betydelsen av Spodoptera litura testikelfusion är det viktigt att undersöka effekterna av att blockera processen. I detta protokoll sattes aluminiumfolie mikrokirurgiskt in mellan testikarna för att hålla dem åtskilda, och de därav följande förändringarna i utvecklingen av insekterna och deras testi testierna studerades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektsuppfödning och underhåll
- Odla Spodoptera litura larver i miljösimuleringskammare med en konstgjord diet tills de når dag 4 av den 6: e instar (L6D4). Välj manliga larver när maskarna går in i den första dagen av den 6: e instar (L6D0) baserat på den inverterade triangelformade strukturen på den åttonde buken14.
OBS: Larver uppfödning och underhåll tekniker publicerades tidigare4,14.
2. Presurgical förberedelse
- Trimma aluminiumfolien i rektangulära bitar med rundade hörn (1 mm x 2 mm, figur 2).
- Sterilisera operationsplattformen och relaterade föremål (bordsyta, mikroskop, islåda, insektslåda, vaxbricka, stift och tråd) genom att spruta 75% alkohol på ytan och torka av dem.
- Sterilisera kirurgiska verktyg (inklusive aluminiumfolien) med en högtrycks ångsteriliserare i 30 minuter och placera dem i en uppvärmnings- och torkningsugn vid 120 °C.
- Se till att operatörerna bär rena laboratoriekläder, kirurgiska masker och sterila handskar.
3. Mikrokirurgisk placering av en barriär mellan testikerna
OBS: Det allmänna arbetsflödet är följande: Frysning → Fixering → desinfektion → snitt → barriärplacering → suturering→ postoperativ utfodring och inspektion
- Placera manliga larver (L6D4) på is i 10-30 min för att hålla dem sövda under operationen.
- Placera en larva på vaxbrickan med dorsala sidan uppåt och fixera sedan larvens huvud och svans med stift och trådar och visa det kirurgiska området som är den dorsala ytan på det 9: e kroppssegmentet (figur 3A).
- Desinficera operationsområdet genom att applicera 3% jodtinktur med en bomullspinne på epidermis (9: e kroppssegmentet), följt av 70% alkohol för att ta bort joden (figur 3B).
OBS: Fokusera på larven genom grov och fin justering av operationsmikroskopet (figur 3C). Placera vaxbrickan på en större odlingsfat fylld med is för att hålla anestesin. - Gör ett 2 mm långt snitt på dorsala epidermis i 9: e kroppssegmentet. Använd sedan en steril bomullspinne för att ta bort eventuella läckande hemolymph och fettkroppar och få en tydlig bild av operationsområdet.
OBS: Det är viktigt att undvika hjärtat under proceduren. Detta kan göras genom att göra snittet något bredvid mittlinjen i det 9: e kroppssegmentet eller vid leden mellan 9: e och 10: e kroppssegmenten för att förhindra testikerna från att dyka ut på grund av larvens inre tryck. När du använder skalpellen, gör en vertikal slits med bladet först (figur 4A) och vrid den sedan 45° mot epidermis innan den jämnt och kontinuerligt skär genom epidermis (figur 4B). - Använd kirurgiska pincett för att sätta in en bit aluminiumfolie mellan testiklarna (figur 5).
- I slutet av operationen stänger du snittet för att undvika infektion och låt larverna återhämta sig från operationen.
- Stäng epidermis med en rinnande sutur (bild 6).
- Använd en nålhållare och kirurgisk pincett för att knyta en kirurgisk fyrkantig knut, vilket kräver två motsatta spegelbilds enkla knutar (figur 6D, E).
- Använd sax för att skära överskottet sutur från slinga svansar, lämnar en 2 mm tråd bakom.
- Efter suturering, lägg försiktigt larven i uppfödningslådan och behåll dem i en ren miljösimuleringskammare. Fortsätt observera larverna.
OBS: Såret slutar läcka hemolymph, och larverna återhämtar sig gradvis efter operationen. Maskarna fortsätter att slutföra sin metamorfos.
