Summary
Il modello murino di disperazione cronica (CDM) della depressione consiste in sessioni di nuoto forzate ripetitive e un'altra fase di nuoto ritardata come lettura. Rappresenta un modello idoneo per l'induzione di uno stato depressivo cronico stabile per almeno 4 settimane, modificabile per valutare interventi di trattamento subcronico e acuto.
Abstract
Il disturbo depressivo maggiore è una delle forme più diffuse di malattie mentali e causa enormi sofferenze individuali e oneri socioeconomici. Nonostante la sua importanza, l'attuale trattamento farmacologico è limitato e sono urgentemente necessarie nuove opzioni di trattamento. Un fattore chiave nella ricerca di potenziali nuovi farmaci è la valutazione della loro potenza antidepressiva in modelli animali appropriati. Il classico test di nuoto forzato di Porsolt è stato utilizzato a questo scopo per decenni per indurre e valutare uno stato depressivo. Consiste in due brevi periodi di nuoto forzato: il primo per indurre uno stato di depressione e il secondo il giorno successivo per valutare l'effetto antidepressivo dell'agente somministrato tra le due sessioni di nuoto. Questo modello potrebbe essere adatto come strumento di screening per potenziali agenti antidepressivi, ma ignora l'insorgenza ritardata dell'azione di molti antidepressivi. Il CDM è stato recentemente istituito e rappresentava una modifica del test classico con notevoli differenze. I topi sono costretti a nuotare per 5 giorni consecutivi, seguendo l'idea che negli esseri umani la depressione è indotta da stress cronico piuttosto che acuto. In un periodo di riposo di diversi giorni (1-3 settimane), gli animali sviluppano una disperazione comportamentale sostenuta. Il metodo di lettura standard è la misurazione del tempo di immobilità in un'ulteriore sessione di nuoto ritardata, ma vengono proposti diversi metodi alternativi per ottenere una visione più ampia dello stato d'animo dell'animale. È possibile utilizzare più strumenti di analisi per i cambiamenti comportamentali, molecolari ed elettrofisiologici. Il fenotipo depresso è stabile per almeno 4 settimane, fornendo una finestra temporale per strategie di trattamento antidepressivo rapide ma anche subcroniche. Inoltre, le alterazioni nello sviluppo di uno stato depressivo possono essere affrontate utilizzando questo approccio. Il CDM, quindi, rappresenta uno strumento utile per comprendere meglio la depressione e per sviluppare nuovi interventi terapeutici.
Introduction
I disturbi affettivi, come il disturbo depressivo maggiore, sono tra le malattie mentali più frequenti e impegnative e sono associati a un'elevata sofferenza individuale1, ad un aumento del rischio di suicidio2 e causano un notevole onere socioeconomico3 per la società. Nonostante il suo impatto, le opzioni di trattamento sono limitate e vi è un urgente bisogno di sviluppare nuovi interventi antidepressivi, soprattutto a causa della crisi di innovazione in psicofarmacologia negli ultimi decenni. Per comprendere la fisiopatologia della depressione e testare potenziali nuovi agenti, sono urgentemente necessari modelli animali razionali e validi4. Per quasi mezzo secolo, il classico test di nuoto forzato (FST), originariamente descritto da Porsolt5, è stato utilizzato come induzione e lettura per lo screening di potenziali nuovi antidepressivi. Consiste in un periodo di nuoto forzato per 5-15 minuti il giorno 1, successiva applicazione di farmaci una tantum e valutazione della porzione che i topi trascorrono immobili in acqua in un altro periodo di nuoto il giorno successivo. Il tempo di immobilità è stato considerato come un comportamento di fuga naturale mancante e si pensava che fosse correlato al grado di uno stato simile alla depressione nei topi5.
Il FST classico è stato pesantemente criticato, non solo nella comunità scientifica6,7,8 ma anche nei media pubblici8. La maggior parte delle controversie intorno al FST sono dovute ai brevi periodi di induzione e trattamento di solo 1 giorno nel paradigma classico. È stato sostenuto che la FST rappresenta piuttosto un modello di trauma acuto che uno stato paragonabile alla depressione umana. Inoltre, il test porsolt potrebbe essere adatto come strumento di screening per potenziali agenti antidepressivi, ma ignora l'insorgenza ritardata dell'azione di molti antidepressivi.
Il modello di disperazione cronica (CDM)9,10,11,12,13,14,15, derivato dall'FST originale, rappresenta un modello animale più appropriato per la depressione. Nel CDM, lo stress da nuoto ripetuto per 5 giorni consecutivi evita effetti traumatici acuti. Non riuscendo a sfuggire a una situazione stressante ripetuta e continua, si pensa che i topi sviluppino uno stato di impotenza, resa e, infine, disperazione. Questo paradigma è più paragonabile alle attuali teorie psicologiche per lo sviluppo della depressione negli esseri umani rispetto a un singolo trauma acuto, che viene comunemente sperimentato all'inizio di un disturbo da stress post-traumatico. Lo stato depressivo risultante nella CDM è stabile fino a 4 settimane9 e quindi apre la possibilità di periodi di trattamento più lunghi, che sono meglio paragonabili alle condizioni cliniche, in cui gli antidepressivi di solito hanno bisogno di 2-4 settimane per mostrare un beneficio16.
