Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Hanteringstekniker för att minska stress hos möss

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Detta dokument beskriver en hanteringsteknik hos möss, 3D-hanteringstekniken, som underlättar rutinhantering genom att minska ångestliknande beteenden och presenterar detaljer om två befintliga relaterade tekniker (tunnel- och svanshantering).

Abstract

Laboratoriedjur utsätts för flera manipuleringar av forskare eller djurvårdsleverantörer. Den stress som detta orsakar kan ha djupgående effekter på djurens välbefinnande och kan också vara en förvirrande faktor för experimentella variabler som ångeståtgärder. Under årens lopp har hanteringstekniker som minimerar hanteringsrelaterad stress utvecklats med särskilt fokus på råttor och liten uppmärksamhet på möss. Det har dock visat sig att möss kan vana vid manipuleringar med hjälp av hanteringstekniker. Att vanställa möss i hanteringen minskar stress, underlättar rutinhantering, förbättrar djurens välbefinnande, minskar datavariationen och förbättrar experimentell tillförlitlighet. Trots positiva effekter av hantering används svans-pick-up-metoden, som är särskilt stressande, fortfarande i stor utsträckning. Detta dokument ger en detaljerad beskrivning och demonstration av en nyutvecklad mushanteringsteknik avsedd att minimera den stress som djuret upplev under mänsklig interaktion. Denna manuella teknik utförs under 3 dagar (3D-hanteringsteknik) och fokuserar på djurets förmåga att vana vid experimenteraren. Denna studie visar också effekten av tidigare etablerade tunnelhanteringstekniker (med hjälp av en polykarbonattunnel) och tail-pick-up-tekniken. Specifikt studerade är deras effekter på ångestliknande beteenden, med hjälp av beteendetester (Elevated-Plus Maze och Novelty Suppressed Feeding), frivillig interaktion med experimenterare och fysiologisk mätning (kortikosteronnivåer). 3D-hanteringstekniken och tunnelhanteringstekniken minskade ångestliknande fenotyper. I det första experimentet, med hjälp av 6 månader gamla hanmöss, förbättrade 3D-hanteringstekniken experimentinteraktion avsevärt. I det andra experimentet, med 2,5 månader gammal kvinna, minskade det kortikosteronnivåerna. 3D-hanteringen är därför en användbar metod i scenarier där interaktion med experimenteraren krävs eller föredras, eller där tunnelhantering kanske inte är möjlig under experimentet.

Introduction

Möss och råttor är väsentliga tillgångar för prekliniska studier1,2 för flera ändamål, inklusive endokriska, fysiologiska, farmakologiska eller beteendemässiga studier2. Från det ökande antalet studier som involverar djur uppstod det att okontrollerade miljövariabler inklusive mänsklig interaktion påverkar olika resultat i biomedicinsk forskning3,4,5. Detta är ansvarigt för betydande variationer som observerats i experiment och forskningslaboratorier4,5, vilket utgör en stor varning inom djurforskning.

Olika tillvägagångssätt har implementerats med målet att begränsa miljöpåverkan och minska reaktiviteten mot mänsklig interaktion. För att begränsa miljöpåverkan, standardisering av bostadsförhållanden och automatiserade bostadssystem6har7 till exempel implementerats i laboratorier. När det gäller interaktion med människor hade vanliga metoder för hantering och transport av djur liten hänsyn till obehag och stress hos djur. Till exempel, att plocka upp djur i svansen eller använda tång8 ökar baslinjeångest9,10,11, minskarutforskningen 9,12 och bidrar kraftigt till inter-individuell variabilitet inom och över studier13,14. Som ett resultat utvecklades andra tillvägagångssätt, såsom kopphanteringstekniken, som är tillämplig på möss och råttor. I detta tillvägagångssätt "kupas" djuren ut ur sin bur och hålls av experimenterarna med händerna som bildar en kopp9,10,11. Ett annat användbart alternativ till svanshantering innebär användning av en polykarbonattunnel för att överföra möss9,10,15. Den här metoden eliminerar direkt interaktion mellan musen och experimenteraren. Både kopp- och tunnelmetoderna visade effektivitet för att minska ångestliknande beteenden och rädsla för experimenteraren som kan överdrivas av aversiva hanteringstekniker, såsom svanshämtning / svanshantering9,10.

Därför visar ökande bevis nyttan av korrekt mushantering för att minska variabiliteten mellan individer9,11, och förbättra djurens välbefinnande10. De tekniker som nämns ovan står dock fortfarande inför begränsningar. Cuphanteringstekniken har implementerats med scheman från 10 dagar (10 sessioner under 2 veckor16) upp till 15 veckor17, vilket är en betydande tid för anläggningspersonal och experimenterare. Dessutom varierar effektiviteten av kopphantering genom belastning9 och konventionell kopphantering i öppna händer kan leda till naiva möss eller särskilt hoppiga stammar att hoppa från handen9,18. Tunnelhantering resulterar i mer konsekventa och generellt snabbare resultat i gentling19. Tunnlar används också som hemburberikning. De hjälper djur att hantera snabbt och ger de extra fördelarna med berikning. Tunnelhantering har dock begränsningar vid överföring av djur mellan apparater. Intressant nog visade Hurst och West9, och Henderson et al.20 att användning av mild och kort manuell hantering för att överföra djur från tunneln till apparaten inte påverkar deras fenotyp.

För att ge ett alternativ till befintliga metoder, med uppnåelig tillvänjning på kort tid, beskriver denna artikel en ny teknik som expanderar på kopphanteringstekniken, vilket därför inte kräver någon särskild utrustning. Detta tillvägagångssätt använder milstolpar för att mäta nivån på komfortmössen har med hanteringsprocessen. Det visar effekt vid minskad musreaktivitet och stress (på beteendemässiga och hormonella nivåer), underlättar rutinmässig hantering och bidrar till att minska variationen mellan djur. Detaljer om denna teknik tillhandahålls här, och dess effektivitet vid minskning av ångestliknande beteenden, förbättra interaktionen med experimenterare och begränsa perifert stresshormon (kortikosteron) frisättning visas i två separata studier (manliga och kvinnliga möss), i jämförelse med tunnelhantering (positiv kontroll) och svanshanteringstekniker (negativ kontroll).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Förfaranden som involverar djurförsök godkändes av CAMH:s djurskyddskommitté och genomfördes i enlighet med kanadensiska rådet för djurvårdsriktlinjer.