Bild 2: Fysisk barriär beredd med aluminiumfolie (1 mm x 2 mm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Före snitt. A) Fixering av larven. B) Desinficering av epidermis i operationsområdet. C) Utför kirurgi under mikroskopet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Snitt. (A) Skär larverna vertikalt med bladet. (B) Vrid bladet 45° mot epidermis innan du skär igenom. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: För in den fysiska barriären (aluminiumfolie) mellan testikarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: Suturing. (A) Sätt i nålen. B) Dra tillbaka nålen. (C) Dra tillbaka och spänn fast nålen. (D) Knyt den första enkla knuten. (E) Knyt den motsatta spegelbildade enkla knuten. F) Kapa överflödig suturtråd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrokirurgins effekter på Spodoptera litura tillväxt och utveckling
Mikrokirurgi lämnade ett 2 mm långt sår på dorsala larval epidermis som så småningom slutade läcka hemolymph och läkt. Larverna gick igenom prepupal och pupal stadier och eclosed, vilket indikerar att mikrokirurgi hade någon större inverkan på tillväxt och utveckling. När larverna smälte till puppar kasserades suturtrådarna tillsammans med epidermis. Det fanns inga uppenbara skillnader i utseendet på popparna som gjorde och inte genomgick kirurgi. Efter eklosion parades vuxna kvinnor framgångsrikt med de vuxna hanarna som tidigare opererats, vilket resulterade i befruktade ägg och kläckningslarver (figur 7).
Figur 7: Spodoptera litura Utveckling efter mikrokirurgi. A) Hanlarv vid L6D4. B) L6D4 larva omedelbart efter operationen. C) Pre-pupa (L6D6). D) P0, den röda pilen anger platsen för operationen. den gula pilen visar den kasserade epidermis med suturtråd. E) Parning av vuxna. F) Ägg och kläckta larver från en vuxen kvinna parning med en hane som genomgick en operation. Skalningsstaplar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Larverna gick igenom pupalstadiet och eclosed efter den mikrokirurgiska placeringen av aluminiumfolie mellan testiklarna. Detaljerade resultat efter denna operation har publicerats tidigare11. Även om barriären stoppade testiklarna från att smälta i vissa larver, genomgick de flesta larver testikelfusion under larv till pupal metamorfos.
I denna forskning grupperades individer efter tre behandlingar: Experimentell (Exp), Sham-operation (Ctl-sham) och ingen operation (Ctl). Individer i Exp-gruppen genomgick mikrokirurgi för att sätta in en fysisk barriär, och deras testiklar förblev separerade under pupal och vuxna stadier. Individer av Ctl-sham gruppen genomgick samma mikrokirurgi; Deras testi testi testiklingar blockerades dock inte och smältes av okänd anledning. Ctl-gruppen innehöll larverna som växte naturligt utan kirurgi; deras två testi testierna smälte normalt under prepupalstadiet.
Mikrokirurgigruppen innehöll två undergrupper: larver som genomgick mikrokirurgi för att placera en barriär mellan de två testikerna (grupp A) och de som genomgick mikrokirurgi för att avlägsna en testik gång (grupp B: vänster testike som tagits bort i grupp B-1; höger testike som tagits bort i grupp B-2). Tabell 1 visar antalet operationslarver, larvdödlighet, antal puppar, procentandel av poppning, antal vuxna, procentandelar av vuxenuppkomsten, procentandelar av framgångsrik parning och procentandelar av framgångsrika operationer i olika grupper. Grupp A innehåller larver som genomgick mikrokirurgi för att sätta in en barriär mellan testikarna. Framgången av denna tillvägagångssätt kunde endast bestämmas efter dissekering, som var, då de delades vidare in i Expen och Ctl-sham grupper.
