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Biochemistry

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

Abstract

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.

Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.

Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.

Introduction

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) wurde im Labor von Jonathan Weissman an der University of California, San Francisco1entwickelt. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Genexpression auf translationaler Ebene konzentriert sich RIBO-seq auf jede Ribosombindung an mRNA und liefert Informationen über seine Position und die relative Anzahl der Ribosomen auf einem Transkript. Es ermöglicht die Überwachung des Prozesses der Proteinsynthese in vivo und kann eine einzelne Codonauflösung und -genauigkeit liefern, die die Messung der Ribosomendichte sowohl auf der einzelnen mRNA als auch entlang des gesamten Transkriptoms in der Zelle ermöglicht. Grundlage der RIBO-seq-Technik ist die Tatsache, dass das Ribosom während der Translation das mRNA-Molekül bindet und so das vergrabene Fragment des Transkripts vor einer Ribonuklease-Verdauung schützt. Nach Zugabe der Ribonuklease wird die ungeschützte mRNA verdaut und die von Ribosomen eingeschlossenen Fragmente - typischerweise von ~28-30 nt lang - bleiben intakt. Diese Fragmente, die als ribosomale Fußabdrücke (RF) bezeichnet werden, können dann isoliert, sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Erkennung der genauen Position der Ribosomen führt. Tatsächlich wird die Ribosomenfähigkeit zum Schutz von mRNA-Fragmenten seit den 1960er Jahren verwendet, um ribosomale Bindungs- und Translationsinitiierungsstellen (TIS)2,3,4zu untersuchen. Mit dem Fortschritt in der Tiefensequenzierungstechnologie ist RIBO-seq jedoch zu einem Goldstandard für die Translationsüberwachunggeworden 5, der durch das Ribosomengagement genomweite Informationen über die Proteinsynthese liefern kann6. Ribosomenprofilierung füllte die technologische Lücke, die zwischen der Quantifizierung des Transkriptoms und des Proteoms bestand6.

Um ein Ribosomen-Profiling durchzuführen, müssen wir Zelllysat des Organismus erhalten, der unter den untersuchten Bedingungen gewachsen war. Die Störung dieser Bedingungen während der Zellentnahme und -lyse kann unzuverlässige Daten liefern. Um dies zu verhindern, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Zellen können durch kryogenes Mahlen in einem mechanischen Homogenisator wie einer Mischermühle7,8 odereinem Perlenschläger9und durch Trituration durch eine Pipette10 oder mit einer Nadel11lysiert werden. Der Lysepuffer kann kurz vor oder kurz nach der Pulverisierung der Zellen zugegeben werden. In unserem Protokoll verwenden wir flüssigen Stickstoff zur Vorkühlung von Mörtel und Stößel sowie Aluminiumoxid als schonenderen Ansatz zur Störung der bakteriellen Zellwand, was eine RNA-Scherung verhindert, die häufig bei Methoden wie sonifikation auftritt. Nach der Pulverisierung fügen wir dem gekühlten Inhalt des Mörtels einen eiskalten Lysepuffer hinzu. Die Auswahl eines geeigneten Lysepuffers ist wichtig, um die beste Auflösung der ribosomalen Fußabdrücke zu erhalten. Da die Ionenstärke sowohl die HF-Größe als auch die Leserahmengenauigkeit beeinflusst, wird derzeit empfohlen, Lysepuffer mit geringer Ionenstärke und Pufferkapazität zu verwenden, auch wenn es den Anschein hat, dass die Pufferzusammensetzung die ribosomale Belegung auf mRNAs11,12nicht beeinflusst. Wichtige Bestandteile des Lysepuffers sind Magnesiumionen, deren Vorhandensein eine Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten verhindert und spontane Konformationsveränderungen in den bakteriellen Ribosomen hemmt11,13. Calciumionen spielen ebenfalls eine bedeutende Rolle und sind essentiell für die Aktivität der Mikrokokkennuklease (MNase), die in der bakteriellen Ribosomenprofilierungsmethode verwendet wird14. Die Zugabe von Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), einem nicht hydrolysierbaren Analogon von GTP, zusammen mit Chloramphenicol hemmt die Translation während der Lyse15.

Wenn das Lysat erhalten wird, wird es durch Zentrifugation geklärt und in zwei Portionen unterteilt, jeweils für eine RIBO-seq- und eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung (RNA-seq), da sie gleichzeitig durchgeführt werden (Abbildung 1). RNA-seq bietet einen Bezugspunkt, der den Vergleich von Daten sowohl von RIBO-seq als auch von RNA-seq während der Datenanalyse ermöglicht. Das untersuchte Translatom wird durch Normalisierung ribosomaler Fußabdrücke zur mRNA-Häufigkeitdefiniert 16. Daten von RNA-seq können auch helfen, Klon- oder Sequenzierungsartefakte zu identifizieren17.

Figure 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der mRNA-Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq. Für die RIBO-seq-Bibliotheksvorbereitung wird RNA mit MNase (A) verdaut, gefolgt von der Größenauswahl von RF von ~ 28-30 nt Länge (B); für RNA-seq wird RNA isoliert (C), von rRNA (D) erschöpft und die resultierende mRNA wird zufällig in Fragmente unterschiedlicher Länge (E) fragmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die ersten Schritte des Verfahrens der Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq unterscheiden sich geringfügig (Abbildung 1). Für das ribosomale Profiling muss das Lysat durch eine spezifische Endonuklease verdaut werden, um die mRNA-Moleküle abzubauen, die nicht durch die Ribosomen geschützt sind. In Standardprotokollen werden die erhaltenen Monosomen durch eine Saccharosekissen-Ultrazentrifugation oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation8,14zurückgewonnen. In diesem Artikel zeigen wir, dass dieser Schritt nicht notwendig ist, um RF zu isolieren, die für das RIBO-seq in Bakterien erforderlich sind, ebenso für eukaryotische Zellen18, und dass die Größenauswahl der geeigneten mRNA-Fragmente aus dem Polyacrylamid-Gel ausreichend ist.