OBS: Den hanteringsmetod som beskrivs häri kan användas i olika musstammar, inklusive icke-transgena (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) och transgena linjer. Det kan också användas med unga eller gamla möss och noterade att unga vuxna (4-6 veckor gamla) möss tenderar att vara något mer aktiva än vuxna eller gamla möss, särskilt dag 1.

1. Experimentell förberedelse

  1. Innan studien inleds, enligt RIKTLINJERNA21,tilldela slumpmässigt möss till varje hanteringsgrupp (3D-hantering, tunnelhantering eller svanshantering).
  2. Identifiera rummet för att utföra hanteringen. Det kan utföras i bostadsrummet eller i ett separat rum. Om hanteringen utförs i ett separat rum, vilket kräver att djuren flyttas på en flyttvagn, låt djuren vana vid det nya rummet i 20-30 minuter innan hanteringsprotokollet inleds.
  3. För grupphusdjur, använd en tillfällig bur för att hysa möss efter hanteringen, innan du omgrupperar dem alla i deras första hembur. Detta minskar potentiella slagsmål mellan djur före hantering (särskilt hos män).
  4. Arbeta på en räknare (helst en rensad bänkskiva) eller i ett biosäkerhetsskåp, med inhysarburen borta från djuret som hanteras. Närheten till husburen ökar risken för hoppning. Om djur är gruppboende kan mushoppning som hanteras i hemburen orsaka stress för burkamrater.
    OBS: Att arbeta i ett biosäkerhetsskåp begränsar risken för att möss hoppar på golvet och kan krävas i vissa anläggningar. Denna teknik kan användas i ett biosäkerhetsskåp, se till att alltid utföra alla steg inuti biosäkerhetsskåpet och undvika möss som går på hanterarens underarmar.

2. DAG 1: 5 min per mus

  1. Öppna försiktigt buret och placera locket på sidan, ta bort kapslingsmaterial och annan berikning som löphjul eller skydd.
  2. För in en handske öppen hand i hemburen och placera långsamt handen längs ena sidan av burväggen (väggen närmast hanteraren, figur 1A).
    1. Försök inte omedelbart plocka upp musen.
  3. Förbli orörlig och låt djuret vana vid närvaron av handen i buret i ca 30 s.
  4. Försök att plocka upp musen i handflatan (dvs. undvik att plocka upp djuret med svansen).
    1. Om musen inte lätt plockas upp efter 3 försök, styr musen till ett hörn och kopp med båda händerna.
    2. Flytta försiktigt de kupade händerna mot musen för att försöka plocka upp den.
    3. Om det misslyckas efter högst 3 försök med båda händerna, plocka upp musen försiktigt vid svansens botten och överför den till underarmen eller den platta handen.
  5. Håll handen så platt och öppen som möjligt med musen i handen.
    OBS: Detta ger en platt plattform för musen att kliva på och begränsar risken för bett.
  6. Håll handen öppen och platt med handflatan uppåt, placera den andra handen intill handen som håller musen och låt musen röra sig fritt från hand till hand utan fasthållning (figur 1B).
  7. Låt musen utforska och flytta mellan händer i 1 minut.
    1. Vid denna tidpunkt kan möss försöka hoppa bort. Placera händerna så att om musen hoppar, kommer den att landa på en bänkskiva snarare än golvet.
    2. Om en mus ser ut som om den förbereder sig för att hoppa (rör sig mot handens kant och uppfödning på bakben), placera långsamt den andra handen framför den och försök att styra den till att gå på denna hand. Undvik plötsliga rörelser eftersom det ökar risken för hoppning.
    3. Om en mus hoppar försöker du plocka upp den för att undvika svanshantering och återuppta hanteringssessionen. Om musen stannar på golvet eller ur händerna i mer än 10 s, lägg till ytterligare tid till hanteringssessionen för att göra upp för varje gång musen var ur händerna.
    4. Anteckna hoppet. Totalt antal hopp kan användas för att bedöma potentiell variabilitet mellan djur.
  8. Efter 1 min hantering med platta händer, slappna av i handflatan och kupa musen något i handen innan du försiktigt rullar musen mellan händerna(bild 1C).
    1. För att "rulla", placera musen i handflatan, på en platt hand, vinkelrät mot fingrarna.
    2. Stäng långsamt handen och placera fingrarna på baksidan av musen.
    3. Placera den fria handen direkt under handen som håller musen.
    4. Vrid långsamt/rotera handen med musen för att försiktigt överföra musen till den andra handen (180° flip).
    5. Upprepa detta fram och tillbaka mellan händerna.
  9. Växla från skonsam rullning mellan händer och fri utforskning på öppna händer i 60-talet, alternerande mellan tekniker ungefär var 20: e s.
  10. Utför ett "skyddstest" (figur 1D).
    1. Låt musen röra sig till kanten av handen och för sedan ihop de 2 händerna.
    2. Mycket långsamt, kupa dem så att musen passar inuti ett "skydd" som bildas av händerna. Lämna en öppning så att musen kan fly om det behövs.
    3. Sikta på att hålla musen i skyddet i 5-10 s, utan återhållsamhet.
    4. Växla mellan skyddstestet, rulla mellan händer och fri utforskning av öppna händer i ytterligare 60 s, var noga med att utföra skyddssteget 3 eller fler gånger.
  11. I alla procedurer som beskrivs i 2.10, skynda inte processen. Om musen verkar stressad (dvs. trevande att fly, hoppar från händerna, undviker kontakt med händer etc.) genom att vara instängd i händerna, fortsätta med att rulla mellan händerna och fri utforskning i 20 s och sedan försöka igen.
  12. Milstolpe: Utför minst 1 lyckat skyddstest på 10 s för slutförande av dag 1.
    1. Betrakta ett skyddstest som framgångsrikt när musen stannar i händerna. Om musen sticker ut huvudet och återvänder till skyddsrummet är det fortfarande ett framgångsrikt test. Om djuret helt lämnar skyddet är det ett misslyckande.
  13. Tillåt fri utforskning i händerna i 30 s.
  14. Byt försiktigt ut musen i buret. Om gruppen är inhyst, placera musen i den tillfälliga buren tills alla burkamrater hanteras. Sätt tillbaka mössen i sin ursprungliga bur genom att plocka upp dem i handflatan. Använd inte en svans plocka upp.
  15. Rengör bänkskivan på potentiell avföring och urin med 70% etanol.
  16. Skölj handskarna noggrant med 70% etanol (eller lämplig rengöringslösning) eller byt handskar innan du hanterar nästa mus (det är möjligt att behålla samma handskar för burkamrater).
    OBS: Det rekommenderas att utföra hanteringen med ett rimligt antal djur för att undvika trötthet från hanteraren. Hantering av 24 möss tar cirka 2 timmar och det rekommenderas att inte överstiga 24 möss per hanterare. Om fler djur behöver hanteras rekommenderas att antingen ha flera hanterare eller dela upp hanteringsförfarandena i undergrupper under flera dagar.

