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Biochemistry

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

Abstract

A técnica de criação de perfil ribossomo (RIBO-seq) é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método, em comparação com outras abordagens, é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos em uma transcrição mRNA.

Neste artigo, descrevemos as etapas consecutivas de coleta e preparação da amostra para o método RIBO-seq em bactérias, destacando os detalhes relevantes para o planejamento e execução do experimento.

Uma vez que o RIBO-seq conta com ribossomos intactos e mRNAs relacionados, o passo chave é a rápida inibição da tradução e a desintegração adequada das células. Assim, sugerimos filtração e congelamento de flash em nitrogênio líquido para colheita celular com um pré-tratamento opcional com clororamfenícol para prender a tradução em bactérias. Para a desintegração, propomos moer células congeladas com argamassa e pilão na presença de óxido de alumínio para interromper mecanicamente a parede celular. Neste protocolo, não é necessária uma almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação gradiente de sacarose para purificação monossótil. Em vez disso, a separação mRNA usando eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) seguida pela excisão da pegada ribossômica (banda 28-30 nt) é aplicada e fornece resultados satisfatórios. Isso simplifica em grande parte o método, bem como reduz os requisitos de tempo e equipamento para o procedimento. Para a preparação da biblioteca, recomendamos usar o kit RNA pequeno disponível comercialmente para sequenciamento de illumina da New England Biolabs, seguindo as diretrizes do fabricante com algum grau de otimização.

As bibliotecas cDNA resultantes apresentam quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração (NGS). O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com os resultados do protocolo descrito em leituras mapeadas exclusivamente por amostra fornece dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é rápido e relativamente fácil e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.

Introduction

A técnica de perfil ribossomo (RIBO-seq) foi desenvolvida no laboratório de Jonathan Weissman na Universidade da Califórnia, São Francisco1. Em comparação com outros métodos usados para estudar a expressão genética no nível translacional, RIBO-seq concentra-se em cada ligação ribossosome ao mRNA e fornece informações sobre sua localização e o número relativo de ribossomos em uma transcrição. Permite monitorar o processo de síntese proteica in vivo e pode fornecer resolução e precisão de códon único permitindo a medição da densidade ribossomo em ambos, o mRNA individual e ao longo de todo o transcriptome na célula. Na base da técnica RIBO-seq está o fato de que durante a tradução o ribossomo liga a molécula de mRNA e, assim, protege o fragmento enterrado da transcrição de uma digestão ribonuclease. Após a adição da ribonuclease, o mRNA desprotegido é digerido e os fragmentos fechados por ribossomos - tipicamente de ~28-30 nt de comprimento - permanecem intactos. Esses fragmentos, chamados pegadas ribossômicas (RF), podem então ser isolados, sequenciados e mapeados na transcrição de que se originaram resultando na detecção da posição exata dos ribossomos. De fato, a capacidade ribossômica de proteger fragmentos de mRNA tem sido usada desde a década de 1960 para estudar os locais de iniciação de ligação ribossômica e tradução (TIS)2,3,4. No entanto, com o avanço da tecnologia de sequenciamento profundo, o RIBO-seq tornou-se um padrão ouro para o monitoramento de tradução5 que, através do engajamento ribossomo, pode fornecer uma informação em todo o genoma sobre asíntese deproteínas 6 . O perfil ribossomo preencheu a lacuna tecnológica existente entre quantificar o transcriptome e o proteome6.

Para realizar o perfil ribossomo precisamos obter lisecelulares do organismo que cresceu sob as condições investigadas. Interromper essas condições durante a coleta e lise celular pode fornecer dados não confiáveis. Para evitar isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. As células podem ser lístidas pela moagem criogênica em um homogeneizador mecânico como um moinho de batedeira7,8 ou um batedor de contas9, e por trituração através de uma pipeta10 ou com uma agulha11. O tampão de lise pode ser adicionado pouco antes ou pouco depois da pulverização das células. Em nosso protocolo usamos nitrogênio líquido para argamassa pré-colono e pilão, bem como óxido de alumínio como uma abordagem mais suave para a interrupção da parede celular bacteriana, o que impede a tesoura de RNA frequentemente encontrada quando métodos como a sonificação são aplicados. Após a pulverização, adicionamos um tampão de lise gelada no conteúdo resfriado da argamassa. A seleção de um tampão de lise apropriado é importante para obter a melhor resolução de pegadas ribossômicas. Uma vez que a força iônica afeta tanto o tamanho do RF quanto a precisão do quadro de leitura, recomenda-se atualmente o uso de tampões de lise com baixa resistência iônica e capacidade de tampão, mesmo que pareça que a composição do buffer não afeta a ocupação ribossômica em mRNAs11,12. Componentes importantes do tampão de lise são íons de magnésio, a presença que impede a dissociação das subunidades ribossômicas e inibe alterações conformais espontâneas nos ribossomos bacterianos11,13. Os íons de cálcio também desempenham um papel significativo e são essenciais para a atividade da nuclease microcócica (MNase) utilizada no método de perfil ribossomo bacteriano14. Adição de guanosina 5′-[β,γ-imido]triphosfato (GMP-PNP), um análogo não hidroglizável do GTP, juntamente com o clorofenicol inibe a tradução durante a lise15.

Quando o lisato é obtido, ele é esclarecido por centrifugação e dividido em duas porções, cada uma para um RIBO-seq e um sequenciamento de mRNA total de alta produtividade (RNA-seq) uma vez que são realizados simultaneamente(Figura 1). O RNA-seq fornece um ponto de referência que permite a comparação de dados tanto do RIBO-seq quanto do RNA-seq durante a análise dos dados. O translatome investigado é definido pela normalização das pegadas ribossômicas à abundância de mRNA16. Os dados do RNA-seq também podem ajudar a identificar a clonagem ou sequenciamento de artefatos17.