Som visas i figur 8 var larvdödligheten något högre i den kirurgiska gruppen, medan procentandelarna av pupation, vuxen uppkomst och framgångsrik parning var något lägre i den kirurgiska gruppen än kontrollgruppen. Ingen av skillnaderna var dock signifikant annorlunda, vilket tyder på att mikrokirurgin inte påverkade tillväxten och utvecklingen av Spodoptera litura larver.
| Grupp | Antal larver | Larvdödlighet/% | Antal pupae | Procentandel pupation/% | Antal vuxna | Procentandel av vuxenuppkomst/% | Procentandel lyckad parning/% | Procentandel lyckade operationer/% | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-1* | 79 | 35.4 | 39 | 76.5 | N | N | N | 10.3 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-2* | 117 | 12.8 | 102 | 100 | N | N | N | 11.8 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-3* | 73 | 13.7 | 57 | 90.5 | N | N | N | 10.5 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-4 | 101 | 4 | 97 | 96 | 29 | 29.9 | N | 26.9 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-5 | 176 | 20.1 | 140 | 79.5 | 28 | 20 | 44.4 | 25 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-6 | 434 | 12.4 | 376 | 98.9 | 209 | 55.6 | 26.8 | 14.3 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-7 | 260 | 10.8 | 135 | 58.2 | 66 | 48.9 | 47 | 48.4 | |||||
| Mikrokirurgi grupp A-8 | 49 | 24.5 | 37 | 100 | 21 | 56.8 | 81 | 58.8 | |||||
| Mikrokirurgi grupp B-1 | 117 | 29.1 | 71 | 85.5 | 30 | 42.3 | 23.3 | N | |||||
| Mikrokirurgi grupp B-2 | 188 | 6.9 | 172 | 98.3 | 115 | 66.9 | 35.7 | N | |||||
| Genomsnitt av Microsurgery Group (medelvärde± SD) | 159 | 17±10.1 | 123 | 88.3±13.7 | 71 | 45.8±16.3 | 43±20.8 | 25.8±18.5 | |||||
| Kontrollgrupp 1* | 40 | 17 | 37 | 100 | N | N | N | N | |||||
| Kontrollgrupp 2 | 300 | 0 | 281 | 93.7 | 184 | 65.5 | N | N | |||||
| Kontrollgrupp 3 | 354 | 11 | 305 | 96.8 | 127 | 41.6 | N | N | |||||
| Kontrollgrupp 4 | 679 | 2.7 | 638 | 96.5 | 534 | 83.7 | 41.2 | N | |||||
| Kontrollgrupp 5 | 448 | 4.2 | 399 | 93 | 232 | 58.1 | 60 | N | |||||
| Kontrollgrupp 6 | 490 | 7.1 | 448 | 98.5 | 355 | 79.2 | 48 | N | |||||
| Medelvärde för kontrollgrupp (medelvärde± SD) | 385 | 5.4±6.2 | 351 | 96.4±2.7 | 286 | 65.6±15.1 | 50±9.5 | N | |||||
Tabell 1: Mikrokirurgins effekter på utvecklingen av Spodoptera litura . Mikrokirurgigrupperna B-1 och B-2 genomgick mikrokirurgi för att avlägsna ensidig testiklin (vänster i Microsurgery Group B-1 och höger i Microsurgery Group B-2). Observera: Mikrokirurgigrupperna A-1 till A-8 genomgick mikrokirurgi för att sätta in en barriär mellan testikeln. Mikrokirurgigrupperna B-1 och B-2 genomgick mikrokirurgi för att avlägsna ensidig testik (vänster i Microsurgery Group B-1 och höger i Microsurgery Group B-2); Frekvensen och procentsatserna anges som Medelvärde ± SD. Asterisks indikerar att individerna i gruppen dissekerades i pupalstadiet, och det fanns ingen statistik om antalet vuxna, procentandel av vuxenuppkomsten eller procentandelen framgångsrik parning; N anger inga data.