Für RNA-seq wird mRNA durch die Erschöpfung von rRNA aus der gesamten RNA erhalten - rRNA-Moleküle hybridisieren zu den biotinylierten Oligonukleotidsonden, die an die Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen binden. Die rRNA-Oligonukleotid-Perlenkomplexe werden dann mit einem Magneten aus der Probeentfernt,was zu einer rRNA-erschöpften Probe19,20führt. Die gereinigten mRNA-Moleküle werden dann durch alkalische Hydrolyse zufällig fragmentiert. Die erhaltenen Fragmente der mRNA sowie die ribosomalen Fußabdrücke werden in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und für die Tiefensequenzierung vorbereitet (Abbildung 2). Dies beinhaltet die Reparatur der Enden, die nach der alkalischen Hydrolyse (für mRNA) und der enzymatischen Verdauung (für RF) erforderlich ist: Dephosphorylierung von 3'-Enden, gefolgt von Phosphorylierung von 5'-Enden. Die nächsten Schritte sind die Adapterligatur und die umgekehrte Transkription, um cDNA-Inserts zu erstellen, die von Sequenzen umrahmt werden, die für die Next Generation Sequencing (NGS) mit der Illumina-Plattform erforderlich sind. Die letzte Phase der Bibliotheksvorbereitung ist eine PCR-Reaktion, bei der die Konstrukte amplifiziert und mit probenspezifischen Barcodes markiert werden, um multiplexen und sequenzieren zu können, verschiedene Proben auf einem Kanal zu sequenzieren. Vor der Sequenzierung werden Qualität und Quantität der Bibliotheken durch die hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bewertet. cDNA-Bibliotheken mit entsprechenden Parametern können dann gepoolt und sequenziert werden. Die Sequenzierung kann auf verschiedenen Illumina-Plattformen wie MiSeq, NextSeq oder HighSeq durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Bibliotheken, der erforderlichen Leselänge und der Sequenzierungstiefe. Nach der Sequenzierung wird die bioinformatische Analyse durchgeführt.

Figure 2
Abbildung 2. Bibliotheksvorbereitung. Die Bibliotheksvorbereitung umfasst die Reparatur der Enden, die Ligatur der Adapter, die umgekehrte Transkription und die Verstärkung mit Barcoding. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ribosomenprofilierung ist eine universelle Methode, die sich leicht modifizieren und entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung anpassen lässt. Ursprünglich wurde es in Hefe1verwendet, aber kurz darauf wurde es auf Bakterienzellen21 sowie eukaryotische Modellorganismen wie Maus10,Zebrafisch22,Fruchtfliege23 und Arabidopsis thaliana24aufgetragen. Es wurde auch für die Untersuchung verschiedener Ribosomentypen verwendet: zytoplasmatische, mitochondriale25,26 und Chloroplast27,28. Bei Eukaryoten wird RIBO-seq üblicherweise angepasst und verfeinert, um spezifische Aspekte der Translation zu untersuchen, einschließlich Initiation10,11,29,30,31,32, Dehnung1,10,11,31,33, Ribosomenabwürgen33 und Konformationsänderung33. Die meisten Modifikationen beinhalten die Verwendung verschiedener Translationsinhibitoren. Bei Bakterien waren analoge Studien jedoch aufgrund des Mangels an Inhibitoren mit dem erforderlichen Wirkmechanismus schwierigdurchzuführen 34. Der am häufigsten verwendete Translationsinhibitor in Bakterien ist Chloramphenicol (CAM), das an das Peptidyltransferase-Zentrum (PTC) bindet und eine korrekte Positionierung der Aminoacyl-tRNA in der A-Stelle verhindert. Infolgedessen verhindert CAM die Bildung einer Peptidbindung, die dazu führt, dass die länglichen Ribosomen35blockiert werden. Weitere Beispiele für Translationsinhibitoren in Bakterien sind Tetracyclin (TET)36, Retapamulin (RET)34 und Onc11237, die zur Untersuchung von Translationsinitiierungsstellen verwendet wurden. TET, das die tRNA-Abgabe an das Ribosom verhindert, indem es sich direkt mit der Anticodon-Stammschleife der tRNA an der A-Stelle überschneidet, wurde ursprünglich angewendet, um die Ergebnisse der CAM-Behandlung zu überprüfen, da beide Antibiotika sind, die die Translationsdehnung hemmen38. Es wurde festgestellt, dass TET primäre TIS erkennt, konnte jedoch kein internes TIS36aufdecken. RET bindet im PTC des bakteriellen Ribosoms und verhindert die Bildung der ersten Peptidbindung, indem es mit einer Elongator-Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle interferiert. Die Anwendung von RET führt zu einem Ribosomen-Arrest sowohl bei primären als auch bei internen TISs34. Onc112, ein prolinreiches antimikrobielles Peptid, bindet im Austrittstunnel und blockiert die Aminoacyl-tRNA-Bindung an der ribosomalen A-Stelle. Dadurch verhindert Onc112, dass Initiationskomplexe in die Dehnungsphase37eintreten.

Die Hauptinformation, die das Ribosomen-Profiling liefert, ist die Ribosomendichte und ihre Position auf der mRNA. Es wurde erfolgreich angewendet, um die differentielle Genexpression auf der Ebene der Translation in verschiedenen Wachstumsbedingungen1,6zu untersuchen, die translationale Effizienz1,38,39 zu messen und Translationsregulationsereignisse wie ribosomale Pausierung10zu erkennen. RIBO-seq ermöglicht auch die Aufdeckung der Translation von annotierter ncRNA, Pseudogenen und unangekündigten kleinen offenen Leserahmen (ORF), die zur Identifizierung neuer und/oder sehr kurzer proteinkodierender Gene10,12,22,30,37führen. In solchen Fällen kann RIBO-seq die Genomannotation verfeinern und verbessern. Mit seiner hohen Sensitivität für die Identifizierung übersetzter ORFs und seiner quantitativen Natur kann das Ribosomen-Profiling auch als Proxy für die Proteombestimmung oder zur Unterstützung von Proteomik-Studiendienen 31,34,39. Durch die Kartierung von TIS zeigt das Ribosomen-Profiling N-terminal ausgedehnte und abgeschnittene Isoformen bekannter Proteine10,32. RIBO-seq wurde auch angepasst, um die co-translationale Faltung der Proteine14,21,24zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Dehnungsraten1,10,39 oder Dekodierungsgeschwindigkeiten einzelner Codons6 und hilft bei der Entwicklung quantitativer Modelle der Übersetzung17. Die Ribosomen-Profiling-Methode ist auch in der Lage, mechanistische Einblicke in die Ribosomen-Pause bei Bakterien7,15,17, Frameshifting40, Stop-Codon-Readthrough21, Abschluss- / Recyclingdefekte41,42 und ribosomale Konformationsänderungen33 in Eukaryoten zu liefern. RIBO-seq wurde auch angepasst, um den Einfluss spezifischer trans-wirkender Faktoren auf die Translation wie miRNAs6 und RNA-bindende Proteine in Eukaryoten16,43zuuntersuchen. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass das experimentelle Design und die erhaltene Auflösung von RIBO-seq die Menge an Informationen bestimmen, die aus den resultierenden Sequenzierungsdaten extrahiert werden können12.

