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Biochemistry

बैक्टीरिया में RIBO-seq: NGS अनुक्रमण के लिए एक नमूना संग्रह और पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

यहां हम बैक्टीरिया में रिबो-सेक्यू के लिए नमूना संग्रह और तैयारी के चरणों का वर्णन करते हैं। इन दिशा-निर्देशों के अनुसार तैयार पुस्तकालयों के अनुक्रमण के परिणामस्वरूप व्यापक जैव सूचना विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा होता है । प्रोटोकॉल हम मौजूद सरल है, मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करता है और पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए लाइसिस से सात दिन लगते हैं ।

Abstract

राइबोसोम प्रोफाइलिंग तकनीक (RIBO-seq) वर्तमान में वीवो मेंप्रोटीन संश्लेषण की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सबसे प्रभावी उपकरण है। इस विधि का लाभ, अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स की स्थिति और संख्या को ठीक से मैप करके अनुवाद की निगरानी करने की क्षमता है।

इस लेख में, हम नमूना संग्रह के लगातार चरणों और बैक्टीरिया में RIBO-seq विधि के लिए तैयारी का वर्णन करते हैं, जो प्रयोग की योजना और निष्पादन के लिए प्रासंगिक विवरणों को उजागर करते हैं।

चूंकि RIBO-seq बरकरार राइबोसोम्स और संबंधित mRNAs पर निर्भर करता है, महत्वपूर्ण कदम अनुवाद और कोशिकाओं के पर्याप्त विघटन के तेजी से अवरोध है । इस प्रकार, हम बैक्टीरिया में अनुवाद को रोकने के लिए क्लोरम्फेनिकोल के साथ एक वैकल्पिक पूर्वउपचार के साथ सेल हार्वेस्टिंग के लिए तरल नाइट्रोजन में छानने और फ्लैश-फ्रीजिंग का सुझाव देते हैं। विघटन के लिए, हम यांत्रिक रूप से सेल की दीवार को बाधित करने के लिए एल्यूमीनियम ऑक्साइड की उपस्थिति में मोर्टार और मूसल के साथ जमे हुए कोशिकाओं को पीसने का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मोनोसोम शुद्धिकरण के लिए सुक्रोज कुशन या सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, पॉलीएक्रीलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग करके एमआरएनए सेपरेशन लागू किया जाता है और इसके बाद राइबोसोमल पदचिह्न एक्ससेशन (28-30 एनटी बैंड) लागू होता है और संतोषजनक परिणाम प्रदान करता है। यह काफी हद तक विधि को सरल बनाता है और साथ ही प्रक्रिया के लिए समय और उपकरण आवश्यकताओं को कम करता है। पुस्तकालय की तैयारी के लिए, हम कुछ हद तक अनुकूलन के साथ निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स से इलुमिना अनुक्रमण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे आरएनए किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

परिणामस्वरूप सीडीएनए पुस्तकालयों उचित मात्रा और अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) के लिए आवश्यक गुणवत्ता मौजूद हैं । 2 से 10 एमएलएन विशिष्ट रूप से मैप किए गए नमूने में वर्णित प्रोटोकॉल परिणामों के अनुसार तैयार पुस्तकालयों की अनुक्रमण व्यापक जैव सूचनात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान करने वाले प्रति नमूने को पढ़ता है। प्रोटोकॉल हम मौजूद है जल्दी और अपेक्षाकृत आसान है और मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है ।

Introduction

राइबोसोम प्रोफाइलिंग तकनीक (RIBO-seq) कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को1में जोनाथन Weissman की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था । ट्रांसलेशनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में, RIBO-seq एमआरएनए के लिए प्रत्येक राइबोसोम बाध्यकारी पर केंद्रित है और इसके स्थान और ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम की सापेक्ष संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह वीवो में प्रोटीन संश्लेषण की प्रक्रिया की निगरानी करने में सक्षम बनाता है और एकल कोडन रिज़ॉल्यूशन और सटीकता प्रदान कर सकता है जो दोनों पर राइबोसोम घनत्व के माप की अनुमति देता है, व्यक्तिगत एमआरएनए और सेल में पूरे ट्रांसक्रिप्टोम के साथ। RIBO-seq तकनीक की नींव पर तथ्य यह है कि अनुवाद के दौरान राइबोसोम एमआरएनए अणु को बांधता है और इस प्रकार एक राइबोन्यूलीज पाचन से ट्रांसक्रिप्ट के दफन टुकड़े की रक्षा करता है। राइबोन्यूलेज के अलावा, असुरक्षित एमआरएनए पचा जाता है और राइबोसोम्स से घिरे टुकड़े - आमतौर पर ~ 28-30 एनटी लंबे समय तक - बरकरार रहते हैं। इन टुकड़ों, जिसे राइबोसोमल पैरों के निशान (आरएफ) कहा जाता है, को तब अलग किया जा सकता है, अनुक्रमित किया जा सकता है और ट्रांसक्रिप्ट पर मैप किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप राइबोसोम्स की सटीक स्थिति का पता लगाया जा सकता है। वास्तव में, 1960 के दशक से राइबोसोम के टुकड़ों की रक्षा करने की क्षमता का उपयोग रिबोसोमल बाइंडिंग और अनुवाद दीक्षा स्थलों (टीआई)2,3,4का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि, गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में उन्नति के साथ, RIBO-seq अनुवाद निगरानी5 के लिए एक स्वर्ण मानक बन गया है, जो राइबोसोम सगाई के माध्यम से, प्रोटीन संश्लेषण6पर जीनोम-व्यापी जानकारी प्रदान कर सकता है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग ने ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटेम6की मात्रा निर्धारित करने के बीच मौजूद तकनीकी अंतर को भर दिया ।

राइबोसोम प्रोफाइलिंग का संचालन करने के लिए हमें उस जीव की कोशिका लाइसेट प्राप्त करने की आवश्यकता होती है जो जांच की गई परिस्थितियों में बड़ा हो गया था। सेल संग्रह और लाइसिस के दौरान इन स्थितियों को बाधित करने से अविश्वसनीय डेटा प्रदान किया जा सकता है। इसे रोकने के लिए, अनुवाद अवरोधक, तेजी से कटाई और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को मिक्सर मिल 7,8 या मनका बीटर 9 जैसे यांत्रिक समरूप में क्रायोजेनिक पीसकर और पिपेट10के माध्यम से या सुई11 के माध्यम से त्रयी द्वारा किया जा सकता है। कोशिकाओं के पल्वराइजेशन से ठीक पहले या कुछ ही समय बाद लाइसिस बफर जोड़ा जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में हम प्रीकूल मोर्टार और मूसल के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हैं, साथ ही एल्यूमीनियम ऑक्साइड बैक्टीरियल सेल दीवार के व्यवधान के लिए एक सज्जन दृष्टिकोण के रूप में, जो आरएनए कतरनी को अक्सर रोकता है जब सोनिफिकेशन जैसे तरीके लागू होते हैं। पल्वराइजेशन के बाद, हम मोर्टार की ठंडी सामग्री में एक बर्फ-ठंडी लाइसिस बफर जोड़ते हैं। राइबोसोमल पैरों के निशान का सबसे अच्छा संकल्प प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त लाइसिस बफर का चयन महत्वपूर्ण है। चूंकि आयनिक ताकत आरएफ आकार और पढ़ने के फ्रेम परिशुद्धता दोनों को प्रभावित करती है, इसलिए वर्तमान में कम आयनिक शक्ति और बफर क्षमता के साथ लाइसिस बफर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, भले ही ऐसा लगता है कि बफर संरचना mRNAs11, 12पर रिबोसोमल अधिभोग को प्रभावित नहीं करती है। लाइसिस बफर के महत्वपूर्ण घटक मैग्नीशियम आयन हैं, जिनकी उपस्थिति राइबोसोमल सबयूनिट के वियोजन को रोकती है और बैक्टीरियल राइबोसोम्स11, 13में सहज अनुरूप परिवर्तनों को रोकती है। कैल्शियम आयन भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और बैक्टीरियल राइबोसोम प्रोफाइलिंग विधि में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोकोकल न्यूक्लियज़ (एमएनएज) की गतिविधि के लिए आवश्यक हैं14। गुआनोसिन 5 के अलावा-[β,γ-इमिडो] ट्रिप्होस्फेट (जीएमपी-पीएनपी), जीटीपी का एक गैर-हाइड्रोलिजेबल एनालॉग, क्लोरम्फेनिकोल के साथ-साथ लाइसिस15के दौरान अनुवाद को रोकता है ।

जब लिस्नेट प्राप्त किया जाता है, तो इसे अपकेंद्रित्र द्वारा स्पष्ट किया जाता है और दो भागों में विभाजित किया जाता है, प्रत्येक को रीबो-सेक्यू और एक उच्च-थ्रूपुट कुल एमआरएनए अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू) के लिए क्योंकि वे एक साथ किए जाते हैं(चित्र 1)। आरएनए-एसईक्यू संदर्भ का एक बिंदु प्रदान करता है जो डेटा विश्लेषण के दौरान रिबो-सेक्यू और आरएनए-सेक्यू दोनों से डेटा की तुलना में सक्षम बनाता है। जांच किए गए अनुवाद को राइबोसोमल पैरों के निशान को सामान्य बनाकर एमआरएनए बहुतायतमें परिभाषितकिया गया है । आरएनए-एसईक्यू के डेटा से कलाकृतियों17की क्लोनिंग या अनुक्रमण की पहचान करने में भी मदद मिल सकती है ।