3. DAG 2: 3 till 5 min per mus

  1. Försök att plocka upp musen i handflatan. I detta skede bör det redan vara genomförbart och möss bör inte hoppa ur handen.
  2. Börja med handflatan öppen som på dag 1, så att musen kan utforska fritt i 20-talet.
  3. Rulla sedan musen mellan händerna några gånger (4-5 gånger).
  4. Utför "skyddstestet" i 5 s.
  5. Upprepa skyddstestet flera gånger (~5-6) under en period på 2 till 3 minuter.
  6. Under samma 2 till 3 min period, alternera med rullen mellan händer och fri utforskning av öppna händer steg från dag 1 för att förbättra tillvänjningen.
    1. Rör musen på huvudet och ryggen (Bild 1E), 5-6 gånger. Ett tecken på tillvänjning är när musen låter dig röra den utan att försöka fly.
    2. Utför en "Nose poke": Försök att röra vid nosen på musen, 2 till 3 gånger (Bild 1F).
      1. Om musen försöker bita eller visar uppenbara tecken på stress vid beröring, försök inte omedelbart näsan att peta igen. Växla istället med platt handutforskning och rulla. "Habituation" återspeglas av att djuret inte springer iväg eller vrider huvudet vid mänsklig kontakt.
  7. I alla procedurer som beskrivs i 3,4-3,6, skynda inte processen. Om musen verkar stressad genom att vara instängd i händerna eller inte vill röras, fortsätt med att rulla mellan händerna i 20-30 s och försök sedan igen.
  8. Milstolpar: Utför minst 1 lyckad nospuff för 2-3 s för slutförandet av dag 2.
  9. Stoppa denna session efter ca 3 minuters hantering om djuret reagerar bra på "skydd", "huvudknackning", "näspnad", och om musen verkar vara villig att utforska händerna utan tecken på stress.
  10. Om musen fortsätter att uppvisa tecken på stress eller inte reagerar bra på "skyddstestet" eller "nosen poke" -testet, fortsätt sessionen tills den når 5 minuter som i dag 1.
  11. Byt ut musen i buret, rengör bänkskivan och handskarna som i dag 1.

4. DAG 3: Cirka 3 min per mus

  1. På den tredje dagen, fortsätt genom samma steg som i dag 2, i 2 till 3 minuter.
    1. Plocka upp musen i handflatan.
    2. Överför och rulla musen mellan händerna
    3. Utför ett skyddstest.
    4. Försök att klappa musen på baksidan och huvudet.
  2. Växla mellan dessa steg under cirka 1 till 2 minuter.
  3. Fortsätt proceduren tills musen är tillräckligt avslappnad för att sitta i handflatan utan att försöka fly.
  4. Före slutet av dag 3, upprepa skyddstestet och näspnadstestet som ett test av tillvänjning.
    1. Om båda testerna kan slutföras vid deras första försök är habituationsprocessen klar. Fortsätt försiktigt hantera musen i 30 s till en minut.
    2. Om musen inledningsvis är resistent mot något av testerna, upprepa steg 4.1-4.3 för 20-30 s innan du tar på näsan igen.
    3. Om musen förblir resistent mot dessa tester efter 3 min kan den tredje dagen upprepas.
  5. Milstolpar: Utför minst 2 lyckade skyddstester på 10 s vardera och 2 framgångsrika nospufftest för slutförande av dag 3 och slutförande av hela 3D-hanteringsproceduren.
  6. Sätt tillbaka musen i buret, rengör bänkskivan och handskarna.

5. Frivillig metod för djur som ska utsättas för fasthållning för injektion eller sondmatning

OBS: På dag 3, om djuret kommer att hållas fast för experimentella ändamål (oral sondmatning, intraperitoneal injektion etc.), kan mössen utsättas för nacknypningstestet.

  1. Greppa nackens nacke mellan tummen och pekfingret (Bild 1G).
  2. Lyft musen 3-5 cm över handen i 2-3 s.
    OBS: Detta är normalt en icke-naturlig position för vuxna möss, och om mössen förblir nära orörliga är de väl vana vid hantering och kommer att vara lätta att hålla fast för experimentella ändamål.
  3. Placera musen i den platta handen igen, eller om musen reagerar på nacknypan, överväg att placera den på experimenterarens ärm, burlock eller bänkskiva
    OBS: Om du arbetar i ett biosäkerhetsskåp ska du inte placera musen på hylsan eller gå upp och ut ur biosäkerhetsskåpet. Föredrar att placera musen på bänkskivan inuti biosäkerhetsskåpet.
  4. Lämna musen för att fritt utforska experimenterarens hand i 1 minut.

6. Valfritt tillvägagångssätt för ytterligare hanteringsdagar

  1. I händelse av en mycket stressad muslinje, lägg till ytterligare dagar för att minska djurens reaktivitet och stressnivå, med hjälp av de metoder som beskrivs i dag 2/3.
    OBS: Många faktorer kan påverka djurens baslinjestress inklusive stam, förekomst av transgen modifiering, ålder, kön och boendeförhållanden. Om dessa faktorer inte är förenliga mellan grupper som äldre djur som testas mot unga kontroller eller transgena djur som testas mot vilt typkontroller, rekommenderas att samma antal dagar av tillvänjning används för varje grupp.

7. Tunnelhantering

OBS: Denna teknik är endast tillämplig på de tunnel-hanterade mössen. Tunnlar är polykarbonatrör som är cirka 13 cm långa och 5 cm i diameter.