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Protocol

1. Probenentnahme

  1. Bereiten Sie eine Bakterienkultur vor. Wir empfehlen ein Kulturvolumen von 100 ml pro Probe.
  2. Vorbereitung von Geräten und Reagenzien für die Probenentnahme: zwei Messlöffel pro Probe, sterile 0,45 μm McE-Filter (Mixed Cellulose esters Membrane), 50 ml sterile Röhrchen, flüssiger Stickstoff, 50 mg/ml Chloramphenicol in 70% (vol/vol) Ethanol (optional). Durchstechen Sie den Deckel von 50-ml-Rohren, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen und die Explosion geschlossener Rohre zu verhindern. Dekontaminieren Sie Scoopulas mit Laborwaschmittel und 70% Ethanol.
  3. Die Filterausrüstung und eine der Schaufeln auf Wachstumstemperatur der Bakterienkultur vorwärmen.
    HINWEIS: Wir empfehlen eine Ganzglasfiltervorrichtung mit Trichter, gestreuter Basis, Geschliffenem Kolben und Federklemme mit 47 mm Ø.
  4. Vor der Probenernte Chloramphenicol in die Bakterienkultur bis zur Endkonzentration von 100 μg/ml geben und 1 Minute inkubieren (optional).
  5. Gießen Sie flüssigen Stickstoff in ein steriles Röhrchen von 50 ml und legen Sie die zweite Schaufel zum Abkühlen in das Röhrchen.
    Vorsicht! Flüssiger Stickstoff kann dazu führen, dass geschlossene Behälter aufgrund der Druckänderung bei der Verdampfung explodieren. Um dies zu verhindern, ist es notwendig, einige Löcher im Deckel von 50-ml-Rohren zu schaffen, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen.
  6. Sammeln Sie Zellen durch Filtration. Stoppen Sie die Filterung, wenn das Medium die Membran passiert hat, aber lassen Sie den Filter nicht vollständig trocknen.
  7. Sammeln Sie Bakterienpellets, indem Sie die Zellen mit einer vorgewarnten Schaufel schnell von der Filterscheibe abkratzen. Legen Sie sofort die gesamte Schaufel mit den geernteten Zellen in das mit flüssigem Stickstoff gefüllte 50-ml-Röhrchen. Das geerntete Pellet sollte vollständig mit flüssigem Stickstoff bedeckt sein.
  8. Lassen Sie das Pellet gründlich einfrieren und entleeren Sie gefrorene Zellen mit einer zuvor abgekühlten zweiten Schaufel. Schließen Sie den durchbohrten Deckel und führen Sie das Rohr auf -80 °C. STOP-Punkt
    HINWEIS: Desinfizieren Sie Die Schaufeln nach jeder Probenernte.

2. Zelllyse

  1. 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNase I und 1,5 ml Reaktionsröhrchen für Lysate vorbereiten und auf Eis halten. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C.
  2. Lysepuffer vorbereiten (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-Mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 und optional 1 mM Chloramphenicol). Aliquotieren Sie 500 μL des Lysepuffers pro Probe in 1,5 ml Reaktionsröhrchen und legen Sie sie auf Eis.
  3. Mörtel und Stößel mit einem Laborwaschmittel und 70% Ethanol dekontaminieren und trocknen. Kühlen Sie Mörser und Stößel, indem Sie flüssigen Stickstoff in den Mörser gießen.
  4. Gefrorenes Pellet in den vorgekühlten Mörtel überführen und zu einem Pulver mahlen. Mit einem Spatel etwa 1 Volumen Aluminiumoxid hinzufügen und weiter schleifen. Halten Sie Mörser, Stößel und Zellen kühl, indem Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff gießen, lassen Sie den Inhalt des Mörtels nicht auftauen.
  5. Kurz vor der Verwendung des Lysepuffers fügen Sie GMP-PNP und DNase I in das Lysepuffer-Aliquot zur Endkonzentration von 2 mM bzw. 100 U/ml hinzu. Die Lösung mit Zellen und Aluminiumoxid in den Mörtel überführen und weiter mahlen. Lassen Sie das Lysat beim Mahlen langsam auftauen und geben Sie das Gemisch in das vorgekühlte 1,5 ml Reaktionsrohr und legen Sie es sofort auf Eis.
  6. Zentrifugenlysate bei 20 000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Überstände in neue, vorgekühlte 1,5 mL Reaktionsröhrchen überführen und auf Eis halten.
  7. Messen Sie die RNA-Konzentration in jeder Probe mit einem NanoDrop. Verwenden Sie 1:10 Verdünnungen von Proben und 1:10 Verdünnung des Lysepuffers in nukleasefreiem Wasser als Rohling.
    HINWEIS: Beachten Sie, dass Chloramphenicol bei 260 nm eine signifikante Absorption zeigt.
  8. Teilen Sie jedes Lysat in zwei Portionen: eine für RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) und die zweite für RNA-seq (der Rest).
  9. Reinigen Sie die Proben für RNA-seq mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Zymo RNA Clean & Concentrate -25 Kit (siehe Materialtabelle). Wir empfehlen auch, 4,5 Volumen Ethanol (im Vergleich zum Probenvolumen) in die Mischung aus Probe und Bindungspuffer für ribosomale Fußabdrücke und fragmentierte mRNA zu geben, um die Reinigungseffizienz von kurzen RNA-Fragmenten zu erhöhen.
  10. Lagern Sie die für RNA-seq vorgesehenen Proben bei -80 °C. Das Verfahren für RNA-seq wird ab Schritt 5 fortgesetzt.

3. MNase-Aufschluss von Proben für RIBO-seq

  1. Zu 1 mg RNA werden 3,8 μL 187,5 U/μL MNase in 10 mM Tris pH 8 addiert und mit Lysepuffer auf das Gesamtvolumen von 500 μL aufgeladen.
  2. Bei 25 °C, 300 U/min, 45 Minuten in einem Thermomixer inkubieren.
  3. Reinigen Sie die Proben mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit (wie in Schritt 2.9).
  4. Lagern Sie die Proben für RIBO-seq bei -80 °C (STOP-Punkt) oder fahren Sie mit der Größenauswahl fort.

4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Größenauswahl der Proben für RIBO-seq

  1. Bereiten Sie ein 15% Polyacrylamid-FSME-Gel mit 8 M Harnstoff vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 V vorlaufen.
  2. Proben mit TBE-Urea Sample Buffer mischen, bei 95 °C für 1 Minute denaturieren und sofort auf Eis legen.
  3. Waschen Sie den Harnstoff aus, indem Sie TSME-Puffer mit einer Spritze in Gelbrunnen injizieren. Laden Sie die Proben und lassen Sie einen Vertiefungsraum zwischen ihnen, um jede Probe zu trennen und Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie 29 nt Oligonukleotid und eine Mischung aus 26 nt und 32 nt Oligonukleotiden als Marker. Führen Sie die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 180 V durch.
  4. Bereiten Sie einen sterilen Puffer für die Inkubation über Nacht vor (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Nach der Elektrophorese das Gel in einem SYBR Gold-Bad ca. 2-3 Minuten einfärben und das Gel mit nukleasefreiem Wasser abspülen.
  6. Schneiden Sie Gelfragmente zwischen 26 und 32 nt mit den sterilen Nadeln oder den Rasierklingen heraus und legen Sie die Gelfragmente in separate 1,5 ml Röhrchen für jede Probe. Wechseln Sie die Nadel oder die Rasierklinge zwischen den Proben.
  7. Fügen Sie 200 μL des Nachtinkubationspuffers zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu.
  8. Inkubieren Sie die Proben bei 10 °C, 1000 U/min über Nacht in einem Thermomixer.
  9. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag wie in Schritt 2.9. Eluierten Sie die Fußabdrücke in 80 μL nukleasefreiem Wasser.
  10. Lagern Sie die Proben bei -80 °C. STOP-Punkt. Das Verfahren für RIBO-seq wird ab Schritt 7 fortgesetzt.