Figure 1
चित्रा 1। RIBO-seq और आरएनए-seq के लिए mRNA नमूना तैयारी की योजनाबद्ध। RIBO-seq पुस्तकालय की तैयारी के लिए, आरएनए को एमएनएई (ए) के साथ पचाया जाता है, जिसके बाद ~ 28-30 एनटी लंबाई (बी) के आरएफ का आकार चयन होता है; आरएनए-एसईक्यू आरएनए के लिए अलग-थलग (सी), आरएनए (डी) से समाप्त हो गया है, और परिणामस्वरूप एमआरएनए बेतरतीब ढंग से अलग-अलग लंबाई (ई) के टुकड़ों में खंडित हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

RIBO-seq और आरएनए-seq के लिए नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण थोड़ा(चित्रा 1)भिन्न हैं। राइबोसोम्स प्रोफाइलिंग के लिए, लाइसेट को राइबोसोम्स द्वारा संरक्षित नहीं एमआरएनए अणुओं को नीचा दिखाने के लिए एक विशिष्ट एंडोन्यूक्लियस द्वारा पचाने की आवश्यकता होती है। मानक प्रोटोकॉल में, प्राप्त मोनोसोम्स को सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन या सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन8,14द्वारा बरामद किया जाता है। इस लेख में, हम बताते हैं कि यह कदम बैक्टीरिया में RIBO-seq के लिए आवश्यक आरएफ को अलग करने के लिए आवश्यक नहीं है, इसी तरह यूकेरियोटिक कोशिकाओं18के लिए, और पॉलीएक्रीलामाइड जेल से उचित लंबाई एमआरएनए टुकड़ों का आकार चयन पर्याप्त है।

आरएनए-सेक्यू के लिए, एमआरएनए को कुल आरएनए से आरएनए की कमी से प्राप्त किया जाता है - आरएनए अणु बायोटिनाइलेटेड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोब्स को संकरित करते हैं जो स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों से बांधते हैं। इसके बाद आरआरएनए-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-मनका परिसरों को एक चुंबक के साथ नमूने से हटा दिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप आरआरएनए का नमूना19,20समाप्त हो जाता है । शुद्ध mRNA अणुओं तो बेतरतीब ढंग से क्षारीय हाइड्रोलिसिस द्वारा खंडित कर रहे हैं । एमआरएनए के प्राप्त टुकड़ों के साथ-साथ रिबोसोमल पैरों के निशान सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित हो जाते हैं और गहरे अनुक्रमण(चित्रा 2)के लिए तैयार होते हैं। इसमें क्षारीय हाइड्रोलिसिस (एमआरएनए के लिए) और एंजाइमेटिक पाचन (आरएफ के लिए) के बाद आवश्यक मरम्मत समाप्त होती है: 3 के डीफोस्फोरिलेशन 5 ' सिरों के फॉस्फोरिलेशन के बाद समाप्त होता है। अगले कदम इलुमिना प्लेटफॉर्म का उपयोग करके अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के लिए आवश्यक दृश्यों द्वारा तैयार सीडीएनए आवेषण बनाने के लिए एडाप्टर लिगेशन और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन हैं। पुस्तकालय तैयार करने का अंतिम चरण एक पीसीआर प्रतिक्रिया है जिसमें निर्माणों को एक चैनल पर मल्टीप्लेक्सिंग और अनुक्रमण की अनुमति देने के लिए नमूना विशिष्ट बारकोड के साथ परिलक्षित और लेबल किया जाता है। अनुक्रमण से पहले, पुस्तकालयों की गुणवत्ता और मात्रा का मूल्यांकन उच्च संवेदनशीलता वाले डीएनए ऑन-चिप इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया जाता है। उचित मापदंडों के साथ सीडीएनए पुस्तकालयों को फिर पूल और अनुक्रमित किया जा सकता है। विभिन्न इलुमिना प्लेटफार्मों पर अनुक्रमण किया जा सकता है, जैसे कि मिसेक़, नेक्स्टसेक़ या हाईसेक़, पुस्तकालयों की संख्या के आधार पर, आवश्यक अवधि और अनुक्रमण गहराई। अनुक्रमण के बाद, जैव सूचना विश्लेषण किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2। पुस्तकालय की तैयारी। पुस्तकालय की तैयारी में बार्कोडिंग के साथ सिरों की मरम्मत, एडाप्टर लिगेशन, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और प्रवर्धन शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

राइबोसोम प्रोफाइलिंग एक सार्वभौमिक विधि है जिसे वैज्ञानिक प्रश्न के अनुसार आसानी से संशोधित और समायोजित किया जा सकता है। मूल रूप से इसका उपयोग खमीर1में किया जाता था , लेकिन कुछ ही समय बाद इसे बैक्टीरियल कोशिकाओं21 के साथ - साथ यूकेरियोटिक मॉडल जीवों पर लागू किया गया, जिसमें माउस10, जेब्राफिश22, फ्रूट फ्लाई23 और अरबीडोप्सिस थैलियाना24शामिल हैं । इसका उपयोग विभिन्न राइबोसोम प्रकारों का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता था: साइटोप्लाज्मिक, माइटोकॉन्ड्रियल25,26 और क्लोरोप्लास्ट27,28। यूकेरियोट्स आरआईबीओ-सेक़ में अनुवाद के विशिष्ट पहलुओं की जांच करने के लिए आमतौर पर अनुकूलित और परिष्कृत किया जाता है, जिसमें दीक्षा10,11,29,30,32,विस्तार1,10,11,31,33,रिबोसोम स्टालिंग33 और अनुरूपता परिवर्तन33शामिल हैं। अधिकांश संशोधनों में विभिन्न अनुवाद अवरोधकों का उपयोग शामिल है। बैक्टीरिया में हालांकि, कार्रवाई34के आवश्यक तंत्र के साथ अवरोधकों की कमी के कारण अनुरूप अध्ययन ों का संचालन करना मुश्किल हो गया है। बैक्टीरिया में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला अनुवाद अवरोधक क्लोरम्फेनिकोल (सीएएम) है जो पेप्टिडिल ट्रांसफरेस सेंटर (पीटीसी) से बांधता है और ए-साइट में अमीनोएसिल-टर्ना की सही स्थिति को रोकता है। नतीजतन, सीएएम पेप्टाइड बॉन्ड के गठन को रोकता है जो लम्बी राइबोसोम्स35को गिरफ्तार करता है। बैक्टीरिया में अनुवाद अवरोधकों के अन्य उदाहरण टेट्रासाइक्लिन (टीईटी)36,रेटापमुलिन (आरईटी)34 और ओन्क 11237 हैं जिनका उपयोग अनुवाद दीक्षा स्थलों की जांच के लिए किया गया है। टीईटी, जो ए-साइट पर टीएनएआर के एंटीकोडन स्टेम-लूप के साथ सीधे ओवरलैपिंग करके राइबोसोम को टीआरएनए डिलीवरी को रोकता है, मूल रूप से सीएएम उपचार से प्राप्त परिणामों को सत्यापित करने के लिए लागू किया गया था क्योंकि वे दोनों एंटीबायोटिक्स अनुवाद विस्तार38को रोकते हैं। टीईटी प्राथमिक TIS का पता लगाने के लिए पाया गया था, लेकिन आंतरिक TIS३६प्रकट करने में असमर्थ था । आरईटी बैक्टीरियल राइबोसोम के पीटीसी में बांधता है, और एक साइट में एक elongator अमीनोएसिल-tRNA के साथ हस्तक्षेप करके पहले पेप्टाइड बांड के गठन को रोकता है । आरईटी लागू करने से प्राथमिक और आंतरिक तीएसएस34दोनों में राइबोसोम्स की गिरफ्तारी होती है . Onc112, एक प्रोलाइन-समृद्ध एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड, निकास सुरंग में बांधता है और राइबोसोमल ए साइट में अमीनोएसिल-टर्ना बाध्यकारी को अवरुद्ध करता है। नतीजतन, Onc112 दीक्षा परिसरों को विस्तार चरण37में प्रवेश करने से रोकता है।