La valutazione dello stato depressivo dovrebbe quindi essere multidimensionale. La misurazione del tempo di immobilità, come nel classico FST, è utile, ma non deve essere utilizzata come unico parametro di risultato. Vari metodi, che sono descritti di seguito, dovrebbero essere in grado di mappare diverse dimensioni di uno stato depressivo in linea con i sintomi che di solito si trovano negli esseri umani depressi. Adeguate valutazioni di lettura potrebbero includere il comportamento di fuga (tempo di immobilità9,10,17), il test di sospensione della coda (TST)9, l'anedonia (test di preferenza classico del saccarosio (SPT)18), il comportamento orientato alla motivazione (test di preferenza del saccarosio naso-poke (NPSPT)10), il comportamento di aspettativa/esplorazione (risposta al segnale ambiguo19; Test del labirinto a Y9), elettrofisiologia (misure di plasticità a lungo termine (potenziamento a lungo termine, LTP; depressione a lungo termine, LTD)20), valutazioni molecolari (modelli di attivazione di geni precoci immediati (IEG); ulteriori modelli di stress21).
Teoricamente, un test di nuoto ripetuto può essere utilizzato per indurre uno stato depresso senza alcuna valutazione del tempo di immobilità. Tuttavia, si raccomanda vivamente di fornire almeno una serie sperimentale proof-of-concept con tempi di immobilità. Inoltre, cdm rappresenta un modello adatto per valutare lo sviluppo di uno stato depressivo misurando il tempo di immobilità durante la fase di induzione. Specifici ceppi di topi o topi trattati prima del nuoto possono essere valutati in relazione alla resilienza o alla vulnerabilità allo stress e all'induzione della disperazione comportamentale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in accordo con le linee guida europee (UE 2010/63) e in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), l'ente nazionale per il benessere degli animali GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e sono stati approvati dal comitato per il benessere degli animali dell'Università di Friburgo e dal Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35), nonché le autorità locali. Entrambi i sessi di topi wild-type C57Bl6N di età compresa tra 10 e 14 settimane (70-98 giorni post-natali, PND) sono stati utilizzati per esperimenti wild-type (WT). Come linea resistente allo stress, è stata utilizzata la linea di topo transgenico con una maggiore espressione dei recettori dell'adenosina A1 sotto il promotore caMKII neuronale del proencefalo9,15. Dopo gli esperimenti, i topi sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale.
1. Preparazione
- Ottenere una licenza di ricerca sugli animali, compresa un'accurata pianificazione sperimentale.
- Arrivo: All'arrivo, allevare gli animali nella struttura per animali per eseguire il CDM. Se gli animali vengono acquistati da un fornitore esterno, concedi loro almeno 2 settimane per adattarsi al nuovo ambiente.
- Alloggiamento: Per ospitare gli animali, assicurarsi che le gabbie non siano occupate con il numero massimo di animali per evitare ulteriore stress. Garantire che le condizioni abitative siano in linea con le raccomandazioni internazionali sull'alloggiamento del mouse (per ulteriori informazioni, vedere22) e mantenerle costantemente in ogni momento.
NOTA: Le condizioni abitative standard più importanti includono gabbie ventilate individualmente con 25-120 cambi d'aria all'ora, ciclo luce-buio di 12 ore, temperatura il più stabile possibile (almeno costante tra 20-24 °C), umidità il più stabile possibile (almeno tra il 45% -65%), materiale rosicchiato e riparo presente, nessun alloggiamento individuale. - Punto temporale: esegui tutti gli esperimenti alla stessa ora del giorno.
NOTA: Non è stata effettuata alcuna valutazione diretta per verificare l'influenza del giorno sulla CDM, ma la maggior parte dei test comportamentali che valutano stati depressivi mostrano variazioni a seconda dell'ora del giorno23,24,25, ed è altamente probabile che il giorno influenzi anche il CDM. - Materiale di nidificazione: ridurre al minimo il materiale di nidificazione. Assicurarsi che non ci siano ruote da corsa, ecc., Presenti nella gabbia.
NOTA: l'ambiente arricchito impedisce l'induzione di uno stato depresso. - Composizione del gruppo: consenti agli animali di rimanere nello stesso gruppo durante l'intero esperimento. Raggruppare i topi femmina insieme anche da cucciolate diverse; raggruppare i topi maschi insieme agli animali maschi cucciolati. A causa dell'imminente aggressività, specialmente dei maschi, mordere e barbiere possono diventare un problema, quindi dare particolare enfasi alla composizione del gruppo. Evita l'alloggio singolo poiché la privazione è un importante fattore di stress aggiuntivo.