Figur 8: Mikrokirurgins påverkan på Spodoptera litura tillväxt och utveckling av (n ≥ 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mikrokirurgins påverkan på antalet spermier buntar av Spodoptera litura
Mikrokirurgi utfördes för att sätta in en fysisk barriär för att stoppa testikel fusion eller ta bort ensidig testikel i Spodoptera litura. Eupyrene och apyrene spermie buntar räknades för att beräkna andelen eupyrene spermie buntar på den sjätte dagen av pupal scenen. Individerna grupperades efter behandling, som beskrivits ovan. Antalet spermiebuntar (eupyrene spermiebuntar, apyren spermiebuntar och totalt) var betydligt lägre i Exp-gruppen än i Ctl-sham- och Ctl-grupperna. Det genomsnittliga antalet eupyrensperma buntar från två separerade testiklar i Exp-gruppen var 2082 ± 599. I Ctl-sham- och Ctl-grupperna med smälta testistanser varierade antalet eupyrens spermiebuntar från 4652 till 6200.
Antalet apyren spermiebuntar i Exp-gruppen var 1602 ± 703, medan det varierade från 3299 till 4632 i Ctl-Sham- och Ctl-grupperna. Det totala antalet spermabuntar i Exp-gruppen var 3684 ± 985; Det varierade från 9284 till 10832 i Ctl-Sham och Ctl grupper. Således varierade procentandelarna av eupyren spermiebuntar från 50% till 60%, utan några signifikanta skillnader mellan alla tre grupperna. Figur 9 visar att när fusion förhindras minskade mängden eupyren och apyren spermiebuntar, medan andelen eupyren spermiebuntar var oförändrad.
Figur 9: Antalet spermiebuntar och procentandelar eupyrens spermiebuntar i olika grupper. B) Procentandelen eupyrens spermiebuntar skilde sig inte nämnvärt mellan de tre grupperna. Asterisk indikerar en signifikant skillnad jämfört med Ctl. P < 0,05, Mean ± SD (n ≥5). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Efter att ha tagit bort en ensidig testike av larverna räknades antalet eupyrene och apyren spermiebuntar för att beräkna procentandelen eupyren spermiebuntar på den sjätte dagen av pupalstadiet. Antalet eupyrene och apyrene spermiebuntar varierade från 1286 till 1638 respektive 720 till 850, vilket innebär att det totala antalet varierade från 2006 till 2488, vilket motsvarar en eupyren sperm bundle procent på 63% till 65%. Figur 10 visar att antalet spermiebuntar minskade betydligt efter ensidigt testiborttagning (minskat med 60% till 70%), utan mycket inflytande på andelen eupyren spermiebuntar.
Figur 10: Antalet spermiebuntar och procentandelar eupyrens spermiebuntar efter att ha avlägsnat ensidiga testi. (A) Antalet spermiebuntar i puppar som genomgick ensidig testikeborttagning skilde sig avsevärt mellan de tre grupperna (vänster och höger testike tas bort i Microsurgery Group B-1 respektive Microsurgery Group B-2) (B ) Andelen eupyren spermiebuntar i puppar som genomgick ensidig testike avlägsnande var inte signifikant annorlunda jämfört med Ctl. Asterisken indikerar en signifikant skillnad jämfört med Ctl. P < 0,05, Mean ± SD (n ≥8). Kontrollgrupp = ingen operation, testiklarna smälte naturligt under prepupalstadiet; Ctl-Sham grupp = operation misslyckas och testiärer smälte efter mikrokirurgi; Grupp = mikrokirurgi som utförs för att sätta in en fysisk barriär mellan de två testikerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter mikrokirurgiskt hindrande testifest fusion i Spodoptera litura minskade antalet spermier buntar, vilket stödde hypotesen att denna fusion är fördelaktig för reproduktionsförmågan. Kirurgisk manipulation har använts för att studera den fysiologiska utvecklingen av insekter sedan början av 1900-talet. För att avgöra om hjärnnerven regleras av insektsmetamorfos utförde vissa forskare procedurer som ligatur och halshuggning på olika insekter (inklusive Rhodnius prolixus of Hemiptera, Lymantria dispar of Lepidoptera)15,16. Halshuggningsprocessen innebär att man tar bort huvudet med en skalpell, desinfektion med antibiotika och paraffinvaxtätning av såret efter operation17. Efter extraktion och transplantation av prothoracic körtlar av Bombyx mori, var såret förseglat med paraffin vax18. De oundvikliga konsekvenserna av dessa konventionella behandlingar är dock infektion och en hög dödlighet, vilket gör det svårt att analysera det fysiologiska tillståndet under insektens sena utvecklingsstadier.