मुख्य जानकारी राइबोसोम प्रोफाइलिंग प्रदान करता है राइबोसोम घनत्व और एमएनए पर उनकी स्थिति है। इसे विभिन्न विकास स्थितियों 1 , 6 में अनुवाद के स्तर पर अंतर जीन अभिव्यक्ति की जांच करने , अनुवादात्मक दक्षता1,38,39 को मापने और रिबोसोमल रुकेहुए 10जैसे अनुवाद विनियमन कार्यक्रमों का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। RIBO-seq एनोटेटेड एनसीआरएनए, छद्मजीन और बिना एनएनएनोट किए गए छोटे खुले पठन फ्रेम (ओआरएफ) के अनुवाद को उजागर करने की भी अनुमति देता है जिससे उपन्यास और/या बहुत कम प्रोटीन कोडिंगजीन10,12, 22,30, ३७की पहचान होती है । ऐसे मामलों में, RIBO-seq ठीक धुन और जीनोम एनोटेशन में सुधार कर सकते हैं । अनुवादित ओआरएफ और इसकी मात्रात्मक प्रकृति की पहचान के लिए अपनी उच्च संवेदनशीलता के साथ, राइबोसोम प्रोफाइलिंग प्रोटेम निर्धारण के लिए या प्रोटेओमिक्स अध्ययन 31 ,34,39के लिए प्रॉक्सी के रूप में भी काम कर सकती है। टीआई मैप करके, राइबोसोम प्रोफाइलिंग से पता चलता है कि एन-मरणासन्न विस्तारित और ज्ञात प्रोटीन10,32के कटा हुआ आइसोफॉर्म। रीबो-सेक को प्रोटीन14 , 21,24के सह-अनुवादीय तह का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया गयाथा। यह विधि विस्तार दर 1,10,39 या अलग - अलग कोडन 6 की डिकोडिंग गति को मापने में सक्षम बनाती है और अनुवाद17के मात्रात्मक मॉडल विकसित करने में मदद करती है । राइबोसोमप्रोफाइलिंग विधि भी बैक्टीरिया 7,15,17,फ्रेमशिफ्टिंग40,स्टॉप-कोडन रीडथ्रू के माध्यम से21,टर्मिनेशन/रीसाइक्लिंग दोष41, 42 और रिबोसोमल संरचना परिवर्तन33 में रिकेरियोट में मेकेनिस्टिक अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है। यूकेरियोट्स16,43में मिरनास6 और आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे अनुवाद पर विशिष्ट ट्रांस-एक्टिंग कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए RIBO-seq को भी अनुकूलित किया गया था। हालांकि, यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि प्रायोगिक डिजाइन और RIBO-seq का प्राप्त संकल्प जानकारी की मात्रा निर्धारित करता है जो परिणामी अनुक्रमण डेटा12से निकाला जा सकता है।

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Protocol

1. नमूना संग्रह

  1. एक बैक्टीरियल कल्चर तैयार करें। हम प्रति नमूना 100 एमएल की संस्कृति की मात्रा की सलाहते हैं।
  2. नमूना संग्रह के लिए उपकरण और अभिकर्मक तैयार करें: प्रति नमूना दो स्कूपुला, बाँझ 0.45 माइक्रोन मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर झिल्ली (एमसीई) फिल्टर, 50 एमएल बाँझ ट्यूब, तरल नाइट्रोजन, 50 मिलीग्राम/ तरल नाइट्रोजन वाष्पीकरण की अनुमति देने और बंद ट्यूबों के विस्फोट को रोकने के लिए 50 एमएल ट्यूबों के ढक्कन को पंचर करें। प्रयोगशाला डिटर्जेंट और 70% इथेनॉल के साथ स्कूपुला को दूषित करें।
  3. फ़िल्टरिंग उपकरण को प्रीवार्म करें और बैक्टीरियल संस्कृति के तापमान को विकसित करने के लिए स्कूपुला में से एक।
    नोट: हम एक कीप, एक फ्रिटेड बेस, एक जमीन संयुक्त फ्लास्क और 47 मिमी Ø स्प्रिंग क्लैंप के साथ एक ऑल-ग्लास फिल्ट्रेशन उपकरण की सलाहते हैं।
  4. नमूना कटाई से पहले, बैक्टीरियल संस्कृति में क्लोरम्फेनिकोल को 100 μg/mL की अंतिम एकाग्रता और 1 मिनट (वैकल्पिक) को इनक्यूबेट करने के लिए जोड़ें।
  5. तरल नाइट्रोजन को 50 एमएल बाँझ ट्यूब में डालें और ठंडा करने के लिए ट्यूब के अंदर दूसरा स्कूपुला रखें।
    सावधानी! वाष्पीकरण पर दबाव परिवर्तन के कारण तरल नाइट्रोजन बंद कंटेनरों को विस्फोट का कारण बन सकता है। इसे रोकने के लिए, तरल नाइट्रोजन वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए 50 एमएल ट्यूबों के ढक्कन में कुछ छेद बनाना आवश्यक है।
  6. छानने का काम करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें। जब मध्यम झिल्ली के माध्यम से पारित हो गया है फ़िल्टर करना बंद करो, लेकिन फिल्टर पूरी तरह से सूखने के लिए अनुमति नहीं है।
  7. एक प्रीवार्मेड स्कूपुला का उपयोग करके फिल्टर डिस्क से कोशिकाओं को तेजी से स्क्रैप करके बैक्टीरियल छर्रों को इकट्ठा करें। तरल नाइट्रोजन से भरी 50 एमएल ट्यूब में काटी गई कोशिकाओं के साथ पूरे स्कूपुला को तुरंत रखें। काटा गया गोली पूरी तरह से तरल नाइट्रोजन में कवर किया जाना चाहिए।
  8. गोली को अच्छी तरह से फ्रीज करने दें और पहले से ठंडे दूसरे स्कूपुला का उपयोग करके जमे हुए कोशिकाओं को उखाड़ फेंकें। पंचर ढक्कन बंद करें और ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रत्येक नमूना कटाई के बाद कीटाणुरहित स्कूपुला।

2. सेल लाइसिस

  1. 10 m Tris पीएच 8, DNase I और 1.5 एमएल रिएक्शन ट्यूब में 0.1 एम जीएमपी-पीएनपी तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें। सेंट्रलाइज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. लाइसिस बफर (20 एमएम ट्राइस पीएच 7.6, 10 एमएम एमजीएसेट, 150 एमएम केसेट, 0.4% ट्राइटन एक्स-100, 6 एमएम β-मर्केप्टोथेनॉल, 5 एमएम सीसीएल2 और ऑप्शनल 1 एमएम क्लोराफेनीकोल) तैयार करें। एलिकोट 1.5 एमएल रिएक्शन ट्यूब में प्रति सैंपल लाइसिस बफर का 500 माइक्रोन करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
  3. एक प्रयोगशाला डिटर्जेंट और 70% इथेनॉल के साथ मोर्टार और मूसल को दूषित करें, और उन्हें सुखा दें। मोर्टार में तरल नाइट्रोजन डालने से शांत मोर्टार और मूसल।
  4. जमे हुए गोली को पूर्व-ठंडा मोर्टार में स्थानांतरित करें और इसे पाउडर में पीस लें। एक स्पैटुला के साथ, एल्यूमीनियम ऑक्साइड की लगभग 1 मात्रा जोड़ें और पीसने जारी रखें। जरूरत पड़ने पर तरल नाइट्रोजन डालकर मोर्टार, मूसल और कोशिकाओं को ठंडा रखें, मोर्टार की सामग्री को गल न जाने दें।
  5. लाइसिस बफर का उपयोग करने से ठीक पहले, क्रमशः 2 mm और 100 U/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए लाइसिस बफर एलिकोट में जीएमपी-पीएनपी और डीएनएसई I जोड़ें। कोशिकाओं और एल्यूमीनियम ऑक्साइड के साथ मोर्टार में समाधान स्थानांतरित करें और पीस जारी रखें। मिश्रण को पीसते समय धीरे-धीरे गल जाने दें और मिश्रण को पूर्व-ठंडा 1.5 एमएल रिएक्शन ट्यूब में स्थानांतरित करें और तुरंत बर्फ पर रखें।
  6. सेंट्रलाइज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20 000 x g पर रहता है। सुपरनेटैंट्स को नए, प्री-कूल्ड 1,5 एमएल रिएक्शन ट्यूब्स में ट्रांसफर करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
  7. नैनोड्रॉप के साथ प्रत्येक नमूने में आरएनए एकाग्रता को मापें। नमूनों के 1:10 कमजोर पड़ने और एक खाली के रूप में नाभिक मुक्त पानी में लाइसिस बफर के 1:10 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें ।
    नोट: ध्यान रखें कि क्लोरम्फेनिकोल 260 एनएम पर महत्वपूर्ण अवशोषण दिखाता है।
  8. प्रत्येक को दो भागों में विभाजित करें: एक RIBO-seq (0.5 - 1 मिलीग्राम आरएनए) के लिए और दूसरा आरएनए-सेक़ (बाकी) के लिए।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए क्लीन-अप किट का उपयोग करके आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों को साफ करें।
    नोट: हम Zymo आरएनए क्लीन एंड कॉन्सेंट्रेट-25 किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने की सलाह देते हैं। हम छोटे आरएनए टुकड़ों की शुद्धि दक्षता बढ़ाने के लिए, रिबोसोमल पैरों के निशान और खंडित एमआरएनए के लिए नमूना और बाध्यकारी बफर के मिश्रण में इथेनॉल (नमूना मात्रा की तुलना में) के 4.5 वॉल्यूम जोड़ने की भी सलाह देते हैं।
  10. आरएनए-एसईक्यू के लिए इरादा नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आरएनए-एसईक्यू के लिए प्रक्रिया चरण 5 से जारी रहेगी ।