5. Aufreinigung bakterieller mRNA durch rRNA-Depletion aus Proben für RNA-seq

  1. Entfernen Sie rRNA aus Proben mit einem bakteriellen mRNA-Reinigungskit (z. B. Invitrogen MICROBExpress). Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.
  2. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9. Eluierten Sie die mRNA in 50 μL nukleasefreiem Wasser.
  3. Lagern Sie die Proben für RNA-seq bei -80 °C (STOP-Punkt) oder setzen Sie die alkalische Fragmentierung fort.

6. Alkalische Fragmentierung von Proben für RNA-seq

  1. Herstellung eines alkalischen Hydrolysepuffers (Mischung 220 μL 0,1 M NaHCO3, 30 μL 0,1 MNa2CO3 und 1 μL 0,5 M EDTA). 1 Volumen (50 μL) alkalischer Puffer mit 1 Volumen (50 μL) der Probe mischen und bei 95 °C 25 Minuten lang inkubieren.
  2. Fügen Sie 5 μL von 3 M NaOAc pH 5,5 hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
  3. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9 und eluierten Sie die Proben in 80 μL nukleasefreiem Wasser.
  4. Möglicher STOP-Punkt: RNA-seq-Proben bei -80 °C lagern. Wir empfehlen jedoch, direkt zu Schritt 7 überzugehen, um unnötiges Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

7. Dephosphorylierung und Phosphorylierung von Proben für RNA- und RIBO-seq

  1. Jeder Probe werden 10 μL 10x Reaktionspuffer PNK und 5 μL T4 PNK zugefügtem PNK zu. 1,5 Stunden bei 37 °C inkubieren, um die 3'-Enden zu entphosphorylatieren.
  2. Fügen Sie 3 μL von 1 mM ATP hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde, um die 5'-Enden zu phosphorylatieren.
  3. Reinigen Sie die Proben wie in Schritt 2.9, eluierten Sie sie in 30 μL nukleasefreiem Wasser.
  4. Lagern Sie die Proben bei -80 °C. STOP-Punkt.

8. Bibliotheksvorbereitung mit NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina

  1. Bereiten Sie 100-1000 ng Input-RNA (erhaltene mRNA-Fragmente und ribosomale Fußabdrücke) in 6 μL nukleasefreiem Wasser vor und fügen Sie 1 μL 3'-SR-Adapter hinzu. Inkubieren Sie nach dem Protokoll des Herstellers.
  2. Fügen Sie 10 μL 3' Ligation Reaction Buffer (2X) und 3 μL 3' Ligation Enzyme Mix hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 2,5 Stunden, anstatt 1 Stunde bei 25 °C, wie im Protokoll des Herstellers angegeben.
  3. Hybridisieren Sie den Reverse Transcription Primer nach dem Protokoll des Herstellers mit einem modifizierten Programm: 5 Minuten bei 75 °C, 30 Minuten bei 37 °C und halten Sie bei 4 °C.
  4. Ligatieren Sie den 5'-SR-Adapter. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers mit einer Änderung: Führen Sie die Inkubation bei 37 °C für 2,5 Stunden statt 1 Stunde bei 25 °C durch.
  5. Führen Sie die Reverse Transkription gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
  6. Möglicher STOP-Punkt: Inkubieren Sie die Proben, die synthetisierte cDNAs enthalten, bei 70 °C für 15 Minuten, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren und bei -80 °C zu lagern. Wir empfehlen jedoch, direkt mit den nächsten Schritten fortzufahren, um unnötiges Einfrieren und Auftauen der Proben zu vermeiden.
  7. Speichern Sie die Hälfte jeder cDNA-Bibliothek bei -80 °C als Backup.
  8. Führen Sie eine PCR-Amplifikation gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Verwenden Sie die Hälfte der Reaktionsmischung. Lagern Sie die erhaltenen Bibliotheken bei -80 °C. STOP-Punkt.

9. Größenauswahl von cDNA-Bibliotheken mit PAGE

  1. Bereiten Sie 6% Polyacrylamid-FSME-Gel vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 V vorlaufen.
  2. Mischen Sie die Proben mit Gel Loading Dye, Blue (6X) und laden Sie sie auf das Gel. Verwenden Sie Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest als Leiter. Führen Sie zu Beginn die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 120 V durch, damit DNA in das Gel eindringen kann, und ändern Sie dann die Spannung auf 180 V.
  3. Wenn die Elektrophorese beendet ist, färben Sie das Gel in einem SYBR Gold-Bad für ca. 2-3 Minuten und spülen Sie das Gel mit nukleasefreiem Wasser ab.
  4. Verbrauchen Sie Gelfragmente, die die Bibliotheken enthalten. Für RNA-seq-Proben verbrauchen sie zwischen 135-180 nt und für RIBO-seq zwischen 135-170 nt. Verwenden Sie eine sterile Nadel oder Rasierklinge und legen Sie die herausgeschnittenen Gelfragmente in separate 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Denken Sie daran, die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben zu wechseln.
    HINWEIS: Die Adapter und der Barcode von NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina haben insgesamt 119 nt, was den unteren Exzisionsschnitt bestimmt.
  5. Fügen Sie 100 μL nukleasefreies Wasser zu jedem herausgeschnittenen Gelfragment hinzu.
  6. Inkubieren Sie die Gelfragmente bei 10 °C, 450 U/min über Nacht in einem Thermomixer.
  7. Reinigen und konzentrieren Sie die cDNA-Bibliotheken mit einem kommerziellen DNA-Clean-up-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung des Zymo DNA Clean & Concentrate -5 Kits (siehe Materialtabelle).
  8. Lagern Sie gereinigte cDNA-Bibliotheken bei -80 °C. STOP-Punkt.

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Representative Results

Die hier vorgestellten exemplarischen Ergebnisse wurden in einer Studie zur Translationsregulation in sporulierenden WT Bacillus subtilis Zellen erzielt. Über Nachtkulturen wurden auf OD600 entsprechend 0,1 in 100 ml reichhaltigem Medium verdünnt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis OD600 0,5-0,6 erreichte. Das reichhaltige Medium wurde dann durch minimales Medium ersetzt, um den Sporulationsprozess zu induzieren, und die Inkubation wurde für bis zu vier Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden stündlich geerntet, beginnend mit T0 - Sporulationsinduktion - was zu fünf Zeitpunkten führte. Eine Minute vor der Ernte wurden die Kulturen mit Chloramphenicol behandelt, wie im obigen Protokoll beschrieben. Die Zellen wurden durch Filtration in einem vorgewärmten Glasfiltrationssystem mit 0,45 μm McE-Filtern (Mixed Cellulose Esters Membrane) gesammelt und in flüssigem Stickstoff flashgefroren.

Die Menge an Ribonukleinsäure, die im Lysat erhalten wird, hängt von den Wachstumsbedingungen, dem Kulturvolumen und der Dichte ab. Nach unserem Protokoll ergeben 100 ml der Bakterienkultur (Bacillus subtilis) durchschnittlich 1-4 mg RNA. Beispiele für Lysate, die aus dem oben beschriebenen Versuch gewonnen wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt.

RNA-Konzentration [ng/μL] RNA-Menge [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tabelle 1. RNA-Konzentration und -Menge in repräsentativen Proben von B. subtilis-Lysaten. Die Tabelle enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und eine Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden. Die Lyse wurde mit 550 μL Chloramphenicol enthaltenden Lysepuffer durchgeführt. Es kann festgestellt werden, dass mit der Sporulation die Menge der erhaltenen RNA abnimmt.

Wenn die Menge an RNA niedriger als 1 mg ist, werden 0,25 mg RNA für RIBO-seq anstelle von 1-0,5 mg verwendet und die Menge an MNase wird dann entsprechend angepasst. Die repräsentative RNA-Menge und -Konzentration nach der Nuklease-Verdauung ist in Tabelle 2 dargestellt. Die durchschnittliche Menge an RNA nach Verdauung und Reinigung beträgt 50 μg von 0,5 mg RNA-Input.

RNA-Konzentration [ng/μL] RNA-Menge [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tabelle 2. Die Menge und Konzentration der RNA nach der Nuklease-Verdauung der repräsentativen Proben für RIBO-seq. Die Tabelle enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und einer Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf Proben für RIBO-seq. Da die RNA-Konzentration der WT4-R-Probe niedrig war, wurden 0,25 mg RNA verdaut, während 0,5 mg der RNA für die verbleibenden Proben zur ribosomalen Fußabdruckgenerierung verwendet wurden. Die Menge an MNase für die Verdauung betrug 178,125 U für 0,25 mg RNA in WT4-R und 356,25 U für 0,5 mg RNA in anderen Proben. Nach der Verdauung wurden die Proben mit dem kommerziellen RNA-Clean-up-Kit gereinigt und die Ribonukleinsäurekonzentration mit dem NanoDrop gemessen.

Nach der MNase-Verdauung erfolgt die Größenauswahl mit Hilfe von PAGE. Ein Beispiel für ein 15%iges TSME-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel mit den verdauten Proben ist in Abbildung 3 dargestellt. Gelfragmente zwischen 26 und 32 nt wurden mit einer sterilen Rasierklinge herausgeschnitten und über Nacht im Nachtinkubationspuffer inkubiert. Am nächsten Tag wurden ribosomale Fußabdrücke mit dem kommerziellen RNA-Clean-up-Kit gereinigt.

Figure 3
Abbildung 3. 15% FSME-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel mit repräsentativen Proben nach MNase-Aufschluss. Die Abbildung umfasst Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und einer Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf Proben für RIBO-seq. 15 μL denaturierte Proben wurden in die Gel-Wells geladen, in der Reihenfolge: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R und das verbleibende Volumen wurde bei -80 °C als Backup gelagert. Als Marker wurden 29 nt Oligonukleotid und eine Mischung aus 26 nt und 32 nt Oligonukleotiden verwendet. Die Elektrophorese wurde wie oben beschrieben durchgeführt und das Gel in einem SYBR Gold-Bad gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Parallel zur Nuklease-Verdauung wurden die Lysate für RNA-seq mit dem kommerziellen RNA-Clean-up-Kit gereinigt und die erhaltenen RNA-Konzentrationen mit NanoDrop gemessen. Die repräsentativen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Nach der Reinigung sank die Menge an Ribonukleinsäure auf 40-500 μg.

RNA-Konzentration [ng/μL] RNA-Menge [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabelle 3. RNA-Menge und Konzentration der Proben für RNA-seq nach RNA-Aufreinigung. Die Tabelle enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und einer Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "m" bezieht sich auf Proben für RNA-seq (mRNA).

Die erhaltenen RNA-Konzentrationen der Proben für RNA-seq wurden verwendet, um den RNA-Input für die rRNA-Depletion zu definieren. 8 μg RNA aus jeder RNA-seq-Probe wurden mit dem microBExpress bakteriellen mRNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle)gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet und anschließend mit dem kommerziellen RNA-Reinigungskit gereinigt. Die repräsentativen Ergebnisse der rRNA-Depletion sind in Tabelle 4 dargestellt.

RNA-Konzentration [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA-Menge [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabelle 4. Die repräsentative RNA-Menge und -Konzentration nach rRNA-Depletion. Die Tabelle enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und einer Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "m" bezieht sich auf Proben für RNA-seq. 8 μg RNA aus Proben für RNA-seq wurden für die rRNA-Depletion verwendet und anschließend mit einem kommerziellen RNA-Clean-up-Kit gereinigt.

Als nächstes wurde die erhaltene mRNA durch alkalische Hydrolyse fragmentiert und mit einem kommerziellen Kit wie im Protokoll beschrieben gereinigt. Die fragmentierten mRNA- und ribosomalen Fußabdrücke wurden an 3'-Enden dephosphoryliert und an 5'-Enden gemäß dem obigen Protokoll phosphoryliert. Die Proben wurden dann verwendet, um cDNA-Bibliotheken für die Illumina-Sequenzierung zu erstellen, wie im Protokoll beschrieben. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für ein 6%iges Polyacrylamidgel mit den erhaltenen Bibliotheken. Gelfragmente im Bereich von 135-180 nt für RNA-seq und 135-170 nt für RIBO-seq wurden mit sterilen Rasierklingen herausgeschnitten und über Nacht in nukleasefreiem Wasser inkubiert. Bibliotheken wurden mit einem kommerziellen DNA-Reinigungskit gereinigt und Qualität und Quantität wurden durch eine hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer bewertet.