- Animali: utilizzare diversi ceppi di topo, anche se sono state osservate differenze specifiche9,10. Un ceppo di topo frequentemente utilizzato è C57Bl6N. Etichettare i topi per eseguire analisi statistiche accoppiate (vedere il passaggio 3.2.4).
- Sesso animale: Usa ugualmente topi maschi e femmine.
- Età degli animali: assicurarsi che gli animali abbiano almeno 10 settimane (70 PND). Non utilizzare animali più giovani a causa dell'esaurimento causato dal nuoto.
- Attrezzatura: Utilizzare un cilindro/becher di vetro trasparente con una capacità di almeno 2 L, un diametro di 24-26 cm e un'altezza minima di 30 cm. Ulteriori requisiti includono un termometro per controllare la temperatura dell'acqua, asciugamani di carta, lampada riscaldante a luce rossa / tappetino riscaldante o fonte comparabile di riscaldamento, timer, cronometro, ambiente tranquillo. Videoregistra le sessioni di nuoto per l'analisi e la documentazione offline. Assicurarsi che la data e l'ora siano continuamente visibili sul nastro/file, insieme a un numero di codice di identificazione per il singolo animale. Memorizzare i file per un'analisi successiva e ulteriori riferimenti. Film dal lato del cilindro di vetro, non dall'alto, per facilitare l'analisi.
2. Fase di induzione
- Prima di iniziare
- Osservare visivamente gli animali per anomalie, compresi segni di morso o barbiere. Escludere l'intera gabbia dalla serie sperimentale se un animale mostra lesioni minime. Assicurarsi che un veterinario sia disponibile in qualsiasi momento poiché le lesioni peggioreranno durante l'esperimento e impedirà la continuazione man mano che i topi diventano più aggressivi sotto l'influenza dello stress.
- Ottenere il peso corporeo per ogni animale prima di iniziare l'esperimento. Assicurarsi che la perdita di peso spesso osservata non superi il 20% del peso corporeo iniziale. Escludere gli animali con una perdita di peso superiore al 20% e immediatamente eutanasalizzarli a causa della presunta alta sofferenza.
- Riempire un becher o un cilindro con acqua a temperatura ambiente (22-23 °C) ad un'altezza di almeno 20 cm dal fondo, lasciando un minimo di 10 cm tra la superficie dell'acqua e il bordo superiore della nave.
- Prestazione
- Trasferire delicatamente gli animali nell'acqua. Durante la fase di nuoto, tenere l'animale sotto osservazione continua per evitare l'annegamento. Osserva da una posizione in cui l'animale non può vedere lo sperimentatore (ad esempio, l'osservazione video da una stanza accanto).
- Impostare un cronometro all'inizio dell'esperimento. Porta gli animali fuori dall'acqua dopo 10 minuti semplicemente afferrando le loro code. Asciugarli delicatamente con un tovagliolo di carta e metterli sotto una luce riscaldante o su un tappetino riscaldante.
- Valuta solo un animale alla volta. Assicurarsi che gli animali non possano vedersi (ad esempio, separare la gabbia di alloggiamento dall'allestimento sperimentale da un divisorio).
- Esegui la sessione di nuoto forzato per 10 minuti ogni giorno per 5 giorni consecutivi.
- Finissaggio
- Trasferisci gli animali nelle loro gabbie domestiche dopo cinque sessioni di nuoto e permetti loro di riposare per almeno 2 giorni. Iniziare successivamente interventi di trattamento specifici.
3. Valutazione di un trattamento antidepressivo
- Corso orario
- Valutare i trattamenti acuti e subcronici con il CDM. A seconda della domanda scientifica, adattare il periodo di riposo tra la fase di induzione e la lettura.
- Per valutare la potenza acuta e ad azione rapida della ketamina, scegliere un breve periodo di riposo (alcuni giorni) dopo la fase di induzione della CDM. Applicare il trattamento (ad esempio, iniezione intraperitoneale), quindi eseguire la valutazione (sessione di nuoto aggiuntiva o metodo di valutazione diverso) poco dopo.
- Per valutare gli effetti di un trattamento subcronico, aumentare il periodo di trattamento fino a 4 settimane (non ci sono dati disponibili per periodi di trattamento più lunghi). Ad esempio, somministrare il trattamento orale con imipramina agli animali durante 4 settimane dopo la fase di induzione e valutare successivamente.
- Iniziare a valutare lo stato di depressione subito dopo la fine del periodo di trattamento, ad esempio, il giorno seguente. Scegli sempre un periodo di tempo identico per le condizioni di controllo e sperimentali.