Figure 1
Figura 1. Esquemas de preparação de amostras de mRNA para RIBO-seq e RNA-seq. Para a preparação da biblioteca RIBO-seq, o RNA é digerido com MNase (A), seguido pela seleção de tamanho de RF de ~28-30 nt de comprimento (B); para RNA-seq RNA é isolado (C), esgotado de rRNA (D), e o mRNA resultante é aleatoriamente fragmentado em fragmentos de comprimentos variados (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As etapas iniciais do procedimento de preparação da amostra para RIBO-seq e RNA-seq diferem ligeiramente(Figura 1). Para o perfil ribossômico, o liseto precisa ser digerido por uma endonuclease específica para degradar as moléculas de mRNA não protegidas pelos ribossomos. Nos protocolos padrão, os monossomos obtidos são recuperados por uma ultracentrifugação de almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose8,14. Neste artigo, mostramos que esta etapa não é necessária para isolar a RF necessária para o RIBO-seq em bactérias, da mesma forma para as células eucarióticas18, e que a seleção de tamanho dos fragmentos de comprimento apropriado do gel de poliacrilamida é suficiente.

Para RNA-seq, o mRNA é obtido pelo esgotamento do rRNA do total de moléculas de RNA - rRNA hibridizem-se às sondas oligonucleotidas biotinínas que se ligam às contas magnéticas revestidas de streptavidin. Os complexos rRNA-oligonucleotídeo-contas são então removidos da amostra com um ímã resultando em uma amostra esgotada de rRNA19,20. As moléculas de mRNA purificadas são então fragmentadas aleatoriamente por hidrólise alcalina. Os fragmentos obtidos de mRNA, bem como as pegadas ribossômicas são convertidos em bibliotecas cDNA e preparados para sequenciamento profundo(Figura 2). Isso envolve o reparo necessário após a hidrólise alcalina (para mRNA) e digestão enzimática (para RF): desfosforilação de extremidades de 3' seguida de fosforilação de extremidades de 5'. Os próximos passos são a ligadura dos adaptadores e a transcrição reversa para criar inserções cDNA emolduradas por sequências necessárias para o sequenciamento de próxima geração (NGS) usando a plataforma Illumina. A última fase da preparação da biblioteca é uma reação pcr na qual os construtos são amplificados e rotulados com códigos de barras específicos de amostra para permitir multiplexagem e sequenciamento de várias amostras em um único canal. Antes do sequenciamento, a qualidade e a quantidade das bibliotecas são avaliadas pelo DNA de alta sensibilidade na eletroforese do chip. bibliotecas cDNA com parâmetros apropriados podem então ser agrupadas e sequenciadas. O sequenciamento pode ser realizado em diferentes plataformas de Illumina, como MiSeq, NextSeq ou HighSeq, dependendo do número de bibliotecas, comprimento de leitura necessário e profundidade de sequenciamento. Após o sequenciamento, a análise bioinformática é realizada.

Figure 2
Figura 2. Preparação da biblioteca. A preparação da biblioteca inclui o reparo de extremidades, ligadura dos adaptadores, transcrição reversa e amplificação com codificação de barras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O perfil ribossomo é um método universal que pode ser facilmente modificado e ajustado de acordo com a questão científica. Originalmente foi usado na levedura1, mas logo depois foi aplicado às células bacterianas21, bem como organismos modelo eucarióticos, incluindo camundongos10,zebrafish22, mosca de frutas23 e Arabidopsis thaliana24. Também foi utilizado para o estudo de diferentes tipos ribossósmicos: citoplasmásmico, mitocondrial25,26 e cloroplasto27,28. Em eucariotes RIBO-seq é comumente adaptado e refinado para investigar aspectos específicos da tradução, incluindo iniciação10,11,29,30,31,32, alongamento1,10,11,31,33, ribossomo parando33 e alteração de conformação33. A maioria das modificações envolve o uso de diferentes inibidores de tradução. No entanto, nas bactérias, estudos análogos têm sido difíceis de realizar devido à escassez de inibidores com o mecanismo de ação necessário34. O inibidor de tradução mais usado em bactérias é o clorofífenicol (CAM), que se liga ao centro de transferência de peptidyl (PTC) e impede o posicionamento correto do aminoacílico-tRNA no local A. Como resultado, cam impede a formação de um vínculo peptídeo que leva à prisão dos ribossomosalongamentos 35. Outros exemplos de inibidores de tradução em bactérias são a tetraciclina (TET)36, retapamulina (RET)34 e Onc11237 que foram usados para investigar sites de iniciação de tradução. O TET, que impede a entrega de tRNA ao ribossomo, sobrepondo-se diretamente com o loop anticodon de tRNA no local A, foi originalmente aplicado para verificar os resultados obtidos do tratamento CAM, uma vez que ambos são antibióticos inibindo a alongamento da tradução38. Foi encontrado tet para detectar TIS primário, no entanto foi incapaz de revelar TIS36interno . RET se liga no PTC do ribossomo bacteriano, e impede a formação da primeira ligação de peptídeo interferindo com um alongador aminoacyl-tRNA no site A. A aplicação de RET resulta em prisão de ribossomos tanto nas TISs primárias quanto internas34. Onc112, um peptídeo antimicrobiano rico em proline, liga-se no túnel de saída e bloqueia a ligação aminoacíl-tRNA no local ribossômico A. Como resultado, o Onc112 impede que os complexos de iniciação entrem na fase de alongamento37.

A principal informação que o perfil ribossomo fornece é a densidade de ribossomos e sua posição no mRNA. Foi aplicado com sucesso para investigar a expressão genética diferencial no nível da tradução em várias condições de crescimento1,6, medir a eficiência translacional1,38,39 e detectar eventos de regulação de tradução, como a pausa ribossômica10. RIBO-seq também permite descobrir a tradução de ncRNA anotado, pseudogenes e pequenos quadros de leitura abertos não anotados (ORF) levando à identificação de genes de codificação de proteínas novos e/ou muito curtos10,12,22,30,37. Nesses casos, ribo-seq pode ajustar e melhorar a anotação do genoma. Com sua alta sensibilidade para a identificação de ORFs traduzidos e sua natureza quantitativa, o perfil ribossomo também pode servir como proxy para a determinação proteome ou para auxiliar estudos de proteômica31,34,39. Ao mapear o TIS, o perfil ribossomo revela isóformes n-terminalmente estendidos e truncados de proteínas conhecidas10,32. RIBO-seq também foi adaptado para estudar o dobrável co-translacional das proteínas14,21,24. Este método permite medir as taxas de alongamento1,10,39 ou velocidades de decodificação de códons individuais6 e ajuda no desenvolvimento de modelos quantitativos de tradução17. O método de criação de perfil ribossomo também é capaz de fornecer insights mecanicistas sobre a pausa ribossa em bactérias7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, defeitos de terminação/reciclagem41,42 e alterações de conformação ribossômica33 em eucariotos. RIBO-seq também foi adaptado para examinar o impacto de fatores trans-acionados específicos na tradução, como miRNAs6 e proteínas de ligação de RNA em eucariotes16,43. No entanto, é importante reconhecer que o projeto experimental e a resolução obtida do RIBO-seq determinam a quantidade de informações que podem ser extraídas dos dados de sequenciamentoresultantes 12.

