Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

Abstract

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב vivo. היתרון של שיטה זו, בהשוואה לגישות אחרות, הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים בתעתיק mRNA.

במאמר זה אנו מתארים את השלבים העוקבים של איסוף והכנה לדוגמה לשיטת RIBO-seq בחיידקים, ומדגישים את הפרטים הרלוונטיים לתכנון וביצוע הניסוי.

מאז RIBO-seq מסתמך על ריבוזומים שלמים mRNAs הקשורים, הצעד העיקרי הוא עיכוב מהיר של תרגום התפוררות נאותה של תאים. לכן, אנו מציעים סינון והקפאת פלאש בחנקן נוזלי לקצירת תאים עם טיפול מקדים אופציונלי עם כלוראמפניקול כדי לעצור תרגום בחיידקים. להתפוררות, אנו מציעים שחיקה תאים קפואים עם מרגמה ועלי בנוכחות תחמוצת אלומיניום כדי לשבש מכנית את דופן התא. בפרוטוקול זה, כרית סוכרוז או שיפוע סוכרוז ultracentrifugation עבור טיהור מונוזום אינו נדרש. במקום זאת, הפרדת mRNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ואחריו כריתת טביעת הרגל ריבוזומלית (28-30 nt הלהקה) מוחל ומספק תוצאות משביעות רצון. פעולה זו מפשטת במידה רבה את השיטה וכן מפחיתה את דרישות הזמן והציוד עבור ההליך. להכנת הספרייה, אנו ממליצים להשתמש בערכת RNA קטנה הזמינה מסחרית לריצוף Illumina מניו אינגלנד Biolabs, בהתאם להנחיות היצרן עם מידה מסוימת של אופטימיזציה.

ספריות ה- cDNA המתקבלות מציגות כמות ואיכות מתאימות הנדרשות לריצוף הדור הבא (NGS). רצף הספריות שהוכנו על פי תוצאות הפרוטוקול המתוארות ב 2 עד 10 mln קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם מתן נתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים מהיר וקל יחסית וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

Introduction

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) פותחה במעבדתו של ג'ונתן וייסמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו1. בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות לחקר ביטוי גנים ברמה התרגומית, RIBO-seq מתמקד בכל מחייב ריבוזום ל- mRNA ומספק מידע על מיקומו ועל המספר היחסי של ריבוזומים בתעתיק. זה מאפשר ניטור התהליך של סינתזת חלבון vivo והוא יכול לספק רזולוציה קודון יחיד ודיוק המאפשר מדידה של צפיפות ריבוזום על שניהם, mRNA הפרט לאורך התמלול כולו בתא. בבסיס טכניקת RIBO-seq טמונה העובדה כי במהלך התרגום הריבוזום קושר את מולקולת mRNA ובכך מגן על החלק הקבור של התמליל מעיכול ריבונוקלאאז. עם תוספת של ribonuclease, mRNA לא מוגן מתעכל ואת שברים מוקף ריבוזומים - בדרך כלל של ~ 28-30 nt ארוך - להישאר שלם. שברים אלה, הנקראים עקבות ריבוזומליות (RF), יכולים להיות מבודדים, רציפים וממופים לתעתיק שמקורו בזיהוי המיקום המדויק של הריבוזומים. למעשה, היכולת הריבוזום להגן על שברי mRNA שימש מאז 1960 ללמוד אתרי ייזום מחייב ותרגום ריבוזומלי (TIS)2,3,4. עם זאת, עם ההתקדמות בטכנולוגיית רצף עמוק, RIBO-seq הפך תקן זהב לניטור תרגום5 אשר, באמצעות מעורבות ריבוזום, יכול לספק מידע גנומי רחב על סינתזת חלבונים6. פרופיל ריבוזום מילא את הפער הטכנולוגי שהיה קיים בין כימות התמלול לבין פרוטאום6.

כדי לנהל פרופיל ריבוזום אנחנו צריכים להשיג ליזאט התא של האורגניזם שגדל בתנאים שנחקרו. שיבוש תנאים אלה במהלך איסוף תאים ותמוגה עשוי לספק נתונים לא אמינים. כדי למנוע זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. תאים יכולים להיות lysed על ידי שחיקה קריוגנית homogenizer מכני כמו טחנת מערבל7,8 או מקצף חרוזים9, ועל ידי טריטורציה באמצעות פיפטה10 או עם מחט11. מאגר התמוגה ניתן להוסיף רק לפני או זמן קצר לאחר ריסוק של התאים. בפרוטוקול שלנו אנו משתמשים חנקן נוזלי כדי מרגמה precool ועלי, כמו גם תחמוצת אלומיניום כגישה עדינה יותר להפרעה של דופן התא החיידקי, אשר מונע גזירה RNA לעתים קרובות נתקל כאשר שיטות כגון sonification מוחלים. לאחר ריסוק, אנו מוסיפים חיץ תמוגה קר כקרח לתכולת המרגמה מקוררת. בחירה של מאגר תמוגה מתאים חשוב להשגת הרזולוציה הטובה ביותר של עקבות ריבוזומליות. מאז חוזק יוני משפיע הן על גודל RF ואת דיוק מסגרת הקריאה, מומלץ כיום להשתמש מאגרי תמוגה עם חוזק יוני נמוך קיבולת חיץ, גם אם נראה כי הרכב המאגר אינו משפיע על תפוסה ריבוזואלית על mRNAs11,12. מרכיבים חשובים של מאגר התמוגה הם יוני מגנזיום, שנוכחותם מונעת ניתוק של יחידות המשנה הריבוזומליות ומעכבת שינויים קונפורמיים ספונטניים בריבוזומים החיידקיים11,13. יוני סידן גם לשחק תפקיד משמעותי והם חיוניים לפעילות של גרעין מיקרוקוקאלי (MNase) המשמש בשיטת פרופיל ריבוזום חיידקי14. תוספת של גואנוסין 5′-[β,γ-imido]טריפוספט (GMP-PNP), אנלוגי שאינו הידרוליזה של GTP, יחד עם כלוראמפניקול מעכב תרגום במהלך תמוגה15.

כאשר מתקבל הליסנט, מובהר על ידי צנטריפוגה ומחולק לשני חלקים, כל אחד עבור RIBO-seq ורצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה (RNA-seq) שכן הם מבוצעים בו זמנית (איור 1). RNA-seq מספק נקודת התייחסות המאפשרת השוואה של נתונים הן RIBO-seq והן RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. התרגום שנחקר מוגדר על ידי נורמליזציה של עקבות ריבוזומליות לשפע mRNA16. נתונים מ-RNA-seq יכולים גם לסייע בזיהוי שיבוט או רצף של חפצים17.