- Tempo di immobilità
- Proof-of-concept
- Per utilizzare il tempo di immobilità come metodo di lettura, valutare ogni giorno della fase di induzione e il giorno del test per fornire una prova di concetto (vedere la Figura 1). Per ulteriori serie sperimentali, ridurre le valutazioni al giorno 1, al giorno 5 e al giorno del test (vedere figura 1C).
- Videoregistra ogni esperimento. Consentire a due osservatori addestrati che sono ciechi alle condizioni sperimentali di eseguire l'analisi in modo indipendente. L'analisi video consente allo sperimentatore di osservare il comportamento da una stanza diversa, riducendo così al minimo l'interferenza con il test (ad esempio, vedere il file video nel materiale supplementare).
- Condizioni: Osservare e identificare le tre diverse condizioni comportamentali durante il test di nuoto: lotta, nuoto e immobilità. La maggior parte dei ricercatori si concentra sull'immobilità; un'ulteriore differenziazione tra lotta e nuoto è raramente utile e aumenta notevolmente la complessità e la durata dell'analisi.
- Lotta: l'animale cerca attivamente di fuggire dalla situazione minacciosa. Ciò comporta la zampa del lato del cilindro con la testa orientata verso il muro e i movimenti di tutti gli arti. La superficie dell'acqua è in genere leggermente turbolenta.
- Nuoto: l'animale muove almeno entrambe le zampe posteriori e percorre una distanza in tutta l'acqua. Cerca attivamente una via d'uscita ma non cerca di superare la parete di vetro della nave. Il nuoto non comporta il sollevamento delle zampe sopra la superficie dell'acqua e il corpo è solitamente orientato parallelamente alle pareti del cilindro. In questa condizione, gli animali spesso si girano o si muovono in cerchio.
- Immobilità: l'animale si mantiene fermo, in una posizione gelida, e non si muove affatto o muove solo la coda, o le zampe anteriori per mantenere la testa sopra la superficie dell'acqua. Nessuna distanza viene percorsa attivamente ad eccezione del galleggiamento passivo e non si osserva alcun movimento diretto delle zampe anteriori.
- Inseguimento
- Eseguire la valutazione utilizzando registrazioni video offline. Utilizza valutazioni in cieco di due esaminatori indipendenti ed esperti e calcola le medie tra le due valutazioni.
- Ripetere le valutazioni se i risultati dei due valutatori differiscono al di sopra di un intervallo determinato in precedenza. Osserva continuamente i topi poiché le diverse condizioni cambiano frequentemente tra lotta, nuoto e immobilità.
- Usa un cronometro per misurare il tempo totale trascorso in una fase focalizzata (di solito immobilità) durante i 10 minuti in cui il mouse rimane in acqua. Si consideri una breve latenza di circa un secondo prima di modificare la misurazione del tempo in corso (ad esempio, se un animale rimane per 20 s in immobilità e si muove solo una volta per meno di un secondo e ritorna all'immobilità per altri 10 s, il tempo di immobilità totale è di 30 s).
- Statistiche: a causa della deviazione standard interindividuale relativamente elevata (probabilmente causata da un trasferimento del comportamento dipendente dalla gerarchia dalla gabbia al test di nuoto), contrassegnare o etichettare gli animali per eseguire test parametrici accoppiati (anziché spaiati) in seguito. Valutare la distribuzione della normalità e, a seconda della domanda specifica, eseguire l'analisi della varianza (ANOVA) con t-test post-hoc o t-test accoppiati per confrontare i diversi gruppi. Eseguire l'analisi utilizzando valori assoluti di tempo di immobilità o come valori normalizzati.
- Valori assoluti: fornire valori medi del tempo di immobilità dal giorno 1 al giorno 5 e per il giorno di prova ± SEM (vedere Figura 1A). Confronta i valori medi per il giorno 1 e il giorno 5, preferibilmente usando un t-test accoppiato per convalidare l'induzione di uno stato depresso. Se c'è una differenza significativa tra il giorno 1 e il giorno 5, confrontare i valori medi del giorno 5 con i risultati medi del giorno del test. Assicurarsi che una dimensione tipica del gruppo in un esperimento sia compresa tra 6 e 10 animali e aspettarsi differenze significative tra i tempi di immobilità basale e post-induzione negli animali selvatici. Confrontare diversi gruppi con un t-test spaiato è difficile se vengono utilizzati valori assoluti a causa delle differenze di base; pertanto, utilizzare valori normalizzati.
- Valori relativi/normalizzati: confrontare i diversi effetti del trattamento mediante normalizzazione con il risultato individuale del giorno 5, quindi esprimere i valori come percentuale del giorno 5 (vedere Figura 1B).