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Protocol

1. Coleta de amostras

  1. Prepare uma cultura bacteriana. Recomendamos um volume cultural de 100 mL por amostra.
  2. Preparar equipamentos e reagentes para coleta de amostras: duas scoopulas por amostra, filtros de membrana de ésteres de celulose mista (MCE) de 0,45 μm, tubos estéreis de 50 mL, nitrogênio líquido, 50 mg/mLram clorofenicol em 70% (vol/vol) de etanol (opcional). Puna a tampa de tubos de 50 mL para permitir a evaporação de nitrogênio líquido e evitar a explosão de tubos fechados. Descontaminar scoopulas com detergente de laboratório e 70% de etanol.
  3. Pré-aquecimento do equipamento de filtragem e uma das scoopulas à temperatura de crescimento da cultura bacteriana.
    NOTA: Recomendamos um aparelho de filtragem de vidro com funil, base fritada, frasco de articulação moída e um grampo de mola Ø de 47 mm.
  4. Antes da colheita da amostra, adicione clororamfenicol na cultura bacteriana até a concentração final de 100 μg/mL e incubar 1 minuto (opcional).
  5. Despeje nitrogênio líquido em tubo estéril de 50 mL e coloque a segunda scoopula dentro do tubo para esfriar.
    cuidado! O nitrogênio líquido pode causar a explosão de recipientes fechados devido à mudança de pressão após a evaporação. Para evitar isso, é necessário criar alguns furos na tampa de tubos de 50 mL para permitir a evaporação de nitrogênio líquido.
  6. Coletar células por filtragem. Pare de filtrar quando o meio passou pela membrana, mas não permita que o filtro seque completamente.
  7. Colete pelotas bacterianas raspando rapidamente as células do disco do filtro usando uma scoopula pré-armada. Coloque imediatamente toda a scoopula com as células colhidas no tubo de 50 mL cheio de nitrogênio líquido. A pelota colhida deve ser completamente coberta de nitrogênio líquido.
  8. Deixe a pelota congelar completamente e desalojar células congeladas usando uma segunda scoopula previamente resfriada. Feche a tampa perfurada e transfira o tubo para -80°C. Ponto STOP
    NOTA: Desinfetar scoopulas após cada colheita de amostra.

2. Lise celular

  1. Prepare 0,1 M GMP-PNP em tubos de reação Tris 8, DNase I e 1,5 mL para lises e mantenha-os no gelo. Esfrie a centrífuga a 4 °C.
  2. Prepare o tampão de lise (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 e opcional 1 mM chloramphenicol). Alíquota de 500 μL do tampão de lise por amostra em tubos de reação de 1,5 mL e coloque-os no gelo.
  3. Descontaminar argamassa e pilão com detergente de laboratório e 70% de etanol, e secá-los. Argamassa fria e pilão despejando nitrogênio líquido na argamassa.
  4. Transfira a pelota congelada para a argamassa pré-gelada e moa-a em pó. Com uma espátula, adicione aproximadamente 1 volume de óxido de alumínio e continue moendo. Mantenha argamassa, pilão e células frias derramando nitrogênio líquido quando necessário, não deixe o conteúdo da argamassa descongelar.
  5. Pouco antes de usar o tampão de lise, adicione GMP-PNP e DNase I na alíquota do buffer de lisis à concentração final de 2 mM e 100 U/mL, respectivamente. Transfira a solução para a argamassa com células e óxido de alumínio e continue moendo. Deixe o degelo de lise lentamente durante a moagem e transfira a mistura para o tubo de reação pré-resfriado de 1,5 mL e coloque imediatamente no gelo.
  6. Centrifuge lysates a 20 000 x g por 5 minutos a 4 °C. Transfira supernantes para novos tubos de reação pré-refrigerados de 1,5 mL e mantenha-os no gelo.
  7. Meça a concentração de RNA em cada amostra com um NanoDrop. Use diluições de 1:10 de amostras e diluição de 1:10 de tampão de lise em água sem nuclease como um branco.
    NOTA: Esteja ciente de que o clorofífenicol apresenta absorção significativa a 260 nm.
  8. Divida cada lise em duas porções: uma para RIBO-seq (0,5 - 1 mg de RNA) e a segunda para RNA-seq (o resto).
  9. Limpe as amostras para RNA-seq usando um kit de limpeza RNA comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
    NOTA: Recomendamos o uso do kit Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (ver Tabela de Materiais). Recomendamos também a adição de 4,5 volumes de etanol (em comparação com o volume amostral) na mistura de amostra e Buffer de Ligação para pegadas ribossômicas e mRNA fragmentado, a fim de aumentar a eficiência de purificação de fragmentos curtos de RNA.
  10. Armazene as amostras destinadas ao RNA-seq a -80 °C. O procedimento para RNA-seq continuará a partir da etapa 5.

3. Digestão mnase de amostras para RIBO-seq

  1. A 1 mg de RNA adicione 3,8 μL de 187,5 U/μL MNase em 10 mM Tris pH 8 e cubra-o com tampão de lise ao volume total de 500 μL.
  2. Incubar a 25 °C, 300 RPM, por 45 minutos em um termomixer.
  3. Limpe as amostras com um kit de limpeza de RNA disponível comercialmente (como na etapa 2.9).
  4. Armazene as amostras para RIBO-seq a -80 °C (ponto STOP) ou proceda à seleção de tamanho.

4. Eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e seleção de tamanho de amostras para RIBO-seq

  1. Prepare um gel de poliacrilamida-TBE de 15% com 8 M de ureia e coloque-o em um tanque com tampão TBE. Pré-execução por no mínimo 10 minutos em uma tensão constante de 200 V.
  2. Misture amostras com tampão de amostra de TBE-Ureia, desnaturação a 95 °C por 1 minuto e coloque-as imediatamente no gelo.
  3. Lave a ureia injetando tampão TBE em poços de gel usando uma seringa. Carregue as amostras deixando um bom espaço entre elas para separar cada amostra e evitar contaminação cruzada. Use oligonucleotídeos de 29 nt e uma mistura de oligonucleotídeos de 26 nt e 32 nt como marcadores. Execute a eletroforese a uma tensão constante de 180 V.
  4. Prepare o tampão estéril para incubação durante a noite (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Após a eletroforese, manche o gel em um banho de ouro SYBR por cerca de 2-3 minutos e enxágue o gel com água sem nuclease.
  6. Fragmentos de gel entre 26 e 32 nt com as agulhas estéreis ou as lâminas de barbear e coloquem os fragmentos de gel em tubos separados de 1,5 mL para cada amostra. Troque a agulha ou a lâmina de barbear entre as amostras.
  7. Adicione 200 μL do tampão de incubação durante a noite a cada tubo de reação.
  8. Incubar as amostras a 10 °C, 1000 RPM durante a noite em um termomixer.
  9. No dia seguinte, limpe as amostras como na etapa 2.9. Elute as pegadas em 80 μL de água sem nuclease.
  10. Armazene as amostras a -80 °C. Ponto STOP. O procedimento para RIBO-seq continuará a partir da etapa 7.

5. Purificação de mRNA bacteriano por esgotamento de rRNA a partir de amostras para RNA-seq

  1. Remova o rRNA das amostras com um kit de purificação de mRNA bacteriano (por exemplo, Invitrogen MICROBExpress). Siga o protocolo do fabricante.
  2. Limpe as amostras como na etapa 2.9. Elute o mRNA em 50 μL de água sem nuclease.
  3. Armazene as amostras para RNA-seq a -80 °C (ponto STOP) ou continue a fragmentação alcalina.

6. Fragmentação alcalina de amostras para RNA-seq

  1. Prepare o tampão de hidrólise alcalina (mix de 220 μL de 0,1 M NaHCO3, 30 μL de 0,1 M Na2CO3 e 1 μL de 0,5 M EDTA). Misture 1 volume (50 μL) de tampão alcalino com 1 volume (50 μL) da amostra e incubar a 95 °C por 25 minutos.
  2. Adicione 5 μL de 3 M NaOAc pH 5.5 para parar a reação.
  3. Limpe as amostras como na etapa 2.9 e elute as amostras em 80 μL de água sem nuclease.
  4. Possível ponto STOP: armazene amostras de RNA-seq a -80 °C. No entanto, recomendamos ir diretamente para a etapa 7, a fim de evitar congelamento e descongelamento desnecessários.

7. Desfosforilação e fosforilação de amostras para RNA e RIBO-seq

  1. Adicione 10 μL de 10x de tampão de reação PNK e 5 μL T4 PNK a cada amostra. Incubar a 37 °C por 1,5 hora para desfosforilar as extremidades de 3'.
  2. Adicione 3 μL de ATP de 1 mM e incubar a 37 °C por 1 hora, a fim de fosforilar as extremidades de 5'.
  3. Limpe as amostras como na etapa 2.9, elute em 30 μL de água sem nuclease.
  4. Armazene as amostras a -80 °C. Ponto STOP.

8. Preparação da biblioteca usando NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set para Illumina

  1. Prepare 100-1000 ng de RNA de entrada (fragmentos de mRNA obtidos e pegadas ribossômicas) em 6 μL de água sem nuclease e adicione 1 μL de Adaptador SR de 3'. Incubar de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Adicione 10 μL de tampão de reação de ligação de 3' (2X) e 3 μL de 3' Ligation Enzima Mix e incubar a 37 °C por 2,5 horas, em vez de 1 hora a 25 °C como o protocolo do fabricante especifica.
  3. Hibridize o Primer de Transcrição Reversa de acordo com o protocolo do fabricante com um programa modificado: 5 minutos a 75 °C, 30 minutos a 37 °C e mantenha a 4 °C.
  4. Ligate o Adaptador SR de 5'' . Siga o protocolo do fabricante com uma mudança: realize a incubação a 37 °C por 2,5 horas, em vez de 1 hora a 25 °C.
  5. Realize a Transcrição Reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Possível ponto STOP: incubar as amostras contendo cDNAs sintetizadas a 70 °C durante 15 minutos para inativar a transcriptase reversa e armazená-las a -80 °C. No entanto, recomendamos proceder diretamente aos próximos passos para evitar o congelamento e o descongelamento desnecessários das amostras.
  7. Armazene metade de cada biblioteca cDNA a -80 °C como backup.
  8. Realize a amplificação do PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Use metade da mistura de reação. Armazene as bibliotecas obtidas a -80 °C. Ponto STOP.

9. Seleção de tamanho de bibliotecas cDNA usando PAGE

  1. Prepare 6% de gel poliacrilamida-TBE e coloque-o em um tanque com tampão TBE. Pré-execução por no mínimo 10 minutos em uma tensão constante de 200 V.
  2. Misture as amostras com gel loading dye, azul (6X) e carregue-as no gel. Use Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest como uma escada. No início, execute a eletroforese a uma tensão constante de 120 V para permitir que o DNA entre no gel e, em seguida, mude a tensão para 180 V.
  3. Quando a eletroforese estiver concluída, manche o gel em um banho de ouro SYBR por cerca de 2-3 minutos e enxágue o gel com água sem nuclease.
  4. Fragmentos de gel de impostos contendo as bibliotecas. Para o consumo de amostras de RNA-seq entre 135-180 nt e para RIBO-seq entre 135-170 nt. Use agulha estéril ou lâmina de barbear e coloque os fragmentos de gel excisados em tubos de reação separados de 1,5 mL. Lembre-se de trocar a agulha ou a lâmina entre as amostras.
    NOTA: Os adaptadores e o código de barras do NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set para Illumina têm 119 nt no total, o que determina o corte de excisão inferior.
  5. Adicione 100 μL de água sem nuclease a cada fragmento de gel excisado.
  6. Incubar os fragmentos de gel a 10 °C, 450 RPM durante a noite em um termomixer.
  7. Limpe e concentre as bibliotecas cDNA com um kit comercial de limpeza de DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
    NOTA: Recomendamos o uso do kit Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (ver Tabela de Materiais).
  8. Armazene bibliotecas cDNA purificadas a -80 °C. Ponto STOP.