3. RIBO-seq के लिए नमूनों के MNase पाचन

  1. आरएनए के 1 मिलीग्राम के लिए 10 mM Tris पीएच 8 में 187.5 U/μL MNase के 3.8 μL जोड़ें और यह 500 μL की कुल मात्रा के लिए lysis बफर के साथ ऊपर।
  2. थर्मोमिक्सर में 45 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 300 आरपीएम पर इनक्यूबेट।
  3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए साफ किट के साथ नमूनों को साफ (कदम २.९ में के रूप में) ।
  4. -80 डिग्री सेल्सियस (स्टॉप पॉइंट) पर RIBO-seq के लिए नमूनों को स्टोर करें या आकार चयन के लिए आगे बढ़ें।

4. पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) और RIBO-seq के लिए नमूनों का आकार चयन

  1. 8 एम यूरिया के साथ 15% पॉलीएक्रीलामाइड-टाबी जेल तैयार करें और इसे टाबी बफर वाले टैंक में रखें। 200 वी के निरंतर वोल्टेज पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए प्री-रन।
  2. 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर TBE-यूरिया नमूना बफर, एनएएचर के साथ नमूने मिलाएं और उन्हें तुरंत बर्फ पर रखें।
  3. एक सिरिंज का उपयोग कर जेल कुओं में TBE बफर इंजेक्शन द्वारा यूरिया बाहर धो । प्रत्येक नमूने को अलग करने और क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए उनके बीच एक अच्छी तरह से स्थान छोड़ने वाले नमूनों को लोड करें। मार्कर के रूप में 29 एनटी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड और 26 एनटी और 32 एनटी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का मिश्रण का उपयोग करें। 180 वी के निरंतर वोल्टेज पर इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
  4. रात भर इनक्यूबेशन (5 एमएम ईडीटीए, 10 एमएम नाओएसी पीएच 5) के लिए बाँझ बफर तैयार करें।
  5. इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, जेल को सिबीआर गोल्ड-बाथ में लगभग 2-3 मिनट तक दाग दें और नाभिक मुक्त पानी के साथ जेल को कुल्ला दें।
  6. बाँझ सुइयों या रेजर ब्लेड के साथ 26 और 32 एनटी के बीच जेल के उत्पाद शुल्क टुकड़े और प्रत्येक नमूने के लिए अलग 1.5 एमएल ट्यूब में जेल के टुकड़े जगह है। नमूनों के बीच सुई या रेजर ब्लेड बदलें।
  7. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए रात भर इनक्यूबेशन बफर के 200 μL जोड़ें।
  8. एक थर्मोमिक्सर में रात भर 10 डिग्री सेल्सियस, 1000 आरपीएम पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  9. अगले दिन, चरण 2.9 के रूप में नमूनों को साफ करें। नाभिक मुक्त पानी के 80 माइक्रोन में पैरों के निशान एल्यूट करें।
  10. नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। RIBO-seq के लिए प्रक्रिया 7 कदम से जारी रहेगा ।

5. आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों से आरएनए की कमी से बैक्टीरियल एमआरएनए का शुद्धिकरण

  1. एक बैक्टीरियल एमआरएनए शुद्धिकरण किट (जैसे, इनविट्रोजन माइक्रोबीएक्सप्रेस) के साथ नमूनों से आरएनए निकालें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. कदम 2.9 के रूप में नमूनों को साफ करें। नाभिक मुक्त पानी के 50 माइक्रोन में mRNA Elute।
  3. आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस (स्टॉप पॉइंट) पर स्टोर करें या क्षारीय विखंडन जारी रखें।

6. आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों का क्षारीय विखंडन

  1. क्षारीय हाइड्रोलिसिस बफर तैयार करें (0.1 एम नाएचसीओ3,30 माइक्रोल के 0.1 एमएनए 2सीओ3 और 0.5 एम ईडीटीए के 1 माइक्रोल) का मिश्रण करें। नमूने के 1 वॉल्यूम (50 माइक्रोन) के साथ क्षारीय बफर की 1 वॉल्यूम (50 माइक्रोल) मिलाएं और 25 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 3 एम नाओएसी पीएच 5.5 के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  3. कदम 2.9 के रूप में नमूनों को साफ और नाभिक मुक्त पानी के 80 माइक्रोन में नमूनों elute.
  4. संभावित स्टॉप पॉइंट: -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए-सेक्यू नमूने स्टोर करें। हालांकि, हम अनावश्यक ठंड और विगलन से बचने के लिए सीधे 7 कदम पर जाने की सलाह देते हैं।

7. आरएनए और रिबो-सेक दोनों के लिए नमूनों का डेफोस्फोरिलेशन और फॉस्फोरिलेशन

  1. प्रत्येक नमूने में 10x रिएक्शन बफर पीएनके के 10 माइक्रोन और 5 माइक्रोन टी 4 पीएनके जोड़ें। 3 'सिरों को डीफोस्फोरलेट करने के लिए 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 5 के सिरों को फॉस्फोरलेट करने के लिए 1 mm एटीपी के 3 माइक्रोन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. नमूनों को चरण 2.9 के रूप में साफ करें, 30 माइक्रोन नाभिक मुक्त पानी में एल्यूट करें।
  4. नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. पुस्तकालय तैयारी NEBNext मल्टीप्लेक्स छोटे आरएनए लाइब्रेरी तैयारी का उपयोग कर Illumina के लिए सेट

  1. नाभिक मुक्त पानी के 6μL में इनपुट आरएनए (प्राप्त एमआरएनए के टुकड़े और राइबोसोमल पैरों के निशान) के 100-1000 एनजी तैयार करें और 3 ' एसआर एडाप्टर के 1 माइक्रोन जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इनक्यूबेट।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल निर्दिष्ट 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के बजाय 2.5 घंटे के लिए 3 'लिगेशन रिएक्शन बफर (2X) और 3'लिगेशन एंजाइम मिक्स और 3 μl के 10 माइक्रोन जोड़ें।
  3. एक संशोधित कार्यक्रम के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर को हाइब्रिड करें: 75 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
  4. लिगेट 5 ' एसआर एडाप्टर । एक परिवर्तन के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें: 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के बजाय 2.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें।
  6. संभावित स्टॉप पॉइंट: रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज को निष्क्रिय करने और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर संश्लेषित सीडीएनए युक्त नमूनों को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। हालांकि, हम नमूनों की अनावश्यक ठंड और विगलन से बचने के लिए सीधे अगले चरणों में आगे बढ़ने की सलाह देते हैं।
  7. प्रत्येक सीडीएनए लाइब्रेरी का आधा हिस्सा बैक-अप के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर प्रवर्धन करें। रिएक्शन मिक्स का आधा इस्तेमाल करें। प्राप्त पुस्तकालयों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. पेज का उपयोग कर सीडीएनए पुस्तकालयों का आकार चयन

  1. 6% पॉलीएक्रीलामाइड-टाबी जेल तैयार करें और इसे टाब बफर वाले टैंक में रखें। 200 वी के निरंतर वोल्टेज पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए प्री-रन।
  2. जेल लोडिंग डाई, ब्लू (6X) के साथ नमूनों को मिलाएं और उन्हें जेल पर लोड करें। सीढ़ी के रूप में क्विक-लोड pBR322 डीएनए-एमएसपीआई डाइजेस्ट का उपयोग करें। शुरुआत में, डीएनए को जेल में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए 120 वी के निरंतर वोल्टेज पर इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं और फिर वोल्टेज को 180 वी में बदल दें।
  3. जब इलेक्ट्रोफोरेसिस समाप्त हो जाता है, तो जेल को एसवाईबीआर गोल्ड-बाथ में लगभग 2-3 मिनट तक दाग दें और नाभिक मुक्त पानी के साथ जेल को कुल्ला दें।
  4. पुस्तकालयों वाले उत्पाद शुल्क जेल के टुकड़े। आरएनए-एसईक्यू नमूनों के लिए 135-180 एनटी के बीच आबकारी और 135-170 एनटी के बीच RIBO-seq के लिए। बाँझ सुई या रेजर ब्लेड का उपयोग करें और उत्पादित जेल के टुकड़ों को अलग-अलग 1.5 एमएल रिएक्शन ट्यूब में रखें। नमूनों के बीच सुई या रेजर ब्लेड को बदलने के लिए याद रखें।
    नोट: एनईबीनेक्स्ट मल्टीप्लेक्स स्मॉल आरएनए लाइब्रेरी प्रेप सेट से इलुमिना के लिए एडाप्टर और बारकोड में कुल 119 एनटी हैं जो कम एक्सिशन कट-ऑफ निर्धारित करता है।
  5. प्रत्येक उत्पादित जेल टुकड़े में नाभिक मुक्त पानी के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  6. एक थर्मोमिक्सर में रात भर 10 डिग्री सेल्सियस, 450 आरपीएम पर जेल के टुकड़ों को इनक्यूबेट करें।
  7. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए क्लीन-अप किट के साथ सीडीएनए पुस्तकालयों को साफ और केंद्रित करें।
    नोट: हम Zymo डीएनए क्लीन एंड कंसंट्रेट-5 किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
  8. -80 डिग्री सेल्सियस स्टॉप पॉइंट पर शुद्ध सीडीएनए पुस्तकालयों को स्टोर करें।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत अनुकरणीय परिणाम डब्ल्यूटी बैसिलस सबटिलिस कोशिकाओं में अनुवाद विनियमन की जांच करने वाले अध्ययन में प्राप्त किए गए थे । रातोंरात संस्कृतियों को अमीर माध्यम के१०० मिलीएल में ०.१ के बराबर ओडी ६०० के बराबर पतला किया गया और ३७ डिग्री सेल्सियस पर जोरदार मिलाते हुए जब तक ओडी६०० 0.5-0.6 तक पहुंच गया । इसके बाद अमीर माध्यम को कम से कम माध्यम से बदलकर स्पोरुलेशन प्रक्रिया को प्रेरित किया गया और इनक्यूबेशन चार घंटे तक जारी रखा गया । कोशिकाओं को हर घंटे टी0-स्पोरुलेशन प्रेरण के साथ शुरू काटा गया था-जिसके परिणामस्वरूप पांच समय अंक होते थे । कटाई से एक मिनट पहले, संस्कृतियों को ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित क्लोरम्फेनिकोल के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को एक प्रीवार्म ग्लास निस्पंदन प्रणाली में छानने से एकत्र किया गया था जिसमें 0.45 माइक्रोन मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर झिल्ली (एमसीई) फिल्टर और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रोजन का उपयोग किया गया था।