- Esperimenti di controllo
NOTA: Le prestazioni di nuoto potrebbero essere correlate alla locomozione. Le sostanze che causano un'iper-locomozione potrebbero indurre risultati falsi positivi (vale a dire, una diminuzione del tempo di immobilità); così come gli agenti sedativi potrebbero aumentare artificialmente il tempo di immobilità.- Valutare i cambiamenti nella locomozione per sostanze sconosciute prima di eseguire l'analisi del nuoto. Utilizzare Open Field Test (OFT) in un gruppo separato di animali per almeno 10 minuti.
- Scegli lo stesso tempo di osservazione (10 min) nell'OFT come nel CDM per rilevare effetti iper-locomotori non specifici del composto testato che potrebbero influenzare la lettura CDM tramite la misurazione del tempo di immobilità con elevata validità.
- In caso di effetti iper-locomotori significativi, non valutare la sessione di nuoto per valutare la potenza antidepressiva ma utilizzare diversi metodi di lettura (ad esempio, preferenza per il saccarosio, test di sospensione della coda, ecc.).
- Proof-of-concept
4. Valutazione dello sviluppo di uno stato depressivo
- Per valutare lo sviluppo di un disturbo depressivo, valutare ogni giorno della fase di induzione per misurare il tempo di immobilità.
NOTA: In questo caso, un lieve aumento del tempo di immobilità tra un giorno e l'altro descrive la resilienza, mentre un aumento più forte e più precoce rispetto agli animali non trattati o selvatici rappresenta una maggiore vulnerabilità alla disperazione indotta dallo stress. Trattando i topi prima dell'evento di nuoto, l'intervento preventivo o le linee transgeniche di topo potrebbero essere valutate per quanto riguarda lo sviluppo della disperazione comportamentale.
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Representative Results
Nella prima sessione di nuoto della fase di induzione della CDM, i topi di solito mostrano un tempo medio di immobilità tra 190 s e 230 s, che aumenta costantemente con ogni sessione di nuoto aggiuntiva (Figura 1A). Questo aumento è più pronunciato nei primi 3 giorni e raggiunge una fase simile a un plateau negli ultimi 2-3 giorni. Il tempo di immobilità misurato il giorno 5 rimane stabile fino a 4 settimane, indicando una disperazione comportamentale stabile. La potenza antidepressiva di un intervento può essere valutata trattando l'animale tra l'ultimo giorno della fase di induzione e il giorno del test. Si noti che il tempo di punteggio assoluto durante le sessioni di nuoto è abbastanza soggettivo e dipende dallo sperimentatore, dall'età, dal sesso e dalla linea del mouse utilizzata. Tuttavia, la differenza relativa tra le sessioni è abbastanza stabile con solo piccole differenze interterrater.
Nella Figura 1, sono mostrati diversi trattamenti rappresentativi. L'imipramina, la privazione del sonno e la ketamina hanno ridotto significativamente il tempo di immobilità, mentre la privazione del sonno combinata con un sonno di recupero non ha mostrato un cambiamento significativo del fenotipo depressivo. Questi risultati sono concordanti con una potenza antidepressiva dei trattamenti applicati e simili agli effetti osservati nei pazienti umani. Il trattamento prevedeva l'ingestione di imipramina 20 mg/kg/die per 3 settimane tramite acqua potabile, 3 mg/kg di ketamina con una singola iniezione intraperitoneale 24 ore prima del test e privazione del sonno per 6 ore prima del test.
A seconda della domanda di ricerca, possono essere visualizzate varie rappresentazioni. Una rappresentazione di valori assoluti può fornire una reale panoramica dei dati e permette una buona valutazione della fase di induzione e di un singolo trattamento (Figura 1A,D). Tuttavia, le differenze dei vari trattamenti non possono essere confrontate direttamente; quindi ogni gruppo di trattamento ha diversi valori medi di immobilità-tempo il giorno 5. Pertanto, si consiglia di utilizzare la rappresentazione dei valori medi normalizzati in questo caso (Figura 1B). Una rappresentazione ridotta può essere scelta a causa di limiti di spazio (Figura 1C). Si noti che è obbligatorio mostrare almeno i risultati del giorno 1, del giorno 5 e del giorno del test.
Figura 1: Risultati positivi in valori assoluti e normalizzati. (A) Si può osservare un'induzione riuscita di uno stato simile a depresso in 30 topi. Ogni punto rappresenta il tempo di immobilità di un singolo animale in un giorno specifico e le barre rappresentano i valori medi degli animali testati. Il tempo di immobilità è rappresentato per ogni giorno della fase di induzione (dal giorno 1 al giorno 5) e per il giorno di prova (dopo la linea tratteggiata) con o senza trattamento. Si noti che in questo campione, un aumento significativo può essere osservato tra il giorno 1 e il giorno 2. In alcuni casi, i livelli di significatività vengono raggiunti per la prima volta tra il giorno 1 e il giorno 3. Per la continuazione dell'esperimento, è obbligatorio un aumento statisticamente significativo tra il giorno 1 e il giorno 5. Si noti l'effetto soffitto tipico (aumento tra i giorni 1, 2 e 3, rispetto alla differenza tra i giorni 4 e 5). Tra il giorno 5 e i giorni di prova, gli animali sono stati ospitati per 4 settimane nelle loro gabbie domestiche, senza ulteriore trattamento (CDM) o trattati con imipramina (Imip.); privazione del sonno (SD); privazione del sonno e sonno di recupero (RS) e ketamina (Ket). (B) Per ogni giorno viene indicato un tempo esemplare per le prestazioni dei singoli animali. (C) Rappresentazione normalizzata degli stessi risultati già mostrati nella Figura 1A. Il tempo di immobilità di ciascun animale e giorno è stato normalizzato al tempo di immobilità corrispondente il giorno 5 ed espresso in percentuale. I valori post-trattamento di diversi gruppi possono essere visualizzati e confrontati meglio utilizzando questo approccio. (D) Rappresentazione dei valori normalizzati per il giorno 1, il giorno 5 e il giorno del test (CDM). Dopo uno studio proof of concept di successo, i tempi di valutazione possono essere ridotti al primo giorno, al quinto giorno e al giorno del test. Questi punti temporali sono necessari perché è necessario un aumento significativo tra il giorno 1 e il giorno 5 per dimostrare un'induzione di successo e il giorno 5 deve essere confrontato con il giorno del test per fornire una dichiarazione sull'efficacia del trattamento. (E) Confronto del tempo di immobilità di tre diverse linee di topo: Wildtype (WT) mostra un'induzione riuscita; una linea resiliente esemplare (RL) mostra un comportamento simile alla depressione significativamente ridotto nei primi tre giorni e nel giorno del test. ANOVA unidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗/#p < 0,05, ∗∗/##p < 0,01, ∗∗∗/###p < 0,001, ∗∗∗∗/####p < 0,0001. (#indica la differenza ai valori medi del giorno 1, ∗indicare la differenza ai valori medi del giorno 5 nella Figura 1A,C e alla linea del mouse WT nella Figura 1E). I dati sono espressi come mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
In caso di un tempo di immobilità invariato durante tutti i 5 giorni (Figura 2), lo stress applicato non è stato in grado di modificare il comportamento in modo rilevante e non è possibile valutare gli effetti del trattamento; gli animali devono essere sacrificati e non devono essere utilizzati ulteriormente.
Figura 2: Risultati non riusciti. Una rappresentazione di un'induzione inefficace è mostrata nella figura. Si noti che non si verifica alcun aumento significativo del tempo di immobilità tra il giorno 1 e il giorno 5. Pertanto, i criteri per la continuazione dell'esperimento non sono stati raggiunti e nessun ulteriore prolungamento è razionale (in questo caso, sono stati testati solo topi maschi e, dopo un'indagine retrospettiva, è stato riscontrato che non erano compagni di cucciolata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ulteriori metodi di lettura devono essere utilizzati per descrivere una visione più ampia della disperazione comportamentale degli animali. Sono disponibili una varietà di test comportamentali, misurazioni elettrofisiologiche e valutazioni molecolari dei cambiamenti indotti dallo stress. Risultati esemplari per il Tail Suspension Test (TST), con trattamento CDM, imipramina e ketamina, Nose-poke-Sucrose Preference Test (NPSPT) e valutazione del potenziamento a lungo termine utilizzando la tecnica patch-clamp sono riportati nella Figura 3. Questi risultati incoraggiano l'utilizzo della fase di induzione CDM come strumento generale per l'induzione della disperazione comportamentale. Per ulteriori dettagli sulle tecniche utilizzate (TST, NPSPT, LTP-assessment) si veda 9,10,17,20.