Figure 4
Abbildung 4. 6% Polyacrylamid-Gel von cDNA-Bibliotheken vor und nach der Größenauswahl. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest wurde als Leiter verwendet. 25 μL Proben wurden in der folgenden Reihenfolge in das Gel geladen: drei RIBO-seq-Bibliotheken und sechs RNA-seq-Bibliotheken. Die restlichen Probenmengen wurden als Backup bei -80 °C gelagert. Die Abbildung enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die eine Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf Proben für RIBO-seq und der Buchstabe "m" bezieht sich auf Proben für RNA-seq. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Beispiele für virtuelle Gelbilder und Elektropherogramme, die mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer erhalten wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Bänder und Peaks, die die RIBO-seq-Bibliotheken repräsentieren, sind enger und besser definiert als diese, die RNA-seq-Bibliotheken darstellen. Laut der On-Chip-Elektrophorese sind Bibliotheken etwa 150 bp lang, was einer erwarteten Bibliotheksgröße entspricht. Die Adapter und der Barcode, die bei der Bibliotheksvorbereitung verwendet werden, sind 119 nt lang und die Einsätze sind entweder 29-30 nt lang (für RIBO-seq) oder in einem Bereich zwischen 25 und 50 nt (für RNA-seq). Die zusätzlichen Peaks, die näher an den 200 bp aus RIBO-seq-Bibliotheken liegen, können auf PCR-Artefakte hinweisen, die während der bioinformatischen Analyse verworfen werden können, wenn die aus der Sequenzierung gewonnenen Daten getrimmt und rRNA/tRNA gefiltert werden. Die durchschnittliche Menge an DNA beträgt 32 ng, was eine ausreichende Menge an Material liefert, die für die Sequenzierung der nächsten Generation benötigt wird.

Figure 5
Abbildung 5. Die Beispiele für Elektropherogramme und virtuelle Gelbilder aus einer hochempfindlichen DNA-On-Chip-Elektrophorese. Die Abbildung umfasst Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und einer Stunde (1), zwei (2), drei (3) oder vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf RIBO-seq-Bibliotheken und der Buchstabe "m" bezieht sich auf RNA-seq-Bibliotheken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nach der Qualitätskontrolle durch die On-Chip-Elektrophorese wurden Bibliotheken für die Single-End-50-bp-Sequenzierung auf der NextSeq500-Plattform von Illumina (10 Bibliotheken pro Kanal mit mindestens 350 Mio. Lesevorgängen pro Kanal) gebündelt. Die Sequenzierung ergab 30-57 Millionen Lesevorgänge pro Probe für RNA-seq-Bibliotheken und 30-50 Millionen Lesevorgänge pro Probe für RIBO-seq-Bibliotheken. Das Trimmen der Adapter und die Sequenzen von schlechter Qualität führten zu 24-47 Mio. Lesevorgängen pro Probe für RNA-seq-Proben und 25-50 Mio. Lesevorgängen pro Probe für RIBO-seq-Proben. Die kartierung, die mit STAR44durchgeführt wurde, ergab 2,4-9,6 Millionen eindeutig kartierte Lesevorgänge pro Probe für RNA-seq-Proben (die 8-16,8% der Gesamtzahl der Lesevorgänge ausmachen) und 2,3-10,4 Millionen eindeutig kartierte Lesevorgänge (7,7-22,1%) für RIBO-seq Proben. Die gewonnenen Daten wurden mit FastQC45qualitätskontrolliert. Beispiele für die von FastQC erzeugten Qualitätsdiagramme für die getrimmten Sequenzen sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Sequenzen der interessierenden Länge, die <32 nt für RIBO-seq und <50 nt für RNA-seq beträgt, wiesen eine sehr gute Qualität auf. Die Beispiele für Diagramme des GC-Inhalts und Verteilungen von Sequenzlängen über alle getrimmten Sequenzen sind in Abbildung 7 dargestellt. Der zusätzliche Peak bei 72% im GC-Verteilungsdiagramm der RIBO-seq-Bibliothek kann möglicherweise auf eine rRNA-Kontamination hinweisen, die während der bioinformatischen Analyse durch rRNA-Filtration46,47,48entfernt werden kann . Die Verteilung der Sequenzlängen ist für RIBO-seq-Bibliotheken sehr eng, mit einem Peak bei 26-27 nt, während die Längenverteilung für RNA-seq-Bibliotheken breiter ist und zwischen 15 und 50 nt liegt.

Figure 6
Abbildung 6. Die Beispiele für Box-and-Whisker-Plots von Qualitätsbewertungen über alle Basen für RIBO-seq- und RNA-seq-Bibliotheken nach dem Trimmen. Die Abbildung enthält Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vor der Sporulationsinduktion (0) und vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf RIBO-seq-Proben und der Buchstabe "m" bezieht sich auf RNA-seq-Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7. Die Beispiele für Diagramme des GC-Inhalts und der Sequenzlängenverteilung aller Sequenzen für RIBO-seq- und RNA-seq-Bibliotheken nach dem Trimmen. Die Abbildung zeigt Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die vier (4) Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf Probe für RIBO-seq und der Buchstabe "m" bezieht sich auf Probe für RNA-seq. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu überprüfen, ob die RIBO-seq-Daten Informationen über echte ribosomale Fußabdrücke und nicht über zufällige mRNA-Fragmente der ausgewählten Länge liefern, verglichen wir Sequenzierungsdaten von RIBO-seq und RNA-seq mit RiboToolkit, einem Webserver für RIBO-seq-Datenanalyse49. Ribo-seq-Daten zeigen eine Triplett-Periodizität und einen hohen, schmalen Peak, der den initiierenden Ribosomen entspricht und für die RF charakteristisch ist, wie in Abbildung 8Agezeigt, was in den RNA-seq-Daten nicht beobachtet wird (Abbildung 8B). Darüber hinaus zeigte das Metagendiagramm, das die Profile der durchschnittlichen Abdeckung von HF- und mRNA-Fragmenten auf den kodierenden Sequenzen (CDS) zeigt, wie erwartet einen höheren Anteil an Lesevorgängen, die den CDSs im RIBO-seq-Datensatz zugeordnet sind (Abbildung 8C).

Figure 8
Abbildung 8. Metagenperiodizitätsdiagramme und durchschnittliche Abdeckung von RF- und mRNA-Fragmenten auf CDSs. Metagenprofile wurden mit RiboToolkit, einem integrierten Webserver49,erhalten. Die CDS-Länge wurde auf einen Wert von 1 normalisiert und jedes CDS wurde in 100 gleiche Behälter unterteilt. Die Abbildung zeigt Proben des Wildtyps (WT) B. subtilis, die eine (1) Stunde nach Sporulationsinduktion geerntet wurden; der Buchstabe "R" bezieht sich auf Probe für RIBO-seq und der Buchstabe "m" bezieht sich auf Probe für RNA-seq. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu vergleichen, ob das hier vorgestellte RIBO-seq-Protokoll ähnliche Ergebnisse liefert wie die Standardmethode der HF-Wiederherstellung (Saccharosegradient-Ultrazentrifugation), haben wir die Sequenzierungsergebnisse aus Bibliotheken, die nach den beiden Methoden erstellt wurden, paralleliert. Die Experimente zur Untersuchung der Translationsregulation während der Sporulation im WT B. subtilis wurden nach dem vorgestellten RIBO-seq-Protokoll sowie nach dem Standardprotokoll durchgeführt, das die Monosomenrückgewinnung durch eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation beinhaltet. Die Ergebnisse der Ribosomen-Abdeckungsprofile, die aus den beiden Experimenten gewonnen wurden, sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Visualisierung von kartierten RFs ist zwischen den beiden Experimenten sehr ähnlich und ergab ähnliche Ergebnisse bei bioinformatischer Analyse.

