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Biochemistry

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

Abstract

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método, en comparación con otros enfoques, es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas en una transcripción de ARNm.

En este artículo, se describen las etapas consecutivas de la recolección de muestras y la preparación para el método RIBO-seq en bacterias, destacando los detalles relevantes para la planificación y ejecución del experimento.

Puesto que el RIBO-seq confía en los ribosomas intactos y los mRNAs relacionados, el paso dominante es la inhibición rápida de la traducción y la desintegración adecuada de células. Por lo tanto, sugerimos la filtración y la congelación flash en nitrógeno líquido para la recolección celular con un pretratamiento opcional con cloranfenicol para detener la traducción en bacterias. Para la desintegración, proponemos moler las células congeladas con mortero y pestle en presencia de óxido de aluminio para alterar mecánicamente la pared celular. En este protocolo, no se requiere un cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa para la purificación del monosoma. En lugar, la separación del mRNA usando la electroforesis del gel de la poliacrilamida (PÁGINA) seguida por la supresión ribosómica de la huella (venda de 28-30 nt) se aplica y proporciona resultados satisfactorios. Esto simplifica en gran medida el método, así como reduce los requisitos de tiempo y equipo para el procedimiento. Para la preparación de la biblioteca, recomendamos usar el pequeño kit de ARN disponible comercialmente para la secuenciación de Illumina de New England Biolabs, siguiendo las pautas del fabricante con cierto grado de optimización.

Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan la cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito da como resultado de 2 a 10 mln lecturas mapeadas de forma única por muestra, lo que proporciona datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es rápido y relativamente fácil y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.

Introduction

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) fue desarrollada en el laboratorio de Jonathan Weissman de la Universidad de California, San Francisco1. En comparación con otros métodos utilizados para estudiar la expresión génica a nivel traslacional, RIBO-seq se centra en cada ribosoma que se une al ARNm y proporciona información sobre su ubicación y el número relativo de ribosomas en una transcripción. Permite monitorizar el proceso de síntesis de proteínas in vivo y puede proporcionar resolución y precisión de un solo codón permitiendo la medición de la densidad del ribosoma tanto en el ARNm individual como a lo largo de todo el transcriptoma de la célula. En la fundación de la técnica RIBO-seq se encuentra el hecho de que durante la traducción el ribosoma se une a la molécula de ARNm y por lo tanto protege el fragmento enterrado de la transcripción de una digestión ribonucleasa. Sobre la adición de la ribonucleasa, el mRNA desprotegido se digiere y los fragmentos encerrados por los ribosomas - típicamente de ~28-30 nt de largo - permanecen intactos. Estos fragmentos, llamados huellas ribosómicas (RF), pueden ser aislados, secuenciados y mapeados en la transcripción de la que se originaron, lo que resulta en la detección de la posición exacta de los ribosomas. De hecho, la capacidad del ribosoma para proteger los fragmentos de ARNm se ha utilizado desde la década de 1960 para estudiar la unión ribosómica y los sitios de iniciación a la traducción (TIS)2,3,4. Sin embargo, con el avance en la tecnología de secuenciación profunda, RIBO-seq se ha convertido en un estándar de oro para el monitoreo de la traducción5 que, a través del compromiso del ribosoma, puede proporcionar una información de todo el genoma sobre la síntesis de proteínas6. El perfilado de ribosomas llenó el vacío tecnológico que existía entre la cuantificación del transcriptoma y elproteoma 6.

Para llevar a cabo el perfilado de ribosomas necesitamos obtener el lisoto celular del organismo que había crecido en las condiciones investigadas. La interrupción de estas condiciones durante la recolección y lisis celular puede proporcionar datos poco confiables. Para prevenir esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación repentina en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. Las células pueden ser lisadas por molienda criogénica en un homogeneizador mecánico como un molino mezclador7,8 o un batidor de perlas9,y por trituración a través de una pipeta10 o con una aguja11. El tampón de lisis se puede agregar justo antes o poco después de la pulverización de las células. En nuestro protocolo utilizamos nitrógeno líquido para preenfriar mortero y pestle, así como óxido de aluminio como un enfoque más suave para la interrupción de la pared celular bacteriana, lo que evita la cizalladura de ARN que a menudo se encuentra cuando se aplican métodos como la sonificación. Después de la pulverización, añadimos un tampón de lisis helada en el contenido enfriado del mortero. La selección de un tampón de lisis adecuado es importante para obtener la mejor resolución de las huellas ribosómicas. Dado que la resistencia iónica afecta tanto al tamaño de RF como a la precisión del marco de lectura, actualmente se recomienda utilizar tampones de lisis con baja resistencia iónica y capacidad de tampón, incluso si parece que la composición del tampón no afecta a la ocupación ribosómica en arns11,12. Los componentes importantes del tampón de lisis son los iones de magnesio, cuya presencia impide la disociación de las subunidades ribosómicas e inhibe los cambios conformacionales espontáneos en los ribosomas bacterianos11,13. Los iones de calcio también juegan un papel importante y son esenciales para la actividad de la nucleasa microcócica (MNase) utilizada en el método de perfilado de ribosomas bacterianos14. La adición de guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un análogo no hidrolizable de GTP, junto con cloranfenicol inhibe la traducción durante la lisis15.

Cuando se obtiene el lisato, se clarifica por centrifugación y se divide en dos porciones, cada una para un RIBO-seq y una secuenciación de ARNm total de alto rendimiento (ARN-seq) ya que se realizan simultáneamente (Figura 1). El ARN-seq proporciona un punto de referencia que permite la comparación de datos tanto de RIBO-seq como de ARN-seq durante el análisis de datos. El translatoma investigado se define por la normalización de las huellas ribosómicas a la abundancia deARNm 16. Los datos de RNA-seq también pueden ayudar a identificar artefactos de clonación o secuenciación17.

Figure 1
Figura 1. Schematics of mRNA sample preparation for RIBO-seq and RNA-seq. Para la preparación de la biblioteca RIBO-seq, el ARN se digiere con MNase (A), seguido por la selección del tamaño de RF de ~28-30 nt de longitud (B); para el ARN-seq el ARN se aísla (c), agotado del rRNA (d), y el mRNA resultante se hace fragmentos aleatoriamente en los fragmentos de longitudes diversas (e). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los pasos iniciales del procedimiento de preparación de muestras para RIBO-seq y ARN-seq difieren ligeramente (Figura 1). Para el perfilación ribosómica, el lisoto necesita ser digerido por una endonucleasa específica para degradar las moléculas de ARNm no protegidas por los ribosomas. En los protocolos estándar, los monosomas obtenidos son recuperados mediante una ultracentrifugación de cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa8,14. En este artículo, mostramos que este paso no es necesario para aislar la RF requerida para el RIBO-seq en bacterias, así mismo para las células eucariotas18,y que la selección del tamaño de los fragmentos de ARNm de longitud adecuada del gel de poliacrilamida es suficiente.

Para el ARN-seq, el mRNA es obtenido por el agotamiento del rRNA del ARN total - las moléculas del rRNA hibridan a las puntas de prueba biotinylated del oligonucleótido que atan a los perlas magnéticos streptavidin-revestidos. Los complejos rRNA-oligonucleótido-perlas se eliminan de la muestra con un imán dando como resultado una muestra agotada de ARNr19,20. Las moléculas purificadas del mRNA entonces son fragmentadas aleatoriamente por hidrólisis alcalina. Los fragmentos obtenidos de ARNm, así como las huellas ribosómicas se convierten en bibliotecas de ADNc y se preparan para la secuenciación profunda (Figura 2). Esto implica la reparación de los extremos necesarios después de la hidrólisis alcalina (para el mRNA) y de la digestión enzimática (para el RF): dephosphorylation de los extremos 3' seguidos por la fosforilación de los extremos de 5'. Los siguientes pasos son la ligadura de adaptadores y la transcripción inversa para crear insertos de ADNc enmarcados por secuencias requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS) utilizando la plataforma Illumina. La última fase de la preparación de la biblioteca es una reacción de PCR en la que las construcciones se amplifican y etiquetan con códigos de barras específicos de la muestra para permitir la multiplexación y secuenciación de varias muestras en un canal. Antes de la secuenciación, la calidad y la cantidad de las bibliotecas se evalúan mediante la electroforesis en chip de ADN de alta sensibilidad. Las bibliotecas de ADNc con los parámetros adecuados se pueden agrupar y secuenciar. La secuenciación se puede realizar en diferentes plataformas Illumina, como MiSeq, NextSeq o HighSeq, dependiendo del número de bibliotecas, la longitud de lectura requerida y la profundidad de secuenciación. Después de la secuenciación, se realiza el análisis bioinformático.

Figure 2
Figura 2. Preparación de la biblioteca. La preparación de la biblioteca incluye la reparación de los extremos, la ligadura de los adaptadores, la transcripción inversa y la amplificación con código de barras. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

El perfilado de ribosomas es un método universal que puede modificarse y ajustarse fácilmente de acuerdo con la pregunta científica. Originalmente se utilizaba en la levadura1,pero poco después se aplicó a las células bacterianas21, así como a organismos modelo eucariotas como el ratón10,el pez cebra22,la mosca de la fruta23 y Arabidopsis thaliana24. También se utilizó para el estudio de diferentes tipos de ribosomas: citoplasmático, mitocondrial25,26 y cloroplasto27,28. En eucariotas RIBO-seq es comúnmente adaptado y refinado para investigar aspectos específicos de la traducción, incluyendo la iniciación10,11,29,30,31,32,el alargamiento1,10,11,31, 33,ribosoma estancamiento33 y cambio de conformación33. La mayoría de las modificaciones implican el uso de diferentes inhibidores de la traducción. En bacterias sin embargo, estudios análogos han sido difíciles de realizar debido a la escasez de inhibidores con el mecanismo de acción requerido34. El inhibidor de la traducción más comúnmente utilizado en bacterias es el cloranfenicol (CAM) que se une al centro de la peptidil transferasa (PTC) e impide la correcta colocación del aminoacil-ARNt en el sitio A. Como resultado, cam previene la formación de un enlace peptídico que conduce a la detención de los ribosomas alargados35. Otros ejemplos de inhibidores de la traducción en bacterias son la tetraciclina (TET)36,la retapamulina (RET)34 y la Onc11237, que se han utilizado para investigar los sitios de iniciación a la traducción. La TET, que impide la entrega de ARNt al ribosoma mediante la superposición directa con el tallo-as del anticodón del ARNt en el sitio A, se aplicó originalmente para verificar los resultados obtenidos del tratamiento con CAM, ya que ambos son antibióticos que inhiben la elongación de la traducción38. Se encontró que TET detectaba TIS primario, sin embargo, no pudo revelar TIS36interno. Ret se une en el PTC del ribosoma bacteriano, y previene la formación del primer enlace peptídico interfiriendo con un aminoacil-ARNt elongador en el sitio A. La aplicación de RET da lugar a la detención de los ribosomas tanto en el TISs primario como en el interno34. Onc112, un péptido antimicrobiano prolina-rico, ata en el túnel de la salida y bloquea el atascamiento aminoacyl-tRNA en el sitio ribosomal de A. Como resultado, Onc112 evita que los complejos de iniciación entren en la fase de elongación37.

La principal información que proporciona el perfilado de ribosomas es la densidad de los ribosomas y su posición sobre el ARNm. Se aplicó con éxito para investigar la expresión génica diferencial a nivel de traslación en diversas condiciones de crecimiento1,6,medir la eficiencia traslacional1,38,39 y detectar eventos de regulación de la traducción como la pausa ribosómica10. RIBO-seq también permite descubrir la traducción de ncRNA anotado, pseudogenes y pequeños marcos de lectura abiertos no anotados (ORF) que conducen a la identificación de genes codificantes de proteínas nuevos y /o muy cortos10,12,22,30,37. En tales casos, RIBO-seq puede afinar y mejorar la anotación del genoma. Con su alta sensibilidad para la identificación de ORFs traducidos y su naturaleza cuantitativa, el perfilado de ribosomas también puede servir como un proxy para la determinación del proteoma o en la ayuda a los estudios de proteómica31,34,39. Mediante el mapeo de TIS, el perfilado de ribosomas revela isoformas N-terminalmente extendidas y truncadas de proteínas conocidas10,32. RIBO-seq también se adaptó para estudiar el plegamiento co-traslacional de proteínas14,21,24. Este método permite medir las tasas de elongación1,10,39 o velocidades de decodificación de codones individuales6 y ayuda en el desarrollo de modelos cuantitativos de traslación17. El método de perfilado de ribosomas también es capaz de proporcionar información mecanicista sobre la pausa del ribosoma en bacterias7,15,17,cambio de marco40,lectura de codones de parada21,defectos de terminación /reciclaje41,42 y cambios de conformación ribosómica33 en eucariotas. RIBO-seq también se adaptó para examinar el impacto de factores específicos de acción trans en la traducción, como los miRNAs6 y las proteínas de unión a ARN en eucariotas16,43. Sin embargo, es importante reconocer que el diseño experimental y la resolución obtenida de RIBO-seq determinan la cantidad de información que puede ser extraída de los datos de secuenciaciónresultantes 12.

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Protocol

1. Recogida de muestras

  1. Preparar un cultivo bacteriano. Recomendamos un volumen de cultivo de 100 mL por muestra.
  2. Preparar equipos y reactivos para la recolección de muestras: dos scápulas por muestra, filtros estériles de membrana de ésteres de celulosa (MCE) mixtos de 0,45 μm, tubos estériles de 50 mL, nitrógeno líquido, 50 mg/mL de cloranfenicol en etanol al 70% (vol/vol) (opcional). Pinchar la tapa de tubos de 50 mL para permitir la evaporación de nitrógeno líquido y evitar la explosión de tubos cerrados. Descontaminar las escápulas con detergente de laboratorio y etanol al 70%.
  3. Preguerra el equipo de filtrado y una de las scoopulas a temperatura de crecimiento del cultivo bacteriano.
    NOTA: Recomendamos un aparato de filtración totalmente de vidrio con un embudo, una base fritada, un matraz de unión a tierra y una abrazadera de resorte Ø de 47 mm.
  4. Antes de la recolección de la muestra, agregue cloranfenicol en el cultivo bacteriano a la concentración final de 100 μg/mL e incube 1 minuto (opcional).
  5. Vierta nitrógeno líquido en un tubo estéril de 50 mL y coloque la segunda cápula dentro del tubo para enfriar.
    ¡cautela! El nitrógeno líquido puede hacer que los contenedores cerrados exploten debido al cambio de presión tras la evaporación. Para evitar esto, es necesario crear algunos agujeros en la tapa de los tubos de 50 mL para permitir la evaporación del nitrógeno líquido.
  6. Recoger las células por filtración. Deje de filtrar cuando el medio haya pasado a través de la membrana, pero no permita que el filtro se seque por completo.
  7. Recoger pellets bacterianos raspando rápidamente las células fuera del disco del filtro utilizando una cápula preguerra. Coloque inmediatamente toda la cápula con las células cosechadas en el tubo de 50 mL lleno de nitrógeno líquido. El pellet cosechado debe estar completamente cubierto de nitrógeno líquido.
  8. Deje que el pellet se congele a fondo y desaloje las células congeladas usando una segunda cápula previamente enfriada. Cierre la tapa perforada y transfiera el tubo a -80 °C. Punto de parada
    NOTA: Desinfecte las scápulas después de cada recolección de muestras.

2. Lisis celular

  1. Preparar tubos de reacción GMP-PNP de 0,1 M en 10 mM Tris pH 8, DNasa I y 1,5 mL de tubos de reacción para los lisatos y mantenerlos en hielo. Enfriar la centrífuga a 4 °C.
  2. Preparar tampón de lisis (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoetanol, 5 mM CaCl2 y cloranfenicol opcional de 1 mM). Alícuota 500 μL del tampón de lisis por muestra en tubos de reacción de 1,5 mL y colóquelos en hielo.
  3. Descontaminar mortero y pestle con un detergente de laboratorio y etanol al 70%, y secarlos. Enfríe el mortero y el pestle vertiendo nitrógeno líquido en el mortero.
  4. Transfiera el pellet congelado al mortero preenfriado y muele en polvo. Con una espátula, agregue aproximadamente 1 volumen de óxido de aluminio y continúe moliendo. Mantenga el mortero, el pestle y las células frescas vertiendo nitrógeno líquido cuando sea necesario, no deje que el contenido del mortero se descongele.
  5. Justo antes de usar el tampón de lisis, agregue GMP-PNP y DNasa I en la alícuota del tampón de lisis hasta la concentración final de 2 mM y 100 U/mL respectivamente. Transfiera la solución al mortero con células y óxido de aluminio y continúe moliendo. Deje que el lysate se descongele lentamente mientras se muele y transfiera la mezcla al tubo de reacción de 1,5 mL preenfriado y colóquela inmediatamente sobre el hielo.
  6. La centrífuga se liste a 20 000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Transfiera sobrenadantes a tubos de reacción nuevos de 1,5 mL preenfriados y manténgalos en hielo.
  7. Mida la concentración de ARN en cada muestra con un NanoDrop. Utilice diluciones 1:10 de muestras y 1:10 dilución de tampón de lisis en agua libre de nucleasas como un espacio en blanco.
    NOTA: Tenga en cuenta que el cloranfenicol muestra una absorción significativa a 260 nm.
  8. Divida cada lysate en dos porciones: una para RIBO-seq (0.5 - 1 mg. de ARN) y la segunda para RNA-seq (el resto).
  9. Limpie las muestras para RNA-seq utilizando un kit de limpieza de ARN disponible en el comercio de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    NOTA: Recomendamos usar el kit Zymo RNA Clean &Concentrate -25 (ver Tabla de Materiales). También recomendamos agregar 4.5 volúmenes de etanol (en comparación con el volumen de la muestra) en la mezcla de muestra y tampón de unión para huellas ribosómicas y ARNm fragmentado, con el fin de aumentar la eficiencia de purificación de fragmentos cortos de ARN.
  10. Almacene las muestras destinadas a RNA-seq a -80 °C. El procedimiento para el ARN-seq continuará a partir del paso 5.

3. Digestión de MNase de muestras para RIBO-seq

  1. A 1 mg de ARN añadir 3,8 μL de 187,5 U/μL MNasa en 10 mM Tris pH 8 y recargarlo con tampón de lisis al volumen total de 500 μL.
  2. Incubar a 25 °C, 300 RPM, durante 45 minutos en un termomezclador.
  3. Limpie las muestras con un kit de limpieza de ARN disponible en el comercio (como en el paso 2.9).
  4. Almacene las muestras para RIBO-seq a -80 °C (punto stop) o proceda a la selección de tamaño.

4. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y selección de tamaño de muestras para RIBO-seq

  1. Prepare un gel de poliacrilamida-TBE al 15% con urea de 8 M y colóquelo en un tanque con tampón TBE. Pre-funcionamiento durante un mínimo de 10 minutos a una tensión constante de 200 V.
  2. Mezcle las muestras con TBE-Urea Sample Buffer, desnaturalizar a 95 °C durante 1 minuto y colocarlas inmediatamente sobre hielo.
  3. Lave la urea inyectando tampón de TBE en los pocillos de gel con una jeringa. Cargue las muestras dejando un espacio de pozo entre ellas para separar cada muestra y evitar la contaminación cruzada. Utilice oligonucleótidos de 29 nt y una mezcla de oligonucleótidos de 26 nt y 32 nt como marcadores. Ejecute la electroforesis a un voltaje constante de 180 V.
  4. Preparar tampón estéril para incubación nocturna (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Después de la electroforesis, manche el gel en un baño SYBR Gold durante aproximadamente 2-3 minutos y enjuague el gel con agua sin nucleasa.
  6. Eliminar fragmentos de gel entre 26 y 32 nt con las agujas estériles o las cuchillas de afeitar y colocar los fragmentos de gel en tubos separados de 1,5 mL para cada muestra. Cambie la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras.
  7. Añadir 200 μL del tampón de incubación durante la noche a cada tubo de reacción.
  8. Incubar las muestras a 10 °C, 1000 RPM durante la noche en un termomezclador.
  9. Al día siguiente, limpie las muestras como en el paso 2.9. Elute las huellas en 80 μL de agua libre de nucleasa.
  10. Almacene las muestras a -80 °C. Punto de parada. El procedimiento para RIBO-seq continuará desde el paso 7.

5. Purificación del ARNm bacteriano por depleción de ARNr a partir de muestras de ARN-seq

  1. Elimine el ARNr de las muestras con un kit de purificación de ARNm bacteriano (por ejemplo, Invitrogen MICROBExpress). Siga el protocolo del fabricante.
  2. Limpie las muestras como en el paso 2.9. Elute el mRNA en 50 μL de agua sin nucleasa.
  3. Almacene las muestras para RNA-seq a -80 °C (punto stop) o continúe con la fragmentación alcalina.

6. Fragmentación alcalina de muestras para ARN-seq

  1. Preparar tampón de hidrólisis alcalina (mezclar 220 μL de 0,1 M NaHCO3,30 μL de 0,1 M Na2CO3 y 1 μL de 0,5 M EDTA). Mezclar 1 volumen (50 μL) de tampón alcalino con 1 volumen (50 μL) de la muestra e incubar a 95 °C durante 25 minutos.
  2. Añadir 5 μL de NaOAc 3 M pH 5.5 para detener la reacción.
  3. Limpie las muestras como en el paso 2.9 y eluda las muestras en 80 μL de agua libre de nucleasa.
  4. Posible punto de parada: almacenar muestras de ARN-seq a -80 °C. Sin embargo, recomendamos ir directamente al paso 7 para evitar la congelación y descongelación innecesarias.

7. Desfosforilación y fosforilación de muestras tanto para ARN- como para RIBO-seq

  1. Añadir 10 μL de tampón de reacción 10x PNK y 5 μL T4 PNK a cada muestra. Incubar a 37 °C durante 1,5 horas para desfosforilar los extremos de 3'.
  2. Añadir 3 μL de 1 mM de ATP e incubar a 37 °C durante 1 hora para fosforilar los extremos de 5'.
  3. Limpie las muestras como en el paso 2.9, eluda en agua libre de nucleasa de 30 μL.
  4. Almacene las muestras a -80 °C. Punto de parada.

8. Preparación de la biblioteca utilizando NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set para Illumina

  1. Preparar 100-1000 ng de ARN de entrada (fragmentos de ARNm obtenidos y huellas ribosómicas) en 6 μL de agua libre de nucleasa y añadir 1 μL de adaptador SR de 3'. Incubar según el protocolo del fabricante.
  2. Añadir 10 μL de tampón de reacción de ligadura de 3' (2X) y 3 μL de mezcla de enzimas de ligadura de 3' e incubar a 37 °C durante 2,5 horas, en lugar de 1 hora a 25 °C como especifica el protocolo del fabricante.
  3. Hibridar el Cebador de Transcripción Inversa según el protocolo del fabricante con un programa modificado: 5 minutos a 75 °C, 30 minutos a 37 °C y mantener a 4 °C.
  4. Ligate el 5' SR Adaptador. Siga el protocolo del fabricante con un cambio: realice la incubación a 37 °C durante 2,5 horas, en lugar de 1 hora a 25 °C.
  5. Realice la transcripción inversa según el protocolo del fabricante.
  6. Posible punto stop: incubar las muestras que contienen cDNA sintetizados a 70 °C durante 15 minutos para inactivar la transcriptasa inversa y almacenarlas a -80 °C. Sin embargo, recomendamos proceder directamente a los siguientes pasos para evitar la congelación innecesaria y el descongelamiento de las muestras.
  7. Almacene la mitad de cada biblioteca de ADNc a -80 °C como copia de seguridad.
  8. Realizar la amplificación por PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice la mitad de la mezcla de reacción. Almacene las bibliotecas obtenidas a -80 °C. Punto de parada.

9. Selección de tamaño de las bibliotecas de ADNc usando PAGE

  1. Prepare un gel de poliacrilamida-TBE al 6% y colóquelo en un tanque con tampón TBE. Pre-funcionamiento durante un mínimo de 10 minutos a una tensión constante de 200 V.
  2. Mezcle las muestras con Gel Loading Dye, Blue (6X) y cárguelas en el gel. Utilice Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest como escalera. Al principio, ejecute la electroforesis a un voltaje constante de 120 V para permitir que el ADN ingrese al gel y luego cambie el voltaje a 180 V.
  3. Cuando termine la electroforesis, manche el gel en un baño SYBR Gold durante aproximadamente 2-3 minutos y enjuague el gel con agua sin nucleasa.
  4. Suprimir fragmentos de gel que contienen las bibliotecas. Para muestras de ARN-seq entre 135-180 nt y para RIBO-seq entre 135-170 nt. Use una aguja estéril o una cuchilla de afeitar y coloque los fragmentos de gel suprimidos en tubos de reacción separados de 1,5 mL. Recuerde cambiar la aguja o la cuchilla de afeitar entre las muestras.
    NOTA: Los adaptadores y el código de barras de NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina tienen 119 nt en total, lo que determina el corte de escisión inferior.
  5. Añadir 100 μL de agua sin nucleasa a cada fragmento de gel suprimido.
  6. Incubar los fragmentos de gel a 10 °C, 450 RPM durante la noche en un termomezclador.
  7. Limpie y concentre las bibliotecas de ADNc con un kit comercial de limpieza de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    NOTA: Recomendamos usar el kit Zymo DNA Clean &Concentrate -5 (ver Tabla de Materiales).
  8. Almacene las bibliotecas de ADNc purificadas a -80 °C. Punto de parada.

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Representative Results

Los resultados ejemplares presentados aquí se obtuvieron en un estudio que examina la regulación de la traducción en células de los subtilis del Bacilo wt esporulantes. Los cultivos nocturnos se diluyeron a OD600 igual a 0,1 en 100 mL de medio rico y se incubaron a 37 °C con agitación vigorosa hasta que OD600 alcanzó 0,5-0,6. El medio rico fue reemplazado por un medio mínimo para inducir el proceso de esporulación y la incubación se continuó hasta por cuatro horas. Las células fueron cosechadas cada hora comenzando con T0 - inducción de la esporulación - dando por resultado cinco puntos de tiempo. Un minuto antes de la cosecha, los cultivos fueron tratados con cloranfenicol como se describe en el protocolo anterior. Las células se recolectaron por filtración en un sistema de filtración de vidrio precalentado utilizando filtros mixtos de membrana de ésteres de celulosa (MCE) de 0,45 μm y congelados en nitrógeno líquido.

La cantidad de ácido ribonucleico obtenida en el lisato depende de las condiciones de crecimiento, volumen de cultivo y densidad. Siguiendo nuestro protocolo, 100 mL del cultivo bacteriano(Bacillus subtilis)produce 1-4 mg de ARN en promedio. Ejemplos de lisatos obtenidos del experimento descrito anteriormente se muestran en la Tabla 1.

Concentración de ARN [ng/μL] Cantidad de ARN [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tabla 1. Concentración de ARN y cantidad en muestras representativas de B. subtilis lysates. La tabla incluye muestras del tipo salvaje (WT) B. subtilis que fueron cosechadas antes de la inducción de esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de esporulación. La lisis se realizó con 550 μL de tampón de lisis que contenía cloranfenicol. Se puede notar que a medida que avanza la esporulación disminuye la cantidad de ARN obtenido.

Cuando la cantidad de ARN es inferior a 1 mg, 0,25 mg de ARN se utiliza para RIBO-seq en lugar de 1-0,5 mg y la cantidad de MNasa se ajusta respectivamente. La cantidad representativa de ARN y la concentración después de la digestión de la nucleasa se muestra en el Cuadro 2. La cantidad promedio de ARN después de la digestión y la limpieza es de 50 μg de 0,5 mg de entrada de ARN.

Concentración de ARN [ng/μL] Cantidad de ARN [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tabla 2. La cantidad y concentración de ARN después de la digestión de la nucleasa de las muestras representativas para RIBO-seq. La tabla incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a muestras para RIBO-seq. Porque la concentración del ARN de la muestra de WT4-R era baja, el magnesio 0,25 del ARN fue digerido, mientras que el magnesio 0,5 del ARN para las muestras restantes fue utilizado para la generación ribosómica de la huella. La cantidad de MNase para la digestión era 178,125 U para el magnesio 0,25 del ARN en WT4-R, y 356,25 U para el magnesio 0,5 del ARN en otras muestras. Después de la digestión, las muestras se limpiaron con el kit de limpieza de ARN comercial y la concentración de ácido ribonucleico se midió con el NanoDrop.

Después de la digestión de MNase, la selección del tamaño se realiza con la ayuda de PAGE. Un ejemplo de un gel de poliacrilamida de TBE-urea al 15% con las muestras digeridas se muestra en la Figura 3. Los fragmentos del gel entre 26 y 32 NT fueron suprimidos con una lámina estéril de la maquinilla de afeitar e incubados durante la noche en el almacenador intermediario de noche de la incubación. Al día siguiente, las huellas ribosómicas se limpiaron con el kit comercial de limpieza de ARN.

Figure 3
Figura 3. Gel de poliacrilamida TBE-urea al 15% con muestras representativas después de la digestión de la MNasa. La figura incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a muestras para RIBO-seq. Se cargaron 15 μL de muestras desnaturalizado en los pozos de gel en orden: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R y el volumen restante se almacenó a -80 °C como respaldo. Se utilizaron como marcadores oligonucleótidos de 29 nt y mezcla de oligonucleótidos de 26 nt y 32 nt. La electroforesis fue realizada según lo descrito arriba y el gel fue manchado en un oro-baño de SYBR. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Paralelamente a la digestión de la nucleasa, los lisatos para RNA-seq se limpiaron con el kit comercial de limpieza de ARN y las concentraciones obtenidas de ARN se midieron con NanoDrop. Los resultados representativos se presentan en el Cuadro 3. Después de la limpieza, la cantidad de ácido ribonucleico disminuyó a 40-500 μg.

Concentración de ARN [ng/μL] Cantidad de ARN [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabla 3. Cantidad de ARN y concentración de muestras para RNA-seq después de la purificación de ARN. La tabla incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "m" se refiere a muestras de ARN-seq (ARNm).

Las concentraciones obtenidas del ARN de las muestras para el ARN-seq fueron utilizadas para definir la entrada del ARN para el agotamiento del rRNA. Se utilizaron 8 μg de ARN de cada muestra de ARN-seq con el kit de purificación de ARNm bacteriano MICROBExpress (ver Tabla de Materiales) deacuerdo con el protocolo del fabricante y se limpiaron con el kit de limpieza de ARN comercial posteriormente. Los resultados representativos de la depleción del ARNr se muestran en la Tabla 4.

Concentración de ARN [ng/μL] A260/A280 A260/A230 Cantidad de ARN [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabla 4. La cantidad representativa del ARN y la concentración después del agotamiento del rRNA. La tabla incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "m" se refiere a muestras para ARN-seq. 8 μg de ARN de muestras para RNA-seq se utilizaron para el agotamiento de ARNr y se limpiaron con un kit comercial de limpieza de ARN después.