  1. Placera tunneln i musens bur.
  2. Lämna tunneln i buret i 7 dagar före hantering.
  3. Öppna buret och placera locket på sidan.
  4. Led försiktigt in musen i polykarbonattunneln (redan i buret).
  5. Lyft tunneln från buret, horisontellt. Täck vid behov löst över tunnelns ändar för att förhindra att djuret hoppar/faller ut ur tunneln, potentiellt faller tillbaka i sin bur eller på golvet.
  6. Flytta djuret i tunneln bort från hemburen och håll den borta från alla ytor i 30 s.
  7. Placera tunneln tillbaka i hemburen, så att musen kan lämna röret.
  8. Vänta i 60 s och upprepa sedan steg 7.4-7.7 en gång.
  9. Skölj handskarna noggrant med 70% etanol eller byt handskar innan du vaner nästa mus.
  10. Upprepa proceduren i tio dagar i följd.

8. Hantering av svansar

OBS: Denna teknik är endast tillämplig på tail-hanterade möss. Det används för att överföra möss från sin bur till en apparat och vice versa.

  1. Öppna buret och placera locket på sidan.
  2. Ta tag i mössen vid svansens botten mellan tummen och pekfingret.
  3. Lyft musen från buret.
  4. I 2-3 s, överför musen till experimenterarens motsatta underarm samtidigt som du behåller ett grepp på svansen för att undvika att musen dinglar.
  5. När svanshantering krävs vid genomförandet av detta experiment (t.ex. innan bloddragningar för kortisoltestning) överförs djur till försöksläkarens underarm genom svanshantering och hålls i 15 s innan de returneras till sin bur.

9. Förhöjd pluslabyrint

  1. Rumsinställning
    1. Placera labyrinten mitt i rummet, under en digitalkamera utrustad med ett minneskort.
    2. Sätt upp rummets ljus på ~60 Lux med 2 stående lampor placerade bakom labyrinten.
    3. Stäng av eventuell överliggande belysning för att undvika direkt ljus på labyrinten som skapar reflektion och stör upptäckten av djuren i labyrinten.
    4. När all utrustning är inställd, överför djuren till rummet och låt dem acklimatisera sig till ljusinställningarna och den nya miljön i 30 minuter.
  2. Provning
    1. Rengör labyrinten med 70% etanol för att förhindra lukter från damm eller från djuret som testades tidigare.
    2. Starta kameran.
    3. Använd ett papper med djur-ID för att spela in ID: t på videon, innan du placerar djuret i labyrinten (detta underlättar korrekt identifiering av vilken mus som filmas på varje video).
    4. Använd lämplig hanteringsteknik till varje djur för att överföra den till labyrinten.
    5. Placera musen på den centrala plattformen, vänd mot en öppen arm.
    6. Låt musen utforska apparaten i 10 minuter, ostört.
    7. Efter 10 minuter, stoppa kameran.
    8. Hämta musen från labyrinten och sätt tillbaka den i buren.
    9. Rengör avföring och urin från labyrinten med 70% etanol.
    10. När testningen är klar med alla möss överför du videor från minneskortet till en dator för videospårning.
    11. Använd automatiserad programvara för djurspårning, spåra antalet poster till de öppna och slutna armarna och den tid som tillbringas i öppna eller slutna armar (här Ethovision XT 14).

10. Experimentinteraktion (härledd från Hurst och West9)

  1. Rumsinställning
    1. Placera ett bord mitt i testrummet under en digitalkamera utrustad med ett minneskort.
    2. Sätt upp lampan på 50-70 Lux med 4 glödlampor placerade i hörnet av rummet som vetter mot taket. Stäng av överliggande belysning för att undvika direkt ljus på labyrinten som skapar reflektion och stör upptäckten av djuren i arenan.
    3. Ta med djuren till rummet.
    4. Låt dem acklimatisera sig till rummet i 30 minuter.
  2. Experiment
    1. Placera hemburen under digitalkameran.
    2. Ta bort locket.
    3. Ta bort bomaterial och annan berikning som kan störa spårningen av djur.
    4. Starta kameran.
    5. Använd burkortet med djur-ID för att identifiera djuret på videon.
    6. Placera en hand i hemmaburen längs burväggen längst fram till höger.
      1. Se till att hanterarens huvud inte blockerar kameran för att filma musen.
    7. Starta en timer.
    8. Håll handen orörlig i 2 minuter och låt musen utforska handen.
    9. Ta bort handen från buret i 15 s.
    10. Försök att plocka upp musen med kupade händer och registrera om musen flyr.
    11. Upprepa det sista steget upp till fem gånger, var 5:e sekund eller tills musen tillåter sig att plockas upp.
    12. Registrera antalet försök som krävs för att plocka upp musen.
    13. Returnera kapslingsmaterial och berikning till buret.
    14. Rengör handskarna med 70% etanol eller byt handskar innan du fortsätter till nästa djur.
    15. När du har testat överför du videor från minneskortet till en dator.
    16. Använd automatiserad videospårningsprogramvara, dela upp buren i fyra lika kvadranter och spela in den tid som musen tillskräktar i varje kvadrant (här, Ethovision XT 14).