Figure 1
איור 1. שרטוטים של הכנת דגימת mRNA עבור ריבו-seq ו- RNA-seq. להכנת ספריית RIBO-seq, RNA מתעכל עם MNase (A), ואחריו מבחר הגודל של RF של ~ 28-30 nt אורך (B); עבור RNA-seq RNA מבודד (C), מדולדל של rRNA (D), ואת mRNA וכתוצאה מכך הוא מקוטע באופן אקראי לרסיסים באורכים משתנים (E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

השלבים הראשוניים של הליך ההכנה לדוגמה עבור RIBO-seq ו- RNA-seq שונים במקצת (איור 1). עבור פרופיל ריבוזומלי, lysate צריך להיות מתעכל על ידי אנדונוקלאאז מסוים כדי להשפיל את מולקולות mRNA לא מוגן על ידי ריבוזומים. בפרוטוקולים סטנדרטיים, מונוזומים המתקבלים הם התאוששו על ידי אולטרה צנטריפוגציה כרית סוכרוז או אולטרה צנטריפוגציה שיפוע סוכרוז8,14. במאמר זה, אנו מראים כי שלב זה אינו הכרחי כדי לבודד RF הנדרש עבור RIBO-seq בחיידקים, כמו כן עבור תאים אוקריוטיים18, וכי מבחר גודל של שברי mRNA אורך המתאים מן ג'ל polyacrylamide מספיק.

עבור RNA-seq, mRNA מתקבל על ידי דלדול של rRNA מן RNA הכולל - מולקולות rRNA הכלאה לבדיקות אוליגונוקלאוטיד biotinylated אשר נקשרים חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין. קומפלקסים rRNA-oligonucleotide-חרוזים מוסרים לאחר מכן מן המדגם עם מגנט וכתוצאה מכך מדגם מדולדל rRNA19,20. מולקולות mRNA מטוהרים לאחר מכן מפוצלים באופן אקראי על ידי הידרוליזה אלקליין. שברי ה-mRNA המתקבלים, כמו גם עקבות הריבוזומליות, מומרים לספריות cDNA ומוכנים לריצוף עמוק(איור 2). זה כרוך בתיקון מסתיים הדרוש לאחר הידרוליזה אלקליין (עבור mRNA) ועיכול אנזימטי (עבור RF): dephosphorylation של 3 ' קצוות ואחריו זרחון של קצוות 5 '. השלבים הבאים הם קשירת מתאמים ואת התמלול ההפוך כדי ליצור מוסיף cDNA ממוסגר על ידי רצפים הנדרשים עבור ריצוף הדור הבא (NGS) באמצעות פלטפורמת Illumina. השלב האחרון של הכנת הספרייה הוא תגובת PCR שבה המבנים מוגברים ומתויגים עם ברקודים ספציפיים לדוגמה כדי לאפשר multiplexing רצף דגימות שונות בערוץ אחד. לפני הרצף, האיכות והכמות של הספריות מוערכים על ידי אלקטרופורזה DNA רגישות גבוהה על השבב. לאחר מכן ניתן לאגד ולרצף ספריות cDNA עם פרמטרים מתאימים. ניתן לבצע רצף בפלטפורמות שונות של Illumina, כגון MiSeq, NextSeq או HighSeq, בהתאם למספר הספריות, אורך הקריאה הנדרש ועומק הרצף. לאחר הרצף מבוצע הניתוח הביואינפורמטי.

Figure 2
איור 2. הכנת ספרייה. הכנת הספרייה כוללת את תיקון הקצוות, קשירת מתאמים, שעתוק הפוך והגברה עם ברקודינג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרופיל הריבוזום הוא שיטה אוניברסלית אשר ניתן לשנות ולהתאים בקלות על פי השאלה המדעית. במקור הוא שימש שמרים1, אבל זמן קצר לאחר מכן הוחל על תאים חיידקיים21, כמו גם אורגניזמים מודל אוקריוטי כולל עכבר10, זברה דג22, זבוב פירות23 ו Arabidopsis thaliana24. הוא שימש גם לחקר סוגים שונים של ריבוזומים: ציטופלסמי, מיטוכונדריאלי25,26 וכלורופלסט27,28. באיקריוטים RIBO-seq מותאם ומעודן בדרך כלל כדי לחקור היבטים ספציפיים של התרגום, כולל חניכה10,11,29,30,31,32, התארכות 1,10,11,31,33, ריבוזום השתהות33 ושינוי קונפורמציה33. רוב השינויים כרוכים בשימוש במעכבי תרגום שונים. בחיידקים עם זאת, מחקרים מקבילים היו קשים לביצוע בגלל מחסור במעכבים עם מנגנון הפעולה הנדרש34. מעכב התרגום הנפוץ ביותר בחיידקים הוא כלוראמפניקול (CAM) הנקשר למרכז הפפטידיל טרנספראז (PTC) ומונע מיקום נכון של האמינואציל-tRNA באתר A. כתוצאה מכך, CAM מונע היווצרות של קשר פפטיד אשר מוביל למעצר ריבוזומים מוארכים35. דוגמאות אחרות של מעכבי תרגום בחיידקים הם טטרציקלין (TET)36, retapamulin (RET)34 ו Onc11237 אשר שימשו כדי לחקור אתרי ייזום תרגום. TET, אשר מונע משלוח tRNA לריבוזום על ידי חפיפה ישירה עם לולאת גזע אנטיקודון של tRNA באתר A, הוחל במקור כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו מטיפול CAM שכן שניהם אנטיביוטיקה מעכבת התארכות תרגום38. TET נמצא לזהות TIS ראשי, עם זאת לא הצליח לחשוף פנימי TIS36. RET נקשר PTC של ריבוזום חיידקי, ומונע היווצרות של הקשר פפטיד הראשון על ידי הפרעה עם aminoacyl-tRNA מוארך באתר. החלת תוצאות RET במעצר ריבוזומים הן ראשי, כמו גם פנימי TISS34. Onc112, פפטיד אנטי מיקרוביאלי עשיר בפרולין, נקשר במנהרת היציאה וחוסם את כריכת aminoacyl-tRNA באתר ריבוזומלי A. כתוצאה מכך, Onc112 מונע ממתחמי חניכה להיכנס לשלב התארכות37.

המידע העיקרי פרופיל ריבוזום מספק הוא צפיפות ריבוזומים ואת מיקומם על mRNA. זה יושם בהצלחה לחקור ביטוי גנים דיפרנציאליים ברמת התרגום בתנאי צמיחה שונים1,6, למדוד יעילות תרגום1,38,39 ולזהות אירועי ויסות תרגום כגון השהייה ריבוזומלית10. RIBO-seq מאפשר גם לחשוף את התרגום של ncRNA ביאורים, פסאודוגנים ומסגרות קריאה פתוחות קטנות ללא ביאורים (ORF) המוביל לזיהוי של גנים קידוד חלבון הרומן ו / או קצר מאוד10,12,22,30,37. במקרים כאלה, RIBO-seq יכול לכוונן ולשפר ביאור הגנום. עם הרגישות הגבוהה שלה לזיהוי של ORFs מתורגם ואופיו הכמותי, פרופיל ריבוזום יכול לשמש גם פרוקסי לקביעת פרוטאום או בסיוע מחקרים פרוטאומיקים31,34,39. על ידי מיפוי TIS, פרופיל ריבוזום חושף N-סופני מורחב וקצץ isoforms של חלבונים ידועים10,32. RIBO-seq הותאם גם ללמוד קיפול תרגום משותף של חלבונים14,21,24. שיטה זו מאפשרת מדידה של שיעורי התארכות1,10,39 או מהירויות פענוח של קודונים בודדים6 ומסייעת בפיתוח מודלים כמותיים של תרגום17. שיטת פרופיל ריבוזום הוא גם מסוגל לספק תובנות מכניות לתוך הריבוזום השהיה בחיידקים7,15,17, frameshifting40, עצור קודון readthrough21, סיום / מיחזור פגמים41,42 ו שינויים קונפורמציה ריבוזומלית33 באיקריוטים. RIBO-seq הותאם גם כדי לבחון את ההשפעה של גורמים טרנס-משחקים ספציפיים על תרגום כגון miRNAs6 וחלבונים מחייבי RNA באיקריוטים16,43. עם זאת, חשוב להכיר בכך שהתכנון הניסיוני והרזולוציה המתקבלת של RIBO-seq קובעים את כמות המידע שניתן לחלץ מנתוני הרצףהמתקבלים 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אוסף לדוגמה

