Summary
聚合物体是自组装的聚合囊泡，形成球形，以尽量减少吉布的自由能量。在药物输送方面，更拉长的结构是有益的。本协议建立了方法，以创建更多的棒状聚合物体，与拉长的纵横比，使用盐诱导渗透压力和减少内部囊泡体积。
Abstract
聚合物体是膜结合的双层囊泡，由嗜血块共聚体制成，可以封装疏水和亲水有效载荷，用于药物输送应用。尽管聚合物体很有前途，但由于其球形，其应用有限，而细胞不易被细胞占据，固体纳米粒子科学家证明了这一点。本文描述了一种盐基方法，用于提高球形聚合物（乙二醇）（PEG）基聚合物的纵横比。这种方法可以拉长聚合物体，并最终通过在形成后透析中加入氯化钠来控制其最终形状。盐浓度可以多种多样，如本方法所述，基于用作聚合物和目标形状基础的块聚合物的疏水性。拉长的纳米粒子有可能更好地瞄准直径较大的血管中的内皮，如观察到边缘的静脉。本方案可利用拉长技术与聚合物的双载长循环效益配合，扩大治疗纳米粒子的应用。
Introduction
形状调制是改善纳米粒子介质药物输送的一种相对较新和有效的方法。形态的变化不仅增加了粒子的表面积，反过来又增加了承载能力，而且对提高稳定性、循环时间、生物可用性、分子靶向和受控释放1具有全面的影响。聚合物体是该方法中焦点的纳米粒子，它倾向于热力学自我组装成球形，这已被证明在细胞吸收中不切实际，并且更容易在免疫系统中作为异物检测到。能够将结构拉长成一根蛋白石或一根棒子，将使药物携带者通过模仿原生细胞来躲避巨噬细胞，并更成功地将它们交付到他们期望的目标2、3、4、5、6、7。聚合物体的显著优点，包括有效载荷的膜绑定保护，膜的刺激反应，以及亲水药物和疏水药物8，9，10的双重封装，使他们在形状调制过程中保持药物输送的有力候选者。
调节聚合物体的形状有许多不同的方法，每种方法都有各自的优缺点。然而，这些方法大多分为两类：溶剂驱动和盐驱动的渗透压力变化11。这两种方法都旨在克服聚合物形成球形平衡形状后存在的弯曲能量。通过引入渗透压力梯度，聚合物体可以被迫弯曲成拉长结构，尽管强弯曲能量11，12。
基于溶剂的方法探索形状的变化灵感来自金和范赫斯特13的工作。他们将有机溶剂和水混合物中的聚合物塑料化，将有机溶剂捕获在囊泡膜中，并将水从囊芯中排出。最终，粒子的内部体积如此之低，以至于拉长了。虽然这种方法已显示出希望，但它缺乏实用性。此方法需要不同的溶剂为每个单独的聚合物骨干参与调制。因此，它并不广泛适用于促进形状的变化。相反，盐基方法是均匀的，并利用一个通用驱动因素，可以引入渗透压力到许多块聚合物为基础的聚合物体。
该项目采用拉莫罗等人引进的盐基方法。此协议涉及两轮透析。一种旨在通过去除在生产过程中可能困在双层中的有机溶剂来净化和凝固聚（乙二醇）-b-聚合物（乳酸）（PEG-PLA）聚合物，另一种则促进形状变化。第二个透析步骤引入了 50 mM NaCl 溶液，可创建渗透压力梯度以驱动形状变化。这种方法得到了萨尔瓦等人的支持，他们指出，溶液中的超音速应激会导致囊泡收缩15。此方法基于先前发布的方法14， 从 50-200 m NaCl 中查看两种不同的聚酯聚合物和各种盐梯度。聚酯由于其生物相容性和生物降解而使用。盐梯度对形状有不同的影响，具体取决于块共聚体骨干的疏水性。它可用于创建前列腺、棒和豆类细胞。之所以选择这种盐驱动的方法，是因为复制的便利性和实验的多功能性。
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Protocol
1. 使用溶剂注射法形成球形聚合物
- 有机溶剂中聚酯溶解
注：一次只应溶解一个聚酯溶解在各自的有机溶剂中，形成聚合物体。- 溶解聚酯PEG-PLA或PEG-b-poly（乳酸-共甘油酸）（PEG-PLGA）在二甲基硫氧化物（DMSO）的浓度为1.5%的重量。具体来说，溶解 0.015 克选定的聚酯在 1 mL 的 DMSO （15 毫克/毫升）.。聚合物的完全溶解可能需要长达15分钟的涡流。
- 当聚酯溶解在有机溶剂中时，根据 图1设置溶剂注射装置。
- 将搅拌板直接放在垂直注射器泵下面。将一个 5 mL 玻璃瓶与 1 mL 的 II 型电离水和微型搅拌棒放在搅拌盘上。
- 调整注射器泵的高度，使针头的尖端完全浸入II型电离水中。
- 将注射器泵的输液速率设置为 5 μL/分钟。
注：如果使用小容量注射器泵，则可以将带注射器的适配器设置在环形支架上。如果使用大容量注射器泵，泵可以垂直放置在实验室插孔上以调整高度。
- 通过将有机溶剂和聚酯溶液（第 1.1.1 步）绘制成 27 G 针头，针头长度为 1/2"，执行溶剂注射。
- 将针头放入注射器泵中，确保完全安全。调整推手块以触摸注射器柱塞的末端。
- 启动搅拌盘，使水在 100 rpm 旋转，然后启动注射器泵。