11. Nyhet undertryckt utfodring

  1. Livsmedelsbrist
    1. 3 dagar före testet, utför en fullständig burbyte och ett enda hus djuren (enkelhus är att föredra för att utföra hemburstestning).
      OBS: Om du ger färska sängkläder avlägsnas potentiellt damm eller små bitar av mat som ackumulerats i sängkläderna sedan förra burbytet.
    2. Dagen före testningen, väg alla djur runt 18:00.
    3. Ta bort all mat från matbehållaren och se till att det inte finns några bitar mat i buret eller i sängkläderna.
  2. Rumsinställning
    1. Placera NSF-kammaren på ett bord.
    2. Fyll kammaren med ett tunt lager majssängkläder (eller andra sängkläder som skiljer sig från sängkläder som används i djur hembur).
    3. Sätt upp lampan på 70 Lux med 4 glödlampor placerade i hörnet av bordet där kammaren står, vänd mot taket. Släck överliggande lampor för att bibehålla låg rumsbelysning.
    4. Placera en pellet av standard chow som används i anläggningen, på sidan av kammaren som vetter mot experimenteraren (≈10 cm från väggen).
  3. Provning
    1. På morgonen efter matbrist, ta djuren till rummet 30 minuter före testningen för att låta dem acklimatisera sig till ljusinställningarna och den nya miljön.
    2. Väg alla djur för att mäta deras viktminskning baserat på den vikt som mättes föregående dag. Djur bör förlora 8-12% över natten för att kunna utföra uppgiften ordentligt.
    3. Sortera djuren per viktminskning och screena dem från musen som förlorade mest till musen som förlorade minst vikt.
    4. Se till att kammaren är fylld med sängkläder och med en enda pellet.
    5. Placera djuret på motsatt sida av kammaren, bort från matpelleten.
    6. Starta timern omedelbart.
    7. Låt musen utforska kammaren i upp till 12 minuter.
    8. Mät latensen för att närma dig och mata (djuret måste bita och äta) på matpelleten.
      1. Betrakta det som ett tillvägagångssätt när djuret kommer nära pelleten, luktar det och biter inte.
      2. Definiera en bit som när djuret börjar konsumera pelleten.
    9. Registrera latensen för att närma dig och mata på pelleten på några sekunder.
    10. När musen har matat på matpelleten, ta bort musen från kammaren.
    11. Kassera sängkläderna men spara pelleten som kommer att användas för att testa aptitdrift i musens hembur.
    12. Återställ kammaren för nästa djur och fortsätt med nästa djur.
    13. 15 min efter avslutad provning i kammaren, släpp pelleten som används under testet, inuti musens hembur, mot väggen på burens framsida.
    14. Mät latensen för att mata på pelleten när pelleten är i hemburen. Detta är ett mått på aptitdrift.
      1. Det är att föredra att ta bort bomaterialet för att säkerställa att musen ser pelleten tappas i sin bur.

12. Serumsamling och kortikosteronmätning

  1. Hantera djur i 1 min med den tilldelade tekniken, 15 minuter före blodsamling (detta kan göras med grupp inhyst eller enstaka inhyst djur, med tanke på risken för slagsmål vid omgruppering av möss).
    1. För tunneln hanterade möss, styr dem till tunneln, lyft tunneln från buret i 1 min och byt ut musen i buret.
    2. För svans hanterade möss, ta tag i musens svansbas och ta bort musen från buret. Överför musen till experimenterarhylsan i 1 min och sätt tillbaka musen i buret genom svanshantering.
    3. För 3D-hanterade möss, använd kupade händer för att ta bort musen från buret. Håll musen i kupade händer i 1 minut och sätt tillbaka den i buren.
  2. 15 min efter hantering, fortsätt med blodinsamling från submandibularvenen 22.
  3. Klottra fast musen så att musens huvud är ordentligt immobiliserat.
  4. Leta reda på platsen för punktering.
    1. Det finns en liten hårlös dimple längs mandible av ansiktet som kan användas som ett landmärke för att hitta punkteringsplatsen. Att dra en linje mellan käkens botten och detta dimple punkteringsställe ligger bakom denna dimple mot örat med ungefär 5 mm, precis bakom käkens gångjärn.
  5. Håll en ren 23 G nål vinkelrätt mot punkteringsstället och använd en snabb fast lancing rörelse. Nålens spets ska tränga in i ett djup mellan 1-2 mm, blodet kommer att flöda omedelbart så snart venen punkteras.
  6. Samla ~150 μL blod i EDTA-belagda uppsamlingsrör och förvara på is.
  7. Applicera lätt tryck med en steril gasväv på punkteringsstället i 5 s eller mer för att låta blodet koagera.
  8. När blodet har koagulerat, sätt tillbaka musen i hemburen.
  9. Centrifugblod vid 4 °C 3 500 x g i 10 min.
  10. Dekanta supernaten.
  11. Förvara supernaten vid -20 °C för nedströmsanalyser.
  12. Mät kortikosteronnivåerna med ett kortikosteron ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll.
  13. Använd en spektrofotometer för att läsa ELISA-resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två separata studier utfördes med C57BL/6 möss. Studie #1 inkluderade 6 månader gamla män och studie #2 inkluderade 2,5 månader gamla honor (N=36/studie) från Jackson Laboratories (Cat #000664). Möss anlände till anläggningen vid 2 års ålder. Medan studie #2 kvinnor hanterades och testades två veckor efter ankomsten, hanterades och testades studie #1-män endast vid 6 månaders ålder (försening på grund av global pandeminedstängning). Under denna tid dog en mus från studie #2, innan man började hantera experiment. Studien visade #1 hanmöss vårdades av djuranläggningens personal. Alla möss bibehölls på en 12 timmars ljus / mörk cykel (7:00 ON, 19:00 OFF), ges tillgång till mat och vatten ad libitum. Deras hembur fylldes med återvunnen tidning som strömaterial, liksom bomaterial. Möss inhysdes individuellt, för att begränsa potentiellt agonistiskt beteende hos gruppboende män under hanteringssessionen eller efter procedurer som blodinsamling eller beteendetestning. Möss randomiserades till tre grupper: svanshantering, tunnelhantering och 3D-hanteringoch hanterades i det öppna rummet enligt utformningen av deras respektive grupp (figur 2). Tunnelhanteringsgruppen fick tunneln som anrikning i 1 vecka före hanteringssessionen. De hanterades sedan i tio (10) på varandra följande dagar, före beteendetestning. En vecka efter slutförandet av de olika hanteringssessionerna påbörjades beteendetestning. Dag 16 testades möss i EPM och sedan i experimentinteraktionstestet. Två dagar senare testades möss i NSF. Slutligen, på dag 24, drogs blod 15 min efter en minuts hantering av samma typ som den första hanteringen.

För beteendetestning överfördes tunnel-hanterade djur från sin bur till apparaten med hjälp av tunneln så mycket som möjligt. Men för Elevated-Plus Maze-experimentet gjorde labyrintens dimensioner det svårt att ta bort eller placera djur i labyrinten med hjälp av tunneln. I det här fallet överfördes djur från tunnlar till kupade händer och transporterades till labyrinten. Möss som hanterades av 3D hanterades under de tre dagarna, samtidigt som dag 8-10 av tunnelhantering (figur 2). Svans hanterade möss var inte vana vid hantering men var svans hanteras under interaktioner med experimenterare. Under studietiden utfördes burbyte av experimenteraren för att säkerställa användningen av lämplig hanteringsteknik som används för varje grupp.