  1. הכינו תרבות חיידקים. אנו ממליצים על נפח תרבות של 100 מ"ל לכל מדגם.
  2. הכן ציוד ריאגנטים לאיסוף מדגם: שתי כפות מדידה לדגימה, סטרילי 0.45 מיקרומטר מעורב אסטרים תאית ממברנה (MCE) מסננים, 50 מ"ל צינורות סטריליים, חנקן נוזלי, 50 מ"ג / מ"ל כלוראמפניקול ב 70% (vol / vol) אתנול (אופציונלי). לנקב את המכסה של צינורות 50 מ"ל כדי לאפשר אידוי חנקן נוזלי ולמנוע פיצוץ של צינורות סגורים. מרוקנים כפות מדידה עם חומר ניקוי במעבדה ו-70% אתנול.
  3. מחממים מראש את ציוד הסינון ואת אחת הסקופולות לטמפרטורת הגדילה של תרבות החיידקים.
    הערה: אנו ממליצים על מנגנון סינון זכוכית עם משפך, בסיס פריט, בקבוקון משותף טחון ומהדק קפיץ Ø 47 מ"מ.
  4. לפני קציר מדגם, להוסיף chloramphenicol לתוך תרבות החיידקים לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל דגירה 1 דקה (אופציונלי).
  5. יוצקים חנקן נוזלי לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל ומניחים את הסקופולה השנייה בתוך הצינור כדי להתקרר.
    זהירות! חנקן נוזלי יכול לגרום מיכלים סגורים להתפוצץ עקב שינוי הלחץ על אידוי. כדי למנוע זאת, יש צורך ליצור כמה חורים במכסה של צינורות 50 מ"ל כדי לאפשר אידוי חנקן נוזלי.
  6. לאסוף תאים על ידי סינון. הפסק לסנן כאשר המדיום עבר דרך הממברנה, אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין.
  7. לאסוף כדורי חיידקים על ידי גירוד מהיר את התאים של דיסק המסנן באמצעות scoopula מראש. מיד למקם את הסקופולה כולה עם התאים שנקטפו בצינור 50 מ"ל מלא חנקן נוזלי. גלולה שנקטפו צריך להיות מכוסה לחלוטין חנקן נוזלי.
  8. תן גלולה להקפיא ביסודיות לעקור תאים קפואים באמצעות scoopula השני מקורר בעבר. סגור את המכסה המנוקב והעבר את הצינור ל- -80°C. נקודת עצירה
    הערה: יש לחטא כפות מדידה לאחר כל דגימת קציר.

2. תמוגה תאית

  1. הכן 0.1 M GMP-PNP ב 10 mM Tris pH 8, DNase I ו 1.5 צינורות תגובה מ"ל עבור lysates ולשמור אותם על הקרח. מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן מאגר תמוגה (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0.4% טריטון X-100, 6 מ"מ β-מרקפתנול, 5 מ"מ CaCl2 ו- 1 מ"מ כלוראמפניקול אופציונלי). Aliquot 500 μL של מאגר תמוגה לכל מדגם לתוך צינורות תגובה 1.5 מ"ל ומניחים אותם על קרח.
  3. לסלק מרגמות ועלי עם חומר ניקוי במעבדה ו-70% אתנול, ולייבש אותם. מצננים מרגמה ועלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרגמה.
  4. מעבירים גלולה קפואה למרגמה המצוננת מראש וטוחנים אותה לאבקה. עם מרית, מוסיפים כ 1 נפח של תחמוצת אלומיניום ולהמשיך שחיקה. שמור על מרגמה, עלה ותאים להתקרר על ידי שפיכת חנקן נוזלי בעת הצורך, לא נותנים את התוכן של מרגמה להפשיר.
  5. רגע לפני השימוש במאגר תמוגה, להוסיף GMP-PNP ו DNase אני לתוך aliquot מאגר תמוגה לריכוז הסופי של 2 mM ו 100 U /mL בהתאמה. מעבירים את הפתרון למרגמה עם תאים ותחמוצת אלומיניום וממשיכים לטחון. תן את הפשרה lysate לאט תוך שחיקה ולהעביר את התערובת לתוך צינור תגובת 1.5 מ"ל מקורר מראש ומניחים מיד על קרח.
  6. צנטריפוגה lysates ב 20 000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר supernatants לתוך חדש, מראש מקורר 1,5 מ"ל צינורות תגובה ולשמור אותם על הקרח.
  7. למדוד את ריכוז RNA בכל מדגם עם NanoDrop. השתמש 1:10 דילול של דגימות ו 1:10 דילול של מאגר תמוגה במים ללא גרעין כמו ריק.
    הערה: שים לב כי כלוראמפניקול מראה ספיגה משמעותית ב 260 ננומטר.
  8. מחלקים כל lysate לשתי מנות: אחד עבור RIBO-seq (0.5 - 1 מ"ג של RNA) והשני עבור RNA-seq (השאר).
  9. נקה את הדגימות עבור RNA-seq באמצעות ערכת ניקוי RNA זמינה מסחרית על פי פרוטוקול היצרן.
    הערה: אנו ממליצים להשתמש בערכת Zymo RNA נקייה וריכוז -25 (ראה טבלת חומרים). כמו כן, אנו ממליצים להוסיף 4.5 כמויות של אתנול (בהשוואה לנפח המדגם) לתערובת של מדגם ומאגר כריכה עבור עקבות ריבוזומליות ו- mRNA מקוטע, על מנת להגביר את יעילות הטיהור של שברי RNA קצרים.
  10. אחסן את הדגימות המיועדות ל- RNA-seq ב- -80 °C (60 °F). ההליך עבור RNA-seq ימשיך משלב 5.

3. MNase עיכול של דגימות עבור RIBO-seq

  1. כדי 1 מ"ג של RNA להוסיף 3.8 μL של 187.5 U / μL MNase ב 10 מ"מ Tris pH 8 ומעלה אותו עם מאגר תמוגה לנפח הכולל של 500 μL.
  2. דגירה ב 25 °C (60 °F), 300 סל"ד, במשך 45 דקות תרמומיקסר.
  3. נקה את הדגימות באמצעות ערכת ניקוי RNA זמינה מסחרית (כמו בשלב 2.9).
  4. אחסן את הדגימות עבור RIBO-seq ב- -80 °C (נקודת עצירה) או המשך לבחירת גודל.

4. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ומבחר גודל של דגימות עבור RIBO-seq

  1. הכינו ג'ל פוליאקרילמיד-TBE 15% עם 8 M אוריאה והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. הפעלה מוקדמת למשך 10 דקות לפחות במתח קבוע של 200 וולט.
  2. מערבבים דגימות עם מאגר מדגם TBE-Urea, denature ב 95 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת ומניחים אותם מיד על קרח.
  3. לשטוף את אוריאה על ידי הזרקת חיץ TBE לתוך בארות ג'ל באמצעות מזרק. לטעון את הדגימות משאיר רווח אחד היטב ביניהם להפריד כל מדגם ולמנוע זיהום צולב. השתמש 29 nt אוליגונוקלאוטידים ותערובת של 26 nt ו 32 nt אוליגונוקלאוטידים כסמנים. הפעל אלקטרופורזה במתח קבוע של 180 V.
  4. הכן חיץ סטרילי עבור דגירה לילה (5 מ"מ EDTA, 10 מ"מ NaOAc pH 5).
  5. לאחר אלקטרופורזה, הכתימו את הג'ל באמבט זהב SYBR במשך כ-2-3 דקות ושטוף את הג'ל במים נטולי גרעין.
  6. בלו שברי ג'ל בין 26 ל 32 nt עם מחטים סטריליות או סכיני גילוח ומניחים את שברי הג'ל בצינורות נפרדים 1.5 מ"ל עבור כל מדגם. לשנות את המחט או את סכין הגילוח בין הדגימות.
  7. הוסף 200 μL של מאגר הדגירה לילה לכל צינור תגובה.
  8. דגירה הדגימות ב 10 °C (60 °F), 1000 סל"ד לילה תרמומיקסר.
  9. למחרת, לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9. תטביע את העקבות ב-80 μL של מים נטולי גרעין.
  10. אחסן את הדגימות ב- -80 °C (60 °F). ההליך עבור RIBO-seq יימשך משלב 7.

5. טיהור של mRNA חיידקי על ידי דלדול rRNA מדגימות עבור RNA-seq

  1. הסר rRNA מדגימות עם ערכת טיהור mRNA חיידקי (למשל, Invitrogen MICROBExpress). פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. נקה את הדגימות כמו בשלב 2.9. ללטף את mRNA ב 50 μL של מים ללא גרעין.
  3. אחסן את הדגימות עבור RNA-seq ב -80 °C (נקודת עצירה) או להמשיך פיצול אלקליין.

6. פיצול אלקליין של דגימות עבור RNA-seq

  1. הכן מאגר הידרוליזה אלקליין (לערבב 220 μL של 0.1 M NaHCO3, 30 μL של 0.1 MNa 2CO3 ו μL של 0.5 M EDTA). מערבבים 1 נפח (50 μL) של מאגר אלקליין עם 1 נפח (50 μL) של המדגם דגירה ב 95 °C (70 °F) במשך 25 דקות.
  2. הוסף 5 μL של 3 M NaOAc pH 5.5 כדי לעצור את התגובה.
  3. לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9 ו elute את הדגימות ב 80 μL של מים ללא גרעין.
  4. נקודת עצירה אפשרית: לאחסן דגימות RNA-seq ב -80 °C (69 °F). עם זאת, אנו ממליצים ללכת ישירות לשלב 7 על מנת למנוע הקפאה והפשרה מיותרים.

7. דפוספורילציה וזרחון של דגימות הן עבור RNA והן עבור RIBO-seq

  1. הוסף 10 μL של 10x מאגר תגובה PNK ו 5 μL T4 PNK לכל מדגם. דגירה ב 37 °C (60 °F) במשך 1.5 שעה על מנת dephosphorylate את קצוות 3 '.
  2. הוסף 3 μL של 1 מ"מ ATP ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה על מנת לזרח את הקצוות 5 '.
  3. לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9, elute ב 30 μL מים ללא גרעין.
  4. אחסן את הדגימות ב- -80 °C (60 °F).

8. הכנת ספריה באמצעות NEBNext מולטיפלקס קטן ספריית RNA הכנה להגדיר עבור Illumina

  1. הכינו 100-1000 ng של RNA קלט (שברי mRNA שהושגו וטביעות רגל ריבוזומליות) ב 6 μL של מים ללא גרעין ולהוסיף 1 μL של 3 ' מתאם SR. דגירה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. הוסף 10 μL של 3' חיץ תגובת קשירה (2X) ו 3 μL של 3' אנזים קשירה לערבב דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 2.5 שעה, במקום 1 שעה ב 25 °C (69 °F) כפי שפרוטוקול היצרן מציין.
  3. הכלא את פריימר שעתוק הפוך על פי פרוטוקול היצרן עם תוכנית שונה: 5 דקות ב 75 °C (75 °F), 30 דקות ב 37 °C (69 °F) ולהחזיק ב 4 °C (69 °F).
  4. ליגייט מתאם 5 'SR. בצע את פרוטוקול היצרן עם שינוי אחד: לבצע את הדגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 2.5 שעות, במקום 1 שעה ב 25 °C (69 °F).
  5. בצע תמלול הפוך בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  6. נקודת עצירה אפשרית: דגירה הדגימות המכילות cDNAs מסונתז ב 70 °C (70 °F) במשך 15 דקות כדי להשבית את התמלול ההפוך ולאחסן אותם ב -80 °C (69 °F). עם זאת, אנו ממליצים להמשיך ישירות לשלבים הבאים כדי למנוע הקפאה והפשרה מיותרת של הדגימות.
  7. אחסן מחצית מכל ספריית cDNA ב- -80 °C (60 °F) כגיבוי.
  8. בצע הגברה PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש במחצית מתערובת התגובה. אחסן את הספריות שהושגו ב- -80 °C (60 °F).

