Summary
ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。
Abstract
このプロトコルは、抗生物質誘導を使用して病原性 大腸菌 株によって産生されるコリシンE3およびバクテリオシンの殺菌酵素の免疫タンパク質を同定し、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法およびトップダウンプロテオミクス分析によって社内で開発されたソフトウェアで同定される。アシシンE3(Im3)の免疫タンパク質とバクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン残基のC末端側のポリペプチド骨格切断(PBC)によって生成された顕著なb-および/またはy型断片イオンから同定された。このソフトウェアは、細菌株の全ゲノムシーケンシングに由来する インシリコ タンパク質配列を迅速にスキャンします。また、このソフトウェアは、成熟タンパク質配列が切り捨てられた場合にタンパク質配列のアミノ酸残基を繰りつ離します。1つのタンパク質配列は、各免疫タンパク質について検出されたものと一致する質量およびフラグメントイオンを有する。候補シーケンスを手動で検査し、検出されたすべてのフラグメントイオンが割り当てられることを確認しました。Im3のN末端メチオニンは翻訳後に除去されたのに対し、Im-Bacは完全な配列を持っていた。さらに、正しいタンパク質配列を同定するためにPBCによって形成された非相補性フラグメントイオンは2~3個しか必要でないことがわかりました。最後に、プロモーター(SOSボックス)を、細菌株のプラスミドゲノム中の抗菌遺伝子および免疫遺伝子の上流で同定した。
Introduction
質量分析法による未消化タンパク質の分析および同定は、トップダウンプロテオーム解析1、2、3、4と呼ばれる。エレクトロスプレーイオン化(ESI)5と高解像度質量分析計6を利用した技術として確立され、高度な解離技術、例えば電子転写解離(ETD)、電子捕捉解離(ECD)7、紫外線光解離(UV-PD)8、等を利用する技術が確立されている。
他のソフトイオン化技術は、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化(MALDI)9、10、11であり、主に飛行時間(TOF)質量分析装置と結合されているため、トップダウン分析にはあまり広く利用されておらず、他の質量分析装置と比較して分解能が限られている。これらの制限にもかかわらず、MALDI-TOFおよびMALDI-TOF-TOFの装置は、純粋なタンパク質の迅速なトップダウン分析と、タンパク質の分画および未分化混合物のために利用されてきました。純粋なタンパク質の同定のために、インソース崩壊(ISD)は、ISD断片イオンの質量分析(MS)分析、ならびに標的のN-およびC末筋からしばしば配列特異的断片を提供するタンパク質イオン断片のタンデム質量分析(MS/MS)を可能にするため、特に有用な技術である。.ISD アプローチの欠点は、エドマンシーケンシングと同様に、サンプルに含まれているタンパク質が 1 つだけである点です。1つのタンパク質要件は、前駆体イオンへのフラグメントイオンの明確なアトリビューションの必要性によるものです。サンプルに複数のタンパク質が存在する場合、どのフラグメントイオンがどの前駆物質に属しているかは、割り当てが難しい場合があります。
フラグメントイオン/前駆体イオンアトリビューションは、MALDI-TOF-TOF-MS/MSを使用して対処することができます。従来のMS/MS実験と同様に、前駆体イオンは断片化の前に質量選択/単離され、検出されたフラグメントイオンは特定の前駆体イオンに起因する可能性があります。しかしながら、このアプローチで利用可能な解離技術は、主に高エネルギー衝突誘発解離(HE-CID)14またはポストソース崩壊(PSD)15,16に限定される。HE-CIDおよびPSDは、ペプチドおよび小タンパク質の断片化に最も効果的であり、配列被覆範囲は、場合によっては制限される可能性がある。また、PSDは、アスパラギン酸効果17、18、19、20と呼ばれる現象によって、主にアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基のC末端側にポリペプチド骨格切断(PBC)をもたらす。
MALDI-TOF-MSはまた、微生物の分類学的同定におけるニッチな用途を発見しました: 細菌21、 真菌22、およびウイルス23.例えば、MSスペクトルは、比較のためにパターン認識アルゴリズムを用いて既知の細菌のMSスペクトルの参照ライブラリーと比較して未知の細菌を同定するために使用される。このアプローチは、その速度とシンプルさのために非常に成功していますが、分離物の一晩の培養が必要です。このアプローチによって検出されたタンパクイオン(通常は20kDa以下)は、属および種レベルでの分類学的分解能を可能にするMS指紋を含み、場合によってはサブ種24および株レベル25、26で。しかし、病原性の可能性のある微生物を分類的に分類するだけでなく、特定の病原性因子、毒素、抗菌性(AMR)因子を同定する必要があります。これを達成するために、ペプチド、タンパク質、または小分子の質量をMSによって測定し、その後MS/MSによって単離され、断片化されます。
病原性細菌は、しばしばプラスミドと呼ばれるDNAの円形の断片を運ぶ。プラスミドは、プロファージと共に、細菌間の水平遺伝子導入の主要なベクターであり、細菌間で抗菌性および他の毒性因子の急速な広がりを引き起す。プラスミドはまた、抗菌(AB)遺伝子、例えば、コリシンおよびバクテリオシンを運ぶことができる。これらの遺伝子が発現し、タンパク質が分泌されると、それらは、同じ環境ニッチ27を占める隣接細菌のタンパク質翻訳機械を無効にする作用をする。しかし、これらの殺菌酵素は、それらを産生する宿主にリスクをもたらす可能性もある。その結果、遺伝子は、AB酵素の機能を特異的に阻害し、その免疫タンパク質(Im)と呼ばれる宿主によって共発現される。
マイトマイシンCやシプロフロキサシンなどのDNA損傷性抗生物質は、細菌ゲノム28に存在するプロファージゲノム内に滋賀毒素遺伝子(stx)が見つかる滋賀毒素産生大腸菌(STEC)においてSOS応答を誘導するためによく用いられる。我々は、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス分析を使用して、STEC株29、30、31、32によって産生されるStx型およびサブタイプを検出し、同定した。前の研究では、STEC O113:H21株RM7788は、マイトマイシンCを補充した寒天培地上で一晩培養した。しかし、m/z~7816で予想されるStx2aのBサブユニットを検出する代わりに、m/z〜7839で異なるタンパク質イオンが検出され、未知の機能33のプラスミドコード化された仮説タンパク質として同定された。今回の研究では、全ゲノムシーケンシング(WGS)由来のインシリコタンパク質配列を処理およびスキャンするために開発されたスタンドアロンソフトウェアを用いて、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス解析を用いて、この株によって産生される2つのプラスミドコード化AB-Imタンパク質を同定した。さらに、シーケンス切り捨てを伴う翻訳後改変(PTM)の可能性がソフトウェアに組み込まれました。免疫タンパク質は、アスパラギン酸効果によって引き起こされたPBCからの成熟タンパク質イオンおよび配列特異的フラグメントイオンの測定質量からこのソフトウェアを使用して同定され、MS/MS-PSDによって検出された。最後に、この株がDNA損傷性抗生物質にさらされたときにこれらの遺伝子の発現を説明することができるプラスミドゲノム中のAB/Im遺伝子の上流にプロモーターが同定された。この作品の一部は、2020年8月17-20日の仮想会議&博覧会(2020年8月17-20日)34で発表された。
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Protocol
1. 微生物学的サンプル調製
- 無菌1 μLループを使用してグリセロールストックから50 mL円錐管に25 mLのルリアスープ(LB)を大 腸菌 O113:H21株RM7788(または別の細菌株)を接種します。チューブをキャップし、4時間振る(200rpm)で37°Cで前培養します。
- アリコート100 μLの前培養ブロスを400または800 ng/mLのミトマイシンCを補ったLB寒天プレートに広げる。培養寒天プレートを37°Cのインキュベーターで一晩静に培養する。
注意:STEC株は病原性微生物です。BSL-2バイオセーフティキャビネットで、培養を超えたすべての微生物学的操作を行います。 - 滅菌1 μLループを使用して単一の可視コロニーから細菌細胞を収穫し、300 μLのHPLCグレードの水を含む2.0 mL Oリング裏地付きスクリューキャップマイクロ遠心チューブに移します。チューブをキャップし、渦を短時間、遠心分離機を11,337 x g で2分間ペレットにします。
2. 質量分析
- サンプル上清の0.75 μLアリコートをステンレス鋼MALDIターゲットにスポットし、乾燥させます。乾燥したサンプルスポットを、33%アセトニトリル、67%の水、0.2%トリフルオロ酢酸のシナピエン酸の飽和溶液の0.75 μLアリコートでオーバーレイします。スポットを乾燥させます。
- MALDI-TOF-TOF質量分析計を使用して、乾燥したサンプルスポットを分析します。
- MALDI ターゲットを質量分析計にロードした後、取得ソフトウェアで MS リニア モード取得のボタンをクリックします。取得方法ソフトウェアのそれぞれのフィールドに下限と上限のm/z(例えば、2 kDa から20 kDa)を入力して、分析するm/z範囲を入力します。
- ソフトウェアの MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押下し、サンプルスポット上にマウスカーソルをドラッグして、レーザーアブレーション/イオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。マウスボタンを放すと、取得が開始されます。各サンプルスポットに対して1,000枚のレーザーショットを集める。
メモ:データ取得は、ソフトウェア取得ウィンドウにリアルタイムで表示されます。 - イオンが検出されない場合は、ソフトウェアのレーザー強度の下で、タンパク質イオン信号が検出されるまで、レーザー強度の下でスライディングスケールバーを調整してレーザー強度を高めます。これをしきい値と呼びます。
注:サンプルスポット分析の前に、m / zが分析される範囲にまたがるタンパク質キャリブラント(例えば、タンパク質キャリブラントの+1および+2の電荷状態)でMSリニアモードで機器を外部キャリブレーションします:シトクロムC、リソチーム、ミオグロビンは2kDa〜20 kDaの質量範囲をカバーします。指定された質量範囲内の中間質量は、例えば9 kDaの焦点質量として使用されます。焦点質量は、リニアモード検出器による検出のためにm/zが最適に焦点を合わせているイオンです。 - MS リニア モードの取得が完了したら、取得ソフトウェアで MS/MS 反射モード取得のボタンをクリックします。解析する前駆体質量を 前駆体質量 フィールドに入力します。次に、 前駆体質量 の低質量側と高質量側の分離幅(Da)を前駆体質量の側面(例えば、±100 Da)に入力します。
- CID オフボタンをクリックします。メタスタブルサプレッサーONボタンをクリックします。ソフトウェアのレーザー強度の下のスライドスケールバーを調整して、レーザー強度を最大値の90%以上に調整します。
- ソフトウェアの MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押し下げ、サンプルスポット上にマウスカーソルをドラッグして、レーザーアブレーション/イオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。マウスボタンを放すと、取得が開始されます。各サンプルスポットに対して10,000枚のレーザーショットを集める。
注:サンプルスポット分析の前に、器具は、アルキル化チオレドキシン35の+1電荷状態のポストソース崩壊(PSD)からのフラグメントイオンを使用してMS / MS反射体モードで外部較正する必要があります。
- 生の MS データは処理しません。高度なベースライン補正(32、0.5、0.0)、次のノイズ除去(2標準偏差)、続いてガウス平滑法(31ポイント)の順にMS/MS-PSDの生データを処理します。
- PBC19,20で生成された顕著なフラグメントイオンの存在を MS/MS-PSD データを手動で検査します。
- フラグメントイオンの絶対量と相対量と、そのシグナル対雑音(S/N)に関してMS/MSデータを評価します。MS/MS-PSDデータが騒々しい場合は特に、タンパク質同定のために最も豊富なフラグメントイオンのみを使用してください。
3.インシリコ タンパク質データベース構築
- 細菌株 のインシリコ タンパク質配列を含むテキストファイルを生成し、タンパク質の同定のためにタンパク質バイオマーカーSeekerソフトウェアによってスキャンされます。タンパク質配列は、分析対象の株(または密接に関連する株)の全ゲノムシーケンシング(WGS)に由来する。
- NCBI/PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)のウェブサイトにアクセスして、分析中の特定の細菌株(例えば、大腸菌 O113:H21株RM7788)の約5,000個のタンパク質配列をダウンロードします。最大ダウンロード サイズは 200 シーケンスです。
- 結果として、25 のダウンロードをコピーして、1 つのテキスト ファイルに貼り付けます。ダウンロードごとに FASTA (テキスト) 形式を選択します。
4. 操作タンパク質バイオマーカーシーカーソフトウェア
- タンパク質バイオマーカーシーカー実行可能ファイルをダブルクリックします。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) ウィンドウが表示されます (図 1、上部パネル)。
- タンパク質バイオマーカーの質量(MS-リニアモードで測定)を 成熟タンパク質質量 フィールドに入力します。次に、質量測定誤差を [質量公差 ]フィールドに入力します。標準的な質量測定誤差は、10,000 Daタンパク質の場合±10 Daです。
- 必要に応じて、補完的な相補フラグメントイオンペア(CFIPまたはb/y)からタンパク質量を計算するために、 相補b/yイオンタンパク質量計算 ボタンをクリックします。ポップアップ ウィンドウのタンパク質量計算ツールが表示されます (図 1、下部パネル)。
- 推定CFIPの m/z を入力し、 ペアを追加 ボタンをクリックします。計算されたタンパク質量が現れます。
- この数値をコピーして [成熟したタンパク質量 ]フィールドに貼り付け、[ タンパク質量計算ツール] ウィンドウを閉じます。
- N末端シグナルペプチド長を選択するには、[残留制限の設定]ボックスをクリックします。スライドスケールとカーソルを含むポップアップが表示されます。カーソルを目的のシグナルペプチド長(最大50)に移動します。シグナルペプチド長が選択されていない場合、無制限のシーケンス切り捨てがソフトウェアによって実行されます。
- GUIの フラグメントイオン条件 下で、ポリペプチド骨格切断(PBC)の残基を選択する。D、E、N、P の 1 つまたは複数の残基のボックスをクリックします。
- [ フラグメントイオン入力(+1)検索対象 ]ボタンをクリックします。ポップアップ フラグメントページ が表示されます。次に、入力する フラグメントイオン の数に対応する[フラグメントイオンの追加]ボタンをクリックします。入力するフラグメントイオンごとにドロップダウンフィールドが表示されます。
- フラグメントイオンの m/z と、関連する m/z 許容値を入力します。完了したら、[ 保存して閉じる ] ボタンをクリックします。
注: 妥当な m/z 許容値は ±1.5 です。 - [照合する必要があるフラグメントイオンの数] ボックスの右側にある目的の数までスクロールして、識別に一致する 必要があるフラグメントイオンの最小数を選択します。
注: 3 つの試合が適切なはずです。 - システイン残基を、対応する円をクリックして酸化状態にするを選択します。検索後にタンパク質の同定が見つからない場合は、システインを減少させた状態で検索を繰り返します。検索後に識別が見つからない場合は、フラグメントイオン許容値を±3 に広げ、検索を繰り返します。
- [ ファイル設定] で 、[FASTA ファイルの選択 ] ボタンをクリックして、プロトコルステップ 3.1 ~ 3.2 で以前に構築された細菌株の インシリコ タンパク質配列を含む FASTA (テキスト) ファイルを参照して選択します。次に、出力フォルダーを選択し、出力ファイル名を作成します。
- [ファイル エントリで検索を実行 ] ボタンをクリックします。ポップアップ ウィンドウが表示され、「 検索パラメータの確認 」(図 1、下のパネル)、検索が開始される前に検索パラメータが表示されます。
- 検索パラメータが正しい場合は、[検索の 開始 ]ボタンをクリックします。検索パラメータが正しくない場合は、[ キャンセル ]ボタンをクリックして、正しいパラメータを再入力します。検索が開始されると、パラメータ ウィンドウが閉じ、新しいポップアップ ウィンドウが表示され、進行状況バー (図 1、下部パネル) に検索の進行状況と、検出された ID の数の集計が表示されます。
- 検索が完了すると (数秒)、プログレスバーが自動的に閉じ、検索の概要がGUIの[ログ]フィールド(図2、上部パネル)に表示されます。また、新しいポップアップウィンドウが表示され、タンパク質の同定が表示されます(図2、下のパネル)。
注:認識されない残基を有する シリコ タンパク質配列では、例えば、UまたはXは、分析から自動的にスキップされ、これらの配列は、検索の完了時にどの(もし)配列がスキップされたかオペレータに警告するために、別のポップアップウィンドウで報告されます。
5. タンパク質配列の探索後確認
- 手動分析により候補シーケンスの正確性を確認します。
注: プロテインバイオマーカー Seeker ソフトウェアの目的は、明らかに間違ったタンパク質配列を考慮から排除し、成熟タンパク質に可能な PTM として配列切り捨てを組み込むことにより、タンパク質配列を高精度に同定することです。返される候補シーケンスの数が少ないほど、手動確認は管理可能です。 - そのような機能性を有する任意の質量分析法またはプロテオミクスソフトウェアを用いて、候補配列のb-およびy型フラグメントイオンの平均m/zの表を生成する。D-、E-、N残基のC末端側(およびP残基のN末端側)の シリコ 断片イオンの平均m/zを、MS/MS-PSDデータからの顕著な断片イオンのm/zと比較します。
注:最も顕著なMS/MS-PSDフラグメントイオンは、 インシリコ フラグメントイオンのD-E-およびN-関連と容易に一致する必要があります。しかし、アスパラギン酸効果断片化機構は、タンパク質配列36のN-またはC末語付近で効率が悪い。
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Representative Results
図3(上パネル)は、400 ng/mLミトマイシン-Cを補充したLBA上で一晩培養したSTEC O113:H21株RM7788のMSを示す。m/z 7276、7337、および7841のピークは、以前はコールドショックタンパク質C(CspC)、コールドショックプロテインE(CspE)、および未知の機能を有するプラスミド媒介タンパク質と同定されていた。m/z 9780[M+H]+におけるタンパク質イオンを、図3(下パネル)に示すようにMS/MS-PSDで分析した。前駆体イオンは、時間イオンセレクタ(TIS)ウィンドウ±100 Da.フラグメントイオンは、m/zおよびタイプ/数によって同定される。m/z 2675.9のフラグメントイオン(星で強調)は、図3(上パネル)に示すm/z 9655におけるメタスタブルタンパク質イオンの解離から波及する。各フラグメントイオンの理論平均m/zは、上に示したコリシンE3免疫タンパク質(Im3)の配列のPBCに基づく括弧内に示されている。PBC のサイトは、対応するフラグメントイオンが生成された赤いアスタリスクで強調表示されます。N末端メチオニンは、成熟タンパク質中で翻訳後除去されることを示す下線が付いている。配列は、単一のシステイン残基(箱入り)を有し、したがって、その減少状態で考慮される。
タンパク質バイオマーカーの質量といくつかの顕著な非相補性フラグメントイオンを使用して:m/z 1813.8、2128.9、および4293.7(±1.5耐性)およびPBCをD残基およびE残基のC末端側に制限し、ソフトウェアによって報告された候補配列はIm3タンパク質配列(Nthiinin-2)、下部パネル)。フラグメントイオンを探索対象として選択する場合、非相補的なフラグメントイオンのグループは、グループ内の任意の2つのフラグメントイオンのm/zを合計すること(および2つの陽子を差し引く)結果として、バイオマーカー質量と関連質量許容範囲(±10 Da)に該当しない質量を生じると仮定することが強調されるべきである。RM7788の草案WGSは5008タンパク質配列(オープンリーディングフレーム)37を明らかにした。これらの約5,000個の完全なタンパク質配列のうち、189,490個の完全および部分的な配列(無制限の切り捨て)がバイオマーカー質量基準を満たしている(図2、上部パネル)。質量基準を通過する配列は、次いで、D-および/またはE残基のC末端側のシリコPBCで受ける。生成されたフラグメントイオンは、次に、入力された観察断片イオンと比較される。ソフトウェアによって報告された候補シーケンスは、その質量と3つのDおよび/またはE固有のPBCサイトのみに基づいていました。このような少量の情報によって達成される特異性については、次のセクションで説明します。
図3(下パネル)に示すように、最も豊富なフラグメントイオンは、アスパラギン酸効果断片化機構19,20を介したD-およびE残基のC末端側のPBCの結果である。2 つの CFIP が観察されます: b67/y17 (m/z 7645/m/z 2128.9) および b70/y14 (m/z 7959.4/m/z 1813.8)。これらのCFIPは、単純な式を用いてタンパク質前駆体イオンの質量をより正確に計算するために使用することができる:b(m/z)+y(m/z)−2H+=タンパク質量(Da)33。2つのCFIPを用いて、MS-リニアモードでのタンパクイオンの測定質量よりも理論値9772.5 Daに近い9771.6 Daの平均質量を得る:9779 Da(図3、上パネル)。唯一のアルギニン残基でイオン化プロトンを隔離した前駆体イオンのほとんどがR80であるため、ほんの数個のCFIPのみが検出された。リジン残基(K)(221.8kcal/mol38)と比較してアルギニン(237.0 kcal/mol38)の高い気相塩基性は、唯一のR残基でのイオン化陽子の優先的な隔離を引き起こしている可能性が高い。
図4(上パネル)は、800 ng/mLミトマイシン-Cを補充したLBA上で一晩培養したSTEC O113:H21株RM7788のMSを示す。図4(上パネル)は図3(上パネル)とよく似ていますが、利用される抗生物質濃度の差に起因するタンパク質イオンの相対的な存在量には違いがあります。また、異なる日に機器の外部キャリブレーションの違いを反映するタンパク質バイオマーカーm/ zのわずかな変化があります。もう一度、m/z 7272、7335、および7838のタンパク質イオンは、それぞれCspC、CspE、プラスミド媒介タンパク質です。また、M/z 9778(図3より存在量は少ないが)でIm3タンパク質イオンを検出し、m/z 9651[M+H]+でタンパク質イオンを検出した。図4(下パネル)は、m/z 9651におけるタンパク質前駆体イオンのMS/MS-PSDを示す。前駆体イオンは、-75/+60 Daの狭く非対称的なTISウィンドウを使用して単離され、m/z 9539および9778で隣接するタンパク質イオンの寄与を排除した。フラグメントイオンは、m/zとタイプ/数によって識別されます。バクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質の配列は上に示す。PBC のサイトは、対応するフラグメントイオンを持つ赤いアスタリスクで強調表示されます。各フラグメントイオンの理論平均m/zも、スペクトル内の括弧内に示されている。Im-Bac配列はまた、単一のシステイン残基(箱入り)を有し、したがって、その減少状態で考慮される。
タンパク質バイオマーカー質量を使用して、 図4 からm/z 2675.4、3853.5、および5772.8(±1.50耐性)の3つの顕著な非相補性断片イオンを使用し、PBCをDおよび/またはEおよび/またはアスパラギン(N)残基のC末端側のみに制限し、1つの候補配列のみがIm-Im-タンパク質によって報告されました。候補配列は、バイオマーカー質量および許容範囲(±10 Da)基準を満たす191,375個の完全または部分的な配列をスキャンした後に取り出した。候補シーケンスは、ソフトウェアベースの質量と3つのDおよび/またはEおよび/またはN固有のPBCサイトでのみ識別されました。
図4の最も顕著なフラグメントイオン(下パネル)は、再び、Dおよび/またはE残基のC末端側およびP残基20のN末端側のPBCの結果であった。我々はまた、アスパラギン酸効果様断片化機構39,40によっても発生しそうなN残基のC末端側のPBCを観察する。タンパク質前駆体イオンシグナルの弱さは、解釈可能な断片イオンの数に制限をもたらす。フラグメントイオンm/zの精度は、フラグメントイオン量が多いほど低下する。タンパク質イオン配列の唯一のアルギニン残基(R74)でイオンプロトンが隔離されたことが原因でCFIPが検出されなかった。すべてのフラグメントイオンはR74残基を含み、この仮説と一致する。
抗菌免疫遺伝子の促進剤
図5は、全ゲノムショットガンシーケンシング37から大腸菌株RM7788(GenBank:NWVS0100000996.1)の6482 bp contig00100の部分を示す。コリシンE3のコード領域、その免疫タンパク質(Im3)、バクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質、およびリシスタンパク質が黄色で強調表示されます。コリシンE3遺伝子の符号化領域の上流は、−35領域、プリブナウボックス(PB)、SOSボックスの反転繰り返し、シャインダルガルノ/リボソーム結合部位(SD/RBS)27である。コリシンE3とIm3の間には9つのベースペアの異性間領域がある。LexA (リプレッサータンパク質とオートペプチダーゼ) 下流の遺伝子の発現を遮断するSOSボックスに結合します。DNA損傷(例えば、紫外線またはDNA損傷性抗生物質)に対して、LexAは自己切断を受け、下流の遺伝子を27,28に発現させる。したがって、これら2つの免疫タンパク質の発現は、DNA損傷性抗生物質へのこの株の暴露と一致する。
図1:プロテインバイオマーカーSeekerソフトウェアのスクリーンショット トップパネル:タンパク質バイオマーカーシーカーソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)。下部パネル:タンパク質量計算ツール、フラグメントページ、検索パラメータの確認、および検索進行状況バーのポップアップウィンドウ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タンパク質バイオマーカーSeekerソフトウェアを用いたタンパク質同定の結果 上部パネル: ソフトウェア GUI のログフィールドに表示される検索結果の概要。下部パネル:ソフトウェアを使用してタンパク質の識別を表示するポップアップウィンドウ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:STEC O113:H21株RM7788の質量分析分析 トップパネル: STEC O113:H21株のMS 400 ng /mLミトマイシン-Cを補充LBAで一晩培養 RM7788.下部パネル:m/z 9780(上部パネル)におけるプロテイン前駆体イオンのMS/MS-PSD。前駆体イオンは、TIS窓±100Da.フラグメントイオンがm/zおよびイオンタイプによって同定されることで単離された。また、コリシンE3(Im3)に対する免疫タンパク質の配列が示されている。基本的な残基(電荷隔離の可能性がある部位)は青色で強調表示されます。PBC は、対応するフラグメントイオンが生成された赤いアスタリスクで強調表示されます。各フラグメントイオンの理論平均m/zは括弧内に示されている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:STEC O113:H21株RM7788の質量分析 トップパネル: STEC O113:H21株RM7788のMSは800 ng /mLミトマイシン-Cを補充LBA上で一晩培養.下部パネル:m/z 9651(上部パネル)におけるタンパク質前駆体イオンのMS/MS-PSD。前駆体イオンは、前駆体イオンの低m/z側に-75、前駆体イオンの高m/z側に+60の非対称TISウィンドウで分離した。フラグメントイオンは、m/zとイオンの種類によって識別されます。バクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質の配列が示されている。基本的な残基(電荷隔離の可能性がある部位)は青色で強調表示されます。PBC は、対応するフラグメントイオンが生成された赤いアスタリスクで強調表示されます。各フラグメントイオンの理論平均m/zを括弧で示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:大腸菌O113:H21株RM7788によって運ばれたプラスミドゲノムの一部の解析全ゲノムショットガンシーケンシング37から大腸菌O113:H21株RM7788(GenBank:NWVS010000096.1)の6482 bp contig00100の一部を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助ファイル 1 (S1 Im3): Im3の選択フラグメントイオンを用いたソフトウェアのベンチマーク分析結果( 図3、下パネルから)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2 (S2 ImBac): Im-Bacの選択フラグメントイオンを用いたソフトウェアのベンチマーク分析結果( 図4、下パネルから)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルに関する考慮事項
現在のプロトコルの主な強みは、その速度、サンプル調製のシンプルさ、および操作が比較的容易で、訓練され、維持される楽器の使用です。液体クロマトグラフィー-ESI-HR-MSによるボトムアップおよびトップダウンプロテオミクス分析は、MALDI-TOF-TOFによるトップダウンに対して多くの点で普及していますが、より多くの時間、労力、専門知識が必要です。機器の複雑さは、質量分析で正式に訓練されていない科学者によって特定の機器プラットフォームが採用される可能性があるかどうかに影響を与えることがよくあります。MALDI-TOF-TOFのトップダウンアプローチは、MALDI-TOF-MSの分析を、臨床微生物学ラボにおける細菌の分類学的同定に使用する現在の使用を超えて拡張することを目的としており、分析に必要な労働力、複雑さ、または専門知識を劇的に増加させないようにすることを目的としている。
このプロトコルは、機械的(または電気的)細胞のライシスステップを採用していません。分泌されたタンパク質または細胞外タンパク質はプロトコルを使用して検出される可能性がありますが、この方法の以前のバージョンは、抗生物質誘導が細菌性細胞リシス41を担う後期ファージ遺伝子を含むファージ遺伝子の発現をもたらす細菌SOS応答を引き起こすSTEC株から滋賀毒素(Stx)を検出するために最初に開発されました。.抗生物質による細胞リシスは、STXの検出だけでなく、SOSプロモーターを有するプラスミドタンパク質(現在の研究)に一定の利点があることを発見した。確かに、機械的な細胞のライシス(例えば、ビーズ・ビート)も使用することができる(現在の作業では使用されていないが)。しかし、機械的なリシスは、すべての細菌細胞が(単に誘発された細胞ではない)、サンプルが豊富で高度に保存された宿主タンパク質で濃縮され、未分離サンプルからのファージおよびプラスミドタンパク質の検出をより困難にする結果となります。
細菌株の抗生物質濃度は、検出された抗生物質誘発タンパク質に関して一般的に再現可能であることが判明した。我々は、検出された抗生物質誘導タンパク質に関する相対的なタンパク質の豊富量の変動を指摘した。我々の分析は定性(定量的ではない)であるため、タンパク質バイオマーカーの存在量は十分なMS/MS分析に十分な必要があります。推定STEC株は、まず、収穫に十分な細菌細胞を提供しながら細菌SOS応答を引き起こすような最適濃度を決定するために、抗生物質濃度の範囲(例えば、300 ng/mL〜2,000 ng/mLのマイトマイシン-C)で培養される。STEC株RM7788の場合、同定されたバイオマーカーの検出に最適な抗生物質濃度は、マイトマイシン-Cの400〜800 ng/mLであることがわかりました。
タンパク質配列の切り捨てに加えて、 大腸菌 タンパク質は、例えば、リン酸化、グリコシル化などの質量の添加を伴うPTMを有することができる。MS/MSは、MALDIによって生成された1対数に荷電したメタスタブルタンパク質イオン(質量は20kDa以下)の解離にPSDを利用しているため、残留側鎖に付着したPTMは、PSDがエルゴディック解離技術であるため、容易な解離損失を受ける可能性が高い。このようなPTMの存在は、MS/MSデータ内の元の前駆体イオン(PTMの質量を差し引いたもの)に近い断片イオンの出現から推測することができる。ただし、PSD もソフトウェアも、そのような PTM が接続されている場所を識別することはできません。さらに、ソフトウェアはPBCの断片イオンからタンパク質を同定することしかなく、小分子(水やアンモニアなど)や残留物の側鎖に付着したPTMの解離損失は認められていない。しかし、PBCからのフラグメントイオンが検出された場合、タンパク質は、PTMの質量を含むようにタンパク質量許容度ウィンドウを広げるか、または疑わしいPTMの解離損失に対応するタンパク質断片イオンの質量に単に入ることによって、ソフトウェアを使用して同定することができます。ソフトウェアによる識別は、PTMを使用しないタンパク質配列になります。興味深いことに、これまで細菌の働きにおいて、リン酸化、グリコシル化などを有するタンパク質は検出されていません。しかし、それは、MALDIによる相対的な豊富さ、使用されている質量範囲:2〜20 kDa、そのようなPTMが異常に不安定であり、MALDIマトリックスの適用を生き残ることがないかもしれないこと、またはイオンがソースから加速される前に、そのようなPTMがソースで非常に急速な解離損失を受ける可能性がある。
現在、このソフトウェアにはシステインアルキル化が含まれておらず、当社のサンプルプロトコルにはシステイン残基に対するジスルフィド還元ステップは含まれていません。このプロトコルは、検索が酸化された状態でシステイン残基で操作されることを示すために明らかにされており、同定が得られない場合は、そのReduced状態のシステイン残基で再び探索を実行する。再び同定が見つからない場合、フラグメントイオン許容度を±2または±3に広げると、システインとの配列が酸化および/または減少状態にあるかどうかにかかわらず、フラグメントイオンマッチングの閾値が下がります。
MALDI-TOF-TOF質量分析によるトップダウンプロテオミクス解析
トップダウンプロテオミクス解析の大半は、ESIおよび高解像度質量分析プラットフォームを使用して行われています。対照的に、MALDI-TOF-TOFプラットフォームを用いて実施されたトップダウンプロテオミクス解析は少なくなっています。その結果、断片化に対するアスパラギン酸効果を利用するMALDI-TOF-TOF-MS-MS/MS-PSDによって生成および分析された、一重に荷電したメタスタブルタンパク質イオンの分析のためのトップダウンプロテオミクスソフトウェアは非常に少ない、42。これにはいくつかの理由があります。まず、MALDIのイオン化効率は、より低い分子量のペプチドおよびタンパク質に偏っており、このバイアスは、分圏のない細菌細胞のリセートに見られるタンパク質の混合物で特に明らかである。第二に、MALDIは低電荷状態を発生し、タンパク質イオン解離を容易にするクーロン反発がほとんどまたはまったくない。第三に、PSD配列のカバレッジは、他の技術ECD 7、ETD7、UV-PD8などとは全く限られています。第4に、PSDの断片化効率は、タンパク質イオンの質量の増加に伴って低下する。第5に、PSDなどのエルゴディック解離技術は、残留物、例えばリン酸化、グリコシル化等に付着したPTMの融解性損失をもたらす傾向にあり、PTM付着部位の決定が困難となる。これらの厳しい制限にもかかわらず、MALDI-TOF-TOF-MS-MS/MS-PSDを用いたトップダウン分析は、サンプル調製のシンプルさ、LC分離の欠如、MS/MSによるメタスタブルタンパク質イオンの単離、前駆イオンへのフラグメントイオンの帰属、配列切り捨ておよび分子内ジスルフィド結合を含むPTMの同定および最も重要な分子内ジスル化結合を含むPTMの同定および最も重要な分析速度の明確な利点を有する。WGS データから得られたインシリコタンパク質配列と組み合わせると、この技術は、他のより時間がかかり、労力を要する分析が完了する前に、迅速な情報を提供できます。
タンパク質バイオマーカーシーカーソフトウェアは、IntelliJを使用して開発され、細菌株のWGSに由来するタンパク質アミノ酸配列を効率的に処理し、検索するためにJavaで書かれました。このソフトウェアは、Excel33内のマクロとして動作する以前のアルゴリズムから変更されました。GUIインターフェイスを備えたスタンドアロンバージョンのソフトウェアを開発して、GUIインターフェイスをより使いやすくし、さらなる改善を行うことにしました。
タンパク質配列の切り捨てが含まれるPTMの場合、ソフトウェアは、検出されたタンパク質バイオマーカーの測定質量に合致するか、または質量を超えるまで、配列の残基を反復的に追加しながら、N末流からアミノ酸残基を順次除去します。このプロセスは、非常に多くのタンパク質量フラグメント(〜5000個の完全なタンパク質配列から〜200,000)をもたらす可能性があるが、N末語またはC末語(またはその両方)での切り捨てから潜在的なタンパク質断片を除外しない利点を有するが、そのような切り捨ては生物学的観点からである可能性はあり得る。この方法は、無制限の切り捨てと呼ばれます。しかし、切り捨てを伴う最も一般的な細菌PTMは、N末端メチオニンまたはN末端シグナルペプチドの除去である。その結果、このソフトウェアはまた、N末端からの残留トランセプションの上限(50残基)を選択することを可能にし、タンパク質バイオマーカー質量基準を満たすタンパク質断片がはるかに少なくなります。
D残基およびE残基のC末端側及びP残基のN末端側のPBCは、アスパラギン酸効果機構と一致しており、実験的および理論的には17、18、19、20の両方で広範囲に研究されている。N残基のC末端側にPBCを含めることは、我々の研究室39,40において多数のメタスタブルタンパク質イオンについて観察されたアスパラギン酸効果様機構のためにソフトウェアに含まれていた。MS/MS-PSDで分析した1つの荷電メタスタブルタンパク質イオンの解離から最も豊富なフラグメントイオンは、アスパラギン酸効果断片化メカニズムによるものです。オペレータはMS/MS-PSDデータから最も顕著なフラグメントイオンを選択し、そのm/zをソフトウェアに入力し、関連するフラグメントイオン許容度(±m/z)を入力します。フラグメントイオン耐性は、その相対的な存在量を反映するように各フラグメントイオンに対して調整することができる。適切なフラグメントイオン耐性は、±1.0~± 2.5m/zの間で、背景の化学ノイズと比較したフラグメントイオンの絶対存在量と相対的な存在量によって異なる場合があります。一般的に、フラグメントイオンが豊富であるほど、質量精度が高くなり、より狭いフラグメントイオン耐性を使用できます。
メタスタブルタンパク質イオンのMS/MS-PSDデータは、その複雑さの点で劇的に変化する可能性があります。MS/MS-PSDスペクトルの中には、他のものよりも簡単に解釈できるものもあります。この現象には、いくつかの理由があります。まず、タンパク質イオンは、MALDIマトリックス溶液に可溶化した後も折り畳まれたままか、部分的に折り畳まれたままであるため、分析のタイムスケール(〜10〜30μs)で効率的に断片化しない可能性があります。第二に、PBCに加えて、メタスタブルタンパク質イオンは、小分子の解離損失、すなわちアンモニア(-17 Da)または水(−18Da)15を受けることができる。スペクトルの複雑さに大きく寄与するのが、R残基33の側鎖からのアンモニアの解離的損失である。タンパク質配列中のR残基数を用いてMS/MS-PSDデータのスペクトル複雑度の増加を観察しました。R残基を持たないタンパク質(YahOタンパク質36およびコールドショックタンパク質CspC 33、43)、1つのR残基(コールドショックタンパク質CspE33およびStx241のBサブユニット)を有し、2つのR残基(仮説タンパク質33)を有し、比較的複雑で解釈しやすいMS/MS-PSDスペクトルを産生する。しかし、R残基数が3個(HUタンパク質44)、または4個(ユビキチン35およびコールドショックタンパク質CsbD33,43)に増加すると、スペクトルの複雑さが大幅に増加する。このソフトウェアは、MS/MS-PSDによって分析された単一荷を帯びたメタスタブルタンパク質イオンの最もアクセス可能な解離チャネルであるため、アスパラギン酸効果機構に特異的な残基でPBCからの断片イオンを比較します。ソフトウェアには、低中性分子の解離損失(または損失)に起因するフラグメントイオンは含まれていません。その結果、オペレータは小さな中性解離損失を含むフラグメントイオンを選択しないことが重要です。PBCからのフラグメントイオンは、典型的には最も顕著なフラグメントイオンである。しかし、タンパク質中のR残基数が3または4に増加すると、PBC部位で最も豊富な断片イオンは、小さな解離損失(または損失)を含むものである可能性があります。そのようなフラグメントイオンのクラスター(17または18 m/zの倍数で区切られた)が検出された場合、クラスター内で最も高いm/zを持つフラグメントイオンがフラグメントイオン検索パラメータに入力される必要があります。
ソフトウェアはオペレータフリーのプロテオミクス同定用に設計されていないということを強調すべきである。オペレータは、MS/MS-PSDデータからどのフラグメントイオンを検索に含めるかを選択する必要があります。しかし、MS/MS-PSDによるアスパラギン酸効果を確認した数多くの実験に基づいて、最も顕著なフラグメントイオンは、常にD-またはE-またはN残基のC末端側のPBCの結果である。ソフトウェアの有用性は、多くの明らかに間違ったシーケンスを排除し、少数の候補のみを取得することです。一部の候補配列は、配列内のD残基が顕著なフラグメントイオンを生成することが期待されるフラグメントイオンの欠如に基づいて排除され得る。常に、D残基は、アスパラギン酸効果の効率が低下するN-またはC末の数残基内に位置する場合を除いて、ポリペプチド骨格全体に顕著な断片イオンをもたらす。
仮のタンパク質同定に必要なPBC部位の最小数
CFIPは、同じPBC部位で解離するが、切断部位の反対側にそれらの電離プロトンを有する2つの同一のタンパク質前駆体イオンから形成される。CFIPは、タンパク質バイオマーカーの質量をより正確に計算するために使用することができますが(検索中にタンパク質量許容範囲の狭小化を可能にします)、配列特異的同定のためのその有用性は、より大きな同定特異性を提供する2つの異なる切断部位から形成された2つの非相補性断片イオンのそれよりも有用ではありません。2つのAB-Imタンパク質が同定されやすい結果、何千ものタンパク質またはタンパク質断片配列から正しいタンパク質配列を暫定的に同定するために必要なフラグメントイオンの最小数を推測しました。我々は、それ以上のフラグメントイオンの数ではなく、各非相補性フラグメントイオンが1つのPBC部位を表すのに対し、CFIPは同じ切断部位を表すため、重要な非相補性フラグメントイオンの数であるとすぐに判断した。したがって、同定特異性は、フラグメントイオンの数ではなく検出されたPBC部位の数に由来する。
たった3個のフラグメントイオンとの同定の成功は単に直感的であった可能性があります。この仮説をテストし、フラグメントイオンの選択における偏りを排除するために、補完および/または非相補性フラグメントイオンのより大きなプールからフラグメントイオンをランダムに選択するベンチマークモジュールをソフトウェア内に作成しました。より大きなフラグメントイオンプールは、その相対的な存在量に基づいて 、図3( 下部パネル)で同定された14個の顕著なフラグメントイオンから選択された。
試験プロトコルは以下の通りであった。バイナリ検索を使用して、 図3( 下部パネル)の14個の顕著なフラグメントイオンのプールから3個のフラグメントイオンを無作為に選択した(m/z 1813.8、 2128.9, 3881.3, 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3, 8961.5).3フラグメントイオンコホートを、D-またはE-またはN残基のC末端側のPBC由来の インシリコ フラグメントイオンと、D&EおよびD&E&Nの組み合わせと比較した。この比較は、コホートの個々のフラグメントイオン、コホートの3つのフラグメントイオン対、およびコホートの3フラグメントイオン組み合わせについて行った。一致として数えられる比較のためには、ペアのフラグメントイオンと組み合わせの3つのフラグメントイオンの両方が 、インシリコ フラグメントイオンと一致する必要があります。分析が完了すると、別の3フラグメントイオンコホートがランダムに選択され、分析が繰り返されます。フラグメントイオン選択で繰り返しが認められていた。364の可能な組み合わせがあるので[(n!/r!)n-r)!14個のフラグメントイオン(n)のプールから3個の断片イオンコホート(r)のうち 、S1Im3( 補足情報)に示すように10回の分析のみが行われた。
3 フラグメントイオン識別要件は、表 2-7、9-10(S1Im3)の列3_ABCに示すように、一般的な現象のようです。 3_ABC列の 1 のカウントはすべて、Im3 シーケンス (N 末端メチオニンなし) に対応します。識別の失敗は、m/z 8136.2 のフラグメントイオン (図 3、下のパネル、および表 1および8のグレーで強調表示) が、分析に入力されたフラグメントイオン許容値 (±1.5 m/z) を超えたために発生しました。この試験アルゴリズムでは、3フラグメントイオンコホートのすべてのフラグメントイオンが一致することが必要なため、m/z 8136.2フラグメントイオンを含む任意のグループは、正しいタンパク質配列を同定/カウントすることができません。
S1Im3の表6は、3つのフラグメントイオンのうち2個が相補的(黄色で強調)である場合、3つのフラグメントイオンすべてが非相補的であったときに観察されたものよりも多くの誤った配列が基準に一致することを示しています。前述したように、これは、CFIPが単一のPBC部位に対応するため、2つのPBC部位に対応する2つの非相補性フラグメントイオンを用いるのに比べて、より多くの不正確なインシリコ配列で達成可能な閾値であり、より厳しい基準である。
同様の分析は、図4(下パネル)に示すIm-Bacの6つの顕著なフラグメントイオン(m/z 2675.4、2904.5、3076.2、3853.5、5657.5、および5772.8)に対して行われた。Im3とは異なり、Im-Bacは識別可能なCFIPを持たないため、6つのフラグメントイオンはおそらく6つのPBC部位に対応する。6個のフラグメントイオンのプールから選択された3フラグメントイオンコホートの組み合わせが20個あるため、S2 Im-Bac(補足情報)の表に示すように、10の分析のみが行われました。Im-Bac配列は、すべての分析において列3_ABC内のすべての3フラグメントイオン群について正しく識別/カウントされた。4つの解析では、1つまたは2つの誤ったシーケンスも一致しました。ただし、この少数の不正なシーケンスは、手動確認のための管理可能な番号です。
全体として、2つまたは3つのPBC部位に対応する相補および/または非相補性フラグメントイオンは、1つまたは2つの候補配列を取り出すのに十分な特異性を提供しているように見える。もちろん、オペレータによって選択されたフラグメントイオンは比較的豊富で、良好なS/Nを有する必要があります。1つのPBC部位からの1つまたは2つのフラグメントイオンは、オペレータによって確認されなければならない誤った配列の動作できない数を取り出すことを避けるために十分な特異性を提供しない。なぜ2つまたは3つのPBCサイトが十分なのかは明らかではありませんが、単一のPBCサイトは明らかに十分に具体的ではありません。無制限の切り捨ては、タンパク質量基準を満たすタンパク質およびタンパク質断片配列の20万個のタンパク質とタンパク質断片配列をもたらすが、切断部位の部位/残基特異的な性質、すなわち、D-、E-およびN残基のC末端側は、イオン断片比較中に可能な配列の急激な狭小化に寄与する可能性がある。これは、細菌タンパク質配列におけるD-E-およびN残基の頻度と、細菌のプロテオーム全体のタンパク質配列におけるそれらのユニークな位置に起因する可能性があります。酸性残基はタンパク質構造と溶媒相互作用において重要な役割を果たします。その結果、タンパク質機能に固有でない場合、その頻度とプライマリ配列内の位置は重要であり、数十万の誤った配列の中で正しいタンパク質配列を暫定的に同定するために少数のPBC部位だけが必要である理由を説明するかもしれません。
ガス相化学の観点から、D-E-およびN残基の重要性は、MALDIによって生成された三次荷電メタスタブルタンパクイオンの低い内部エネルギーでアクセス可能な解離チャネルへの参加とPSD20による崩壊に由来する。PSDによる分子イオン断片化の比較的長いタイムスケール(約10〜30μs)は、タンパク質イオンの内部エネルギーが分子イオンの振動・回転自由度の中でランダム化され、解離が自己生成的かつ統計的であることを意味します。また、アスパラギン酸効果のメカニズムは、PBC17、18、19の活性化障壁を低下させる好ましい幾何学的形状が達成されるまで、複数の原子を含む一連のステップまたは単一の協調ステップによって起こる分子イオンの再配列を伴うことを指摘すべきである。
STEC株によって産生される2つのプラスミドコード化された抗菌免疫タンパク質を、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS-MS/MS-PSD、およびトップダウンプロテオーム分析を含むプロトコルを使用して同定した。これらのタンパク質は、アスパラギン酸効果の結果として形成されるタンパク質の測定質量と比較的少数の配列特異的フラグメントイオンを組み込んだ社内開発ソフトウェアを用いて同定した。このソフトウェアは、MSおよびMS/MSデータを、WGSデータから得られた インシリコ タンパク質およびタンパク質断片配列と比較します。ソフトウェアは識別メトリックやスコアリングを提供しませんが、誤ったシーケンスの非常に高い割合を排除し、手動検査で簡単に確認できる候補シーケンスの数(1つまたは2つ)が非常に少なくなります。最後に、この細菌株のWGSデータを手動で調べた結果、プラスミドゲノム中のAB遺伝子とIm遺伝子のプロモーター(SOSボックス)が明らかにされ、DNA損傷抗生物質の暴露によるこれらの遺伝子の発現を合理化する。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
プロテインバイオマーカーシーカーソフトウェアは、clifton.fagerquist@usda.gov でクリフトンK.Fagerquistに連絡することで、無料で(無料で)自由に利用できます。我々は、ARS、USDA、CRIS助成金によるこの研究の支援を認めてほしい:2030-42000-051-00-D。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
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