I experimentförsöksinteraktionstestet testades djuren för sin vilja att frivilligt interagera med försökspersonen och hur lätt det är att hantera i ett experimentellt sammanhang (figur 3). ANOVA utförde på antalet försök att plocka upp musen från buret visade en betydande effekt av hanteringsmetoden i studie #1 män (F(2,31)=6, 36, p=0, 004) och i studie #2 honor (F(2,33)=12,21, p=0,0001). Scheffes post hoc-analyser visade att antalet försök att plocka upp mössen minskade signifikant med både 3D (p=0,0061 i studie #1 män, och p=0,0002 i studie #2 honor) och tunnelhantering (p=0,04 i studie #1 hanar och p=0,003 i studie #2 honor), i jämförelse med den svanshanterade gruppen (figur 3A). ANOVA utförde på tiden i samma kvadrant som handen visade betydande effekt av hantering i studie #1 män (F(2,31)=5,38, p=0, 009) och i studie #2 honor (F(2,33)=3, 5, p=0,04; Figur 3B). Scheffes post hoc-analyser visade att studie #1 hanmöss hanterade med 3D-hanteringstekniken tillbringade betydligt mer tid i samma kvadrant än experimenterarens hand, jämfört med svanshanterade möss (p=0,012). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan hanteringsgrupper #2 studie, 2,5 månader gamla honor. Graden av interaktion med experimenteraren demonstreras ytterligare av de kombinerade värmekartorna över mössens mittpunkter(figur 3C-E). Dessa illustrerar hur de 3D-hanterade hanmössen från studie #1 tillbringade mer tid proximalt till handen, inklusive områden nära handen, medan svans hanterade möss hade den minst övergripande interaktionen med handen.

Effekterna av 3D- och tunnelhantering jämfördes med svanshantering i två tester av ångestliknande beteenden, det nya undertryckta utfodringstestet (NSF) och den förhöjda pluslabyrinten (EPM). I NSF-testet visade ANOVA som utfördes på latensen att närma sig en effekt av hanteringsteknik som används i studie #1 män (F(2,31)=3, 5, p=0,04). Scheffes post hoc-analyser i studie #1-hanar visade trender från 3D-hanterade möss (p=0,08) och från de tunnelhanterade mössen (p=0,08), med minskad latens att närma sig jämfört med svanshanterade möss (Figur 4A). Inga effekter observerades i studie #2. ANOVA som utfördes på latensen att närma sig i musens hembur (data som inte visas) visade ingen effekt av hantering (p=0, 88 i studie #1 män och p=0, 16 i studie #2 honor). ANOVA utförde på procenttiden i de öppna armarna i EPM visade en betydande effekt av hantering i studie #2 honor (F(2,33)=3,5, p=0,04). Inga effekter observerades i studie #1 män (F(2,31)=2, 1, p=0, 1; Figur 4B). Scheffes post hoc-analyser visade bara en trend mot ökad tid i de öppna armarna i tunnel hanterade möss från studie #2, jämfört med svans hanterade möss (p=0,07). När det gäller procentposterna i de öppna armarna (figur 4C) visade ANOVA ingen effekt av hanteringen, varken i studie #1 män eller i studie #2 honor (F(2,31)=1, 12, p=0,33; och F(2,33)=1,3, p=0, 26). Beteendemässiga poäng sammanfattades i en z-poäng, som i Guilloux et al.23, informera om potentiell minskning av ångestliknande beteenden jämfört med svans hanterade möss (Figur 4D). ANOVA på z-poängen visade en signifikant effekt av hantering i studie #1 män (F(2,31)=5, 6, p=0, 008) men inte i studie #2 honor (F(2,33)=1, 07, p=0,35). Scheffes post hoc-analyser visade att 3D-hantering och tunnelhantering minskade z-poängen avsevärt (p=0,04 respektive 0,01), jämfört med svanshantering, vilket tyder på att båda metoderna minskar ångestliknande beteenden i studie #1 män.

Kortikosteronnivåer efter hantering bedömdes också 15 minuter efter en kort hanteringssession (figur 5). ANOVA fann en signifikant effekt av hantering i studie #2 honor (F(2,33)=4, 44, p=0, 01), men inte i studie #1 män (F(1,31)=0, 53, p=0, 59). I studie #2 kvinnor visade post hoc-analyser en signifikant minskning av kortikosteronnivåerna hos möss från 3D-hanteringsgruppen jämfört med svanshanteringsgruppen (p=0, 02).

För att avgöra om hanteringsteknikerna hade en betydande inverkan på variabiliteten hos erhållna data tillämpade vi Bartletts test av homogenitet i variansen. Våra resultat fann ingen signifikant skillnad i variabilitet i studien #2 kvinnliga möss över mätningar (% tid EPM B(2,33)=4,95, p=0,087; % Poster EPM B(2, 33)=3, 68, p=0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). I studie #1 var dock hanmössen signifikant heterogenitet i NSF-testet (B(2,31)=8,08, p=0,0175) och uppmätta CORT-nivåer (B(2,32)=11,63, p=0,0029), men inte i något av måtten för EPM (% tid EPM B(2,32)=1,16, p=0,56; % Poster EPM B(2,32)=2,79, p=0,25). Användning av F-testet för att jämföra två avvikelser visade att i NSF-testavvikelsen minskades signifikant för studie #1 män med både 3D (F(1,21)=4, 22, p=0,04) och tunnelhanteringsteknik (F(1,22)=4,01;p=0,03) i jämförelse med svanshantering. För koncentrationen av CORT efter hantering minskade endast 3D-hanteringen avsevärt variabiliteten (F(1,20)=9,65, p=0,0019) jämfört med svanshantering.