9. בחירת גודל של ספריות cDNA באמצעות PAGE

  1. הכינו 6% ג'ל פוליאקרילמיד-TBE והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. הפעלה מוקדמת למשך 10 דקות לפחות במתח קבוע של 200 וולט.
  2. מערבבים את הדגימות עם צבע טעינת ג'ל, כחול (6X) וטוען אותם על הג'ל. השתמש בטעינה מהירה pBR322 DNA-MspI Digest כסולם. בהתחלה, להפעיל אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V כדי לאפשר DNA להיכנס הג'ל ולאחר מכן לשנות את המתח ל 180 V.
  3. כאשר האלקטרופורזה מסתיימת, הכתימו את הג'ל באמבט זהב SYBR במשך כ-2-3 דקות ושטוף את הג'ל במים נטולי גרעין.
  4. Excise שברי ג'ל המכילים את הספריות. עבור דגימות RNA-seq בלו בין 135-180 nt ועבור RIBO-seq בין 135-170 nt. השתמשו במחט סטרילית או בסכין גילוח והניחו את שברי הג'ל שנכרתו בצינורות תגובה נפרדים של 1.5 מ"ל. זכור לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות.
    הערה: המתאמים וברקוד מ NEBNext מולטיפלקס קטן ספריית RNA ערכת הכנה עבור Illumina יש 119 nt בסך הכל אשר קובע את חתך כריתה התחתונה.
  5. הוסיפו 100 μL של מים נטולי גרעין לכל שבר ג'ל שנכרת.
  6. דגירה שברי ג'ל ב 10 °C (60 °F), 450 סל"ד לילה תרמומיקסר.
  7. לנקות ולרכז את ספריות cDNA עם ערכת ניקוי DNA מסחרית על פי פרוטוקול היצרן.
    הערה: אנו ממליצים להשתמש בערכת Zymo DNA נקייה וריכוז -5 (ראה טבלת חומרים).
  8. אחסן ספריות cDNA מטוהרות ב- -80 °C (60 °F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המופתיות שהוצגו כאן התקבלו במחקר שבחן את ויסות התרגום בתאי הסאבטיליס של WT Bacillus. תרבויות לילה היו מדולל OD600 שווה 0.1 ב 100 מ"ל של בינוני עשיר דגירה ב 37 °C (600) עם רעידות נמרצות עד OD600 הגיע 0.5-0.6. המדיום העשיר הוחלף אז במדיום מינימלי כדי לגרום לתהליך ההצטברות והדגירה נמשכה עד ארבע שעות. תאים נקצרו כל שעה החל T0 - אינדוקציה sporulation - וכתוצאה מכך חמש נקודות זמן. דקה אחת לפני הקציר, התרבויות טופלו בכלוראמפניקול כמתואר בפרוטוקול לעיל. תאים נאספו על ידי סינון במערכת סינון זכוכית מראש באמצעות 0.45 מיקרומטר מעורב אסטרים תאית ממברנה (MCE) מסננים פלאש קפוא חנקן נוזלי.

כמות החומצה ריבונוקלאית המתקבלת lysate תלוי בתנאי הצמיחה, נפח התרבות וצפיפות. בעקבות הפרוטוקול שלנו, 100 מ"ל של תרבות החיידקים (Bacillus subtilis) מניב 1-4 מ"ג של RNA בממוצע. דוגמאות של lysates המתקבלים מהניסוי המתואר לעיל מוצגים בטבלה 1.

ריכוז RNA [ng/μL] כמות רנ"א [מ"ג] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

שולחן 1. ריכוז RNA וכמות בדגימות מייצגות של B. subtilis lysates. הטבלה כוללת דגימות מסוג הפרא (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה sporulation (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation. תמוגה בוצעה עם 550 μL של מאגר תמוגה המכיל כלוראמפניקול. ניתן להבחין כי ככל שהספורולציה מתקדמת כמות ה- RNA המתקבלת פוחתת.

כאשר כמות RNA נמוכה מ 1 מ"ג, 0.25 מ"ג של RNA משמש RIBO-seq במקום 1-0.5 מ"ג ואת כמות MNase מותאם לאחר מכן בהתאמה. כמות ה- RNA הייצוגית והריכוז לאחר עיכול הגרעין מוצגים בטבלה 2. הכמות הממוצעת של RNA לאחר עיכול וניקוי היא 50 מיקרוגרם מ 0.5 מ"ג של קלט RNA.

ריכוז RNA [ng/μL] כמות RNA [מיקרוגרם] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

שולחן 2. כמות וריכוז של RNA לאחר עיכול נוקלאאז של הדגימות המייצגות עבור RIBO-seq. הטבלה כוללת דגימות מסוג הפרא (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה sporulation (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "R" מתייחסת לדוגמאות עבור RIBO-seq. בגלל ריכוז RNA של מדגם WT4-R היה נמוך, 0.25 מ"ג של RNA היה מתעכל, בעוד 0.5 מ"ג של RNA עבור הדגימות הנותרות שימש לייצור טביעת רגל ריבוזומלית. כמות MNase לעיכול היה 178.125 U עבור 0.25 מ"ג של RNA ב WT4-R, ו 356.25 U עבור 0.5 מ"ג של RNA בדגימות אחרות. לאחר העיכול הדגימות נוקו עם ערכת ניקוי RNA מסחרית וריכוז חומצה ריבונוקלאית נמדד עם NanoDrop.

לאחר עיכול MNase, בחירת הגודל מתבצעת בעזרת PAGE. דוגמה לג'ל פוליאקרילאמיד TBE-urea 15% עם הדגימות המתעכלות מוצגת באיור 3. שברי ג'ל בין 26 ל 32 nt הוצאו עם סכין גילוח סטרילית דגירה לילה במאגר הדגירה לילה. למחרת, עקבות ריבוזומליות נוקו עם ערכת הניקוי המסחרית של הרנ"א.

Figure 3
איור 3. 15% ג'ל פוליאקרילאמיד TBE-אוריאה עם דגימות מייצגות לאחר עיכול MNase. האיור כולל דגימות מסוג הבר (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה ספורולציה (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "R" מתייחסת לדוגמאות עבור RIBO-seq. 15 μL של דגימות denatured הועמסו לתוך בארות ג'ל בסדר: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R ואת הנפח הנותר אוחסן ב -80 °C (70 °F) כגיבוי. 29 nt אוליגונוקלאוטידים ותערובת של 26 nt ו 32 nt אוליגונוקלאוטידים שימשו כסמנים. אלקטרופורזה בוצעה כמתואר לעיל ואת הג'ל היה מוכתם באמבטיה זהב SYBR. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

במקביל לעיכול גרעין, lysates עבור RNA-seq נוקו עם ערכת ניקוי RNA מסחרי ואת הריכוזים המתקבלים של RNA נמדדו עם NanoDrop. התוצאות הייצוגיות מוצגות בטבלה 3. לאחר ניקוי, כמות חומצה ריבונוקלאית ירדה ל 40-500 מיקרוגרם.

ריכוז RNA [ng/μL] כמות RNA [מיקרוגרם] A260/A280 A260/A230
WT0 מ' 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2 מ' 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3 מ' 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4 מ' 757 37.85 2.01 1.95

שולחן 3. כמות RNA וריכוז של דגימות עבור RNA-seq לאחר טיהור RNA. הטבלה כוללת דגימות מסוג הפרא (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה sporulation (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "m" מתייחסת לדגימות עבור RNA-seq (mRNA).

ריכוזי RNA שהתקבלו של הדגימות עבור RNA-seq שימשו להגדרת קלט RNA עבור דלדול rRNA. 8 מיקרוגרם של RNA מכל מדגם RNA-seq שימשו עם ערכת טיהור mRNA חיידקי MICROBExpress (ראה טבלה של חומרים)על פי פרוטוקול היצרן נוקו עם ערכת ניקוי RNA מסחרי לאחר מכן. התוצאות הייצוגיות של דלדול rRNA מוצגות בטבלה 4.

ריכוז RNA [ng/μL] A260/A280 A260/A230 כמות RNA [מיקרוגרם]
WT0 מ' 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2 מ' 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3 מ' 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4 מ' 85.0 1.97 2.00 4.2

שולחן 4. כמות RNA מייצג וריכוז לאחר דלדול rRNA. הטבלה כוללת דגימות מסוג הפרא (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה sporulation (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "m" מתייחסת לדגימות עבור RNA-seq. 8 מיקרוגרם של RNA מדגימות עבור RNA-seq שימשו דלדול rRNA וניקוי עם ערכת ניקוי RNA מסחרי לאחר מכן.