Därför utformades detta protokoll för att säkerställa en minimalt invasiv kirurgi som görs under mikroskopet för att minimera såret. Dessutom, jämfört med koldioxidestetisering, är frysning av bedövning mer genomförbar och bekväm. Aluminiumfolie, som används som hinder, skars i en storlek av 1 mm x 2 mm, ett område som motsvarar utrymmet mellan testikelerna. Efter mikrokirurgi faller suturtrådarna av med den tidiga epidermis under smältning, vilket gör att metamorfos och utveckling kan fortsätta normalt. Reproduktionsresultaten tyder på att framgångsrik mikrokirurgi inte väsentligt påverkade insektsutvecklingen. När testikerna inte smälte samman var antalet totala, eupyrene och apyrene spermiebuntar betydligt lägre än de i Ctl-gruppen. Dessa resultat tyder på att manlig reproduktionsförmåga påverkas av testikverk fusion. Bedömning av spermiernas kvalitet och vitalitet har olika index och metoder hos olika djur, inklusive spermiernas akromala status hos däggdjur19, spermier motilitet20, mitokondriell aktivitet21, plasmamembranintegritet22 och andra markörer23,24 . På grund av insekters unika utveckling av spermier måste framtida studier undersöka förändringar i reproduktionsförmågan (parning, inkubation25).
Kritiska steg i det här protokollet kräver särskild uppmärksamhet för att säkerställa tillförlitliga resultat. Undvikande av skador på andra vävnader är viktigt när man gör snitten. För det andra måste valet av barriärmaterial baseras på dess giftfria och sterila egenskaper och brist på skarpa gränser. Slutligen stängdes snittet med en löpande sutur och en kirurgisk fyrkantig knut, följt av tätning i det kirurgiska området för att effektivt förhindra postoperativa infektion. Operationer på insektens inre struktur som transplantation, extraktion och applicering av droger kan fortfarande utföras, följt av tätning i det kirurgiska området.
Höga framgångsgrader kräver skickliga färdigheter, och denna teknik har vissa nackdelar. För det första är det inte effektivt, eftersom verksamheten görs en efter en, på grund av vilken individuell variation är oundviklig. Preliminära studier visade att när man använder medicinska venösa transfusionsrör, gummimembran, absorberande pärlor och tandmaterial för att separera testiklarna, var resultaten inte så framgångsrika som förväntat. Dessutom lyckas tekniken inte när obstruktören driver. Möjliga orsaker till en minskad kirurgisk framgångsgrad inkluderar barriären som glider av när insekterna rör sig, krymper, smälter och omorganiserar organ under prepupalfasen. Alternativt kan aluminiumfolien sättas in för nära lubricous tarmen, vilket gör att barriären flyter bort. Därför bör ett lämpligt material optimeras ytterligare.
Trots begränsningarna av mikrokirurgi ger det en metod för att få preliminära resultat om biologiska fenomen innan man upprättar ett transgent modellsystem. Sweeney och Waterson analyserade ridutveckling i kycklingembryon genom att sätta in tantalfolieblock26, medan Wilde och Logan använde aluminiumfolie som en ogenomtränglig barriär för att studera rollen som retinsyrasignalering i induktion och efterföljande initiering av för- och baklimbs27. I ryggradslösa Spodoptera litura möjliggör detta mikrokirurgi framgångsrikt normal masktillväxt och utveckling, vilket ger ett sätt att studera fysiologiska fenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) och ett öppet bidrag från State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