Figure 1
Figur 1. Representativa bilder av 3D-hanteringsproceduren.  Bilderna illustrerar 3D-hanteringsproceduren. A) Hand i bur: Experimenterarens hand placeras i buret och hålls stilla, så att musen kan vana vid närvaron av handen i buret. B) Platt hand: Vid första borttagningen från buret placeras musen på handens platta handflata. Musen kan fritt gå runt handflatan och röra sig mellan intilliggande platta händer. C) Rulla: Slappna av handflatan för att bilda en lös "kopp" runt musen. Luta försiktigt koppen i motsatt hand musen ska fritt flytta till denna hand, om inte försiktigt styra den i den andra handen. D) Skydd: placera musen vid kanten av handen och för sedan ihop båda händerna och bilda mycket långsamt kopp runt musen. Musen ska inte hållas fast och en öppning bör lämnas så att musen kan fly. Håll i ~5-10 s och öppna sedan för platta händer. E) Huvud/ryggflappning: Medan musen utforskar handens platta handflata, klappa försiktigt musen på huvudet och baksidan. Detta tillvänjer musen till experimentörens tillvägagångssätt ovanifrån. F) Nose Poke: När musen verkar vara van vid hantering, försök att försiktigt röra musen direkt på nosen. Om musen inte flyttar huvudet bort är det väl vant vid hantering. G) Det är möjligt att utföra en kort (2-3 s) nacknypa den sista dagen, för att mäta djurens tillvänjning i händelse av framtida ingripanden som kräver stridigheter. När möss är vana vid hantering förblir de orörliga under nacknypan, medan icke-vana möss kommer att försöka fly genom att rotera svansen för att bli befriade från striden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Experimentell design.  Efter ankomsten till anläggningen fick svans hanterade möss ingen tillvänjning. Tunnel-hanterade möss var vana vid tunnlarna i sin hembur i en vecka innan hanteringen började. Tunnel hanterade möss hanterades med tunnelhanteringstekniken i 10 dagar (Första dagen för hantering = dag 1), medan 3D-hanterade möss var vana i tre dagar (dag 8-10). Möss utsattes sedan för den förhöjda pluslabyrint (EPM) (dag 16), experimentinteraktionstest (dag 19), nyhet undertryckt utfodring (dag 21) och en kort hanteringssession följt av serumuppsamling för CORT-mätning (dag 24). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. De tre hanteringsteknikerna påverkar enkel hantering och vilja att interagera med experimenteraren. A) Genomsnittligt antal upphämtningsförsök som krävs för att ta bort en mus från buret. Studie #1 Hane (vänster panel, Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 och 3D-hantering N=11) och Studie #2 honmöss (höger panel, N=12 per grupp) från både tunnel- och 3D-hanterade grupper visade en signifikant minskning av antalet försök som krävs för att ta bort dem från buret jämfört med svansmöss som hanteras. B) Genomsnittlig tid som spenderas av ett djur i samma kvadrant av buret som experimenterarens hand. Studie #1 hanmöss som hanterades med 3D-tekniken visade en betydande ökning av tiden i samma kvadrant som experimenterarens hand. C-E) Genomsnittliga värmekartor av musen mittpunkt efter tid renderade i Ethovision XT 14, visade visuellt den ökade utforskningen och interaktionen med experimenterare av studien #1 3D-hanterade hanmöss. Felstaplar anger SEM. *p<0.05, **p<0.01 jämfört med gruppen Tail Handled. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. 

Figure 4
Figur 4. Effekten av de tre hanteringsteknikerna på ångestliknande beteenden. A) Latens att närma sig och mata på pelleten i den nymodiga undertryckta utfodringskammaren i studie #1 hanmöss (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 och 3D-hantering N=11) och i studie #2 kvinnliga möss (N=12/grupp). Data från studien #1 hanmöss i 3D-hanterings- och tunnelhanteringsgrupperna visade en trend mot betydande minskning av latensen för att närma sig pelleten. B) Medel för % av tiden i de öppna armarna på den upphöjda pluslabyrinten. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan grupper i studie #1 män, och en trend mot mer tid i öppna armar av studie #2 kvinnor i tunnelhanteringsgruppen. C) Anmälningar i öppna armar: Det fanns inga signifikanta skillnader mellan grupper i studie #1 män, inte heller i studie #2 kvinnor. D) Z-poäng som sammanfattar ångestliknande beteenden. Med hjälp av de data som presenteras i A, B och C beräknades en z-poäng med hjälp av tail-hanterade möss som referens. Minskning av z-poängen tyder på en minskning av ångestliknande beteenden mätta av NSF- och EPM-testerna. Studie #1 hanmöss som hanterades med hjälp av 3D- eller tunneltekniken visade en minskad ångestliknande fenotyp jämfört med tail-hanterade möss. Felstaplar anger SEM. *p<0.05 jämförelse med svans-hanterad grupp. t visar trendig signifikansnivå (p<0.1) jämfört med svans hanterad grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. 

Figure 5
Figur 5. Nivåer av kortikosteron efter hantering.  Serum samlades in 15 min efter en kort hantering och sedan mättes CORT-nivåerna med ELISA i både studie #1 hane (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 och 3D-hantering N=11) och i studie #2 honmöss (N=12/grupp). Studie #2 honmöss som hanterades via 3D-hanteringstekniken visade minskade kortikosteronnivåer jämfört med möss som hanteras av svansen. ANOVA i studie #1 hanmöss inte nådde betydelse för skillnader mellan grupper (p=0,5). Felstaplar anger SEM. *p<0.05 jämfört med gruppen Tail Handled. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Table 1
Tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna studie- och metodutveckling bygger på observationen att hanteringstekniker hos möss fortfarande förbises av det vetenskapliga samfundet, och att vissa laboratorier fortfarande är ovilliga att genomföra tillvänjnings- eller hanteringstekniker för att minska stress och reaktivitet hos sina djur före experiment. Djurhanteringen ger goda effekter för djuren, vilket kan bidra till att de experiment som ska utföras lyckas och förhindrar att försök måste utföras flera gånger på grund av datavariation eller överreaktivitet hos djur. Användningen av 3D-hanteringstekniken minskade flyktförsök hos möss. Det ökade också interaktionen med experimenteraren och minskade ångestliknande fenotyper i våra 6 månader gamla manliga möss. Vidare minskade 3D-hantering datavariationen och minskade kortikosteronnivåerna hos 2, 5 månader gamla honmöss efter endast 3 inledande dagar av hantering. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på milda manipuleringar för att vana musen till hantering av experimenteraren som underlättar smidigare transport och enklare ingripande.