Figure 9
Abbildung 9. Die Visualisierung der erhaltenen RF, die auf das Genom abgebildet ist. Die Abbildung umfasst RF, die aus wilden Typ B. subtilis gewonnen werden, die vier Stunden nach der Sporulationsinduktion geerntet und nach dem Standardprotokoll (WT4-R-s, obere Platte) oder dem vorgestellten Protokoll (WT4-R, untere Platte) hergestellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die wichtigste technische Herausforderung des Ribosomen-Profilings besteht in der Notwendigkeit, die Translation schnell zu hemmen, um eine Momentaufnahme von Ribosomen auf mRNAs in einem bestimmten physiologischen Zustand von Interesse zu erfassen. Um dies zu erreichen, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Die Anwendung von Antibiotika ist optional, da sie Artefakte verursachen können. Chloramphenicol ist ein häufig verwendetes Medikament, um längliche Ribosomen in bakteriellem RIBO-seq zu verhaften. Es verhindert jedoch nicht die Initiation, was zu einer Ansammlung von Ribosomen etwa sechs Codons nach der Translationsinitiierungsstelle14führt. Darüber hinaus kann seine Fähigkeit, die Peptidyltransferase-Reaktion zu hemmen, von der Art der ribosomalen P- und A-Site-Substrate abhängen. Vermutlich hält CAM Ribosomen effektiver mit Gly, Ala, Ser, Cys oder Thr als vorletzte Aminosäure des entstehenden Peptids17,38,50fest. Dies ist es wert, während des experimentellen Designs und der bioinformatischen Analyse berücksichtigt zu werden, insbesondere bei der Untersuchung der ribosomalen Pause17. Es wurde auch gezeigt, dass CAM die Translationsgenauigkeit beeinflusst, indem es ein Stop-Codon-Lesen und Frameshifting51fördert. Dennoch ist die CAM-Hemmung relativ schnell und ausreichend für die typische RIBO-seq-Forschung14 und induziert keine Fehleingliederung51. Einige der artefakte, die durch Antibiotika verursacht werden, können vermieden werden, indem die Arzneimittelmenge erhöht wird9. Die in unserem Protokoll verwendete CAM-Konzentration ist die typische Menge, die in RIBO-seq-Experimenten7,14,21verwendet wird, jedoch kann die Konzentration für verschiedene Mikroorganismen variieren und sollte vor der Probenernte optimiert werden. Aufgrund der Möglichkeit des Auftretens von Artefakten, die durch die Anwendung von Translationsinhibitoren verursacht werden, wird empfohlen, die Inhibitorbehandlung zu vermeiden, wenn dies für die Forschungsfrage nicht erforderlich ist und wenn die schnelle Ernte möglich ist14. Eine schnelle Zellentnahme ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere wenn sie ohne die Inhibitorbehandlung durchgeführt wird, da eine längere Ernte zu einem Verlust von Polysomen und/oder einer Veränderung des Translatoms als Reaktion auf die sich ändernden Umweltbedingungen führen kann14. Daher empfehlen wir, die Filtration als Erntemethode zu verwenden, da sie unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen wie das Kulturwachstum durchgeführt werden kann, einschließlich Temperatur und / oder Schütteln. Während der Filtration werden die an der Filteroberfläche gesammelten Zellen ständig mit Wachstumsmedium gespült, wodurch sie daran gehindert werden, Verschiebungen der Zelldichte, der Sauerstoffversorgung und des Gehalts an Aminosäuren und anderen Nährstoffen zu erfassen14. Die Filtration ist schonender und kann schneller sein als die Zentrifugation, wenn die Dichte der Kultur moderat ist, da sonst eine große Anzahl von Zellen die Filterporen verstopfen und den Prozess verlangsamen kann. Wenn die Wahrscheinlichkeit einer längeren Filtration besteht, empfehlen wir eine Chloramphenicol-Vorbehandlung der Kultur, die zu einem Translationsarrest führt und eine Verlängerung der Erntezeit ermöglicht. Wenn die Filtration aufgrund der Filterverstopfung schwierig zu vervollständigen ist, empfehlen wir, die Filtration zu stoppen, die überschüssige Kultur zu entfernen und den Anteil der auf dem Filter gesammelten Kultur zu flashen. Wir beobachteten, dass 50 ml dichte Bakterienkultur ausreichen, um RIBO-seq durchzuführen. Das anschließende Flash-Einfrieren von Zellen in flüssigem Stickstoff ist der universellste und effektivste Ansatz, um die Translation sofort zu stoppen8,21,52.

Die Auswahl des richtigen Enzyms ist wichtig, da die ribosomalen Untereinheiten aus RNA-Molekülen bestehen, die verdaut werden können, wodurch die Integrität des Ribosoms gestört wird, eine rRNA-Kontamination verursacht und RF44zerstört wird. Ursprünglich wurde RNase I zur Verdauung von mRNA und RF-Erzeugung in Eukaryoten1verwendet. Da dieses Enzym in Bakterien inaktiv schien, wurde es durch eine Mikrokokkennuklease (MNase) aus Staphylococcus aureus21ersetzt. Es wurde später gezeigt, dass RNAse I tatsächlich den Aufschluss von Bakterienproben durchführen kann, aber MNase bleibt für diesen Zweck üblich53. Der Nachteil von MNase liegt in der Sequenzverzerrung ihrer katalytischen Aktivität, die 30-fach erhöht proximal zu A oder T ist, was zu 80% der mRNA-Fragmente führt, die mit A oder T am 5′-Ende14beginnen. Dies wurde jedoch durch die Beobachtung überwunden, dass die meisten Längenunterschiede am 5′-Ende der RF auftreten und die Zuordnung der Ribosomendichte zum 3′-Ende genaue und genaue Informationen über die Ribosomenposition7liefert. Die MNase-Aktivität wird durch die Enzymkonzentration, den pH-Wert und die Verdauungszeit beeinflusst und sollte für jede neue MNase-Charge bestimmt werden. Eine erhöhte Nukleaseaktivität führt zu einer erhöhten rRNA-Kontamination, während eine verminderte Aktivität zu einer weniger genauen Spaltung der ribosomalen Fußabdrücke führt. Dies kann die Gesamtausbeute von RF im größenselektiven Gelreinigungsverfahren verringern und weniger genaue Informationen über Ribosomenpositionen auf mRNA14liefern. Daher sollte die erforderliche Menge an MNase sorgfältig bestimmt werden. Für unsere Experimente wenden wir 712,5 U Mikrokokkennuklease pro 1 mg RNAan,während die in der Literatur berichtete Konzentration zwischen 50 U38,450 U34,1000U14 und 1500 U15,21,36 pro 1 mg RNA variiert. Wie oben erwähnt, benötigt MNase das Vorhandensein von Kalziumionen für seine Aktivität. In Standardprotokollen wird EGTA, ein Chelatbildner für zweiwertige Ionen, der im Vergleich zu Magnesium54eine höhere Affinität zu Kalzium aufweist, verwendet, um die Verdauung durch Bindung von Kalzium und Inaktivierung von MNase zu stoppen. In unserem Protokoll wird die Verdauungsreaktion jedoch durch die Verwendung eines RNA-Reinigungskits direkt nach der Inkubation mit der Nuklease gestoppt.