לאחר מכן, mRNA המתקבל היה מקוטע על ידי הידרוליזה אלקליין ונוקה עם ערכה מסחרית כמתואר בפרוטוקול. טביעות הרגליים המפוצלות של ה-mRNA והריבוזומליות נותקו בקצוות של 3' וזרחן בקצוות של 5' לפי הפרוטוקול לעיל. הדגימות שימשו אז לבניית ספריות cDNA לריצוף Illumina, כמתואר בפרוטוקול. איור 4 מציג דוגמה של ג'ל פוליאקרילמיד של 6% עם הספריות המתקבלות. שברי ג'ל בטווח של 135-180 nt עבור RNA-seq ו 135-170 nt עבור RIBO-seq הוצאו עם סכיני גילוח סטריליים דגירה לילה במים ללא גרעין. ספריות נוקו עם ערכת ניקוי DNA מסחרית ואיכות וכמות הוערך על ידי DNA רגישות גבוהה על שבב אלקטרופורזה באמצעות Agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
איור 4. 6% ג'ל פוליאקרילמיד של ספריות cDNA לפני ואחרי בחירת גודל. טעינה מהירה pBR322 DNA-MspI Digest שימש כסולם. 25 μL של דגימות הועמסו לתוך הג'ל בסדר הבא: שלוש ספריות RIBO-seq ושש ספריות RNA-seq. שאר כמויות הדגימות אוחסנו ב-80°C כגיבוי. האיור כולל דגימות מסוג הבר (WT) B. subtilis שנקטפו שעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה ספורולציה; האות "R" מתייחסת לדוגמאות עבור RIBO-seq והאות "m" מתייחסת לדגימות עבור RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדוגמאות לתמונות ג'ל וירטואלי ואלקטרופרוגרמות המתקבלות מ-Agilent 2100 Bioanalyzer מוצגות באיור 5. להקות ופסגות המייצגות את ספריות RIBO-seq צרות ומוגדרות טוב יותר בהשוואה לאלה המייצגות ספריות RNA-seq. על פי אלקטרופורזה על שבב, ספריות הן כ 150 bp ארוך, וזה גודל הספרייה צפוי. אורכם של המתאמים והברקוד המשמש להכנת ספריה הוא 119 nt והתוספות באורך 29-30 nt (עבור RIBO-seq) או בטווח שבין 25 ל- 50 nt (עבור RNA-seq). הפסגות הנוספות הקרובות יותר ל-200 bp המתקבלות מספריות RIBO-seq עשויות להצביע על חפצי PCR שניתן למחוק במהלך ניתוח ביואינפורמטי כאשר הנתונים המתקבלים מרצף נחתכים ו- rRNA/tRNA מסונן. הכמות הממוצעת של DNA הוא 32 ng מתן כמות מספקת של חומר הנדרש עבור רצף הדור הבא.

Figure 5
איור 5. הדוגמאות של אלקטרופרוגרמות ותמונות ג'ל וירטואליות מתוך אלקטרופורזה של דנ"א על שבב רגישות גבוהה. האיור כולל דגימות מסוג הבר (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה ספורולציה (0) ושעה אחת (1), שתיים (2), שלוש (3) או ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "R" מתייחסת לספריות RIBO-seq והאות "m" מתייחסת לספריות RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר בקרת איכות על ידי אלקטרופורזה על השבב, ספריות אוגדו עבור רצף יחיד 50 bp על פלטפורמת NextSeq500 של Illumina (10 ספריות לערוץ, עם מינימום של 350 מיליליטר קריאות לכל ערוץ). רצף הניב 30-57 מיליון קריאות לכל מדגם עבור ספריות RNA-seq ו 30-50 מיליון קריאות לכל מדגם עבור ספריות RIBO-seq. חיתוך המתאמים ורצפי איכות ירודים הביא 24-47 מיליליטר קריאות לכל מדגם עבור דגימות RNA-seq ו 25-50 מיליליטר קריאות לכל מדגם עבור דגימות RIBO-seq. מיפוי, שבוצע עם STAR44, הניב 2.4-9.6 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם עבור דגימות RNA-seq (המהוות 8-16.8% מכלל הקריאות) ו 2.3-10.4 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי (7.7-22.1%) עבור דגימות RIBO-seq. הנתונים שהושגו היו בקרת איכות נבדק עם FastQC45. באיור 6מוצגות דוגמאות לחלקות האיכות שהופקו על-ידי FastQC עבור הרצפים החתוכים . הרצפים של אורך העניין, אשר <32 nt עבור RIBO-seq ו <50 nt עבור RNA-seq, הציג איכות טובה מאוד. הדוגמאות להתוויות של תוכן GC והפצות של אורכי רצף לאורך כל הרצפים החתוכים מוצגות באיור 7. השיא הנוסף ב 72% בחלקת הפצת GC של ספריית RIBO-seq עשוי להצביע על זיהום rRNA אשר ניתן להסיר במהלך ניתוח ביואינפורמטי על ידי סינון rRNA46,47,48. התפלגות אורכי הרצף צרה מאוד עבור ספריות RIBO-seq, עם שיא של 26-27 nt ואילו התפלגות האורך עבור ספריות RNA-seq היא רחבה יותר והיא נעה בין 15 ל - 50 nt.

Figure 6
איור 6. הדוגמאות לחלקות קופסה ושפם של ציונים איכותיים בכל הבסיסים עבור ספריות RIBO-seq ו- RNA-seq לאחר החיתוך. האיור כולל דגימות מסוג הבר (WT) B. subtilis שנקטפו לפני אינדוקציה sporulation (0) וארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "R" מתייחסת לדגימות RIBO-seq והאות "m" מתייחסת לדגימות RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. הדוגמאות של התוויות של תוכן GC והפצה באורך רצף של כל הרצפים עבור ספריות RIBO-seq ו- RNA-seq לאחר החיתוך. האיור מראה דגימות מסוג הבר (WT) B. subtilis שנקטפו ארבע (4) שעות לאחר אינדוקציה sporulation; האות "R" מתייחסת לדוגמה עבור RIBO-seq והאות "m" מתייחסת לדוגמה עבור RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לוודא אם נתוני RIBO-seq מספקים מידע על עקבות ריבוזומליות אמיתיות ולא על שברי mRNA אקראיים של האורך שנבחר, השווינו נתוני רצף מ- RIBO-seq ו- RNA-seq באמצעות RiboToolkit, שרת אינטרנט לניתוח נתונים RIBO-seq49. נתוני ריבו-סק מציגים מחזוריות שלישייה ושיא גבוה וצר המתאים לריבוזומים היוזמים ולמאפיינים של ה-RF כפי שמוצג באיור 8A, שאינו נצפה בנתוני ה-RNA-seq (איור 8B). יתר על כן, העלילה metagene מראה את הפרופילים של כיסוי ממוצע של שברי RF ו- mRNA על רצפי קידוד (CDSS) גילה שיעור גבוה יותר של קריאות ממופה CDSs בקבוצת הנתונים RIBO-seq (איור 8C), כצפוי.