lysate में प्राप्त रिबोन्यूक्लिक एसिड की मात्रा विकास की स्थिति, संस्कृति की मात्रा और घनत्व पर निर्भर करती है। हमारे प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, बैक्टीरियल कल्चर(बेसिलस सबटिलिस)के 100 एमएल औसतन 1-4 मिलीग्राम आरएनए की पैदावार करते हैं। ऊपर वर्णित प्रयोग से प्राप्त lysates के उदाहरण तालिका 1में दिखाए गए हैं।

आरएनए एकाग्रता [एनजी/μL] आरएनए राशि [मिलीग्राम] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

तालिका 1. बी सबटिलिस के प्रतिनिधि नमूनों में आरएनए एकाग्रता और राशि। तालिका में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे बाद स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था । लाइसिस को लाइसिस बफर के 550 माइक्रोल के साथ किया गया था जिसमें क्लोराम्फेनिकोल होता था। यह देखा जा सकता है कि जैसे ही स्पोरुलेशन प्राप्त आरएनए की मात्रा कम हो जाती है।

जब आरएनए की मात्रा 1 मिलीग्राम से कम होती है, तो 0.25 मिलीग्राम आरएनए का उपयोग 1-0.5 मिलीग्राम के बजाय RIBO-seq के लिए किया जाता है और एमएनएसई की मात्रा को क्रमशः समायोजित किया जाता है। नाभिक पाचन के बाद प्रतिनिधि आरएनए राशि और एकाग्रता तालिका 2में दिखाई जाती है । पाचन और सफाई के बाद आरएनए की औसत मात्रा 0.5 मिलीग्राम आरएनए इनपुट से 50 माइक्रोग्राम है।

आरएनए एकाग्रता [एनजी/μL] आरएनए राशि [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

तालिका 2. RIBO-seq के लिए प्रतिनिधि नमूनों के नाभिक पाचन के बाद आरएनए की मात्रा और एकाग्रता। तालिका में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे पोस्ट स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq के लिए नमूनों को संदर्भित करता है । क्योंकि WT4-R नमूने की आरएनए एकाग्रता कम थी, 0.25 मिलीग्राम आरएनए पचा गया था, जबकि शेष नमूनों के लिए आरएनए के 0.5 मिलीग्राम का उपयोग रिबोसोमल पदचिह्न पीढ़ी के लिए किया गया था। पाचन के लिए एमएनएसई की मात्रा डब्ल्यूटी4-आर में 0.25 मिलीग्राम आरएनए के लिए 178.125 यू और अन्य नमूनों में 0.5 मिलीग्राम आरएनए के लिए 356.25 यू थी। पाचन के बाद नमूनों को वाणिज्यिक आरएनए क्लीन-अप किट के साथ साफ किया गया और नैनोड्रॉप के साथ राइबोन्यूक्लिक एसिड एकाग्रता को मापा गया।

MNase पाचन के बाद, आकार चयन पृष्ठ की सहायता से किया जाता है। पचाने वाले नमूनों के साथ 15% TBE-यूरिया पॉलीएक्रेलैमाइड जेल का एक उदाहरण चित्र 3में दिखाया गया है। 26 और 32 एनटी के बीच जेल के टुकड़े एक बाँझ रेजर ब्लेड के साथ उत्पादित किए गए थे और रात भर इनक्यूबेशन बफर में रात भर इनक्यूबेटेड थे। अगले दिन, राइबोसोमल पैरों के निशान वाणिज्यिक आरएनए सफाई किट के साथ साफ किया गया ।

Figure 3
चित्रा 3। एमएनएईई पाचन के बाद प्रतिनिधि नमूनों के साथ 15% TBE-यूरिया पॉलीएक्रीलामाइड जेल। इस आंकड़े में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे बाद स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq के लिए नमूनों को संदर्भित करता है । 15 μl denatured नमूनों के क्रम में जेल कुओं में लोड किया गया: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R और शेष मात्रा में एक वापस अप के रूप में-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था । 29 एनटी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड और 26 एनटी और 32 एनटी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के मिश्रण को मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इलेक्ट्रोफोरेसिस ऊपर वर्णित के रूप में किया गया था और जेल एक SYBR गोल्ड स्नान में दाग था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाभिक पाचन के समानांतर, आरएनए-एसईक्यू के लिए lysates वाणिज्यिक आरएनए क्लीन-अप किट के साथ साफ किया गया था और आरएनए की प्राप्त सांद्रता नैनोड्रॉप के साथ मापा गया था। प्रतिनिधि परिणाम तालिका 3में प्रस्तुत किए जाते हैं । सफाई के बाद रिबोन्यूक्लिक एसिड की मात्रा घटकर 40-500 माइक्रोन हो गई।

आरएनए एकाग्रता [एनजी/μL] आरएनए राशि [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

तालिका 3. आरएनए शुद्धिकरण के बाद आरएनए-एसईक्यू के लिए आरएनए राशि और नमूनों की एकाग्रता। तालिका में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे पोस्ट स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "एम" आरएनए-seq (mRNA) के लिए नमूनों को संदर्भित करता है ।

आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों की प्राप्त आरएनए सांद्रता का उपयोग आरएनए की कमी के लिए आरएनए इनपुट को परिभाषित करने के लिए किया गया था। प्रत्येक आरएनए-एसईक्यू नमूने से आरएनए के 8 माइक्रोग्राम का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार माइक्रोबीएक्सप्रेस बैक्टीरियल एमआरएनए शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ किया गया था और बाद में वाणिज्यिक आरएनए क्लीन-अप किट के साथ साफ किया गया था। आरआरएनए की कमी के प्रतिनिधि परिणाम तालिका 4में दिखाए गए हैं।

आरएनए एकाग्रता [एनजी/μL] A260/A280 A260/A230 आरएनए राशि [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

तालिका 4. आरएनए की कमी के बाद प्रतिनिधि आरएनए राशि और एकाग्रता। तालिका में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे पोस्ट स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "एम" आरएनए-seq के लिए नमूनों को संदर्भित करता है । आरएनए-एसईक्यू के लिए नमूनों से आरएनए के 8 माइक्रोन का उपयोग आरएनए की कमी के लिए किया गया था और बाद में एक वाणिज्यिक आरएनए क्लीन-अप किट के साथ साफ किया गया था।

इसके बाद, प्राप्त एमआरएनए को क्षारीय हाइड्रोलिसिस द्वारा खंडित किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित एक वाणिज्यिक किट के साथ साफ किया गया था। खंडित एमआरएनए और राइबोसोमल पैरों के निशान 3 ' सिरों पर dephosphphorylated थे और उपरोक्त प्रोटोकॉल के अनुसार 5 ' सिरों पर फॉस्फोरिलेटेड थे । नमूनों का उपयोग तब इल्यूमिना अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। चित्रा 4 प्राप्त पुस्तकालयों के साथ 6% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल का एक उदाहरण दिखाता है। आरएनए-सेक्यू के लिए 135-180 एनटी और रिबो-सेक्यू के लिए 135-170 एनटी की सीमा में जेल के टुकड़ों को बाँझ रेजर ब्लेड के साथ उत्पादित किया गया था और नाभिक मुक्त पानी में रात भर इनक्यूबेटेड किया गया था। पुस्तकालयों को एक वाणिज्यिक डीएनए क्लीन-अप किट के साथ साफ किया गया था और गुणवत्ता और मात्रा का आकलन एक उच्च संवेदनशीलता वाले डीएनए ऑन-चिप इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा फुर्चिंत २१०० बायोएनालाइजर का उपयोग करके किया गया था ।