In Standardprotokollen ist der nächste Schritt die Ribosomenrückgewinnung durch eine Saccharosekissen-Ultrazentrifugation oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation8,14. Eine Saccharosegradientenzentrifugation ermöglicht die selektive Trennung der Monosomen von den Untereinheiten und Polysomen, erfordert jedoch spezielle Geräte wie einen Gradientenmischer und eine Ultrazentrifuge. Auch der Durchsatz dieser Methode ist auf 500-700 μL des Lysats begrenzt. Auf der anderen Seite polstert Saccharose-Ultrazentrifugationspellets die meisten ribosomalen Partikel, ermöglicht die Verarbeitung von über einem Dutzend Milliliter Lysat und ist weniger anspruchsvoll in Bezug auf die erforderliche Instrumentierung. Beide Ansätze sind jedoch langwierig, da sie mindestens 4 bis 6,5 Stunden14 dauern und eine Ultrazentrifuge erfordern. In unserem Protokoll wird dieser Schritt weggelassen, da wir direkt zur Größenauswahl in 15% TSME-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel übergehen. Die Elektrophorese wird unter denaturierungsbedingungen durchgeführt, um die Sekundärstrukturen der RNA zu entfalten und intramolekulare Wechselwirkungen zu verhindern. Wir verwenden 26 nt, 29 nt und 32 nt Oligonukleotide als Marker für die Entfernung eines engen Bereichs von ribosomalen Fußabdrücken. Wir gehen davon aus, dass die Konzentration des tatsächlichen RF die potenzielle Kontamination mit falscher RF, die als zufällig angesehen wird, deutlich übersteigt, ungeschützt durch die Ribosomen-mRNA- oder rRNA-Fragmente der Länge in diesem Bereich. Die ergebnisse, die mit unserem Protokoll erzielt wurden, zeigten tatsächlich einen angereicherten Anteil der HF im ausgewählten Größenbereich. Die Qualitätsprüfung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer zeigt RIBO-seq-Bibliotheken als einzelne, gut definierte Bänder und Peaks, im Gegensatz zu RNA-seq-Bibliotheken, die als deutlich breitere Abstriche und Peaks visualisiert werden (Abbildung 5). Auch erhaltene Ribo-seq-Daten weisen eine Triplett-Periodizität auf (Abbildung 8A), die in den RNA-seq-Daten nicht beobachtet wird (Abbildung 8B). Darüber hinaus zeigen die Visualisierungen der erhaltenen RF, die auf das Genom abgebildet sind, sehr ähnliche Expressionsmuster, unabhängig von der Footprint-Isolationsmethode, die in unseren bioinformatischen Analysen weiter bestätigt wurde (Abbildung 9). Dennoch sind wir uns bewusst, dass falsche RF dem Genom zugeordnet werden könnte, was das erhaltene Signal stören könnte. Die Tatsache, dass falsche RF zufällig generiert werden, impliziert jedoch, dass sie sich nicht an einer Stelle im Genom ansammeln sollten und daher nicht zu Artefakten und falschen Ergebnissen führen sollten. Es muss auch beachtet werden, dass es in Bakteriellen Studien keinen Konsens über die Größe von RFs gibt, die isoliert werdensollten53,55 und dass die Auswahl nur eines Unterfraktions des Längenbereichs zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen kann17. Es wird vermutet, dass eine breite Palette von Längen, die für bakterielle Fußabdrücke charakteristisch sind, eher eine Folge des prokaryotischen Ribosomenverhaltens als der MNase-Verdauung ist55. Zum Beispiel kann eine komplementäre Interaktion zwischen dem 3′-Ende der 16S-rRNA in einer kleinen ribosomalen Untereinheit und einem Shine-Dalgarno-Motiv in mRNA zu längeren RF56führen. Unter Berücksichtigung einer Breiten von Längen von bakteriellen Fußabdrücken, Mohammad et al. empfehlen, eine Größenauswahl zwischen 15 und 40 nt17,55durchzuführen. Dies sollte zur Isolierung einer möglicherweise ganzen Reihe von RFs führen und eine umfassende Darstellung von Ribosomen in verschiedenen Stadien des Translationalzyklus gewährleisten. Aufgrund der laufenden Diskussion sollte der Exzisionsbereich sorgfältig geprüft werden, und es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die falsche Wahl einige Unterfraktionen von RF ausschließen und zu Verzerrungen in der nachfolgenden Analyse führen kann.

Aufgrund der Größenauswahl direkt nach der Nukleaseverdauung und unter Wegfall der Monosomenisolierung durch Ultrazentrifugation ist unser Protokoll schnell, relativ einfach und kann mit einer Standard-Laborausrüstung durchgeführt werden. Mit speziellen Kits für die Reinigung der RNA und DNA, die Aufreinigung von mRNA und die Bibliotheksvorbereitung gewährleisten Standardisierung und Wiederholbarkeit. Das Applausieren von mehr Ethanolvolumen während der RNA-Reinigung erhöht die Reinigungseffizienz von <200 nt RNA-Fragmenten57. Modifikationen an der Bibliotheksvorbereitung - Verlängerung der Inkubationszeit und Erhöhung der Temperatur während der Adapterligatur - werden angewendet, um die Ligationseffizienz für methylierte RNA wie rRNA zu verringern und die rRNA-Kontamination zu reduzieren58. Unser Protokoll wurde verwendet, um die Translationsregulation unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen (Publikationen in Vorbereitung), kann aber angewendet werden, um andere Aspekte der Translation wie den TIS-Nachweis zu untersuchen oder die Genomannotation zu verbessern und proteomische Studien zu unterstützen. Eine zusätzliche Modifikation des Protokolls, abhängig von der Forschungsfrage, kann leicht aufgenommen werden, z. B. die Vernetzung des Ribosoms mit dem interessierenden Protein oder die Affinitätsreinigung der interessierenden Ribosomen, die zu den angereicherten Fraktionen der Ribosomen führt. Mit unserem Protokoll ist das RIBO-seq-Verfahren für Wissenschaftler zugänglicher und kann somit neue Entdeckungen anregen und Entwicklungen auf diesem Gebiet beschleunigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

ALS möchte die finanzielle Unterstützung der EMBO Installation Grants IG 3914 und POIR anerkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 durchgeführt im Rahmen des Programms First TEAM der Stiftung für polnische Wissenschaft, das von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung kofinanziert wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

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Biochemie Ausgabe 174
RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung
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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

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