Figura 3: Risultati aggiuntivi con mouse CDM. (A) Una rappresentazione esemplare degli effetti del CDM nella prova di sospensione della coda. I topi sono stati sospesi per la coda e il tempo trascorso immobile è stato registrato (per i dettagli metodologici si veda 9). Ogni punto rappresenta il tempo di immobilità di un singolo animale e le barre rappresentano i valori medi degli animali testati. ANOVA unidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗∗∗p < 0,001. I dati sono espressi come mezzi ± SEM. (B) Risultati rappresentativi del test di preferenza del saccarosio recentemente stabilito nei topi CDM. In questo compito, la preferenza per il saccarosio è stata misurata con uno sforzo gradualmente crescente per raggiungere la bottiglia di saccarosio (numero di nosepokes) (per i dettagli metodologici vedi10). Si noti che la preferenza per il saccarosio è diminuita nel CDM e che la differenza tra CDM e topi di controllo aumenta gradualmente con lo sforzo (valori medi di poke al naso ogni giorno indicato come Nspk1-7) che i topi hanno dovuto applicare per bere la soluzione dolce. ANOVA bidirezionale con test post hoc Bonferroni: ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001. I dati sono espressi come mezzi ± SEM. (C) I cambiamenti dipendenti dal CDM nella plasticità sinaptica a lungo termine sono presentati come cambiamenti dei valori medi degli EPSP dopo l'applicazione di un protocollo associativo di induzione LTP in fette di cervello ippocampale di topi WT. I dati sono stati ottenuti mediante stimolazione della sinapsi CA3-CA1 (per i dettagli vedere 17,20). I dati del t-test non accoppiato, ∗∗p < 0,01, sono espressi come mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il modello CDM rappresenta un modello rilevante e consolidato per testare la potenza antidepressiva di nuovi interventi e apre una finestra temporale estesa per esperimenti molecolari o elettrofisiologici per chiarire la fisiopatologia della depressione. Soprattutto se combinato con altri test per valutare uno stato simile alla depressione, il CDM ha un'elevata validità facciale e concettuale. Combina lo stress subcronico e l'impotenza acquisita per l'induzione e produce uno stato depressivo di lunga durata. È insensibile alla singola applicazione di antidepressivi classici ma risponde all'applicazione subcronica e quindi imita la situazione nell'uomo. In una finestra temporale di 4 settimane, molti diversi interventi antidepressivi mostrano efficacia, che vanno da diverse classi di antidepressivi, stimolazione cerebrale non invasiva, privazione del sonno ad antidepressivi ad azione rapida9,10,11. Inoltre, la misurazione del tempo di immobilità durante la fase di induzione potrebbe essere utilizzata come marker di resilienza o vulnerabilità allo stress, in caso di test su animali transgenici o topi trattati prima della fase di induzione. Tutto sommato, il CDM è economico in termini di costi, durata, standardizzazione e riproducibilità tra i laboratori. Anche se le prestazioni sembrano abbastanza semplici – "si fa cadere un mouse in un recipiente d'acqua e lo si tira fuori dopo 10 min" – ci sono diversi punti critici che devono essere tenuti a mente per ottenere risultati ragionevoli e stabili. La maggior parte dei problemi sono dovuti a una precisione insufficiente durante la preparazione o l'analisi.
Un problema comunemente riscontrato è che i topi, in particolare i maschi, non mostrano un aumento significativo del tempo di immobilità nella fase di induzione. In questi casi, i topi potrebbero essere già stati stressati prima dell'inizio dell'induzione; pertanto, lo stress aggiuntivo durante il protocollo di nuoto non causa un aumento rilevante della disperazione. Si noti che il tempo di immobilità sembra avere un effetto massimale poiché l'aumento tra il giorno 1 e il giorno 2 è maggiore rispetto a quello tra il giorno 2 e il giorno 3, rispettivamente. Dopo il giorno 3, di solito, non ci si può aspettare un ulteriore aumento significativo. Le ragioni comuni per l'eccessivo stress basale potrebbero includere il recente trasporto degli animali o la convivenza di animali maschi adolescenti / adulti, una condizione che non si verifica mai in natura. Pertanto, lo sperimentatore dovrebbe essere cauto e assicurarsi sempre che gli animali siano compagni di cucciolata, che abbiano avuto abbastanza tempo per acclimatarsi al nuovo ambiente circostante e che non ci siano segni di morsi o barbieri prima dell'inizio dell'esperimento. Inoltre, gli animali devono essere pesati ogni giorno e la perdita di peso deve essere controllata per non superare il 20% del peso corporeo iniziale. Una maggiore perdita di peso è considerata critica, a causa del fatto che il nuoto ripetitivo è estenuante e gli animali che non sono in grado di mantenere il loro peso corporeo soffrono troppo di questo esaurimento. Un punto critico qui è che gli animali che soffrono troppo di esaurimento probabilmente non sono in grado di nuotare o lottare per 10 minuti durante il test. Quando vengono analizzati i tempi di immobilità di questi animali, tendono a mostrare un risultato falso negativo a causa dell'esaurimento fisico.
Un'altra circostanza problematica che a volte si verifica, specialmente quando sono richiesti periodi di trattamento più lunghi, è una diminuzione spontanea del tempo di immobilità nella valutazione del test. Dopo 4 settimane, il tempo di immobilità di solito diminuisce rispetto alle valutazioni eseguite 2 giorni dopo la fine del periodo di induzione (N.B. questo corrisponde, anche se con una scala temporale diversa, alla situazione nell'uomo in cui gli episodi depressivi sono solitamente autolimitanti). Per ridurre al minimo questa trappola, è necessario garantire che nessun materiale di nidificazione non necessario venga applicato alla gabbia domestica dell'animale, che può essere considerato un efficace intervento antidepressivo (ambiente arricchito). Inoltre, un aumento delle dimensioni del gruppo potrebbe aiutare a ridurre la varianza. Se necessario, è possibile aggiungere un'ulteriore sessione di nuoto come modifica del protocollo standard sopra descritto. Ad esempio, un aumento da cinque a sette sessioni di nuoto in 7 giorni consecutivi potrebbe essere eseguito e dovrebbe comportare uno stato depresso più stabile degli animali. Non è consigliabile aumentare ulteriormente la durata della sessione di nuoto individuale per evitare un eccessivo esaurimento.