- 一旦注射器泵将有机溶剂和聚合物充分注入搅拌水中，从搅拌棒中取出并盖住玻璃瓶。
- 通过动态光散射 （DLS） 来描述聚合物体的特征。
- 取1mL的水，现在有一小部分有机溶剂和聚合物，并放置在1mL的cuvette。
- 使用 表 1中的设置，通过在系统中放置 1 mL cuvette 并设置运行来执行 DLS。阅读并收集聚合物强度加权直径和聚分散度指数 （PDI）。
注意：在这种情况下，塑料小面包效果很好，因为有机溶剂的含量非常低。但是，如果存在任何顾虑，玻璃杯也会起作用。
- 使用传输电子显微镜 （TEM） 和扫描电子显微镜 （SEM） 确认球形聚合物的形成。
- 根据可用设备优化 TEM 和 SEM 协议。在 TEM 中获得了 120 kV 的代表性结果，在 SEM 中获得了 5.0 kV 的代表性结果。
- 如果使用 EM 看不到聚合物，请将醋酸尿素用作背景污渍。
注：关于聚酯聚合物形状调制的 TEM 和 SEM 成像的详细信息，请参照14找到。软纳米粒子电子显微镜技术资料详见参考16。
2. 透析去除有机溶剂
- 根据制造商提供的协议清洗 300 kDa 透析膜。
- 将 1 mL 聚合物溶液加入透析装置的储层中。
- 将透析装置放在 250 mL 烧饼中，将 150 mL 的 II 型电离水放在搅拌盘上。将搅拌板设置为允许透析装置的轻柔运动的速度，然后离开搅拌过夜。
注意：如果在透析过程中形成漩涡，则速度需要降低。 - 透析完成后，从透析装置中提取 1 mL 聚合物溶液。按照第 1.5 步对聚合物溶液进行特征化。
注：收集此信息与确定形状调制协议的成功相关，因为如果聚合物体已拉长，则应能够识别 PDI 的增加。
3. 对盐梯度进行透析
- 根据最终所需的聚合物特性，创建 150 mL 的所需盐缓冲区，其氯化钠浓度为 50 mM、100 mM 或 200 mM。一般来说，盐浓度的增加会导致聚合物拉长的增加。
- 取透析和定性聚合物溶液，重新放入透析装置中。将装载的透析装置放入所需的盐溶液的 150 mL 中，并轻轻搅拌 18 小时。
注：可将形状调节聚合物体存储并维持其形状，以同位素溶液保存长达 7 天。
4. 形状调制聚合物特征
- 形状调制后，通过 DLS、TEM 和 SEM 执行聚合物特征。如果使用 EM 看不到聚合物，请将醋酸尿素用作背景污渍。
- 执行第 1.5 步中描述的 DLS 测量，特别注意 PDI 测量与球形聚合物体相比，因为 PDI 的变化表明聚合物体的形状发生了有效变化。
- 确保使用适当的成像控制，特别是非形状调制聚合物，以确保该方法的成功。
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Representative Results
表 2 在遵循协议步骤 1 时呈现预期结果。请注意，DMSO 在聚合物体形成中用作 PEG-PLA 和 PEG-PLGA 的溶剂。偏离这种溶剂是可能的，因为其他水错溶剂将溶解共聚物，但预计将改变结果。预计PDI将低于0.2，表明单分散聚合物体17的形成。请注意，水灵性增加会导致聚合物直径和 PDI 的偏差增加。如果运行协议时，聚合物直径与此表中报告的直径有显著差异：最典型的罪魁祸首是纳米粒子浓度低，该样本的计数率较低。
图2在添加盐梯度之前显示非形状调节聚合物的外观。这里介绍的是PEG-PLA聚合物体在协议步骤1之后取得的具有代表性的结果。无论使用块共聚体，TEM 应指示整体球形结构，外线较厚，表示膜。没有 NaCl，PEG-PLA 聚合物在 SEM 中作为球形结构存在，通过粗糙的表面呈现观察到类似毛刷的 PEG 外部层。
图3显示了透析后聚合物体的预期变化（第2步）。无论聚合物形成中使用的有机溶剂浓度如何，在水中进行一小时透析以去除溶剂将导致相同的总体平均直径，溶剂去除会降低聚合物直径。当使用更大的有机溶剂初始浓度时，预计直径会减少。
图 4提供具有代表性的 DLS 结果后形状更改（步骤 4）。 图4A 显示，在制造PEG-PLA聚合物时，PDI预期会有适度变化，这可能表示形状发生变化，但需要成像来确认聚合物形成哪些特定形状。将 PEG-PLA 聚合物与 50 mM NaCl 进行透析可导致宽比在 2 左右的前列叶形成，尽管这不是一个一致的结果，PDI14中的较大偏差证明了这一点。盐的浓度越高，就会形成更多的类似番茄子的形状，这与目前的文献18是一致的。当对PEG-PLGA聚合物（比PEG-PLA聚合物略多）与盐进行透析时，PDI 的增加与拉长更一致，所有探索的盐梯度都会导致 PDI 的增加。在PDI（+PDI）之上进行改变对长聚合物体的形成是令人鼓舞的。同样，成像应用于确认正在创建哪些形状。 图4B 显示，使用 50 mM 盐梯度导致形状变化时，应观察到类似的结果， 无论聚酯疏水性如何，100 mM 和 200 mM NaCl 盐梯度都显示出随着聚酯疏水性增加而增加的直接趋势（即PEG-PLGA在盐透析后应比 PEG-PLA 具有更高的 +PDI）。