Figure 4
चित्रा 4। आकार चयन से पहले और बाद में सीडीएनए पुस्तकालयों का 6% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल। क्विक-लोड pBR322 डीएनए-एमएसपीआई डाइजेस्ट का इस्तेमाल सीढ़ी के रूप में किया गया । निम्नलिखित क्रम में जेल में 25 μL नमूने भरे गए थे: तीन RIBO-seq पुस्तकालयों और छह आरएनए-seq पुस्तकालयों । नमूनों की शेष मात्रा बैक-अप के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की गई थी। इस आंकड़े में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे बाद स्पोरुलेशन प्रेरण काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq के लिए नमूनों को संदर्भित करता है और पत्र "एम" आरएनए-seq के लिए नमूनों को संदर्भित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2100 बायोएनालाइजर से प्राप्त वर्चुअल जेल छवियों और इलेक्ट्रोफेरोग्राम के उदाहरण चित्र 5में दिखाए गए हैं । राइबो-सेक्यू पुस्तकालयों का प्रतिनिधित्व करने वाले बैंड और चोटियां आरएनए-सेक्यू पुस्तकालयों का प्रतिनिधित्व करने वाले इन लोगों की तुलना में अधिक संकीर्ण और बेहतर परिभाषित हैं। ऑन-चिप इलेक्ट्रोफोरेसिस के अनुसार, पुस्तकालय लगभग 150 बीपी लंबे होते हैं, जो एक अपेक्षित पुस्तकालय आकार है। पुस्तकालय तैयार करने में उपयोग किए जाने वाले एडाप्टर और बारकोड 119 एनटी लंबे होते हैं और आवेषण या तो 29-30 एनटी लंबे (RIBO-seq के लिए) या 25 और 50 एनटी (आरएनए-एसईक्यू के लिए) के बीच की सीमा में हैं। RIBO-seq पुस्तकालयों से प्राप्त २०० बीपी के करीब अतिरिक्त चोटियों पीसीआर कलाकृतियों जो जैव सूचना विश्लेषण के दौरान खारिज किया जा सकता है जब अनुक्रमण से प्राप्त डेटा छंटनी की है और rRNA/tRNA फ़िल्टर किया जाता है संकेत हो सकता है । डीएनए की औसत मात्रा 32 एनजी है जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए आवश्यक सामग्री की पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है।

Figure 5
चित्रा 5। इलेक्ट्रोफेरोग्राम और आभासी जेल छवियों के उदाहरण एक उच्च संवेदनशीलता वाले डीएनए ऑन-चिप इलेक्ट्रोफोरेसिस से। इस आंकड़े में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और एक घंटे (1), दो (2), तीन (3) या चार (4) घंटे बाद स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq पुस्तकालयों को संदर्भित करता है और पत्र "एम" आरएनए-seq पुस्तकालयों को संदर्भित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऑन-चिप इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, पुस्तकालयों को इलुमिना के NextSeq500 प्लेटफ़ॉर्म पर एकल-अंत 50 बीपी अनुक्रमण के लिए एकत्र किया गया था (प्रति चैनल 10 पुस्तकालय, न्यूनतम 350 एमएलएन प्रति चैनल पढ़ता है)। अनुक्रमण मिले 30-57 मिलियन आरएनए-seq पुस्तकालयों के लिए प्रति नमूना पढ़ता है और 30-50 मिलियन RIBO-seq पुस्तकालयों के लिए प्रति नमूना पढ़ता है । एडाप्टर और खराब गुणवत्ता वाले दृश्यों की ट्रिमिंग के परिणामस्वरूप आरएनए-एसईक्यू नमूनों के लिए प्रति नमूना 24-47 एमएलएन पढ़ता है और 25-50 एमएलएन RIBO-seq नमूनों के लिए प्रति नमूना पढ़ता है। मानचित्रण, स्टार४४के साथ प्रदर्शन किया, विशिष्ट मैप के 2.4-9.6 लाख मिले आरएनए-seq नमूनों के लिए प्रति नमूना पढ़ता है (जो पढ़ता है की कुल संख्या का 8-16.8% का गठन) और 2.3-10.4 मिलियन विशिष्ट मैप रीड्स (7.7-22.1%) RIBO-seq नमूनों के लिए। प्राप्त डेटा फास्टक्यूसी45के साथ गुणवत्ता नियंत्रण की जांच की गई थी। छंटनी किए गए दृश्यों के लिए फास्टक्यूसी द्वारा उत्पादित गुणवत्ता वाले भूखंडों के उदाहरण चित्र 6में दिखाए गए हैं। ब्याज की लंबाई के दृश्यों, जो RIBO-seq के लिए <३२ nt है और आरएनए-seq के लिए <५० nt, बहुत अच्छी गुणवत्ता प्रस्तुत की । जीसी सामग्री के भूखंडों और सभी छंटनी किए गए अनुक्रमों पर अनुक्रम लंबाई के वितरण के उदाहरण चित्र 7में दिखाए गए हैं । आरआईबीओ-सेक्यू लाइब्रेरी के जीसी वितरण भूखंड में 72% पर अतिरिक्त चोटी संभावित रूप से आरएनए संदूषण का संकेत दे सकती है जिसे आरएनए निस्पंदन46, 47, 48द्वारा जैव सूचना विश्लेषणके दौरानहटाया जा सकता है। अनुक्रम लंबाई वितरण RIBO-seq पुस्तकालयों के लिए बहुत संकीर्ण है, 26-27 nt पर एक चोटी के साथ, जबकि आरएनए-seq पुस्तकालयों के लिए लंबाई वितरण व्यापक है और 15 और ५० nt के बीच पर्वतमाला ।

Figure 6
चित्रा 6। ट्रिमिंग के बाद RIBO-seq और आरएनए-seq पुस्तकालयों के लिए सभी ठिकानों में गुणवत्ता स्कोर के बॉक्स और मूंछ भूखंडों के उदाहरण । इस आंकड़े में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस के नमूने शामिल हैं जिन्हें स्पोरुलेशन इंडक्शन (0) और चार (4) घंटे पोस्ट स्पोरुलेशन प्रेरण से पहले काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq नमूनों को संदर्भित करता है और पत्र "एम" आरएनए-seq नमूनों को संदर्भित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। जीसी सामग्री के भूखंडों के उदाहरण और ट्रिमिंग के बाद RIBO-seq और आरएनए-seq पुस्तकालयों के लिए सभी दृश्यों के अनुक्रम लंबाई वितरण। यह आंकड़ा जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस से नमूनों को दर्शाता है जिन्हें चार (4) घंटे बाद स्पोरुलेशन प्रेरण काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq के लिए नमूना को संदर्भित करता है और पत्र "एम" आरएनए-seq के लिए नमूना को संदर्भित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यह सत्यापित करने के लिए कि क्या राइबो-सेक़ डेटा चयनित लंबाई के यादृच्छिक एमआरएनए टुकड़ों के बजाय सच्चे राइबोसोमल पैरों के निशान के बारे में जानकारी प्रदान करता है, हमने रिबो-सेक्यू और आरएनए-सेक्यू से रिबो-एसईक्यू से डेटा की तुलना रिबो-सेक्यूलिटिट का उपयोग करके की, जो राइबो-सेक्यू डेटा विश्लेषण49के लिए एक वेब सर्वर है। रिबो-सेक्यू डेटा तीन आवधिकता और आरएफ की शुरुआत करने वाले राइबोसोम्स और विशेषता के अनुरूप एक लंबा, संकीर्ण चोटी प्रदर्शित करता है जैसा कि चित्र 8 एमें दिखाया गया है, जिसे आरएनए-सेक्यू डेटा(चित्रा 8B)में नहीं देखा जाता है। इसके अलावा, मेटाजीन साजिश कोडिंग दृश्यों (सीडीएसएस) पर आरएफ और एमआरएनए टुकड़ों के औसत कवरेज के प्रोफाइल दिखा रहा है RIBO-seq डेटासेट(चित्रा 8C)में CDSs को मैप किया पढ़ता है की एक उच्च अनुपात से पता चला, के रूप में उंमीद है ।