Non c'è accordo all'interno della comunità scientifica sul lasso di tempo più sensato da analizzare. Mentre alcuni gruppi considerano tutti i 10 minuti importanti9,10, altri sostengono che il comportamento entro i primi minuti rappresenta una situazione di stress acuto e analizzano solo gli ultimi 4 minuti o 6 minuti 18. Quest'ultima ipotesi deriva principalmente dalla pratica comune nel processo di valutazione dell'FST classica. Mancano prove sperimentali che affrontino la questione del lasso di tempo più razionale da analizzare in CDM. Varie pubblicazioni di alto livello hanno utilizzato l'analisi di tutti i 10 minuti in CDM9,10.
Nonostante il numero crescente di software disponibili in commercio per l'analisi video automatizzata, nessuna configurazione ha dimostrato una precisione sufficiente per sostituire un osservatore addestrato. La maggior parte dei software si basa sul monitoraggio della locomozione dei topi nell'acqua e richiede una posizione della telecamera dall'alto. Le valutazioni da parte di esseri umani esperti hanno il vantaggio che non solo la locomozione, ma anche l'intenzione presunta di movimenti più complessi possono essere valutati, compresa l'intensità dei movimenti delle zampe. Ad esempio, i topi si muovono spesso girando intorno al loro corpo o con sottili movimenti della coda per mantenere la testa sopra l'acqua, che il software di solito traccia come nuoto. Un altro esempio è il movimento diretto verso la parete di vetro della nave, compreso il naso frequente colpito da una breve distanza. Nonostante la chiara intenzione di sfuggire ai movimenti verticali, il software tiene spesso traccia dell'immobilità dovuta alla scarsa locomozione. Tuttavia, valutazioni accurate e affidabili rimangono difficili e richiedono molto tempo. Si raccomanda di addestrare un valutatore da uno sperimentatore esperto e preparare valutazioni congiunte di video campione da parte dei due valutatori indipendenti per discutere definizioni e ambiguità comuni. Inoltre, i primi risultati di un laboratorio con il CDM dovrebbero essere confrontati con i risultati precedentemente pubblicati da altri gruppi.
I ricercatori che utilizzano il CDM potrebbero spesso sperimentare l'idea che una maggiore immobilità sia una reazione appresa piuttosto intelligente e a risparmio energetico dei topi a una situazione stressante inevitabile ma temporanea. A nostro parere, questo sopravvaluta la flessibilità cognitiva dei topi; tuttavia, sottolinea la necessità di ulteriori valutazioni di uno stato depresso indipendentemente dal tempo di immobilità. Si può inoltre sostenere che altri modelli animali ben consolidati di depressione come il test di stress lieve cronico, producono risultati simili; e che uno stato depresso o forti fattori di stress impediscono, non aumentano l'apprendimento sia nell'uomo che negli animali17,20,26,27,28,29,30.
Il carico degli animali è solitamente valutato come alto o estremo nelle applicazioni di ricerca sugli animali. Le serie sperimentali dovrebbero essere accuratamente pianificate per ridurre al minimo il numero di animali e gli animali dovrebbero essere trattati con cura e rispetto prima e dopo le sessioni di nuoto. Tuttavia, in alcuni paesi, potrebbe non essere possibile ottenere una licenza di ricerca animale per il CDM. Il CDM consente la valutazione dell'efficacia antidepressiva di una vasta gamma di interventi e l'induzione di uno stato depresso relativamente stabile. L'eterogeneità e la complessità del disturbo depressivo maggiore nell'uomo non possono essere replicate in nessun modello animale. La maggior parte dei modelli animali di depressione si basano sull'esperienza indotta dallo stress / simile a un trauma nei topi, che non è necessariamente il caso negli esseri umani, dove anche la privazione infantile, la complessa storia di apprendimento e / o i fattori di rischio socioculturale sembrano essere importanti. I modelli murini di depressione dovrebbero quindi essere riconosciuti per quello che sono: un modello semplificato per un disturbo altamente complesso. Tuttavia, se eseguito in modo adeguato e se vengono utilizzati più metodi di lettura, il CDM è uno strumento adatto nella ricerca di nuove intuizioni e obiettivi nella ricerca sulla depressione.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da fondi interni della Clinica Universitaria di Friburgo, dal Dipartimento di Psichiatria e Psicoterapia e dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici (a SV). TS è finanziato dalle sovvenzioni della Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450) e dell'Istituto di Studi Avanzati dell'Università di Strasburgo (USIAS) (2020-035), nonché dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Francia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
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