Figure 8
איור 8. החלקות תקופתיות של Metagene וכיסוי ממוצע של שברי RF ו- mRNA בתקליטורים. פרופילי Metagene הושגו עם RiboToolkit, שרת אינטרנט משולב49. אורך ה- CDS מנורמל לערך של 1 וכל CDS חולק ל- 100 סלים שווים. האיור מראה דגימות מסוג הפרא (WT) B. subtilis שנקטפו אחת (1) אינדוקציה לאחר ספורולציה; האות "R" מתייחסת לדוגמה עבור RIBO-seq והאות "m" מתייחסת לדוגמה עבור RNA-seq. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להשוות אם פרוטוקול RIBO-seq המוצג כאן מניב תוצאות דומות לאלה המתקבלות בשיטה סטנדרטית של התאוששות RF (אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע סוכרוז), מקבילנו לתוצאות הרצף מספריות שהוכנו בעקבות שתי השיטות. הניסויים החוקרים את ויסות התרגום במהלך ההסתבכות WT B. נערכו על פי פרוטוקול RIBO-seq שהוצג, כמו גם בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי הכולל התאוששות מונוזומים על ידי שיפוע סוכרוז אולטרה צנטריפוגציה. התוצאות של פרופילי כיסוי ריבוזומים המתקבלים משני הניסויים מוצגות באיור 9. ההדמיה של מסמכי RFs ממופים דומה מאוד בין שני הניסויים והניבה תוצאות דומות על ניתוח ביואינפורמטי.

Figure 9
איור 9. ההדמיה של RF שהושג ממופה על הגנום. האיור כולל RF המתקבל מסוג בר B. subtilis שנקטפו ארבע שעות לאחר אינדוקציה sporulation והוכן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי (WT4-R-s, הלוח העליון) או הפרוטוקול המוצג (WT4-R, הלוח התחתון). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האתגר הטכני העיקרי של פרופיל הריבוזום הוא הצורך לעכב במהירות את התרגום על מנת ללכוד תמונת מצב של ריבוזומים על mRNAs במצב פיזיולוגי מסוים של עניין. כדי להשיג זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. החלת אנטיביוטיקה היא אופציונלית שכן הם יכולים לגרום חפצים. כלוראמפניקול הוא סם נפוץ לעצור ריבוזומים מאריכים ב RIBO-seq חיידקי. עם זאת, זה לא מונע חניכה, וכתוצאה מכך הצטברות של ריבוזומים על שישה codons במורד הזרם של אתר ייזום תרגום14. יתר על כן, היכולת שלה לעכב את תגובת peptidyltransferase יכול להיות תלוי באופי של מצעים ריבוזומלי P- ו- A-site. ככל הנראה, CAM עוצר ריבוזומים בצורה יעילה יותר עם גלי, עלא, סר, Cys, או Thr כמו חומצת אמינו הלפני פן של פפטיד המתהווה17,38,50. זה שווה לקחת בחשבון במהלך תכנון ניסיוני וניתוח ביואינפורמטי, במיוחד כאשר לומדים ריבוסומלית השהיה17. CAM הוכח גם להשפיע על דיוק תרגום על ידי קידום קריאה קודון להפסיק frameshifting51. עדיין, עיכוב CAM הוא מהיר יחסית ומספיק למחקר RIBO-seq טיפוסי14 ואינו גורם misincorporation51. חלק מהחפצים הנגרמים על ידי אנטיביוטיקה ניתן להימנע על ידי הגדלת כמות התרופה9. ריכוז CAM מיושם בפרוטוקול שלנו הוא הכמות האופיינית בשימוש בניסויים RIBO-seq7,14,21, עם זאת, הריכוז עשוי להשתנות עבור מיקרואורגניזמים שונים ויש לייעל לפני קציר מדגם. בשל האפשרות להתרחשות של חפצים הנגרמים על ידי החלת מעכבי תרגום, מומלץ להימנע מטיפול מעכב אם אין צורך בשאלת המחקר ואם הקציר המהיר אפשרי14. איסוף תאים מהיר הוא חיוני, במיוחד אם הוא מבוצע ללא טיפול מעכב, שכן קציר ממושך יכול לגרום לאובדן פוליזומים ו / או שינוי בתרגום כתגובה לתנאים הסביבתיים המשתנים14. לכן, אנו ממליצים להשתמש בסינון כשיטת קציר כפי שהוא יכול להתבצע באותם תנאים או דומים כמו הצמיחה התרבותית, כולל טמפרטורה ו / או רועד. במהלך תאי סינון שנאספו על פני השטח של המסנן הם סמוקים כל הזמן עם מדיום צמיחה, מעכב אותם משמרות חישה בצפיפות התא, חמצון ורמת חומצות אמינו וחומרים מזינים אחרים14. הסינון עדין יותר ועשוי להיות מהיר יותר מצנטריפוגה, אם צפיפות התרבות מתונה, אחרת מספר גדול של תאים יכול לסתום את נקבוביות המסנן ולהאט את התהליך. אם יש הסתברות לסינון ממושך, אנו ממליצים על טיפול מקדים כלוראמפניקול בתרבות, שתוצאתו מעצר תרגום ומאפשרת להאריך את זמן הקציר. אם סינון הופך להיות קשה להשלים עקב סתימת המסנן, אנו ממליצים להפסיק את הסינון, להסיר את התרבות עודף פלאש להקפיא חלק של התרבות שנאסף על המסנן. ראינו כי 50 מ"ל של תרבות חיידקים צפופה מספיק כדי לבצע RIBO-seq. הקפאת הבזק הבאה של תאים בחנקן נוזלי היא הגישה האוניברסלית והיעילה ביותר להפסיק מיד את התרגום8,21,52.

עיכול ריבונוקלאאז הוא צעד קריטי הנדרש כדי להשיג RF באיכות טובה. בחירת האנזים הנכון חשוב מאז יחידות המשנה ריבוזומליות מורכבות מולקולות RNA שניתן לעכל, לשבש את שלמות הריבוזום, גרימת זיהום rRNA והרס RF44. במקור, RNase אני שימש לעיכול של mRNA ודור RF ב eukaryotes1. מאז אנזים זה נראה לא פעיל בחיידקים, הוא הוחלף עם גרעין מיקרוקוס (MNase) מ Staphylococcus aureus21. מאוחר יותר הראה כי RNAse אני יכול למעשה לבצע עיכול של דגימות חיידקים, אולם MNase נשאר נפוץ למטרה זו53. החיסרון של MNase טמון בהטיית הרצף של הפעילות הקטליטית שלה, שהיא 30-פי 30 מוגברת proximal כדי A או T, וכתוצאה מכך 80% של שברי mRNA החל A או T בסוף 5′סוף 14. עם זאת, זה כבר להתגבר על ידי התצפית כי רוב וריאציה באורך מתרחשת ב 5′-סוף של RF, והקצאת צפיפות ריבוזום 3′-end מניב מידע מדויק ומדויק על מיקום ריבוזום7. פעילות MNase מושפעת מריכוז האנזים, זמן ה- pH והעיכול ויש לקבוע אותה עבור כל אצווה חדשה של MNase. פעילות גרעין מוגברת גורמת לזיהום rRNA מוגבר, בעוד פעילות מופחתת גורמת למחשוף פחות מדויק של עקבות ריבוזומליות. זה עשוי להפחית את התשואה הכוללת של RF בהליך טיהור ג'ל סלקטיבי גודל ולספק מידע מדויק פחות על עמדות ריבוזום על mRNA14. לכן, הסכום הנדרש של MNase צריך להיקבע בזהירות. עבור הניסויים שלנו אנו מיישמים 712.5 U של גרעין מיקרוקוסאלי לכל 1 מ"ג של RNA בעוד הריכוז המדווח בספרות משתנה בין 50 U38, 450 U34, 1000 U14 ו 1500 U15,21,36 לכל 1 מ"ג של RNA. כפי שהוזכר לעיל, MNase דורש נוכחות של יוני סידן לפעילותה. בפרוטוקולים סטנדרטיים EGTA, סוכן chelating עבור יונים דו-ערכיים אשר יש זיקה גבוהה יותר סידן לעומת מגנזיום54, משמש לעצירת העיכול על ידי איגוד סידן והשבתת MNase. עם זאת, בפרוטוקול שלנו תגובת העיכול נעצרת על ידי שימוש בערכת ניקוי RNA מיד לאחר הדגירה עם הגרעין.