Figure 8
चित्रा 8। मेटाजीन आवधिकता भूखंड और सीडीएसएस पर आरएफ और एमआरएनए टुकड़ों का औसत कवरेज। मेटाजीन प्रोफाइल को रिबोटूलिटिट के साथ प्राप्त किया गया था, जो एक एकीकृत वेब सर्वर49था। सीडीएस की लंबाई को 1 के मूल्य तक सामान्यीकृत किया गया था और प्रत्येक सीडीएस को 100 बराबर डिब्बे में विभाजित किया गया था। यह आंकड़ा जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) बी सबटिलिस से नमूनों को दर्शाता है जिन्हें एक (1) घंटे के बाद स्पोरुलेशन प्रेरण काटा गया था; पत्र "आर" RIBO-seq के लिए नमूना को संदर्भित करता है और पत्र "एम" आरएनए-seq के लिए नमूना को संदर्भित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यहां प्रस्तुत RIBO-seq प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए आरएफ रिकवरी (सुक्रोज ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन) के मानक विधि द्वारा प्राप्त परिणामों के समान परिणाम पैदा होते हैं, हमने दो तरीकों के बाद तैयार पुस्तकालयों से अनुक्रमण परिणामों को समानांतर किया। डब्ल्यूटी बी सबटिलिस में स्पोरुलेशन के दौरान अनुवाद विनियमन की जांच करने वाले प्रयोग प्रस्तुत RIBO-seq प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किए गए थे, साथ ही मानक प्रोटोकॉल का पालन किया गया था जिसमें एक सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा मोनोसोम रिकवरी शामिल है। दो प्रयोगों से प्राप्त राइबोसोम कवरेज प्रोफाइल के परिणाम चित्र 9में दिखाए गए हैं । मैप किए गए आरएफ का विज़ुअलाइज़ेशन दो प्रयोगों के बीच बहुत समान है और जैव सूचना विश्लेषण पर समान परिणाम मिले हैं।

Figure 9
चित्रा 9। प्राप्त आरएफ का दृश्य जीनोम पर मैप किया गया। इस आंकड़े में वाइल्ड टाइप बी सबटिलिस से प्राप्त आरएफ को चार घंटे बाद स्पोरुलेशन इंडक्शन काटा जाता है और मानक प्रोटोकॉल (WT4-R-s, अपर पैनल) या प्रस्तुत प्रोटोकॉल (WT4-R, लोअर पैनल) के अनुसार तैयार किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

राइबोसोम प्रोफाइलिंग की प्रमुख तकनीकी चुनौती एक विशेष शारीरिक स्थिति में mRNAs पर राइबोसोम्स के स्नैपशॉट पर कब्जा करने के लिए तेजी से अनुवाद को बाधित करने की आवश्यकता है। इसे पूरा करने के लिए, अनुवाद अवरोधकों, तेजी से कटाई और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करना वैकल्पिक है क्योंकि वे कलाकृतियों का कारण बन सकते हैं। क्लोरम्फेनिकोल बैक्टीरियल राइबो-सेक्यू में लम्बी राइबोसोम्स को गिरफ्तार करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली दवा है। हालांकि, यह दीक्षा को नहीं रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप अनुवाद दीक्षा स्थल14के डाउनस्ट्रीम छह कोडन के बारे में राइबोसोम्स का संचय होता है। इसके अलावा, पेप्टिडाइलट्रांसफरेज प्रतिक्रिया को बाधित करने की इसकी क्षमता राइबोसोमल पी-और ए-साइट सब्सट्रेट्स की प्रकृति पर निर्भर हो सकती है। संभवतः, सीएएम ने ग्लाई, अला, सेर, सीड्स, या थ्र केसाथ नवजात पेप्टाइड17,38,50के अंतिम अमीनो एसिड के साथ राइबोसोम्स को अधिक प्रभावी ढंग से गिरफ्तार किया। यह प्रयोगात्मक डिजाइन और जैव सूचना विश्लेषण के दौरान विचाराधीन है, खासकर जब रिबोसोमल रुकेहुए 17का अध्ययन करते हैं। सीएएम को स्टॉप कॉडन रीडथ्रू के माध्यम से और फ्रेमशिफ्टिंग51को बढ़ावा देकर अनुवादात्मक सटीकता को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। फिर भी, कैम अवरोध अपेक्षाकृत तेज है और ठेठ RIBO-seq अनुसंधान14 के लिए पर्याप्त है और गलत निगम५१प्रेरित नहीं करता है । एंटीबायोटिक दवाओं के कारण होने वाली कुछ कलाकृतियों को दवा की मात्रा9में वृद्धि करके टाला जा सकता है । हमारे प्रोटोकॉल में लागू सीएएम एकाग्रताRIBO-seq प्रयोगों7,14,21में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट राशि है, हालांकि, एकाग्रता विभिन्न सूक्ष्मजीवों के लिए भिन्न हो सकती है और नमूना संचयन से पहले अनुकूलित की जानी चाहिए। अनुवाद अवरोधकों को लागू करने के कारण कलाकृतियों की घटना की संभावना के कारण, अनुसंधान प्रश्न के लिए आवश्यक नहीं होने पर अवरोधक उपचार से बचने की सिफारिश की जाती है और यदि तेजी से कटाई संभव है14। फास्ट कोशिकाओं का संग्रह महत्वपूर्ण है, खासकर अगर यह अवरोधक उपचार के बिना किया जाता है, क्योंकि लंबे समय तक कटाई के परिणामस्वरूप पॉलीसोम्स का नुकसान हो सकता है और/या बदलते पर्यावरणीय स्थितियों के जवाब के रूप में ट्रांसलियोम में परिवर्तन हो सकता है14। इस प्रकार, हम एक कटाई विधि के रूप में छानने का उपयोग करने की सलाह देते हैं क्योंकि यह संस्कृति विकास के समान या समान परिस्थितियों में किया जा सकता है, जिसमें तापमान और/या मिलाते हुए शामिल हैं । फिल्टर सतह पर एकत्र छानने कीरण कोशिकाओं के दौरान लगातार विकास माध्यम के साथ निकाल दिया जाता है, उन्हें कोशिका घनत्व, ऑक्सीजन और अमीनो एसिड और अन्य पोषक तत्वों के स्तर में संवेदन बदलाव से बाधित14। निस्पंदन जेंटलर है और अपकेंद्रित्र की तुलना में तेज हो सकता है, यदि संस्कृति का घनत्व मध्यम है, अन्यथा बड़ी संख्या में कोशिकाएं फिल्टर छिद्रों को रोक सकती हैं और प्रक्रिया को धीमा कर सकती हैं। यदि लंबे समय तक छानने की संभावना है, तो हम संस्कृति के क्लोरम्फेनिकोल पूर्व-उपचार की सलाह देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनुवाद गिरफ्तारी होती है और कटाई के समय का विस्तार करने की अनुमति मिलती है। यदि फिल्टर क्लोजिंग के कारण फिल्ट्रेशन को पूरा करना मुश्किल हो जाता है, तो हम फ़िल्ट्रेशन को रोकने, फिल्टर पर एकत्र संस्कृति के अतिरिक्त संस्कृति और फ्लैश फ्रीज अंश को हटाने का सुझाव देते हैं। हमने देखा कि घनी जीवाणु संस्कृति का 50 एमएल RIBO-seq प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है। तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं की बाद में अचानक ठंड 8 ,21,52अनुवाद को तुरंत रोकने के लिए सबसे सार्वभौमिक और प्रभावी दृष्टिकोण है ।

राइबोन्यूलियोलेस पाचन अच्छी गुणवत्ता वाले आरएफ प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण कदम है। सही एंजाइम का चयन महत्वपूर्ण है क्योंकि राइबोसोमल सबयूनिट आरएनए अणुओं से बना होता है जिसे पचाया जा सकता है, राइबोसोम की अखंडता को बाधित करता है, जिससे आरएनए संदूषण होता है और आरएफ44को नष्ट कर देता है। मूल रूप से, RNase मैं eukaryotes1में mRNA और आरएफ पीढ़ी के पाचन के लिए इस्तेमाल किया गया था । चूंकि यह एंजाइम बैक्टीरिया में निष्क्रिय लग रहा था, इसलिए इसे स्टेफिलोकोकस ऑरियस21से माइक्रोकोकल न्यूक्लियज़ (एमएनएई) से बदल दिया गया था। बाद में यह पता चला कि आरएनईई मैं वास्तव में बैक्टीरियल नमूनों का पाचन कर सकता हूं, हालांकि एमएनएसई आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है53। MNase का नुकसान अपनी उत्प्रेरक गतिविधि के अनुक्रम पूर्वाग्रह में निहित है, जो 30 गुना एक या टी के लिए समीपस्थ वृद्धि हुई है, जिसके परिणामस्वरूप 5 ' अंत14में ए या टी के साथ शुरू mRNA टुकड़े के ८०% में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, इस अवलोकन से दूर किया गया है कि लंबाई में अधिकांश भिन्नता आरएफ के 5'-अंत में होती है, और राइबोसोम स्थिति7के बारे में सटीक और सटीक जानकारी 3'-अंत पैदावार के लिए राइबोसोम घनत्व निर्दिष्ट करती है। MNase गतिविधि एंजाइम एकाग्रता, पीएच और पाचन समय से प्रभावित है और प्रत्येक नए MNase बैच के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । एक बढ़ी हुई नाभिक गतिविधि के परिणामस्वरूप आरएनए संदूषण में वृद्धि होती है, जबकि कम गतिविधि राइबोसोमल पैरों के निशान के कम सटीक दरार का कारण बनती है। यह आकार-चयनात्मक जेल शुद्धिकरण प्रक्रिया में आरएफ की समग्र उपज को कम कर सकता है और एमआरएनए14पर राइबोसोम पदों के बारे में कम सटीक जानकारी प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, MNase की आवश्यक राशि ध्यान से निर्धारित किया जाना चाहिए। हमारे प्रयोगों के लिए हम 1 मिलीग्राम आरएनए में 712.5 यू माइक्रोकोकल नाभिक लागू करते हैं जबकि साहित्य में रिपोर्ट की गई एकाग्रता 50 यू38,450 यू34,1000 यू14 और 1500 यू15,21,36 प्रति 1 मिलीग्राम आरएनए के बीच होती है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, एमएनएसई को अपनी गतिविधि के लिए कैल्शियम आयनों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। मानक प्रोटोकॉल EGTA में, डिवेलेंट आयनों के लिए एक चेटिंग एजेंट, जिसमें मैग्नीशियम54की तुलना में कैल्शियम के लिए अधिक आत्मीयता होती है, का उपयोग कैल्शियम को बाध्यकारी और निष्क्रिय एमएनएएस द्वारा पाचन को रोकने के लिए किया जाता है। हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल में नाभिक के साथ इनक्यूबेशन के बाद सीधे आरएनए सफाई किट का उपयोग करके पाचन प्रतिक्रिया बंद कर दी जाती है।