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Representative Results

Os resultados exemplares aqui apresentados foram obtidos em estudo que examinou a regulação da tradução na esporosulação das células subtilis WT Bacillus. As culturas durante a noite foram diluídas para OD600 igual a 0,1 em 100 mL de médio rico e incubadas a 37 °C com agitação vigorosa até OD600 atingir 0,5-0,6. O meio rico foi então substituído por meio mínimo para induzir processo de esporulação e a incubação foi continuada por até quatro horas. As células eram colhidas a cada hora começando com T0 - indução de esporulação - resultando em cinco pontos de tempo. Um minuto antes da colheita, as culturas foram tratadas com clororamfenicol como descrito no protocolo acima. As células foram coletadas por filtragem em um sistema de filtragem de vidro pré-armado usando filtros de membrana de ésteres de celulose mista (MCE) de 0,45 μm e congelados em nitrogênio líquido.

A quantidade de ácido ribonucleico obtida no lisato depende de condições de crescimento, volume de cultura e densidade. Seguindo nosso protocolo, 100 mL da cultura bacteriana (Bacillus subtilis) rende em média 1-4 mg de RNA. Exemplos de lises obtidos a partir do experimento descrito acima são mostrados na Tabela 1.

Concentração de RNA [ng/μL] Quantidade de RNA [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Mesa 1. Concentração de RNA e quantidade em amostras representativas de lysates B. subtilis. A tabela inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas pós-indução de esporulação. A lise foi realizada com 550 μL de tampão de lise contendo clororamfenicol. Pode-se notar que à medida que a esporulação prossegue a quantidade de RNA obtido diminui.

Quando a quantidade de RNA é inferior a 1 mg, 0,25 mgs de RNA é usado para RIBO-seq em vez de 1-0,5 mgs e a quantidade de MNase é então ajustada, respectivamente. A quantidade e concentração de RNA representativos após a digestão da nuclease é mostrada na Tabela 2. A quantidade média de RNA após a digestão e limpeza é de 50 μg de 0,5 mg de entrada de RNA.

Concentração de RNA [ng/μL] Quantidade de RNA [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Mesa 2. A quantidade e concentração de RNA após a digestão nuclease das amostras representativas para RIBO-seq. A tabela inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas de indução pós-esporulação; a letra "R" refere-se a amostras para RIBO-seq. Como a concentração de RNA da amostra WT4-R foi baixa, 0,25 mg de RNA foi digerida, enquanto 0,5 mg do RNA para as demais amostras foi usada para a geração de pegada ribossômica. A quantidade de MNase para digestão foi de 178,125 U para 0,25 mg de RNA em WT4-R, e 356,25 U para 0,5 mg de RNA em outras amostras. Após a digestão, as amostras foram limpas com o kit comercial de limpeza de RNA e a concentração de ácido ribonucleico foi medida com o NanoDrop.

Após a digestão do MNase, a seleção de tamanho é realizada com o auxílio do PAGE. Um exemplo de um gel de poliacrilamida de 15% TBE-ureia com as amostras digeridas é mostrado na Figura 3. Fragmentos de gel entre 26 e 32 nt foram extirpados com uma lâmina de barbear estéril e incubados durante a noite no tampão de incubação durante a noite. No dia seguinte, pegadas ribossômicas foram limpas com o kit comercial de limpeza do RNA.

Figure 3
Figura 3. Gel de poliacrilamida de 15% TBE-ureia com amostras representativas após digestão de MNase. A figura inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas de indução pós-esporulação; a letra "R" refere-se a amostras para RIBO-seq. 15 μL de amostras desnaturadas foram carregadas nos poços de gel em ordem: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R e o volume restante foi armazenado a -80 °C como backup. 29 nt oligonucleotídeos e mistura de 26 nt e 32 nt oligonucleotídeos foram usados como marcadores. A eletroforese foi realizada como descrito acima e o gel foi manchado em um banho de ouro SYBR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Paralelamente à digestão nuclease, os lysates para RNA-seq foram limpos com o kit comercial de limpeza de RNA e as concentrações obtidas de RNA foram medidas com NanoDrop. Os resultados representativos são apresentados na Tabela 3. Após a limpeza, a quantidade de ácido ribonucleico diminuiu para 40-500 μg.

Concentração de RNA [ng/μL] Quantidade de RNA [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Mesa 3. Quantidade de RNA e concentração de amostras para RNA-seq após a purificação do RNA. A tabela inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas de indução pós-esporulação; a letra "m" refere-se a amostras para RNA-seq (mRNA).

As concentrações de RNA obtidas das amostras para RNA-seq foram utilizadas para definir a entrada de RNA para esgotamento do rRNA. 8 μg de RNA de cada amostra de RNA-seq foram utilizados com kit de purificação de mRNA bacteriano MICROBExpress (ver Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante e foram limpos com o kit comercial de limpeza de RNA posteriormente. Os resultados representativos do esgotamento do RRNA são mostrados na Tabela 4.

Concentração de RNA [ng/μL] A260/A280 A260/A230 Quantidade de RNA [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Mesa 4. A quantidade e concentração de RNA representativos após o esgotamento do rRNA. A tabela inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas de indução pós-esporulação; a letra "m" refere-se a amostras para RNA-seq. 8 μg de RNA de amostras para RNA-seq foram usados para esgotamento de rRNA e limpos com um kit comercial de limpeza de RNA posteriormente.

Em seguida, o mRNA obtido foi fragmentado por hidrólise alcalina e limpo com um kit comercial conforme descrito no protocolo. As pegadas fragmentadas de mRNA e ribossômico foram desfosforiladas nas extremidades de 3' e fosforiladas nas extremidades de 5'' de acordo com o protocolo acima. As amostras foram então usadas para construir bibliotecas cDNA para sequenciamento de Illumina, conforme descrito no protocolo. A Figura 4 mostra um exemplo de gel de poliacrilamida de 6% com as bibliotecas obtidas. Fragmentos de gel na faixa de 135-180 nt para RNA-seq e 135-170 nt para RIBO-seq foram extirpados com lâminas de barbear estéreis e incubados durante a noite em água sem nuclease. As bibliotecas foram limpas com um kit comercial de limpeza de DNA e a qualidade e quantidade foram avaliadas por um DNA de alta sensibilidade na eletroforese do chip usando o Agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
Figura 4. 6% gel de poliacrilamida de bibliotecas cDNA antes e depois da seleção de tamanho. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest foi usado como uma escada. 25 μL de amostras foram carregadas no gel na seguinte ordem: três bibliotecas RIBO-seq e seis bibliotecas RNA-seq. Os volumes restantes das amostras foram armazenados a -80 °C como backup. A figura inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas após indução de esporulação; a letra "R" refere-se a amostras para RIBO-seq e a letra "m" refere-se a amostras para RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os exemplos de imagens de gel virtual e eletroferogramas obtidos do Agilent 2100 Bioanalyzer são mostrados na Figura 5. Bandas e picos representando as bibliotecas RIBO-seq são mais estreitos e melhor definidos em comparação com estes que representam bibliotecas RNA-seq. De acordo com a eletroforese on-chip, as bibliotecas têm aproximadamente 150 bp de comprimento, o que é um tamanho esperado da biblioteca. Os adaptadores e o código de barras usado na preparação da biblioteca têm 119 nt de comprimento e as pastilhas têm 29-30 nt de comprimento (para RIBO-seq) ou em uma faixa entre 25 e 50 nt (para RNA-seq). Os picos adicionais mais próximos dos 200 bp obtidos das bibliotecas RIBO-seq podem indicar artefatos PCR que podem ser descartados durante a análise bioinformática quando os dados obtidos do sequenciamento são aparados e o rRNA/tRNA é filtrado. A quantidade média de DNA é de 32 ng fornecendo quantidade suficiente de material necessário para o sequenciamento de próxima geração.

Figure 5
Figura 5. Os exemplos de eletroferogramas e imagens de gel virtual de um DNA de alta sensibilidade na eletroforese do chip. A figura inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e uma hora (1), duas (2), três (3) ou quatro (4) horas de indução pós-esporulação; a letra "R" refere-se às bibliotecas RIBO-seq e a letra "m" refere-se às bibliotecas RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após o controle de qualidade pela eletroforese on-chip, as bibliotecas foram agrupadas para sequenciamento de 50 bps de extremidade única na plataforma NextSeq500 da Illumina (10 bibliotecas por canal, com um mínimo de leituras de 350 mln por canal). O sequenciamento rendeu 30-57 milhões de leituras por amostra para bibliotecas RNA-seq e 30-50 milhões de leituras por amostra para bibliotecas RIBO-seq. A aparação dos adaptadores e sequências de baixa qualidade resultaram em leituras de 24-47 mln por amostra para amostras de RNA-seq e leituras de 25-50 mln por amostra para amostras de RIBO-seq. O mapeamento, realizado com o STAR44,rendeu 2,4-9,6 milhões de leituras exclusivamente mapeadas por amostra para amostras de RNA-seq (que constituem 8-16,8% do número total de leituras) e 2,3-10,4 milhões de leituras exclusivamente mapeadas (7,7-22,1%) para amostras RIBO-seq. Os dados obtidos foram verificados com o FastQC45. Exemplos das parcelas de qualidade produzidas pelo FastQC para as sequências aparadas são mostrados na Figura 6. As sequências do comprimento de interesse, que é <32 nt para RIBO-seq e <50 nt para RNA-seq, apresentaram uma qualidade muito boa. Os exemplos de plots de conteúdo GC e distribuições de comprimentos de sequência sobre todas as sequências aparadas são mostrados na Figura 7. O pico adicional de 72% no gráfico de distribuição GC da biblioteca RIBO-seq pode potencialmente indicar contaminação de rRNA que pode ser removida durante a análise bioinformática por filtração de rRNA46,47,48. A distribuição de comprimentos de sequência é muito estreita para bibliotecas RIBO-seq, com um pico de 26-27 nt, enquanto a distribuição de comprimento para bibliotecas RNA-seq é mais ampla e varia entre 15 e 50 nt.

Figure 6
Figura 6. Os exemplos de parcelas de caixa e bigode de pontuações de qualidade em todas as bases para bibliotecas RIBO-seq e RNA-seq após o corte. A figura inclui amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas antes da indução de esporulação (0) e quatro (4) horas após indução de esporulação; a letra "R" refere-se às amostras ribo-seq e a letra "m" refere-se a amostras de RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Os exemplos de plots de conteúdo GC e distribuição de sequência de comprimento de todas as sequências para bibliotecas RIBO-seq e RNA-seq após o corte. A figura mostra amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas quatro (4) horas após a indução de esporos; a letra "R" refere-se à amostra para RIBO-seq e a letra "m" refere-se à amostra para RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para verificar se os dados ribo-seq fornecem informações sobre pegadas ribossômicas verdadeiras em vez de fragmentos aleatórios de mRNA do comprimento selecionado, comparamos dados de seqência de RIBO-seq e RNA-seq usando o RiboToolkit, um servidor web para análise de dados RIBO-seq49. Os dados de Ribo-seq exibem periodicidade trigêmea e um pico alto e estreito correspondente aos ribossomos iniciados e característicos do RF, como mostrado na Figura 8A,o que não é observado nos dados RNA-seq(Figura 8B). Além disso, o gráfico metagene mostrando os perfis de cobertura média de fragmentos de RF e mRNA nas sequências de codificação (CDSs) revelou uma maior proporção de leituras mapeadas para os CDSs no conjunto de dados RIBO-seq(Figura 8C),como esperado.

Figure 8
Figura 8. Parcelas de periodicidade metagene e cobertura média de fragmentos de RF e mRNA em CDSs. Os perfis metagene foram obtidos com o RiboToolkit, um servidor web integrado49. O comprimento do CDS foi normalizado para um valor de 1 e cada CDS foi dividido em 100 caixas iguais. A figura mostra amostras do tipo selvagem (WT) B. subtilis que foram colhidas uma (1) hora após a indução de esporos; a letra "R" refere-se à amostra para RIBO-seq e a letra "m" refere-se à amostra para RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para comparar se o protocolo RIBO-seq apresentado aqui produz resultados semelhantes aos obtidos pelo método padrão de recuperação de RF (ultracentrifugação de gradiente de sacarose), paralelamente os resultados de sequenciamento das bibliotecas preparadas após os dois métodos. Os experimentos que investigam a regulação da tradução durante a esporulação no WT B. subtilis foram conduzidos de acordo com o protocolo RIBO-seq apresentado, bem como seguindo o protocolo padrão que inclui a recuperação de monossómos por uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Os resultados dos perfis de cobertura ribossosome obtidos dos dois experimentos são mostrados na Figura 9. A visualização de RFs mapeadas é muito semelhante entre os dois experimentos e produziu resultados semelhantes após análise bioinformática.

Figure 9
Figura 9. A visualização de RF obtido mapeado no genoma. A figura inclui RF obtida do tipo selvagem B. subtilis colhidas quatro horas após a indução de esporulação e preparadas de acordo com o protocolo padrão (WT4-R-s, painel superior) ou o protocolo apresentado (WT4-R, painel inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O principal desafio técnico do perfil ribossomo é a necessidade de inibir rapidamente a tradução para capturar um instantâneo de ribossomos em mRNAs em um determinado estado fisiológico de interesse. Para isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. A aplicação de antibióticos é opcional, pois podem causar artefatos. Chloramphenicol é uma droga comumente usada para prender ribossomos alongamentos em RIBO-seq bacteriana. No entanto, não impede a iniciação, resultando em um acúmulo de ribossomos cerca de seis códons a jusante do local de iniciação da tradução14. Além disso, sua capacidade de inibir a reação peptidyltransferase pode depender da natureza dos substratos ribossômicos P e A-local. Presumivelmente, cam prende ribossomos de forma mais eficaz com Gly, Ala, Ser, Cys ou Thr como penúltimo aminoácido do peptídeo nascente17,38,50. Isso vale a pena levar em consideração durante o desenho experimental e a análise bioinformática, especialmente quando se estuda a pausa ribossômica17. Cam também tem sido mostrado para influenciar a precisão translacional, promovendo uma leitura de códon stop e frameshifting51. Ainda assim, a inibição do CAM é relativamente rápida e suficiente para a pesquisa típica ribo-seq14 e não induz a má incorporação51. Alguns dos artefatos causados por antibióticos podem ser evitados aumentando a quantidade de medicamentos9. A concentração de CAM aplicada em nosso protocolo é a quantidade típica usada em experimentos RIBO-seq7,14,21, no entanto, a concentração pode variar para diferentes microrganismos e deve ser otimizada antes da colheita da amostra. Devido à possibilidade de ocorrência de artefatos causados pela aplicação de inibidores de tradução, recomenda-se evitar o tratamento inibidor se não for necessário para a questão da pesquisa e se a colheita rápida for possível14. A coleta rápida de células é crucial, especialmente se for realizada sem o tratamento inibidor, uma vez que a colheita prolongada pode resultar em perda de polissomas e/ou mudança no translatome como resposta às mudanças das condições ambientais14. Assim, recomendamos o uso da filtragem como método de colheita, pois pode ser realizada sob as mesmas condições ou similares que o crescimento da cultura, incluindo temperatura e/ou agitação. Durante a filtragem, as células coletadas na superfície do filtro são constantemente lavadas com meio de crescimento, impedindo-as de detectar mudanças nas densidades celulares, oxigenação e nível de aminoácidos e outros nutrientes14. A filtração é mais suave e pode ser mais rápida do que a centrifugação, se a densidade da cultura for moderada, caso contrário um grande número de células pode entupir os poros do filtro e retardar o processo. Se houver uma probabilidade de uma filtragem prolongada, recomendamos um pré-tratamento de clorofenicol da cultura, o que resulta em uma prisão de tradução e permite estender o tempo de colheita. Se a filtragem se tornar difícil de completar devido ao entupimento do filtro, sugerimos parar a filtragem, remover o excesso de cultura e a fração de congelamento de flash da cultura coletada no filtro. Observamos que 50 mL de cultura bacteriana densa é suficiente para realizar RIBO-seq. O subsequente congelamento de flash de células em nitrogênio líquido é a abordagem mais universal e eficaz para parar imediatamente a tradução8,21,52.

A digestão ribonuclease é um passo crítico necessário para obter RF de boa qualidade. A seleção da enzima certa é importante, uma vez que as subunidades ribossômicas são compostas de moléculas de RNA que podem ser digeridas, interrompendo a integridade do ribossomo, causando contaminação do rRNA e destruindo RF44. Originalmente, rnase I foi usado para digestão da geração mRNA e RF em eucariotes1. Uma vez que esta enzima parecia inativa em bactérias, foi substituída por uma nuclease microcócica (MNase) do Staphylococcus aureus21. Mais tarde foi mostrado que rnAse eu posso de fato realizar a digestão de amostras bacterianas, no entanto MNase permanece comumente usado para este fim53. A desvantagem do MNase reside no viés sequencial de sua atividade catalítica, que é 30 vezes maior para A ou T, resultando em 80% dos fragmentos de mRNA começando com A ou T no final de5′14. No entanto, isso foi superado pela observação de que a maior parte da variação no comprimento ocorre no final de 5′-end da RF, e atribuir densidade ribossosome ao 3′-end produz informações precisas e precisas sobre a posição ribossosome7. A atividade de MNase é afetada pela concentração enzimática, pH e tempo de digestão e deve ser determinada para cada novo lote de MNase. Um aumento da atividade nuclease resulta em aumento da contaminação do rRNA, enquanto a diminuição da atividade causa um decote menos preciso das pegadas ribossômicas. Isso pode reduzir o rendimento global de RF no procedimento de purificação de gel seletivo de tamanho e fornecer informações menos precisas sobre posições ribossósas no mRNA14. Assim, a quantidade necessária de MNase deve ser determinada cuidadosamente. Para nossos experimentos aplicamos 712,5 U de nuclease microcócica por 1 mg de RNA, enquanto a concentração relatada na literatura varia entre 50 U38, 450 U34,1000 U14 e 1500 U15,21,36 por 1 mg de RNA. Como mencionado acima, mNase requer presença de íons de cálcio para sua atividade. Nos protocolos padrão, o EGTA, um agente quelaante para íons divalentos que tem maior afinidade com o cálcio em comparação com o magnésio54,é usado para parar a digestão ligando cálcio e inativando MNase. No entanto, em nosso protocolo, a reação de digestão é interrompida usando o kit de limpeza de RNA logo após a incubação com a nuclease.

Nos protocolos padrão, o próximo passo é a recuperação de ribossomos por uma ultracentrifugação de almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose8,14. Uma centrifugação de gradiente de sacarose permite a separação seletiva dos monossómos das subunidades e polissóis, porém requer equipamentos específicos, como um misturador de gradientes e uma ultracentrifuagem. Além disso, o throughput deste método é limitado a 500-700 μL do lysate. Por outro lado, a ultracentrifugação da almofada de sacarose pelotas de pelotas a maioria das partículas ribossômicas, permite o processamento de mais de dezenas de mililitros de lysato e é menos exigente em termos da instrumentação necessária. No entanto, ambas as abordagens são longas, pois levam no mínimo 4 a 6,5 horas14 e requerem uma ultracentrifugação. Em nosso protocolo esta etapa é omitida à medida que procedemos diretamente à seleção de tamanho em gel de poliacrilamida de 15% TBE-ureia. A eletroforese é realizada sob condições de desnaturação, a fim de desdobrar as estruturas secundárias do RNA e prevenir interações intramoleculares. Usamos oligonucleotídeos de 26 nt, 29 nt e 32 nt como marcadores para excisar uma faixa estreita de pegadas ribossômicas. Assumimos que a concentração do RF real excede significativamente a contaminação potencial com rf falso considerado como aleatório, desprotegido pelos fragmentos de mRNA ou rRNA ribososome nessa faixa. Os resultados obtidos utilizando nosso protocolo mostraram de fato uma fração enriquecida do RF na faixa de tamanho selecionada. A verificação de qualidade com o Agilent 2100 Bioanalyzer mostra as bibliotecas RIBO-seq como um único, bem definido bandas e picos, em contraste com as bibliotecas RNA-seq que são visualizadas como manchas e picos significativamente mais amplos(Figura 5). Além disso, os dados obtidos de Ribo-seq exibem periodicidade trigêmea(Figura 8A),o que não é observado nos dados do RNA-seq(Figura 8B). Além disso, as visualizações da RF obtida mapeada no genoma mostram padrões de expressão muito semelhantes, independentemente do método de isolamento da pegada que foi confirmado ainda em nossas análises bioinformaticas(Figura 9). Ainda assim, estamos cientes de que rf falso poderia mapear para o genoma que pode perturbar o sinal obtido. No entanto, o fato de que rf falsos são gerados aleatoriamente implica que eles não devem se acumular para um lugar no genoma e, portanto, não deve resultar em artefatos e resultado falso. Além disso, deve-se notar que não há consenso em estudos bacterianos sobre o tamanho das RFs que devem ser isoladas53,55 e que a seleção de apenas uma subfração de faixa de comprimento pode levar a interpretações erradas dos resultados17. Sugere-se que uma ampla gama de comprimentos característicos para pegadas bacterianas é uma consequência do comportamento ribossomo procariótico em vez da digestão MNase55. Por exemplo, a interação complementar entre o final de 3′ de 16S rRNA em uma pequena subunidade ribossômica e um motivo Shine-Dalgarno no mRNA pode resultar em RF56mais longo . Considerando uma ampla gama de comprimentos de pegadas bacterianas, Mohammad et al. recomenda-se realizar a seleção de tamanho entre 15 e 40nt 17,55. Isso deve levar ao isolamento de potencialmente uma gama de RFs e garantir a obtenção de uma representação abrangente de ribossomos em vários estágios do ciclo translacional. Devido à discussão em curso, a faixa de excisão deve ser considerada com cuidado e é importante lembrar que a escolha incorreta pode excluir algumas subfrações de RF e levar a viés na análise subsequente.

Devido à seleção de tamanho realizada logo após a digestão da nuclease e com omitir o isolamento monossomo por ultracentrifugação, nosso protocolo é rápido, relativamente fácil e pode ser conduzido com um equipamento de laboratório padrão. O uso de kits dedicados para limpeza do RNA e DNA, a purificação do mRNA e da preparação da biblioteca garante a padronização e a repetibilidade. A apreensão de mais volume de etanol durante a limpeza do RNA aumenta a eficiência de purificação dos fragmentos de RNA57de <200 nt . Modificações na preparação da biblioteca - ampliando o tempo de incubação e aumentando a temperatura durante a ligadura dos adaptadores - são aplicadas para diminuir a eficiência de ligadura para o RNA metilado, como o rRNA, e reduzir a contaminação por rRNA58. Nosso protocolo tem sido usado para investigar a regulação da tradução em várias condições de crescimento (publicações em preparação), mas pode ser aplicado para estudar outros aspectos da tradução, como a detecção de TIS ou para melhorar a anotação do genoma e auxiliar estudos proteômicos. Uma modificação adicional ao protocolo, dependendo da questão da pesquisa, pode ser facilmente incluída, por exemplo, interligando o ribossomo com a proteína de interesse ou purificação de afinidade dos ribossomos de interesse resultando nas frações enriquecidas de ribossomos. Com nosso protocolo, o procedimento RIBO-seq é mais acessível para os cientistas e, portanto, pode estimular novas descobertas e acelerar a evolução no campo.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

A ALS gostaria de reconhecer o apoio financeiro dos subsídios de instalação da EMBO IG 3914 e da POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizado no programa First TEAM da Fundação para a Ciência Polonesa co-financiado pela União Europeia no âmbito do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

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References

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Bioquímica Edição 174
RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS
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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

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