图 5提供了运行协议时预期的聚合物形状的一些示例。呈现的是 0、50、100 或 200 m NaCl 透析后形状调节 PEG-PLA 聚合物的代表性 TEM 图像。回想一下，自组装聚合物体比固体颗粒更难以控制。因此，预计每个样品的大小和形状都会出现偏差，在调节更坚固的纳米粒子5、7、19、20、21的形状时，不会观察到这些偏差。图4和图5的知识证明了PEG-PLA聚合物与50mM的NaCl的透析：此样本带有番茄核细胞和拉长棒。随着盐增加到100mM，观察到的棒数增加，番茄细胞数量减少。最后，通过对 200 mM NaCl 进行透析，PEG-PLA 聚合物更一致地形成具有适度纵横比（介于 2 到 3 之间的）的前列。运行此协议将导致纳米粒子形状的分布，自组装纳米医学的性质也会导致纳米粒子形状的分布。
| 设置 | 价值 |
| 材料折射指数 | 设置为您的材料;1.450 聚合物 |
| 分散 剂 | [纳克] 使用;DLS 软件中设置的复杂溶剂 |
| 温度 | 25 °C |
| 平衡时间 | 120s |
| 测量角度 | 173 ° 背部散射 |
| 测量持续时间 | 自动 |
| 数据处理 | 通用用途 |
表1：通过动态光散射形状调制前后聚合物的大小和聚变度指数时使用的参数。
| 聚酯块共聚合物 | 直径 | PDI | ||||
| d， nm | - | |||||
| 佩格 - b - 普拉 | 202.5 | ± | 12.0 | 0.06 | ± | 0.06 |
| 佩格 - b - 普尔加 | 139.6 | ± | 25.9 | 0.16 | ± | 0.06 |
| 佩格 - b - Pcl | 320.9 | ± | 98.8 | 0.14 | ± | 0.06 |
表2：溶剂注射后的平均聚合物直径和聚分散性指数。 此数据是典型的 PEG-PLA 和 PEG-PLGA 聚合物后溶剂注射，继步骤 1.5。在协议中。
图1：溶剂注射装置。 与生物伦德创建。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：球形PEG-PLA聚合物盐前透析的TEM和SEM图像。对于 TEM 而言，球状颗粒由 0 mM NaCl 悬架干燥，并染上醋酸尿素。TEM 图像以 120 kV/60，000x 直接放大拍摄。SEM 图像拍摄于 5.0 kV。图像是根据先前公布的结果14改编的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：透析过程中球形PEG-PLA基聚合物Z平均直径。透析去除有机溶剂，凝固聚合物膜，降低聚合物直径，PEG-PLA聚合物就证明了这一点。这个数字改编自预印本22，发表在《纳米技术14》上。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4：添加盐梯度后，每个聚酯聚合物体的预期PDI变化（+PDI）。 （B） 每个 NaCl 浓度的 éPDI 与聚酯。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：在对0、50、100和200mM NaCl进行透析后，形状调节PEG-PLA聚合物的TEM图像样本。 为了帮助可视化通过盐透析形成的形状，在图形顶部提供了一把钥匙，表示球体（紫色）、棒状（绿色）、蛋白石（橙色）和原子细胞（红色）的潜在形状。与自组装系统一样，形成了各种形状和大小。在盐透析之前，球体一直被观察到。使用 50 mM 和 100 mM 氯化钠梯度可形成多种形状，包括按所提供的键以箭头表示的原子细胞（50 和 100 mM）、棒（50 mM）、球体（100 mM）和前列腺（100 mM）。最后，使用200mM的氯化钠梯度导致形成主要的蛋白石形状，与一些原子细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
自组装系统是出了名的无法控制。它们的最终属性，包括大小、形状和结构，是由所选的两栖动物的疏水特性和所选溶剂环境驱动的。嗜血块共聚物倾向于球形，从而最大限度地减少吉布的自由能量，并导致热力学平衡23，从而形成聚合物体。由于其平衡性质，聚合物体在拉长或改变形状方面具有更大的挑战性，因此，与固体纳米粒子相比，研究较少。溶剂驱动的方法已经与PEG-b-聚苯乙烯（PS）为基础的聚合物体12，13，24，25，26，27进行了广泛的研究。然而，由于需要重新优化每个块聚合物基于溶剂的方法的协议，这种方法尚未被广泛采用，以改变由替代材料制成的聚合物体的形状。用于调节聚合物形状的其他方法与聚合物化学非常特殊：一些引入环乙烯组24，28或其他十字链路器29，30，31启动所需的崩溃和拉长。聚合物材料方法的特殊性限制了其广泛的适用性。此方法使用盐作为驱动因素，在内部、囊封水和外部盐水之间创建渗透压力梯度。这可以比替代溶剂驱动方法更普遍地应用，因为各种聚合物需要各种溶剂来确保形状调制的成功。聚合物体的盐基形状调制与PEG-b-PS18、聚（二甲基硅氧烷）-g-聚（氧化乙烯）15（现在，随着最近的出版，聚酯基聚合物14）合作。这种方法在化学上的成功为开发更有针对性的药物输送系统大有希望。值得注意的是，这种方法在使用聚酯剂时具有广泛的生物效益，因为这些材料是可生物降解的。
第一个透析步骤至关重要。聚合物形成的溶剂注入方法利用水错溶剂，这些溶剂在形成过程中可能被困在聚合物的疏水膜中，使其膜更容易渗透到盐等物中。水中形成聚合物的初始透析可确保溶剂从聚合物骨干中去除，聚合物直径的减少（图3）。这使得聚合物对第二个透析步骤中引入的盐分子的渗透性降低，从而形成聚合物膜上的压力梯度。
在创建形状调节聚合物时，预计每个样品将拥有不同形状和大小的聚合物体。膜结合药物输送的好处，包括但不限于有效载荷保护、延长循环时间和增加细胞吸收，超过了多分散性的缺点。这一事实要求每次准备聚合物体时，图像都要与 DLS 数据同时拍摄。人们注意到，PDI的增加表示从球形粒子向非球形粒子32的转变，但尚未确定+PDI与特定形状之间的直接相关性。这对于降低盐浓度尤为重要，因为在 +PDI 中存在大量批次变异性（图 4）。
这种方法只应用于调节本文中提出的形成聚合物体的两种聚酯块聚合物的形状（PEG-PLA 和 PEG-PLGA）。其他类型的PEG基聚合物系统已经通过其他盐梯度或溶剂梯度改变了形状，这些梯度在其他地方被审查33，尽管对非PEG聚合物系统的形状调制的研究不多。聚合物体是PEG-PLA和PEG-PLGA的平衡状态，由于它们的分子量，它提供了亲水分数，导致膜绑定囊泡10。因此，直接使用替代聚合物遵循该方法可能会产生不同的结果。一般来说，这种方法可以用来控制由聚酯块聚合物形成的臭名昭著的无法控制的自组装聚合物体的形状。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目部分由国家卫生研究院项目5P20GM103499-19通过学生启动研究项目项目资助。这项工作也得到了克莱姆森的创意调查计划的部分支持。我们也感谢尼古拉斯·拉莫罗和奥恩·阿里谁最初致力于创建这个协议，发表他们的第一篇论文引用这里14。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15*45 vials screw thread w/cap attached | Fisherbrand | 9609104000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Chemical | D128-1 | |
| Dimethyl Sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates | Fisher scientific | CIC00008110V19 | |
| LEGATO 130 SYRINGE PUMP | kd Scientific | 788130 | |
| PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer | Polysciences Inc | 24381-1 | note the molecular weights when replicating |
| Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500) | Sigma aldrich | 764825-1G | note the molecular weights when replicating |
| Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical | BD medical | BD305620 | Tuberculin |
| Sodium Chloride | BDH | BDH9286 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern |
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