A continuación, el ARNm obtenido se fragmentó por hidrólisis alcalina y se limpió con un kit comercial como se describe en el protocolo. El mRNA hecho fragmentos y las huellas ribosomales fueron dephosphorylated en 3' extremos y phosphorylated en 5' extremos según el protocolo antedicho. Las muestras se utilizaron para construir bibliotecas de ADNc para la secuenciación de Illumina, como se describe en el protocolo. La Figura 4 muestra un ejemplo de un gel de poliacrilamida al 6% con las bibliotecas obtenidas. Los fragmentos del gel en la gama de 135-180 nt para el ARN-seq y de 135-170 nt para RIBO-seq fueron suprimidos con las láminas estériles de la maquinilla de afeitar e incubados durante la noche en agua nucleasa-libre. Las bibliotecas se limpiaron con un kit comercial de limpieza de ADN y la calidad y cantidad se evaluaron mediante una electroforesis de ADN en chip de alta sensibilidad utilizando el Bioanalizadora Agilent 2100.

Figure 4
Figura 4. Gel de poliacrilamida al 6% de las bibliotecas de ADNc antes y después de la selección del tamaño. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest se utilizó como escalera. Se cargaron 25 μL de muestras en el gel en el siguiente orden: tres bibliotecas RIBO-seq y seis bibliotecas RNA-seq. Los volúmenes restantes de muestras se almacenaron a -80 °C como respaldo. La figura incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que fueron cosechadas una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a muestras para RIBO-seq y la letra "m" se refiere a muestras para RNA-seq. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los ejemplos de imágenes de gel virtual y electroferogramas obtenidos del Bioanalizador Agilent 2100 se muestran en la Figura 5. Las bandas y picos que representan las bibliotecas RIBO-seq son más estrechos y están mejor definidos en comparación con estos que representan las bibliotecas de ARN-seq. De acuerdo con la electroforesis en chip, las bibliotecas tienen aproximadamente 150 pb de largo, que es un tamaño de biblioteca esperado. Los adaptadores y el código de barras utilizado en la preparación de la biblioteca son de 119 nt de largo y las inserciones son de 29-30 nt de largo (para RIBO-seq) o en un rango entre 25 y 50 nt (para RNA-seq). Los picos adicionales más cercanos a los 200 pb obtenidos de las bibliotecas RIBO-seq pueden indicar artefactos de PCR que pueden descartarse durante el análisis bioinformático cuando se recortan los datos obtenidos de la secuenciación y se filtra el ARNr/ARNt. La cantidad media de ADN es de 32 ng proporcionando suficiente cantidad de material necesario para la secuenciación de próxima generación.

Figure 5
Figura 5. Los ejemplos de electroferogramas e imágenes de gel virtual de una electroforesis de ADN en chip de alta sensibilidad. La figura incluye muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y una hora (1), dos (2), tres (3) o cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a las bibliotecas RIBO-seq y la letra "m" se refiere a las bibliotecas RNA-seq. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Después del control de calidad por electroforesis en chip, las bibliotecas se agruparon para la secuenciación de 50 pb de un solo extremo en la plataforma NextSeq500 de Illumina (10 bibliotecas por canal, con un mínimo de 350 mln de lecturas por canal). La secuenciación produjo 30-57 millones de lecturas por muestra para las bibliotecas de ARN-seq y 30-50 millones de lecturas por muestra para las bibliotecas RIBO-seq. El recorte de los adaptadores y las secuencias de mala calidad dieron como resultado 24-47 mln de lecturas por muestra para muestras de ARN-seq y 25-50 mln de lecturas por muestra para muestras ribo-seq. El mapeo, realizado con STAR44,produjo 2.4-9.6 millones de lecturas mapeadas de forma única por muestra para muestras de ARN-seq (que constituyen 8-16.8% del número total de lecturas) y 2.3-10.4 millones de lecturas mapeadas de manera única (7.7-22.1%) para muestras RIBO-seq. Los datos obtenidos fueron el control de calidad comprobado con FastQC45. Ejemplos de las gráficas de calidad producidas por FastQC para las secuencias recortadas se muestran en la Figura 6. Las secuencias de la longitud de interés, que es de <32 nt para RIBO-seq y <50 nt para RNA-seq, presentaron muy buena calidad. Los ejemplos de gráficas de contenido gc y distribuciones de longitudes de secuencia sobre todas las secuencias recortadas se muestran en la Figura 7. El pico adicional al 72% en la gráfica de distribución de GC de la biblioteca RIBO-seq puede potencialmente indicar contaminación por ARNr que puede eliminarse durante el análisis bioinformático por filtración de ARNr46,47,48. La distribución de longitudes de secuencia es muy estrecha para las bibliotecas RIBO-seq, con un pico en 26-27 nt, mientras que la distribución de longitud para las bibliotecas RNA-seq es más amplia y oscila entre 15 y 50 nt.

Figure 6
Figura 6. Los ejemplos de diagramas de caja y bigotes de puntuaciones de calidad en todas las bases para las bibliotecas RIBO-seq y RNA-seq después del recorte. La figura incluye muestras del tipo salvaje (WT) B. subtilis que se cosecharon antes de la inducción de la esporulación (0) y cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a las muestras RIBO-seq y la letra "m" se refiere a las muestras de ARN-seq. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Los ejemplos de gráficas de contenido gc y distribución de la longitud de la secuencia de todas las secuencias para las bibliotecas RIBO-seq y RNA-seq después del recorte. La figura muestra muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que fueron cosechadas cuatro (4) horas después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a la muestra para RIBO-seq y la letra "m" se refiere a la muestra para RNA-seq. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Para verificar si los datos ribo-seq proporcionan información sobre huellas ribosómicas verdaderas en lugar de fragmentos aleatorios de ARNm de la longitud seleccionada, se compararon los datos de secuenciación de RIBO-seq y ARN-seq utilizando RiboToolkit, un servidor web para el análisis de datos RIBO-seq49. Los datos de Ribo-seq exhiben una periodicidad triplete y un pico alto y estrecho correspondiente a los ribosomas iniciadores y característicos de la RF como se muestra en la Figura 8A,que no se observa en los datos de ARN-seq(Figura 8B). Por otra parte, la gráfica de metagenes que muestra los perfiles de cobertura promedio de fragmentos de RF y ARNm en las secuencias de codificación (CDSs) reveló una mayor proporción de lecturas mapeadas a los CDS en el conjunto de datos RIBO-seq(Figura 8C),como se esperaba.

Figure 8
Figura 8. Diagramas de periodicidad del metagene y cobertura media de los fragmentos de RF y mRNA en cdss. Los perfiles de Metagene se obtuvieron con RiboToolkit, un servidor web integrado49. La longitud del CDS fue normalizada a un valor de 1 y cada CDS fue dividido en 100 bins iguales. La figura muestra muestras del tipo silvestre (WT) B. subtilis que fueron cosechadas una (1) hora después de la inducción de la esporulación; la letra "R" se refiere a la muestra para RIBO-seq y la letra "m" se refiere a la muestra para RNA-seq. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Para comparar si el protocolo RIBO-seq presentado aquí produce resultados similares a los obtenidos por el método estándar de recuperación de RF (ultracentrifugación de gradiente de sacarosa), se paralelizó los resultados de secuenciación de las bibliotecas preparadas siguiendo los dos métodos. Los experimentos que investigaron la regulación de la traducción durante la esporulación en el WT B. subtilis se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo RIBO-seq presentado, así como siguiendo el protocolo estándar que incluye la recuperación de monosomas por ultracentrifugación de gradiente de sacarosa. Los resultados de los perfiles de cobertura de ribosoma obtenidos de los dos experimentos se muestran en la Figura 9. La visualización de los FR mapeados es muy similar entre los dos experimentos y arrojó resultados similares tras el análisis bioinformático.

Figure 9
Figura 9. La visualización de la RF obtenida mapeada en el genoma. La figura incluye la RF obtenida a partir de subtilis silvestres tipo B. cosechadas cuatro horas después de la inducción de la esporulación y preparadas según el protocolo estándar (WT4-R-s, panel superior) o el protocolo presentado (WT4-R, panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

El desafío técnico clave del perfilado de ribosomas es la necesidad de inhibir rápidamente la traducción para capturar una instantánea de ribosomas en ARNm en un estado fisiológico particular de interés. Para lograr esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación flash en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. La aplicación de antibióticos es opcional, ya que pueden causar artefactos. El cloranfenicol es un fármaco de uso común para detener los ribosomas alargados en ribo-seq bacteriano. Sin embargo, no impide la iniciación, dando lugar a una acumulación de ribosomas unos seis codones aguas abajo del sitio de iniciación de la traducción14. Por otra parte, su capacidad de inhibir la reacción del peptidyltransferase puede ser dependiente en la naturaleza de los substratos ribosomales del P y del Uno-sitio. Presumiblemente, cam arresta los ribosomas más eficazmente con Gly, Ala, Ser, Cys, o Thr como penúltimo aminoácido del péptido naciente17,38,50. Esto vale la pena tenerlo en cuenta durante el diseño experimental y el análisis bioinformático, especialmente cuando se estudia la pausa ribosómica17. También se ha demostrado que la CAM influye en la precisión de la traslación mediante la promoción de una lectura del codón de parada y el cambio de fotogramas51. Aún así, la inhibición de la CAM es relativamente rápida y suficiente para la investigación típica de RIBO-seq14 y no induce la malacorporación51. Algunos de los artefactos causados por los antibióticos se pueden evitar aumentando la cantidad de la droga9. La concentración de CAM aplicada en nuestro protocolo es la cantidad típica utilizada en los experimentos RIBO-seq7,14,21,sin embargo, la concentración puede variar para diferentes microorganismos y debe optimizarse antes de la recolección de la muestra. Debido a la posibilidad de una aparición de artefactos causados por la aplicación de inhibidores de la traducción, se recomienda evitar el tratamiento con inhibidores si no es necesario para la pregunta de investigación y si la cosecha rápida es posible14. La recolección rápida de células es crucial, especialmente si se realiza sin el tratamiento con inhibidores, ya que la recolección prolongada puede resultar en una pérdida de polisomas y/o un cambio en el traductoma como respuesta a las condiciones ambientales cambiantes14. Por lo tanto, recomendamos utilizar la filtración como método de cosecha, ya que se puede realizar en las mismas o similares condiciones que el crecimiento del cultivo, incluida la temperatura y / o agitación. Durante la filtración, las células recogidas en la superficie del filtro se enjuaguen constantemente con medio de crecimiento, lo que les impide detectar cambios en las densidades celulares, la oxigenación y el nivel de aminoácidos y otros nutrientes14. La filtración es más suave y puede ser más rápida que la centrifugación, si la densidad del cultivo es moderada, de lo contrario un gran número de células pueden obstruir los poros del filtro y ralentizar el proceso. Si existe una probabilidad de una filtración prolongada, recomendamos un tratamiento previo al cloranfenicol del cultivo, que resulta en una detención de traducción y permite extender el tiempo de cosecha. Si la filtración se vuelve difícil de completar debido a la obstrucción del filtro, sugerimos detener la filtración, eliminar el exceso de cultivo y congelar la fracción de congelación del cultivo recogido en el filtro. Observamos que 50 mL de cultivo bacteriano denso es suficiente para realizar RIBO-seq. La posterior congelación flash de células en nitrógeno líquido es el enfoque más universal y eficaz para detener inmediatamente la traducción8,21,52.

La digestión de la ribonucleasa es un paso crítico requerido para obtener RF de buena calidad. La selección de la enzima correcta es importante ya que las subunidades ribosómicas están compuestas de moléculas de ARN que se pueden digerir, interrumpiendo la integridad del ribosoma, causando contaminación por ARNr y destruyendo rf44. Originalmente, la ARNasa I se utilizaba para la digestión del ARNm y la generación de RF en eucariotas1. Dado que esta enzima parecía inactiva en las bacterias, fue reemplazada por una nucleasa microcócica (MNase) de Staphylococcus aureus21. Más tarde se demostró que la RNAse I puede de hecho realizar la digestión de muestras bacterianas, sin embargo, la MNasa sigue siendo comúnmente utilizada para este propósito53. La desventaja de la MNasa radica en el sesgo de secuencia de su actividad catalítica, que es 30 veces mayor proximal a A o T, lo que resulta en el 80% de los fragmentos de ARNm que comienzan con A o T en el extremo 5′14. Sin embargo, esto ha sido superado por la observación de que la mayor parte de la variación en la longitud se produce en el extremo 5′de RF, y la asignación de densidad ribosoma al extremo 3′ produce información precisa y precisa sobre la posición del ribosoma7. La actividad de la MNasa se ve afectada por la concentración enzimática, el pH y el tiempo de digestión y debe determinarse para cada nuevo lote de MNasa. Una actividad nucleasa creciente da lugar a la contaminación creciente del rRNA, mientras que la actividad disminuida causa la hendidura menos exacta de huellas ribosomales. Esto puede reducir el rendimiento global de RF en el procedimiento de purificación de gel selectivo de tamaño y proporcionar información menos precisa sobre las posiciones de ribosoma en el ARNm14. Por lo tanto, la cantidad requerida de MNase debe determinarse cuidadosamente. Para nuestros experimentos aplicamos 712,5 U de nucleasa microcócica por 1 mg de ARN mientras que la concentración reportada en la literatura varía entre 50 U38,450 U34,1000 U14 y 1500 U15,21,36 por 1 mg de ARN. Como se mencionó anteriormente, la MNasa requiere la presencia de iones de calcio para su actividad. En los protocolos estándar EGTA, un agente quelante para iones divalentes que tiene una mayor afinidad por el calcio en comparación con el magnesio54,se utiliza para detener la digestión mediante la unión de calcio e inactivación de la MNasa. Sin embargo, en nuestro protocolo la reacción de digestión se detiene mediante el uso de kit de limpieza de ARN directamente después de la incubación con la nucleasa.

En los protocolos estándar, el siguiente paso es la recuperación de los ribosomas mediante una ultracentrifugación del cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa8,14. Una centrifugación de gradiente de sacarosa permite la separación selectiva de los monosomas de las subunidades y polisomas, sin embargo, requiere un equipo específico como un mezclador de gradiente y una ultracentrífuga. Además, el rendimiento de este método está limitado a 500-700 μL del lisato. Por otro lado, el cojín de sacarosa de ultracentrifugación de pellets de la mayoría de las partículas ribosómicas, permite el procesamiento de más de una docena de mililitros de liso y es menos exigente en cuanto a la instrumentación necesaria. Sin embargo, ambos enfoques son largos, ya que toman un mínimo de 4 a 6,5 horas14 y requieren una ultracentrífuga. En nuestro protocolo se omite este paso ya que procedemos directamente a la selección del tamaño en gel de poliacrilamida TBE-urea al 15%. La electroforesis se realiza en condiciones de desnaturalización con el fin de desplegar las estructuras secundarias del ARN y prevenir las interacciones intramoleculares. Utilizamos oligonucleótidos de 26 nt, 29 nt y 32 nt como marcadores para excising una gama estrecha de huellas ribosomales. Suponemos que la concentración de la RF real excede significativamente la contaminación potencial con rf falsa considerada como aleatoria, desprotegida por el ribosoma mRNA o rRNA fragmentos de longitud en ese rango. Los resultados obtenidos usando nuestro protocolo demostraron de hecho la fracción enriquecida del RF en la gama seleccionada del tamaño. El control de calidad con el Agilent 2100 Bioanalyzer muestra las bibliotecas RIBO-seq como bandas y picos únicos y bien definidos, en contraste con las bibliotecas de ARN-seq que se visualizan como frotis y picos significativamente más anchos(Figura 5). Asimismo, los datos de Ribo-seq obtenidos exhiben una periodicidad triplete(Figura 8A),que no se observa en los datos de ARN-seq(Figura 8B). Por otra parte, las visualizaciones de la RF obtenida mapeada sobre el genoma muestran patrones de expresión muy similares independientemente del método de aislamiento de huellas que se confirmó aún más en nuestros análisis bioinformáticos (Figura 9). Aún así, somos conscientes de que la RF falsa podría mapear al genoma lo que puede perturbar la señal obtenida. Sin embargo, el hecho de que los RF falsos se generen aleatoriamente implica que no deben acumularse en un solo lugar en el genoma y, por lo tanto, no deben dar lugar a artefactos y resultados falsos. Asimismo, hay que señalar que no existe consenso en los estudios bacterianos respecto al tamaño de los FR que deben ser aislados53,55 y que la selección de sólo una subfracción del rango de longitud puede llevar a interpretaciones erróneas de los resultados17. Se sugiere que una amplia gama de longitudes características de las huellas bacterianas es una consecuencia del comportamiento del ribosoma procariota en lugar de la digestión de la MNasa55. Por ejemplo, la interacción complementaria entre el extremo 3′ del ARNr 16S en una pequeña subunidad ribosómica y un motivo Shine-Dalgarno en el ARNm puede resultar en rf56más largo. Teniendo en cuenta una amplia gama de longitudes de huellas bacterianas, Mohammad et al. recomendamos realizar la selección de tamaño entre 15 y 40 nt17,55. Esto debería conducir al aislamiento de potencialmente toda una gama de FR y asegurar la obtención de una representación completa de los ribosomas en varias etapas del ciclo de traslación. Debido a la discusión en curso, la gama de la supresión se debe considerar cuidadosamente y es importante recordar que la opción incorrecta puede excluir algunas subfracciones del RF y llevar al sesgo en el análisis subsecuente.

Debido a la selección de tamaño realizada directamente después de la digestión de la nucleasa y con la omisión del aislamiento del monosoma por ultracentrifugación, nuestro protocolo es rápido, relativamente fácil y se puede llevar a cabo con un equipo de laboratorio estándar. El uso de kits dedicados para la limpieza del ARN y el ADN, la purificación del ARNm y la preparación de la biblioteca garantiza la estandarización y la repetibilidad. El aumento del volumen de etanol durante la limpieza del ARN aumenta la eficiencia de purificación de los fragmentos de ARN de <200 nt57. Las modificaciones en la preparación de la biblioteca - extendiendo el tiempo de incubación y aumentando la temperatura durante la ligadura de los adaptadores - se aplican para disminuir la eficiencia de la ligadura para el ARN metilado, como el ARNr, y para reducir la contaminación por ARNr58. Nuestro protocolo se ha utilizado para investigar la regulación de la traducción en diversas condiciones de crecimiento (publicaciones en preparación) pero se puede aplicar para estudiar otros aspectos de la traducción como la detección de TIS o para mejorar la anotación del genoma y ayudar a los estudios proteómicos. Una modificación adicional al protocolo, dependiente de la pregunta de la investigación, se puede incluir fácilmente, e.g. reticulando el ribosoma con la proteína de interés o la purificación de la afinidad de los ribosomas de interés dando por resultado las fracciones enriquecidas de ribosomas. Con nuestro protocolo el procedimiento RIBO-seq es más accesible para los científicos y, por lo tanto, puede estimular nuevos descubrimientos y acelerar los desarrollos en el campo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

ALS desea agradecer el apoyo financiero de EMBO Installation Grants IG 3914 y POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizado en el marco del programa First TEAM de la Fundación para la Ciencia Polaca cofinanciado por la Unión Europea con cargo al Fondo Europeo de Desarrollo Regional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

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References

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Bioquímica Número 174
RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS
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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

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