मानक प्रोटोकॉल में, अगला कदम सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन या सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन8,14द्वारा राइबोसोम्स रिकवरी है। एक सुक्रोज रेडिएंट अपकेंद्रित्र उपइकाइट और पॉलीसोम्स से मोनोसोम्स के चयनात्मक पृथक्करण को सक्षम बनाता है, हालांकि इसके लिए एक ढाल मिक्सर और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज जैसे विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस विधि का थ्रूपुट 500-700 माइक्रोन तक सीमित है। दूसरी ओर, सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन सबसे अधिक रिबोसोमल कणों को छर्रों, लिसेट के दर्जन से अधिक मिलीलीटर की प्रसंस्करण में सक्षम बनाता है और आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन के मामले में कम मांग करता है। हालांकि, दोनों दृष्टिकोण लंबे होते हैं क्योंकि वे न्यूनतम 4 से 6.5 घंटे14 लेते हैं और एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज की आवश्यकता होती है। हमारे प्रोटोकॉल में इस कदम को छोड़ दिया जाता है क्योंकि हम सीधे 15% TBE-यूरिया पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में आकार चयन के लिए आगे बढ़ते हैं। आरएनए की माध्यमिक संरचनाओं को प्रकट करने और इंट्रामॉलिकुलर इंटरैक्शन को रोकने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस को विकृत परिस्थितियों में किया जाता है। हम रिबोसोमल पैरों के निशान की एक संकीर्ण श्रृंखला को उत्तेजित करने के लिए मार्कर के रूप में 26 एनटी, 29 एनटी और 32 एनटी ओलिगोनियोटाइड्स का उपयोग करते हैं। हम मानते हैं कि वास्तविक आरएफ की एकाग्रता काफी हद तक झूठी आरएफ के साथ संभावित संदूषण से अधिक है जिसे यादृच्छिक माना जाता है, जो उस सीमा में राइबोसोम एमआरएनए या लंबाई के आरएनए टुकड़ों से असुरक्षित है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणाम वास्तव में चयनित आकार सीमा में आरएफ के समृद्ध अंश दिखाया । फुर्तीला 2100 बायोएनालाइजर के साथ गुणवत्ता की जांच एक एकल के रूप में RIBO-seq पुस्तकालयों से पता चलता है, अच्छी तरह से बैंड और चोटियों को परिभाषित, आरएनए-seq पुस्तकालयों के विपरीत जो काफी व्यापक स्मीयरों और चोटियों(चित्रा 5)के रूप में कल्पना कर रहे हैं । इसके अलावा, प्राप्त रिबो-सेक्यू डेटा ट्रिपल आवधिकता(चित्रा 8A)प्रदर्शित करता है, जो आरएनए-एसईक्यू डेटा(चित्रा 8B)में नहीं देखा जाता है। इसके अलावा, जीनोम पर मैप किए गए प्राप्त आरएफ के दृश्य पदचिह्न अलगाव विधि की परवाह किए बिना बहुत समान अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाते हैं, जिसकी पुष्टि हमारे बायोइन्फॉर्मेटिक्सल विश्लेषण(चित्रा 9)में की गई थी। फिर भी, हम जानते है कि झूठी आरएफ जीनोम जो प्राप्त संकेत परेशान कर सकते है नक्शा सकता है । हालांकि, तथ्य यह है कि झूठी आरएफ बेतरतीब ढंग से उत्पन्न कर रहे है मतलब है कि वे जीनोम पर एक स्थान पर जमा नहीं होना चाहिए और इसलिए, कलाकृतियों और झूठे परिणाम में परिणाम नहीं होना चाहिए । साथ ही, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएफ के आकार के संबंध में जीवाणु अध्ययनों में कोई सर्वसम्मति नहीं है जिसे अलग-थलग किया जाना चाहिए53,55 और केवल लंबाई सीमा के उप-उल्लंघन का चयन करने से परिणामों की गलत व्याख्या हो सकती है। यह सुझाव दिया जाता है कि बैक्टीरियल पैरों के निशान के लिए लंबाई की एक विस्तृत विशेषता एमएनएईई पाचन55के बजाय प्रोकैरियोटिक राइबोसोम व्यवहार का परिणाम है। उदाहरण के लिए, छोटे राइबोसोमल सबयूनिट में 16S rRNA के 3 ' अंत और एमआरएनए में शाइन-दलगर्नो आकृति के बीच पूरक बातचीत के परिणामस्वरूप अब आरएफ56हो सकता है। जीवाणु पैरों के निशान की लंबाई की एक विस्तृत श्रृंखला को ध्यान में रखते हुए, मोहम्मद एट अल। 15 और 40 एनटी17,55के बीच आकार चयन प्रदर्शन करने की सिफारिश . इससे संभावित रूप से आरएफ की एक पूरी श्रृंखला का अलगाव होना चाहिए और ट्रांसलेशनल चक्र के विभिन्न चरणों में राइबोसोम्स का व्यापक प्रतिनिधित्व प्राप्त करना सुनिश्चित करना चाहिए। चल रही चर्चा के कारण, उत्तेजना सीमा पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए और यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि गलत विकल्प आरएफ के कुछ घटाव को बाहर कर सकता है और बाद के विश्लेषण में पूर्वाग्रह का कारण बन सकता है।

नाभिक पाचन के बाद सीधे किए गए आकार चयन के कारण और अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा मोनोसोम अलगाव को छोड़ने के साथ, हमारा प्रोटोकॉल त्वरित, अपेक्षाकृत आसान है और एक मानक प्रयोगशाला उपकरण के साथ आयोजित किया जा सकता है। आरएनए और डीएनए की सफाई के लिए समर्पित किट का उपयोग करना, एमआरएनए और पुस्तकालय की तैयारी का शुद्धिकरण मानकीकरण और पुनरावृत्ति सुनिश्चित करता है। आरएनए की सफाई के दौरान इथेनॉल की अधिक मात्रा को अपट्वीपल करने से <200 एनटी आरएनए के टुकड़े57की शुद्धि दक्षता बढ़ जाती है। पुस्तकालय की तैयारी में संशोधन - इनक्यूबेशन समय का विस्तार और एडाप्टर लिगेशन के दौरान तापमान में वृद्धि - एमथेलेटेड आरएनए के लिए लिगाशन दक्षता को कम करने के लिए लागू किया जाता है, जैसे आरआरएनए, और आरएनए संदूषण58को कम करने के लिए। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न विकास स्थितियों (तैयारी के तहत प्रकाशनों) में अनुवाद विनियमन की जांच करने के लिए किया गया है, लेकिन टीआई का पता लगाने या जीनोम एनोटेशन में सुधार करने और प्रोटेओमिक अध्ययनों की सहायता करने जैसे अनुवाद के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के लिए एक अतिरिक्त संशोधन, अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर, आसानी से शामिल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ब्याज के प्रोटीन या ब्याज के राइबोसोम के आत्मीयता शुद्धिकरण के साथ राइबोसोम को क्रॉसलिंक करना जिसके परिणामस्वरूप राइबोसोम्स के समृद्ध अंश होते हैं। हमारे प्रोटोकॉल के साथ RIBO-seq प्रक्रिया वैज्ञानिकों के लिए अधिक सुलभ है और इस प्रकार, नई खोजों को प्रोत्साहित करने और क्षेत्र में विकास में तेजी लाने के लिए कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एएलएस एम्बो इंस्टॉलेशन ग्रांट आईजी 3914 और पीओआईआर की वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहेगा। 04.04.00-00-3E9C/17-00 यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष के तहत यूरोपीय संघ द्वारा सह-वित्तपोषित पोलिश विज्ञान के लिए फाउंडेशन की पहली टीम कार्यक्रम के भीतर किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

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References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 174
बैक्टीरिया में RIBO-seq: NGS अनुक्रमण के लिए एक नमूना संग्रह और पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल
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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

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