בפרוטוקולים סטנדרטיים, השלב הבא הוא התאוששות ריבוזומים על ידי כרית סוכרוז ultracentrifugation או שיפוע סוכרוז ultracentrifugation8,14. צנטריפוגה הדרגתית של סוכרוז מאפשרת הפרדה סלקטיבית של המונוסומים מיחדות המשנה והפוליזומים, אולם היא דורשת ציוד ספציפי כגון מערבל הדרגתי ואולטרה-סנטריפוג. כמו כן, התפוקה של שיטה זו מוגבלת 500-700 μL של lysate. מצד שני, כרית סוכרוז ultracentrifugation כדורי רוב החלקיקים ריבוזומליים, מאפשר עיבוד של מעל תריסר מיליליטר של lysate והוא פחות תובעני במונחים של המכשור הדרוש. עם זאת, שתי הגישות הן ארוכות כפי שהם לוקחים מינימום 4 עד 6.5 שעות14 ודורשים ultracentrifuge. בפרוטוקול שלנו שלב זה מושמט כאשר אנו ממשיכים ישירות לבחירת גודל ב 15% TBE-אוריאה פוליאקרילמיד ג'ל. האלקטרופורזה מבוצעת בתנאים דנאטוריים על מנת לפרוש את המבנים המשניים של RNA ולמנוע אינטראקציות תוך מולקולריות. אנו משתמשים 26 nt, 29 nt ו 32 nt אוליגונוקלאוטידים כסמנים לכריתת טווח צר של עקבות ריבוזומליות. אנו מניחים כי הריכוז של RF בפועל עולה באופן משמעותי על זיהום פוטנציאלי עם RF שווא נחשב אקראי, לא מוגן על ידי mRNA ריבוזום או שברי rRNA של אורך בטווח זה. התוצאות שהתקבלו באמצעות הפרוטוקול שלנו אכן הראו שבר מועשר של RF בטווח הגודל שנבחר. בדיקת האיכות עם Agilent 2100 Bioanalyzer מציגה ספריות RIBO-seq כספריות ופסגות יחידות ומוגדרות היטב, בניגוד לספריות RNA-seq אשר מוצגות כהכפשות ופסגות רחבות משמעותית(איור 5). כמו כן, נתוני ריבו-סק שהתקבלו מציגים מחזוריות שלישייה (איור 8A), שאינה נצפית בנתוני ה-RNA-seq (איור 8B). יתר על כן, ההדמיות של ה- RF המתקבל הממופה לגנום מראות דפוסי ביטוי דומים מאוד ללא קשר לשיטת בידוד טביעת הרגל שאושרה עוד יותר בניתוחים הביו-אינפורמטיים שלנו (איור 9). ובכל זאת, אנו מודעים לכך RF שווא יכול למפות את הגנום אשר עלול להפריע האות המתקבל. עם זאת, העובדה כי RF שווא נוצרים באופן אקראי מרמז כי הם לא צריכים לצבור למקום אחד על הגנום ולכן, לא צריך לגרום חפצים תוצאה כוזבת. כמו כן, יש לציין כי אין קונצנזוס במחקרים חיידקיים לגבי גודל RFs כי צריך להיות מבודד53,55 וכי בחירת רק תת שבר של טווח אורך עלול להוביל לפרשנות מוטעית של התוצאות17. הוא הציע כי מגוון רחב של אורכים האופייניים עקבות חיידקיים היא תוצאה של התנהגות ריבוזום פרוקריוטי ולא MNase עיכול55. לדוגמה, אינטראקציה משלימה בין 3′ סוף 16S rRNA ב subunit ריבוזומלי קטן מוטיב שיין-Dalgarno ב mRNA יכול לגרום RFארוך יותר 56. בהתחשב במגוון רחב של אורכי עקבות חיידקיים, Mohammad et al. ממליץ לבצע בחירת גודל בין 15 ל 40 nt17,55. זה אמור להוביל לבידוד של מגוון רחב של RFs ולהבטיח קבלת ייצוג מקיף של ריבוזומים בשלבים שונים של מחזור התרגום. בגלל הדיון המתמשך, טווח כריתה צריך להיחשב בזהירות וחשוב לזכור כי הבחירה השגויה עשויה להוציא כמה תתי-עבירות של RF ולהוביל להטיה בניתוח הבא.

בשל בחירת הגודל המבוצעת ישירות לאחר עיכול גרעיני ועם השמטת הבידוד המונוזום על ידי ultracentrifugation, הפרוטוקול שלנו מהיר, קל יחסית וניתן לבצע אותו עם ציוד מעבדה סטנדרטי. באמצעות ערכות ייעודיות לניקוי ה-RNA והדנ"א, טיהור ה-mRNA והכנת הספרייה מבטיחים סטנדרטיזציה וחזרה. Appling נפח גדול יותר של אתנול במהלך ניקוי RNA מגביר את יעילות הטיהור של שברי RNA 200 nt <57. שינויים בהכנת הספרייה - הארכת זמן הדגירה והעלאת הטמפרטורה במהלך קשירת מתאמים - מוחלים כדי להפחית את יעילות הקשירה עבור RNA מתילציה, כגון rRNA, ולהפחית זיהום rRNA58. הפרוטוקול שלנו שימש כדי לחקור את תקנות התרגום בתנאי צמיחה שונים (פרסומים תחת הכנה) אך ניתן ליישם אותו כדי ללמוד היבטים אחרים של תרגום כמו גילוי TIS או כדי לשפר את ביאור הגנום ולסייע במחקרים פרוטאומיים. שינוי נוסף בפרוטוקול, התלוי בשאלת המחקר, ניתן לכלול בקלות, למשל הצלבת הריבוזום עם החלבון של עניין או טיהור זיקה של ריבוזומים של עניין וכתוצאה מכך שברים מועשרים של ריבוזומים. עם הפרוטוקול שלנו הליך RIBO-seq נגיש יותר למדענים ולכן, עשוי לעורר תגליות חדשות ולהאיץ את ההתפתחויות בתחום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ALS רוצה להכיר בתמיכה הכספית של EMBO התקנה מענקים IG 3914, ו POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 שבוצע במסגרת תוכנית TEAM הראשונה של הקרן למדע פולני במימון משותף של האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח אזורי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 174
RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter