Summary
여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.
Abstract
이 프로토콜은 bactericidal 효소의 면역 단백질을 식별합니다: 복리신 E3 및 박테리아는 항생제 유도를 사용하여 병원성 대장균 균주에 의해 생성되고, MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광및 하향식 프로테오믹 분석에 의해 확인된 것으로, 사내에서 개발된 소프트웨어와 함께. 배리신 E3(Im3)의 면역 단백질과 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질은 산성, 글루타믹산 및 아스파라진 잔류물의 C-말단 측에서 폴리펩타이드 백본 분열(PBC)에 의해 생성된 눈에 띄는 b-및/또는 y형 단편 이온으로부터 확인되었다. 이 소프트웨어는 세균균의 전체 게놈 염기서열분석에서 파생된 실리코 단백질 서열에서 빠르게 스캔합니다. 또한 이 소프트웨어는 성숙한 단백질 서열이 잘린 경우 단백질 서열의 아미노산 잔류물을 반복적으로 제거합니다. 단일 단백질 서열은 각 면역 단백질에 대해 검출된 것과 일치하는 질량 및 단편 이온을 소유했습니다. 그런 다음 후보 순서를 수동으로 검사하여 감지된 모든 조각 이온을 할당할 수 있는지 확인했습니다. Im3의 N 단말 메티오닌은 번역 후 제거된 반면 임박은 완전한 시퀀스를 가졌다. 또한, 우리는 PBC에 의해 형성된 2개 또는 3개의 비보완 단편 이온만이 올바른 단백질 서열을 식별하는 데 필요하다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 프로모터(SOS box)는 세균균균의 플라스미드 게놈에서 항균 및 면역 유전자의 상류로 확인되었다.
Introduction
질량 분석법에 의한 소화되지 않은 단백질의 분석 및 식별을 하향식 프로테오믹 분석1,2,3,4라고합니다. 현재 는 전기분무 이온화(ESI)5 및 고해상도 질량 분석기6,정교한 해리 기술, 예를 들어 전자 전달 해리(ETD), 전자 포획 해리(ECD)7,자외선 광 해리(UV-PD)8등을 활용하는 확립된 기술이다.
다른 소프트 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)9,10,11은 하향식 분석에 덜 광범위하게 활용되고 있으며, 이는 주로 다른 질량 분석기와 비교하여 해상도가 제한된 비행 시간(TOF) 질량 분석기와 결합되기 때문이다. 이러한 한계에도 불구하고 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF 계측기는 순수 단백질과 분획되고 분수되지 않은 단백질 혼합물의 신속한 하향식 분석을 위해 악용되었습니다. 순수 단백질의 식별을 위해, 산내 붕괴(ISD)는 ISD 단편 이온의 질량 분석(MS) 분석뿐만 아니라 단백질 이온 단편의 질량 분석법(MS/MS)을 허용하고, 표적 단백질의 N-및 C-테르미니로부터 서열특이적 단편을 자주 제공하는, 에드먼12, 에드만12와유사하게 매우 유용한 기술이다. . ISD 접근법의 단점은 Edman 시퀀싱에서와 같이 샘플에 단 하나의 단백질만 포함되어야 한다는 것입니다. 1개의 단백질 요구 사항은 전구체 이온에 단편 이온의 명백한 기여에 대한 필요성 때문입니다. 2개 이상의 단백질이 샘플에 존재하는 경우, 어떤 단편 이온이 전구체 이온에 속하는지 할당하기가 어려울 수 있다.
단편 이온/전구체 이온 어트리뷰션은 MALDI-TOF-TOF-MS/MS를 사용하여 해결할 수 있습니다. 모든 고전적인 MS/MS 실험과 마찬가지로 전구체 이온은 단편화 전에 대량 선택/격리되며, 검출된 단편 이온은 특정 전구체 이온에 기인할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법에 사용할 수 있는 해리 기술은 주로 높은 에너지 충돌 유도 해리(HE-CID)14 또는 포스트 소스 붕괴(PSD)15,16으로제한된다. HE-CID 및 PSD는 펩티드와 작은 단백질을 단편화하는 데 가장 효과적이며, 서열 커버리지는 경우에 따라 제한될 수 있다. 또한, PSD는 아파르산효과(17,18,19,20)라고불리는 현상에 의한 아파르트 및 글루타믹산 잔류물의 C-말단 측에서 주로 폴리펩티드 백본 골짜기(PBC)를초래한다.
MALDI-TOF-MS는 또한 미생물의 분류학적 식별에서 틈새 응용 프로그램을 발견했습니다: 박테리아21,곰팡이22,및 바이러스23. 예를 들어, MS 스펙트럼은 비교를 위해 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 알려진 박테리아의 MS 스펙트럼의 참조 라이브러리와 비교하여 알려지지 않은 박테리아를 식별하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 격리의 하룻밤 배양을 필요로하지만, 속도와 단순성 때문에 매우 성공적인 입증했다. 이러한 접근법(보통 20kDa 미만)에 의해 검출된 단백질 이온은 속 및 종 수준에서 분류학 적 분해를 허용하는 MS 지문을 포함하며, 어떤 경우에는 하위종(24) 및 균주수준(25,26)에서분류학을 용이한다. 그러나, 분류잠재적으로 병원성 미생물을 분류할 뿐만 아니라 특정 독성 요인, 독소 및 항균 저항(AMR) 요인을 식별할 필요가 있습니다. 이를 달성하기 위해 펩티드, 단백질 또는 소분자의 질량은 MS에 의해 측정되고 이후에 MS/MS에 의해 분리되고 단편화됩니다.
병원성 박테리아는 종종 플라스미드에게 불린 DNA의 원형 조각을 전송합니다. 플라스미드는, prophages와 더불어, 박테리아 사이 수평 유전자 전송의 중요한 벡터이고 박테리아를 통해 항균 저항 및 그밖 독성 요인의 급속한 퍼짐에 책임 있습니다. 플라스미드는 또한 항균 (AB) 유전자, 예를 들어, 복리신 및 박테리신을 수행 할 수 있습니다. 이러한 유전자가 발현되고 단백질이 분비될 때, 동일한 환경 틈새 시장을 차지하는 이웃 박테리아의 단백질 번역 기계를 비활성화하는 역할을한다(27). 그러나, 이러한 bactericidal 효소는 또한 그들을 생산 하는 호스트에 위험을 제기할 수 있습니다. 결과적으로, 유전자는 AB 효소의 기능을 구체적으로 억제하고 면역 단백질(Im)으로 지칭되는 숙주에 의해 공동 발현된다.
미토마이신-C 및 시프로플록사신과 같은 DNA 손상 항생제는 종종 시가 독소 생성 대장균(STEC)에서 SOS 반응을 유도하는 데 사용되며, 시가 독소 유전자(stx)는 세균게놈(28)에 존재하는 프로파지 게놈 내에서 발견된다. 우리는 이전에 항생제 유도, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 STEC 균주29,30,31,32에의해 생성된 Stx 유형 및 아류형을 검출하고 식별했습니다. 전작에서는 STEC O113:H21 균주 RM7788이 미토마이신-C로 보충된 한천 매체에서 하룻밤 사이에 배양되었다. 그러나, m/z~7816에서 Stx2a의 예상 B-서브유닛을 검출하는 대신, m/z~7839에서 상이한 단백질 이온이 검출되고 알 수 없는 기능(33)의플라스미드 인코딩 된 가상 단백질로 확인되었다. 현재 작업에서, 우리는 항생제 유도를 사용하여이 균주에 의해 생성 된 두 개의 플라스미드 인코딩 AB-임 단백질을 확인, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, 및 전체 게놈 시퀀싱에서 파생 된 실리코 단백질 서열에서 처리 및 스캔개발 독립 형 소프트웨어를 사용하여 하향식 proteomic 분석 (WGS). 또한 시퀀스 잘림과 관련된 번역 후 수정(PTM)의 가능성이 소프트웨어에 통합되었습니다. 면역 단백질은 인산 효과에 의해 유발되고 MS/MS-PSD에 의해 검출된 PBC로부터의 성숙한 단백질 이온 및 서열 특이적 단편 이온의 측정질량으로부터 이 소프트웨어를 사용하여 확인되었다. 마지막으로, 프로모터는 이 긴장이 DNA 손상 항생제에 드러나면 이러한 유전자의 발현을 설명할 수 있는 플라스미드 게놈에서 AB/Im 유전자의 상류로 확인되었다. 이 작품의 일부는 2020년 가을 미국 화학 협회 가을 가상 회의 및 엑스포 (2020년 8월 17-20일)34에서발표되었습니다.
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Protocol
1. 미생물 샘플 준비
- 루리아 국물(LB)의 접종 25mL은 멸균 1 μL 루프를 이용하여 글리세롤 스톡으로부터 대장균 O113:H21 균주 RM7788(또는 다른 세균균균)을 가진 50mL 원추형 튜브에서 접종하였다. 튜브 및 사전 배양을 37°C에서 4시간 동안 흔들림(200rpm)으로 캡합니다.
- 사전 배양된 국물의 알리쿼트 100 μL을 LB 한천 판에 퍼지고 미토마이신-C의 400 또는 800 ng/mL로 보충됩니다. 배양 식도는 37 °C의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 정전기로 접시를 냅니다.
주의: STEC 균주는 병원성 미생물입니다. BSL-2 생물 안전 캐비닛에서 배양 을 넘어 모든 미생물 조작을 수행합니다. - 멸균 1 μL 루프를 사용하여 단일 가시 식민지에서 세균 세포를 수확하고 HPLC 급 물의 300 μL을 포함하는 2.0mL O 링 안감 나사 -캡 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 튜브, 소용돌이, 원심분리기를 11,337 x g에서 2분 동안 캡하여 세포를 펠릿합니다.
2. 질량 분석
- 스테인레스 스틸 MALDI 대상에 샘플 상류체의 점 0.75 μL 알리쿼트 및 건조 할 수 있습니다. 건조된 시료 반점을 33% 아세토닐릴, 67% 물, 0.2%의 트리플루오라산에 시나피닉산의 포화용 액액을 과대평가한다. 그 자리를 말리십시오.
- MALDI-TOF-TOF 질량 분광계를 사용하여 건조된 시료 반점을 분석합니다.
- MALDI 대상을 질량 분광계에 로드한 후 인수 소프트웨어에서 MS 선형 모드 수집 버튼을 클릭합니다. m/z 범위를 입력하여 하부 및 상한의 m/z(예: 2kDa ~20kDa)를 획득 방법 소프트웨어에서 해당 필드에 입력하여 분석한다.
- 소프트웨어의 MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 마우스 커서를 샘플 스팟 위로 드래그하여 레이저 절제/이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다. 마우스 버튼을 해제하면 획득이 시작됩니다. 각 샘플 스팟에 대해 1,000개의 레이저 샷을 수집합니다.
참고: 데이터 수집은 소프트웨어 수집 창에 실시간으로 표시됩니다. - 이온이 검출되지 않으면 단백질 이온 신호가 감지될 때까지 소프트웨어의 레이저 강도 하에서 슬라이딩 스케일 바를 조정하여 레이저 강도를 높입니다. 이를 임계값이라고 합니다.
참고: 시료 스팟 분석 에 앞서, m/z 범위분석되는 단백질 교정제와 MS 선형 모드에서 계측기를 외부적으로 보정합니다( 예: 단백질 교정제의 +1 및 +2 충전 상태: 사이토크롬-C, 리소지메 및 미오글로빈은 2kDa에서 20kDa까지의 질량 범위를 커버합니다. 지정된 질량 범위 내의 중간 질량은 초점 질량(예: 9 kDa)으로 사용된다. 초점 질량은 m/z가 선형 모드 검출기에 의해 검출을 위해 최적으로 초점을 맞춘 이온입니다. - MS 선형 모드 수집이 완료되면 인수 소프트웨어에서 MS/MS 리플렉션론 모드 수집 버튼을 클릭합니다. 전구체 질량을 입력하여 전구체 질량 필드로 분석합니다. 다음으로, 전구체 질량의 낮고 높은 질량 면(예: ±100 Da)에 대한 전구체 질량 창에 격리 폭(Da)을 입력합니다.
- CID 끄기 버튼을 클릭합니다. 메타스터블 서프레서 ON 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어의 레이저 강도 아래 슬라이딩 스케일 막대를 조정하여 레이저 강도를 최대 값의 90% 이상으로 조정합니다.
- 소프트웨어의 MALDI 대상 템플릿에서 분석할 샘플 스팟을 클릭합니다. 그런 다음 왼쪽 마우스 버튼을 누르고 마우스 커서를 샘플 스팟 위로 드래그하여 레이저 절제/이온화를 위해 샘플링할 직사각형 영역을 지정합니다. 마우스 버튼을 해제하면 획득이 시작됩니다. 각 샘플 스팟에 대해 10,000개의 레이저 샷을 수집합니다.
참고: 샘플 스팟 분석 이전에, 계측기는 alkylated thioredoxin35의+1 전하 상태의 포스트 소스 붕괴(PSD)의 조각 이온을 사용하여 MS/MS-리플론 모드에서 외부로 보정되어야 한다.
- 원시 MS 데이터를 처리하지 마십시오. 지정된 순서로 다음 단계 순서를 사용하여 MS/MS-PSD 원시 데이터를 처리하는 프로세스: 고급 기준 보정(32, 0.5, 0.0) 및 잡음 제거(표준 편차 2개) 다음으로 가우시안 스무딩(31점)이 뒤따릅니다.
- PBC19,20에서생성된 눈에 띄는 조각 이온의 존재에 대해 MS/MS-PSD 데이터를 수동으로 검사한다.
- 단편 이온과 신호-잡음(S/N)의 절대적이고 상대적인 풍부에 대해 MS/MS 데이터를 평가합니다. 특히 MS/MS-PSD 데이터가 시끄러운 경우 단백질 식별을 위해 가장 풍부한 단편 이온만 사용하십시오.
3. 실리코 단백질 데이터베이스 구축
- 단백질 식별을 위해 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어에 의해 스캔되는 세균균의 실리코 단백질 서열에 포함된 텍스트 파일을 생성한다. 단백질 서열은 분석되는 균주의 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에서 파생됩니다(또는 밀접하게 관련된 균주).
- NCBI/PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) 웹사이트에 접속하여 분석중인 특정 세균균의 약 5,000가지 단백질 서열을 다운로드한다(예: 에슈리치아 대장균 O113:H21 균주 RM7788). 최대 다운로드 크기는 200시퀀스입니다.
- 따라서 25개의 다운로드를 단일 텍스트 파일에 복사하여 붙여넣습니다. 각 다운로드에 대해 FASTA(텍스트) 형식을 선택합니다.
4. 운영 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어
- 단백질 바이오마커 시커 실행 파일을 두 번 클릭합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 창이나타납니다(그림 1,상단 패널).
- 단백질 바이오마커의 질량을 성숙한 단백질 질량 필드에 입력합니다(MS-linear 모드에서 측정된 대로). 다음으로 질량 측정 오류를 질량 허용 오차 필드에 입력합니다. 표준 질량 측정 오차는 10,000 Da 단백질에 대한 ±10 Da입니다.
- 선택적으로, 보완 b/y 이온 단백질 질량 계산기 버튼을 클릭하여 퍼티프로 보완 단편 이온 쌍(CFIP 또는 b/y)에서 단백질 질량을 계산합니다. 팝업 창, 단백질 질량 계산기 도구, 나타납니다(그림 1,하단 패널).
- PUTATIVE CFIP의 m/z를 입력하고 쌍 추가 버튼을 클릭합니다. 계산된 단백질 질량이 나타납니다.
- 이 숫자를 성숙한 단백질 질량 필드에 복사하여 붙여 넣고 단백질 질량 계산기 도구 창을 닫습니다.
- 잔여 제한 설정 상자를 클릭하여 N 단자 신호 펩타이드 길이를 선택합니다. 슬라이딩 스케일과 커서가 있는 팝업이 나타납니다. 커서를 원하는 신호 펩티드 길이(최대 50개)로 이동합니다. 신호 펩티드 길이가 선택되지 않으면 소프트웨어에 의해 무제한 서열 잘림이 수행됩니다.
- GUI의 단편 이온 조건하에서 폴리펩티드 백본 골짜기(PBC)에 대한 잔류물을 선택한다. 하나 이상의 잔류물 상자(D, E, N 및/또는 P)를 클릭합니다.
- 검색할 조각 이온(+1) 입력 을 클릭합니다. 팝업 조각 페이지가 나타납니다. 다음으로 각 조각 이온에 대해 한 번 클릭하면 입력할 조각 이온 수에 해당하는 조각 이온 추가 버튼을 클릭합니다. 입력할 각 조각 이온에 대해 드롭다운 필드가 나타납니다.
- 조각 이온의 m/z와 관련 m/z 허용 오차를 입력합니다. 완료되면 저장 및 닫기 버튼을 클릭합니다.
참고: 합리적인 m/z 허용 오차는 ±1.5입니다. - 일치하는 조각 이온 수의 오른쪽에 있는 상자의 원하는 번호로 스크롤하여 식별에 맞게 일치해야 하는 최소 조각 이온 수를 선택합니다.
참고: 세 경기가 적절해야 합니다. - 해당 원을 클릭하여 산화 상태로 시스테인 잔류물을 선택합니다. 검색 후 단백질 식별이 발견되지 않으면 감소 된 상태에서 시스테인으로 검색을 반복하십시오. 검색 후 식별이 발견되지 않으면 조각 이온 허용 오차를 ±3로 확대하고 검색을 반복합니다.
- 파일 설정에서 FASTA 파일 선택 버튼을 클릭하여 이전에 프로토콜 단계 3.1 에서 3.2로 구성된 세균 균주의 실리코 단백질 서열을 포함하는 FASTA(텍스트) 파일을 찾아보고 선택합니다. 그런 다음 출력 폴더를 선택하고 출력 파일 이름을 만듭니다.
- 파일 항목 실행 단추를 클릭합니다. 팝업 창에는 검색이 시작되기 전에 검색 매개 변수를 표시하는 검색 매개 변수 확인(그림1,하단 패널)이라는 제목이 표시됩니다.
- 검색 매개 변수가 올바른 경우 검색 시작 단추를 클릭합니다. 검색 매개 변수가 올바르지 않으면 취소 버튼을 클릭하고 올바른 매개 변수를 다시 입력합니다. 검색이 시작되면 매개 변수 창이 닫히고 진행률 표시줄이 있는 새 팝업창(그림 1,하단 패널)이 나타나 검색 진행 상황과 발견된 식별 수의 실행 집계를 보여 주어 있습니다.
- 검색이 완료되면(몇 초) 진행률 표시줄이 자동으로 닫히고 검색 요약이 GUI의 로그 필드에표시됩니다(그림 2,상단 패널). 또한, 새로운 팝업 창은 단백질 식별(들)을 표시하는 것으로 나타나며(그림2,하단 패널).
참고: 인식되지 않은 잔류물을 갖는 실리코 단백질 서열에서는, 예를 들어, U 또는 X, 분석에서 자동으로 건너뛰고 이러한 서열은 이후에 별도의 팝업 창으로 보고되어 검색이 완료되면 서열이 어느 정도 건너뛴지 운전자에게 경고합니다.
5. 단백질 서열의 검색 후 확인
- 수동 분석을 통해 후보 순서의 정확성을 확인합니다.
참고: 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어의 목적은 성숙한 단백질에서 가능한 PTM으로 서열 잘림절을 고려하지 않고 많은 명백히 잘못된 단백질 서열을 제거하여 고정밀단백질 서열을 식별하는 것입니다. 반환가능한 후보 시퀀스의 수가 적기 때문에 수동 확인이 가능합니다. - 이러한 기능을 갖는 질량 분석 또는 프로테오믹 소프트웨어를 사용하여 후보 시퀀스의 b 및 y형 조각 이온의 평균 m/z 의 테이블을 생성한다. D-, E-및 N-잔류물의 C 단자 측의 실리코 단편 이온의 평균 m/z와 P-잔류물의 N단 측)을 MS/MS-PSD 데이터로부터 눈에 띄는 단편 이온의 m/z와 비교한다.
참고: 가장 눈에 띄는 MS/MS-PSD 단편 이온은 실리코 단편 이온에서 D-, E-및 N과 연관된 것과 쉽게 일치해야 합니다. 그러나, 산성 효과 단편화 메커니즘은 단백질서열(36)의N-또는 C-테르미니 근처에서 덜 효율적이다.
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Representative Results
도 3(상단 패널)는 400 ng/mL 미토마이신-C로 보충된 LBA에서 하룻밤 사이에 배양된 STEC O113:H21 균주 RM7788의 MS를 나타낸다. m/z 7276, 7337 및 7841의 피크는 이전에 감기 충격 단백질 C(CspC), 냉쇼크 단백질 E(CspE), 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개단백질로확인되었다. m/z 9780 [M+H]+에서의 단백질 이온은 도 3(하단 패널)에 도시된 바와 같이 MS/MS-PSD에 의해 분석되었다. 전구체 이온은 시간 시간 이온 선택기 (TIS) 창±100 Da. 조각 이온은 m / z 및 유형 / 번호로 식별하여 격리되었다. m/z 2675.9(별과 함께 강조)의 단편 이온은 도 3(상단 패널)에 도시된 m/z 9655에서 메타안정 단백질 이온의 해리로부터 유출된다. 각 단편 이온의 이론평균 m/z는 위에 도시된 콜리신 E3 면역 단백질(Im3)의 서열의 PBC를 기반으로 괄호안에 도시된다. PBC의 사이트는 생성된 해당 조각 이온과 함께 빨간색 별표로 강조 표시됩니다. N단 메티오닌은 성숙한 단백질에서 번역 후 제거된다는 것을 의미하는 밑줄이 밑줄이 있습니다. 시퀀스는 단일 시스테인 잔류물(boxed)을 가지므로 감소된 상태로 간주됩니다.
단백질 바이오마커의 질량과 몇 가지 눈에 띄는 비 보완 단편 이온을 사용하여: m/z 1813.8, 2128.9, 및 4293.7 (±1.5 허용 오차)(도 1,하단 패널) 및 D-및 E 잔류물의 C 단말 측에 PBC를 제한, 단 하나의 후보 순서는 소프트웨어에 의해 보고되었다: Im3 단백질 서열 (N 단말 메티오닌 없이)(그림 2 , 하단 패널). 검색을 위해 단편 이온을 선택할 때, 비 보완 단편 이온의 임의의 그룹은 그룹에서 두 개의 단편 이온의 m/z를 합산한다고 가정(및 두 개의 양성자를 빼는) 바이오마커 질량 및 관련 질량 내성(±10 Da)에 속하지 않는 질량 합계를 초래한다는 것을 강조해야 한다. RM7788의 초안 WGS는 5008 단백질 서열 (오픈 독서 프레임)37을공개했다. 이들 ~5,000개의 전체 단백질 서열 중, 189,490개의 전체 및 부분 서열(무제한 트렁크)이 바이오마커 질량기준(도 2,상단 패널)을 충족하였다. 질량 기준을 통과하는 그 순서는 D-및/또는 E-잔류물의 C 단자 측에 실리코 PBC에서 겪습니다. 생성된 생성된 조각 이온은 입력된 관찰된 단편 이온과 비교됩니다. 소프트웨어에 의해보고 된 후보 순서는 질량 및 세 개의 D 및 / 또는 E 특정 PBC 사이트에 전적으로 기반으로했다. 이러한 소량의 정보에 의해 달성된 특이성은 다음 섹션에서 논의될 것입니다.
도 3(하단 패널)에 도시된 바와 같이, 가장 풍부한 단편화 이온은 인산효과 단편화메커니즘(19,20)을통해 D-및 E-잔류물의 C-말단 측에 대한 PBC의 결과이다. 두 CFIP관찰: b67/y17 (m/z 7645.1/m/z 2128.9) 및 b70/y14 (m/z 7959.4/m/z 1813.8). 이러한 CFIP는 간단한 포뮬러를 사용하여 단백질 전구체 이온의 질량을 보다 정확하게 계산하는 데 사용할 수 있습니다: b(m/z) + y(m/z) - 2H+ 단백질 질량(Da)33. 두 CFIP를 사용하여, 우리는 단백질의 평균 질량을 얻을 수 있습니다 : 9771.6 Da의 이론적 가치에 가까운 MS-선형 모드에서 단백질 이온의 측정 질량보다 : 9779 Da(도 3,상단 패널). 유일한 아르기닌 잔류물인 R80에서 이온화 양성자를 격리한 전구체 이온의 대부분이 검출되었기 때문에 몇 CFIP만 검출되었다. 리신 잔류물(K)(221.8kcal/mol38)에비해 아르기닌(237.0 kcal/mol38)의높은 가스상 기본성은 유일한 R-잔류물에서 이온화 양성자의 우대 격리를 담당할 가능성이 높다.
도 4(상단 패널)는 800 ng/mL 미토마이신-C로 보충된 LBA에서 하룻밤 사이에 배양된 STEC O113:H21 균주 RM7788의 MS를 나타낸다. 도 4(상단 패널)는 도 3(상단 패널)와 매우 유사하지만, 일부 단백질 이온의 상대적 풍부도는 항생제 농도의 차이로 인해 활용된다. 또한 단백질 바이오마커 m/z의 약간의 변화가 있어 다양한 날에 기기의 외부 교정의 차이를 반영합니다. 다시 한번, m/z 7272, 7335 및 7838에서 단백질 이온은 각각 CspC, CspE 및 플라스미드 매개 단백질이다. 또한, m/z 9778(도 3보다풍부도가 낮음)에서 Im3 단백질 이온뿐만 아니라 m/z 9651 [M+H]+의단백질 이온을 검출한다. 도 4(하단 패널)는 m/z 9651에서 단백질 전구체 이온의 MS/MS-PSD를 나타낸다. 전구체 이온은 m/z 9539 및 9778에서 인접한 단백질 이온의 기여를 제거하기 위해 -75/+60 Da의 더 좁고 비대칭 TIS 창을 사용하여 격리되었다. 조각 이온은 m/z 및 유형/번호로 식별됩니다. 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질의 서열이 위에 도시되어 있다. PBC의 사이트는 해당 조각 이온(들)이 있는 빨간색 별표로 강조 표시됩니다. 각 단편 이온의 이론평균 m/z도 스펙트럼의 괄호안에 표시됩니다. Im-Bac 시퀀스는 또한 단일 시스테인 잔류물 (박스)을 가지고 있으며, 따라서 감소 된 상태에서 고려된다.
단백질 바이오마커 질량을 이용하여, 3개의 눈에 띄는 비보완 단편 이온: m/z 2675.4, 3853.5, 및 5772.8(±1.50 내성) 도 4에서 PBC를 D-및/또는 E-및/또는 아스파라진(N)의 C단측으로만 제한하는 것은, 오직 소프트웨어에 의해서적으로만 보고된 소프트웨어서열이었다. 후보 서열은 바이오마커 질량 및 내성(±10 Da) 기준을 충족하는 191,375개의 전체 또는 부분 서열을 스캔한 후 회수되었다. 후보 순서는 소프트웨어 기반의 질량 및 3개의 D-및/또는 E 및/또는 N-특정 PBC 사이트에만 식별되었습니다.
도 4(하단 패널)에서 가장 눈에 띄는 단편 이온은 다시 한번, D 및/또는 E-잔류물의 C 단말 측과 P-잔류물(20)의N단측에서PBC의 결과였다. 또한 산효과와 같은 단편화메커니즘(39,40)에의해 발생할 가능성이 있는 N-잔류물의 C-단말 측에서 PBC를관찰한다. 단백질 전구체 이온 신호의 약점은 해석 가능한 단편 이온의 제한된 수를 초래한다. 조각 이온 m/z의 정확도는 조각 이온 풍부하게 감소합니다. 단백질 이온 서열의 유일한 아르기닌 잔류물(R74)에서 격리되는 이온화 양성자 때문만은 검출되지 않았다. 모든 단편 이온은 이 가설과 일치하는 R74 잔류물을 함유하고 있습니다.
항균 면역 유전자의 프로모터
도 5는 전체 게놈 산탄총 시퀀싱37로부터 대장균 균주 RM7788(GenBank: NWVS01000096.1)의 6482bp 연속00000의 일부를 나타낸다. 배앓이 E3, 면역 단백질(Im3), 박테리오신의 면역 단백질(Im-Bac), 리시스 단백질용 코딩 영역이 노란색으로 강조된다. 콜리신 E3 유전자에 대한 코딩 영역의 상류는 -35 영역, 프리보우 박스(PB), SOS 박스의 반전 반복, 샤인 달가르노/리보소말 결합 부위(SD/RBS)27이다. 복통 E3와 Im3 사이에는 9개의 염기 쌍 간 간 영역이 있습니다. 렉사(억압단백질 및 오토펩티다아제)는 하류 유전자의 발현을 차단하는 SOS 박스에 결합한다. DNA 손상(예를 들어, UV 방사선 또는 DNA 손상 항생제)에 따라, LexA는유전자다운스트림 27,28의발현을 허용하는 자가 분열을 겪는다. 따라서, 이 두 면역 단백질의 발현은 DNA 손상 항생제에 이 긴장의 노출과 일치합니다.
그림 1: 단백질 바이오 마커 추구자 소프트웨어의 스크린 샷. 상단 패널: 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI). 하단 패널: 단백질 질량 계산기 도구의 팝업 창, 조각 페이지, 검색 매개 변수 확인 및 검색 진행률 표시줄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단백질 바이오마커 시커 소프트웨어를 사용하여 단백질 식별결과를 검색합니다. 상단 패널: 소프트웨어 GUI의 로그 필드에 표시되는 검색 결과의 요약입니다. 하단 패널: 소프트웨어를 사용하여 단백질 식별을 표시하는 팝업 창입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: STEC O113:H21 균주 RM7788의 질량 분광분석. 상단 패널: MS STEC O113:H21 균주 RM7788 LBA에 하룻밤 배양 400 ng/mL 미토마이신-C. 바닥 패널: m/z 9780 (상단 패널)에서 단백질 전구체 이온의 MS/MS-PSD. 전구체 이온은 TIS 창으로 분리되었다±100 Da. 조각 이온은 m/z 및 이온 유형에 의해 식별된다. 배앓이 E3(Im3)에 대한 면역 단백질의 서열이 도시된다. 기본 잔류물(충전 격리 가능한 사이트)이 파란색으로 강조 표시됩니다. PBC는 생성된 해당 조각 이온(들)을 가진 빨간색 별표로 강조 표시됩니다. 각 단편 이온의 이론평균 m/z는 괄호안에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: STEC O113:H21 균주 RM7788의 질량 분광분석. 상단 패널: MS 의 Ms STEC O113:H21 균주 RM7788 LBA에 하룻밤 배양 800 ng/mL 미토마이신-C. 바닥 패널: m/z 9651(상단 패널)에서 단백질 전구체 이온의 MS/MS-PSD. 전구체 이온은 전구체 이온의 낮은 m/z 측에 -75의 비대칭 TIS 창으로 격리되고 전구체 이온의 높은 m/z 측에 +60이 절연되었다. 조각 이온은 m/z 및 이온 유형으로 식별됩니다. 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질의 서열이 도시된다. 기본 잔류물(충전 격리 가능한 사이트)이 파란색으로 강조 표시됩니다. PBC는 생성된 해당 조각 이온(들)을 가진 빨간색 별표로 강조 표시됩니다. 각 조각 이온의 이론평균 m/z는 괄호안에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대장균 O113:H21 균주 RM7788에 의해 운반되는 플라스미드 게놈의 단면의 분석. 대장균 O113:H21 균주 RM7788(GenBank: NWVS0100096.1)의 6482bp 의 일부가 전체 게놈 산탄총 시퀀싱37에서분리된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 (S1 Im3): Im3의 일부 조각 이온을 사용하여 소프트웨어의 벤치마킹 분석 결과(그림 3,하단 패널에서). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 (S2 ImBac): Im-Bac의 선택 조각 이온을 사용하여 소프트웨어의 벤치마킹 분석 결과(그림 4,하단 패널). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜 고려 사항
현재 프로토콜의 주요 강점은 속도, 샘플 준비의 단순성 및 비교적 작동, 훈련 및 유지 보수가 쉬운 계측기의 사용입니다. 액체 크로마토그래피-ESI-HR-MS에 의한 상향식 및 하향식 프로테오믹 분석은 MALDI-TOF-TOF의 하향식에 대한 여러 면에서 유비쿼터스이며 훨씬 우수하지만 더 많은 시간, 노동 및 전문 지식이 필요합니다. 악기 복잡성은 종종 특정 악기 플랫폼이 대량 분석에서 공식적으로 훈련되지 않은 과학자들에 의해 채택 될 가능성이 있는지 여부에 영향을 미칠 수 있습니다. MALDI-TOF-TOF를 사용한 하향식 접근법은 임상 미생물학 실험실에서 박테리아의 분류학적 식별을 위해 현재 사용이 아닌 MALDI-TOF-MS의 분석을 확장하는 동시에 분석에 필요한 노동, 복잡성 또는 전문 지식을 크게 증가시키지 않기 위한 것입니다.
프로토콜은 기계적(또는 전기적) 셀 리시스 단계를 사용하지 않습니다. 분비 또는 세포외 단백질은 프로토콜을 사용하여 검출될 수 있더라도, 이 방법의 이전 버전은 처음으로 STEC 균주로부터 시가 독소(Stx)의 검출을 위해 개발되었으며, 항생제 유도는 세균세포리시스(41)를 담당하는 stx뿐만 아니라 후기 파지 유전자를 포함한 파지 유전자의 발현을 유발하는 세균성 SOS 반응을 유발합니다. . 우리는 항생제 유도된 세포 용해가 SOS 프로모터 (현재 작업)가 있는 흉막 단백질뿐만 아니라 Stx의 검출을 위한 특정 이점이 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 확실히, 기계셀 용해(예를 들어, 비드-구타)도 사용할 수 있습니다(현재 작업에서는 사용되지 않지만). 그러나, 기계적 리시스는 모든 세균 세포가 lysed되는 결과 (단순히 유도 된 세포가 아님) 시료가 풍부하고 보존된 숙주 단백질로 풍부해져 서 표절되지 않은 샘플에서 파지 및 플라스미드 단백질을 더 어렵게 감지할 수 있습니다.
세균균균에 대한 항생제 농도는 일반적으로 검출된 항생제 유도 단백질에 대하여 재현가능한 것으로 나타났다. 우리는 검출된 항생제 유도 단백질에 대하여 상대적인 단백질 풍부에 있는 변이를 주의했습니다. 우리의 분석은 정성적이기 때문에 (정량적이지 않음), 단백질 바이오 마커 풍부는 적절한 MS / MS 분석을 위해 충분해야합니다. putative STEC 균주는 먼저 다양한 항생제 농도(예를 들어, 300 ng/mL ~ 2,000 ng/mL 의 미토마이신-C)로 배양되어 수확을 위한 충분한 세균세포를 제공하면서 세균 SOS 반응을 유발하는 최적의 농도를 결정한다. STEC 균주 RM7788의 경우, 확인된 바이오마커의 검출을 위한 최적의 항생제 농도가 미토마이신-C의 400~800 ng/mL이었다는 것을 발견했습니다.
단백질 서열 절단 이외에, 대장균 단백질은 질량, 예를 들면, 인산화, 글리코실화 등의 추가를 포함하는 PTM을 가질 수 있습니다. MS/MS가 MALDI에 의해 생성된 소박형 단백질 이온(질량20 kDa 미만)의 해리를 위해 PSD를 활용함에 따라, PSD가 인체성 해리 기법이기 때문에 잔류 측 사슬에 부착된 이러한 PTM은 촉진적 해리 손실을 겪을 가능성이 높습니다. 이러한 PTM의 존재는 MS/MS 데이터에서 원래 전구체 이온(PTM의 질량을 뺀 값)에 질량에 가까운 조각 이온의 출현에서 유추될 수 있다. 그러나 PSD나 소프트웨어는 이러한 PTM이 부착된 위치를 식별할 수 없습니다. 또한, 이 소프트웨어는 PBC의 단편 이온에서 단백질을 식별할 수 있으며 잔류물의 측면 사슬에 부착된 소분자(예: 물 또는 암모니아) 또는 PTM의 해리손실은 식별할 수 있습니다. 그러나, PBC로부터의 단편 이온이 검출되면, 단백질은 PTM의 질량을 포함하거나 단순히 의심되는 PTM의 해리 손실에 대응하는 단백질 단편 이온의 질량을 입력하는 단백질 질량 내성 창을 확대함으로써 소프트웨어를 사용하여 여전히 식별될 수 있다. 소프트웨어에 의한 모든 식별은 PTM이 없는 단백질 서열일 것입니다. 흥미롭게도, 우리는 지금까지 우리의 세균성 작용에서 인산화, 글리코실화 등을 갖는 단백질을 검출하지 않았습니다. 그러나, 그 때문일 수 있습니다: MALDI에 의해 그들의 상대적인 풍부, 사용되는 질량 범위: 2-20 kDa, 이러한 PTM비정상적으로 음순 수 및 MALDI 매트릭스의 적용을 살아남을 수 없습니다, 또는 이러한 PTM이 소스에서 가속되기 전에 소스에 매우 빠른 해리 손실을 겪을 수 있습니다.
현재, 소프트웨어는 시스테인 알킬레이션을 포함하지 않으며, 우리의 샘플 프로토콜은 시스테인 잔류물의 이황화 감소 단계를 포함하지 않습니다. 이 프로토콜은 검색이 산화 상태에서 시스테인 잔류물로 작동해야 하며, 식별이 없는 경우 감소된 상태에서 시스테인 잔류물로 다시 검색을 실행해야 한다는 것을 나타내기 위해 명확히 되었습니다. 식별이 다시 발견되지 않으면 조각 이온 허용 오차를 ±2 또는 ±3으로 확대하면 조각 이온 일치에 대한 임계값이 낮아지므로 시스테인과의 시퀀스가 산화 및/또는 감소된 상태에 있는지 여부와 일치하도록 합니다.
MALDI-TOF-TOF 질량 분석법에 의한 하향식 프로테오믹 분석
대부분의 하향식 프로테오믹 분석은 ESI 및 고해상도 질량 분석 플랫폼을 사용하여 달성되었습니다. 대조적으로, MALDI-TOF-TOF 플랫폼을 사용하여 더 적은 하향식 프로테오믹 분석이 수행되었습니다. 그 결과,단편화를위한 아파르트산 효과를 악용하는 MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD에 의해 생성되고 분석된 소충전 된 메타안정 단백질 이온의 분석을 위한 하향식 프로테오믹 소프트웨어가 거의없다. 이에 대한 여러 가지 이유가 있습니다. 첫째, MALDI의 이온화 효율은 낮은 분자량 펩티드와 단백질쪽으로 편향되고, 이 편견은 분별되지 않은 세균성 세포 lysate에서 찾아볼 수 있는 것과 같이 단백질의 혼합물로 특히 명백하다. 둘째, MALDI는 저전하 상태를 생성하며, 단백질 이온 해리를 용이하게 하기 위해 쿨롬 반발이 거의 또는 전혀 없습니다. 셋째, PSD 서열 커버리지는 다른 기술 ECD7,ETD7,UV-PD8등과 는 매우 제한적이다. 넷째, PSD의 단편화 효율은 단백질 이온의 질량증가와 함께 감소한다. 다섯째, PSD와 같은 인체성 해리 기술은 잔류물, 예를 들어 인산화, 글리코실화 등에 부착된 PTM의 촉진적 해리 손실을 초래하여 PTM 부착 부위를 결정하는 데 어려움을 겪고 있다. 이러한 심각한 한계에도 불구하고 MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD를 이용한 하향식 분석은 샘플 준비의 단순성, LC 분리부재, MS/MS에 의한 메타안정 단백질 이온의 분리, 이온 전구에 대한 단편 이온의 기여, 서열 결투 및 분자 적 속도 분석과 관련된 PTM의 식별 등 명확한 장점이 있다. WGS 데이터에서 파생된 실리코 단백질 서열과 결합하면 이 기술은 다른 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 분석이 완료되기 전에 신속한 정보를 제공할 수 있습니다.
단백질 바이오마커 시커 소프트웨어는 IntelliJ를 사용하여 개발되었으며 Java에서 작성하여 세균균균의 WGS에서 추출한 단백질 아미노산 서열을 효율적으로 처리하고 검색합니다. 이 소프트웨어는 Excel33내에서 매크로로 작동하는 이전 알고리즘에서 수정되었습니다. 우리는 GUI 인터페이스를 갖춘 소프트웨어의 독립 실행형 버전을 개발하여 사용자 친화적뿐만 아니라 추가 개선을 제공하기로 결정했습니다.
단백질 서열 을 포함하는 PTM의 경우, 소프트웨어는 N-종부로부터 아미노산 잔류물을 순차적으로 제거하고 질량합계가 검출된 단백질 바이오마커의 측정질량을 충족하거나 초과할 때까지 서열의 잔류물을 반복적으로 첨가한다. 이 과정은 매우 많은 수의 단백질 질량 단편(~5000~5000개의 전체 단백질 서열로부터~200,000~)을 초래할 수 있지만, N-terminus 또는 C-terminus(또는 둘 다)에서 잘림으로부터 잠재적단백질 단편을 배제하지 않는 장점이 있지만 이러한 잘림은 생물학적 관점에서 볼 수 있다. 이 방법을 무제한 트런케이션이라고 합니다. 그러나, 잘림과 관련된 가장 흔한 세균성 PTM은 N단 메티오닌 또는 N단 신호 펩타이드의 제거이다. 결과적으로, 이 소프트웨어는 또한 운영자가 N-terminus로부터 잔류물 잘림에 대한 상한(50 잔류물)을 선택할 수 있게 해주며, 이는 단백질 바이오마커 질량 기준을 충족하는 단백질 단편이 훨씬 적습니다.
PBC는 P-잔류물의 C-말단 측뿐만 아니라 P-잔류물의 N단측에 실험적으로 그리고 이론적으로17,18,19,20을광범위하게 연구하고 있는 산효과 메커니즘과 일치한다. N-잔류물의 C-말단 측에 PBC를 포함시키는 것은 우리의 실험실에서 다수의 메타안정 단백질 이온을 위해 관찰된 아파르트산 효과 와 같은 메커니즘으로 인해 소프트웨어에 포함되었다39,40. MS/MS-PSD에 의해 분석된 소박형 단백질 이온의 해리로부터 가장 풍부한 단편이 산 효과 단편화 메커니즘에 기인한다. 연산자는 MS/MS-PSD 데이터에서 가장 눈에 띄는 조각 이온을 선택하고 소프트웨어에 m/z뿐만 아니라 연관된 조각 이온 허용 오차(±m/z)를 입력합니다. 조각 이온 허용 오차는 상대적 풍부함을 반영하기 위해 각 조각 이온에 대해 조정할 수 있습니다. 적절한 단편 이온 허용 오차는 배경 화학 소음에 비해 단편 이온의 절대 풍부뿐만 아니라 상대적 풍부에 따라 ±1.0에서 ±2.5 m/z 사이로 다를 수 있습니다. 일반적으로 단편 이온이 풍부할수록 질량 정확도가 높아지므로 단편 이온 허용 오차가 더 좁아질 수 있습니다.
메타안정 단백질 이온의 MS/MS-PSD 데이터는 복잡성 면에서 크게 달라질 수 있습니다. 일부 MS/MS-PSD 스펙트럼은 다른 사람보다 더 쉽게 해석할 수 있습니다. 이 현상에는 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 단백질 이온은 MALDI 매트릭스 용액에서 용해화 후에도 접히거나 부분적으로 접혀 있기 때문에 분석(~10-30 μs)의 기간에 효율적으로 단편화되지 않을 수 있다. 둘째, PBC 이외에, 메타안정 단백질 이온은 소분자, 즉 암모니아(-17 Da) 또는 물(-18 Da)15의해리손실을 겪을 수 있다. 스펙트럼 복잡성에 중요한 기여는 R-잔류물33의측면 사슬에서 암모니아의 해리 손실것으로 나타납니다. 우리는 단백질 서열에 있는 R-잔류물의 수와 MS/MS-PSD 데이터의 스펙트럼 복잡성의 증가를 관찰했습니다. R-잔류물이 없는 단백질(YahO 단백질36 및 냉쇼충격 단백질 CspC33, 43),R-잔류물1개(콜드 쇼크 단백질 CspE33 및 Stx241의B-서브유닛),2개의 R-잔기(가상 단백질33)가있어 MS/MS-PSD 스펙트라를 생산하여 비교적 쉽게 해석할 수 있습니다. 그러나 R-잔류물의 수가 3개(HU 단백질44)또는 4개(유비퀴틴35및 냉크 쇼크 단백질 CsbD33,43)으로증가하면 스펙트럼 복잡성이 크게 증가한다. 이 소프트웨어는 MS/MS-PSD에 의해 분석된 singly 충전된 메타안정 단백질 이온의 가장 접근 가능한 해리 채널이기 때문에 인산 효과 메커니즘에 특정한 잔류물에서 PBC의 단편 이온을 비교합니다. 이 소프트웨어는 소중성 분자의 해리 손실 (또는 손실)으로 인한 단편 이온을 포함하지 않습니다. 따라서 작업자가 작은 중립 해리 손실을 포함하는 단편 이온을 선택하지 않는 것이 중요합니다. PBC에서 단편 이온은 일반적으로 가장 눈에 띄는 단편 이온; 그러나, 단백질내R 잔류물의 수가 3개 또는 4개로 증가할 때, PBC 부위에서 가장 풍부한 단편 이온은 작은 해리 손실(또는 손실)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 조각 이온 클러스터(17 m 또는 18m/z의 배수로 구분)가 감지되면 클러스터 내에서 가장 높은 m/z가 있는 조각 이온이 조각 이온 검색 매개 변수에 입력되어야 합니다.
소프트웨어가 운영자가 없는 프로테오믹 식별을 위해 설계되지 않았다는 점을 강조해야 합니다. 연산자는 MS/MS-PSD 데이터에서 어떤 조각 이온을 검색에 포함할지 선택해야 합니다. 그러나, MS/MS-PSD에 의한 산성 효과를 확인한 수많은 실험에 기초하여, 가장 눈에 띄는 단편 이온은 항상 D-또는 E-또는 N-잔류물의 C 단말 측에 대한 PBC의 결과입니다. 소프트웨어의 유용성은 많은 명백하게 잘못된 시퀀스를 제거하고 몇 가지 가능성이 후보를 검색한다는 것입니다. 일부 후보 시퀀스는 시퀀스에서 D-잔류물이 눈에 띄는 조각 이온을 생성할 것으로 예상되는 단편 이온의 부재에 따라 제거될 수 있다. 변함없이, D-잔류물은 산성 효과의 효율이36이감소하는 N-또는 C-테르미니의 몇 잔류물 내에 위치하는 경우를 제외하고 폴리펩티드 백본 전체에 걸쳐 눈에 띄는 단편 이온을 초래한다.
잠정적인 단백질 식별에 필요한 최소 PBC 사이트 수
CFIP는 동일한 PBC 부위에서 해리되지만 분열 부위의 반대편에 이온화 양성자가 있는 두 개의 동일한 단백질 전구체 이온으로부터 형성됩니다. CFIP는 단백질 바이오마커의 질량을 보다 정확하게 계산하는 데 사용될 수 있지만(검색 중에 단백질 질량 내성의 협결을 허용), 서열 특이적 식별을 위한 그 유틸리티는 두 개의 서로 다른 분열 부위로부터 형성된 두 개의 비보완 단편 이온보다 덜 유용하며, 이는 더 큰 식별 특이성을 제공한다. 두 개의 AB-Im 단백질이 확인된 용이성은 수천 개의 단백질 또는 단백질 단편 서열에서 올바른 단백질 서열을 잠정적으로 식별하는 데 필요한 최소 수의 단편 이온으로 추측하게 되었습니다. 우리는 신속하게 각각의 비 보완 단편 이온이 하나의 PBC 사이트를 나타내기 때문에 중요한 비 보완 단편 이온의 수가 아니라 CFIP가 동일한 분열 부위를 나타내기 때문에 중요한 단편 이온의 수가 아니라는 것을 신속하게 결정했습니다. 따라서, 식별 특이성은 단편 이온의 수가 아니라 검출된 PBC 부위의 개수로부터 유래된다.
단편 이온이 3개만으로 식별하는 데 성공했을 수도 있습니다. 이 가설을 테스트하고 조각 이온 선택에서 바이어스를 제거하기 위해, 우리는 임의로 보완 및 / 또는 비 보완 조각 이온의 더 큰 풀에서 조각 이온을 선택하는 소프트웨어 내에서 벤치마킹 모듈을 만들었습니다. 더 큰 조각 이온 풀은 상대적 풍부에 기초하여 도 3(하단 패널)에서 확인된 14개의 눈에 띄는 조각 이온에서 선택되었다.
테스트 프로토콜은 다음과 같습니다. 이진 검색을 사용하여 도 3(하단 패널)에서 14개의 눈에 띄는 조각 이온의 풀에서 3개의 단편 이온을 무작위로 선택하였다(m/z 1813.8), 2128.9, 3881.3, 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3, 8961.5). 3개의 단편 이온 코호트는 D-또는 E-또는 N-잔류물의 C 단자 측의 PBC로부터의 실리코 단편 이온과 D&E 및 D&N의 조합과 비교되었다. 이러한 비교는 코호트의 각 개별 단편 이온에 대해, 코호트의 3개의 단편 이온 쌍및 코호트의 3개의 단편 이온 조합에 대해 수행되었다. 비교를 일치로 계산하려면 쌍의 조각 이온과 조합의 세 조각 이온 모두 실리코 조각 이온과 일치해야 합니다. 분석이 완료된 후 다른 3개의 단편 이온 코호트가 무작위로 선택되고 분석이 반복됩니다. 조각 이온 선택의 반복이 허용되었습니다. 364 개 가능한 조합이 있기 때문에 【(n!/r!) n-r)!] 14개의 단편 이온(n)의 풀에서 3개의 단편 이온 코호트(r)의 경우, S1Im3(보충 정보)에 도시된 바와 같이 10개의 분석만 수행하였다.
3개의 단편 이온 식별 요구 사항은 표 2-7, 9-10(S1 Im3)의기둥 3_ABC 표시된 일반적인 현상으로 보인다. 3_ABC 열에서 1의 모든 카운트는 Im3 서열(N 단말 메티오닌 제외)에 해당합니다. 식별의 유일한 실패는 m/z 8136.2의 단편 이온(도 3,하단 패널에 표시되고 표 1 과 8에서회색으로 강조 표시됨)이 분석을 위해 입력된 단편 이온 허용 오차(±1.5 m/z)를 초과하기 때문에 발생하였다. 테스트 알고리즘은 3개의 단편 이온 코호트의 모든 단편 이온이 일치하도록 요구하기 때문에 m/z 8136.2 단편 이온을 포함하는 모든 그룹은 올바른 단백질 서열을 식별/계산하지 못합니다.
S1Im3의 표 6은 세 개의 단편 이온 중 두 개가 상호 보완적일 때(노란색으로 강조 표시됨) 세 개의 단편 이온이 모두 상호 보완적일 때 관찰된 것보다 더 잘못된 시퀀스가 기준과 일치한다는 것을 보여줍니다. 앞서 언급했듯이, 이는 CFIP가 단일 PBC 사이트에 해당하기 때문이며, 이는 두 개의 PBC 사이트에 해당하는 두 개의 비 보완 단편 이온을 사용하는 것과 비교하여 실리코 서열에서 더 많은 부정확한 임계값인 단일 PBC 사이트에 해당하기 때문입니다.
그림 4(하단 패널)에 도시된 임박의 6개의 눈에 띄는 단편 이온(m/z 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5 및 5772.8)에 유사한 분석을 수행하였다. Im3와 달리 Im-Bac은 식별 가능한 CFIP가 없으므로 6개의 조각 이온은 6개의 PBC 사이트에 해당합니다. 6개의 단편 이온풀에서 선택된 3개의 단편 이온 코호트의 20개의 가능한 조합이 있기 때문에, S2 임박(보충정보)의 표에 도시된 바와 같이 10개의 분석만 수행하였다. Im-Bac 시퀀스는 모든 분석에서 3_ABC 열의 모든 3조각 이온 그룹에 대해 올바르게 식별/계산되었습니다. 4개의 분석에서는 하나 또는 두 개의 잘못된 시퀀스도 일치했습니다. 그러나 이 소수의 잘못된 시퀀스는 수동 확인을 위한 관리 가능한 수입니다.
전반적으로, 두 개 또는 세 개의 PBC 사이트에 해당하는 상호 보완 및/또는 비 보완단편 이온은 하나 또는 두 개의 후보 시퀀스를 검색하기에 충분한 특이성을 제공하는 것으로 보인다. 물론 작업자가 선택한 조각 이온은 상대적으로 풍부하고 S/N이 양호해야 합니다. 단일 PBC 사이트에서 하나 또는 두 개의 조각 이온은 작업자가 확인해야 하는 잘못된 시퀀스의 실행 불가능한 수를 검색하지 않도록 충분한 특이성을 제공하지 않습니다. 두 개 또는 세 개의 PBC 사이트가 적절한 이유는 분명하지 않지만 단일 PBC 사이트는 분명히 충분히 구체적이지 않습니다. 무제한 트런션은 단백질 질량 기준을 충족하는 ~200,000개의 단백질 및 단백질 단편 서열을 초래하지만, 분열 부위의 부위/잔류 특이적 특성, 즉 D-, E-및 N-잔류물의 C-말단 측이 단편화 시 중 가능한 서열의 급격한 협착에 기여할 가능성이 있다. 이것은 부분적으로 박테리아의 프로테아메를 통해 단백질 서열에 있는 그들의 유일한 위치뿐만 아니라 세균성 단백질 서열에 있는 D-, E-및 N 잔류물의 주파수 때문일 지도 모릅니다. 산성 잔류물은 단백질 구조와 용매 상호 작용에서 중요한 역할을 합니다. 결과적으로, 1 차 서열에 있는 그들의 주파수 및 위치는 단백질 기능에 대한 고유하지 않을 경우 중요하며 수십만 개의 잘못된 서열 중 올바른 단백질 서열을 잠정적으로 식별하기 위해 몇 가지 PBC 사이트만이 필요한 이유를 설명 할 수 있습니다.
가스상 화학관점에서, D-, E-및 N-잔류물의 중요성은 MALDI에 의해 생성되고 PSD20에의해 부패하는 소충전된 메타안정 단백질 이온의 낮은 내부 에너지에서 접근할 수 있는 해리 채널에 참여하는 데서 비롯된다. PSD에 의한 분자 이온 단편화의 비교적 긴 기간(~10-30 μs)은 단백질 이온의 내부 에너지가 분자 이온의 모든 진동 및 회전자유도 사이에서 무작위화되어 해리가 잘못되고 통계적이라는 것을 의미한다. 또한, PBC17,18,19의활성화 장벽을 낮추는 유리한 기하학이 달성될 때까지 여러 원자를 포함하는 단계 또는 단일 결합 단계에 의해 발생하는 분자 이온재배열을포함한다.
STEC 균주에 의해 생성된 2개의 플라스미드 인코딩된 항균 면역 단백질은 항생제 유도, MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD 및 하향식 프로테오믹 분석을 포함하는 프로토콜을 사용하여 확인되었다. 이러한 단백질은 사내에서 개발된 소프트웨어를 사용하여 단백질의 측정질량과 아파르트산 효과의 결과로 형성된 비교적 적은 수의 서열 특이 단편 이온을 통합한 것으로 확인되었다. 이 소프트웨어는 MS 및 MS/MS 데이터를 WGS 데이터에서 파생된 실리코 단백질 및 단백질 단편 서열과 비교합니다. 소프트웨어는 식별 메트릭이나 점수를 제공하지 않지만 수동 검사로 쉽게 확인할 수 있는 매우 적은 수의 후보 시퀀스(하나 또는 두 개)를 생성하여 잘못된 시퀀스의 매우 높은 비율을 제거합니다. 마지막으로, 이러한 세균균의 WGS 데이터를 수동 검사하여 DNA 손상 항생제의 노출로 인해 이러한 유전자의 발현을 합리화하는 플라스미드 게놈에서 AB 및 Im 유전자의 프로모터(SOS box)를 상류에 공개했다.
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Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
단백질 바이오마커 시커 소프트웨어는 clifton.fagerquist@usda.gov 클리프턴 K. Fagerquist에 연락하여 자유롭게 사용할 수 있습니다(무료). 우리는 ARS에 의해이 연구의 지원을 인정 하고자, USDA, CRIS 교부금: 2030-42000-051-00-D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
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