Något som är värt att betona från 3D-hanteringstekniken är att utvecklingen av hanteringsmetoder sker som svar på musens reaktivitet, beroende på uppnåendet av milstolparna som beskrivs ovan och i tabell 1. Djur bör ha minskad reaktivitet till ett hanteringssteg innan de går vidare till nästa steg. Att försöka gå för snabbt fram till "skydd" eller "näspnad" på djur som inte är tillräckligt vana skulle sannolikt leda till ökad stress och potentiellt minska effektiviteten i förfarandet. På samma sätt bör djurets reaktivitet varje hanteringsdag övervakas och bör beaktas när man beslutar om ytterligare hanteringsdagar krävs. Om djuren inte svarar bra på skyddstestet den första dagen, utan att uppfylla kriterierna för att uppnå den första milstolpen, kan den första hanteringsdagen upprepas tills milstolpen är klar. På samma sätt, om djur inte svarar på näspnadstestet den andra dagen, kan den andra dagen också upprepas. En annan varning att notera med detta tillvägagångssätt är att risken för möss som hoppar bort är större på den första dagen av hantering, särskilt i hoppiga stammar som C57BL6. Att följa riktlinjerna som beskrivs ovan bör minska risken för hoppning och ge sätt att begränsa sådana beteenden. Varaktigheten av hantering och progression genom stegen kan variera beroende på stammarna, särskilt om arbetet med transgena modeller kända för att uppvisa oroliga fenotyper.

Flera faktorer kan bidra till att minska effektiviteten hos den presenterade 3D-hanteringstekniken. En sådan faktor är den potentiella rädslan eller tveksamheten från experimenteraren, i händelse av att experimenteraren inte är bekant med mushantering eller är rädd för möss. Därför är effekten på hanteraren också något att tänka på. Den gradvisa ökningen av interaktionsnivån med mössen gör det dock möjligt för nybörjare experimenterare att utveckla förtroende och större färdigheter för att utföra hanteringstekniken när de går igenom hanteringsstegen. De föreslagna stegen/milstolparna (skydds- och näspnadstesterna) kan bidra till att motverka potentiell mänsklig variabilitet hos nybörjare, vilket säkerställer att djuren når liknande nivåer av tillvänjning. Det har rapporterats att främjandet av positiva interaktioner mellan människor och djur med djur hade resulterat i högre livskvalitet och medkänsla hos djurvårdspersonalen24. Som sådan innebär gentling från hantering fördelar för både hanteraren och djuret under någon allmän interaktion eller intervention.

Med sin inverkan på att minska antalet försök att plocka upp musen, hos både 6 månader gamla män och 2,5 månader gamla honor, ger 3D-hanteringen ett alternativ till tunnelhantering eller andra tekniker, vilket underlättar överföring av djur från sin bur till experimentella apparater. 3D-hanteringstekniken ökade också interaktionen mellan 6 månader gamla hanmöss och experimenteraren. Detta observerades inte hos 2,5 månader gamla honmöss, men honmöss förblev lättare att plocka upp, jämfört med svans-hanterade möss. Detta tyder på att 3D-hanteringstekniken kan vara mer lämplig för experiment som kräver direkta interaktioner mellan djuret och experimenteraren, såsom Morris vattenlabyrint (trots potentiella köns-/åldersförvekande faktorer som diskuteras senare). Andra har utvecklat och använt manuella hanteringstekniker, bestående av att plocka upp djuren med kupade händer, utan ytterligare manipulering10. Medan dessa tekniker visade positiva effekter, presenterar data i litteraturen ofta hanteringsprotokoll med habituation perioder som överstiger 10 dagar9,16. Dessutom kan cupped-hantering utan den raffinerade interaktionen som tillhandahålls av 3D-hantering inte vara lämplig för hoppiga stammar som fortsätter att hoppa ut och bort från händerna. Även om vi inte gjorde en direkt jämförelse i denna studie med koppmetoden, tar 3D-hanteringen upp detta och förlitar sig på raffinerade drag för att främja interaktion mellan musen och hanteraren. Studien av Ghosal et al.16 använde en kopphanteringsteknik i kombination med massage i 5 dagar, och visade att denna teknik begränsar stressens inverkan på metaboliska effektmått, vilket belyser behovet av raffinerade rörelser och interaktion under hantering för bättre effekt. Baserat på denna koppmassageteknik använder 3D-hanteringen ytterligare interaktion för att vana möss. Med hjälp av 3D-hanteringsmetoden säkerställer hanterarna att alla möss når en liknande nivå av tillvänjning genom att utföra standardiserade rörelser och genom att anpassa procedurens varaktighet till varje djur beroende på dess behov (i den aktuella studien passerade alla möss milstolparna och avslutade 3D-hanteringsprotokollet på 3 dagar). Detta tillvägagångssätt kan betraktas som "personligt" för varje mus, så att alla djur når önskad nivå av tillvänjning på varje dag för hantering. Som nämnts tidigare, om djur inte når de milstolpar som beskrivs i protokollet, kan denna teknik justeras genom att öka antalet dagar. Denna teknik visade positiva effekter för att minska variationen mellan djur i beteendestudier och fysiologisk mätning (CORT-nivåer), vilket tyder på att detta tillvägagångssätt kan bidra till att minska variationen i intrastudien och minska effekten av experimentella fel som potentiellt driver partiska resultat i prekliniska studier.

Stödjande resultat föreslog att möss som utsätts för 3D- och tunnelhantering uppvisar minskad ångest i det nya undertryckta utfodringstestet, jämfört med svans-hanterade möss. Med tanke på kombinerade data från NSF och EPM visade båda metoderna betydande effekter för att minska ångest hos 6 månader gamla hanmöss. Detta replikerar resultaten att djur som är vana vid tunnelhantering hade förbättrad prestanda i tester för ångest9,15 efter 10+ dagars hantering och ytterligare visar potentialen hos 3D-hanteringen att uppvisa liknande effekter. Detta visade också att 3D-hanterade 6 månader gamla manliga möss närmar sig och frivilligt interagerar mer med sin experimenterare än 6 månader gamla manliga möss som utsätts för tunnel- och svanshantering. Viktigt är att 2,5 månader gamla honmöss som utsattes för 3D-hantering hade sänkt nivåerna av CORT, vilket är i stämd med tidigare publicerade resultat9. De två studierna (studie #1 hos 6 månader gamla män och studie #2 hos 2,5 månader gamla honor) bekräftade på två olika sätt att hanteringen har positiv inverkan på ångestliknande fenotyper (antingen på beteendemässiga resultat i studie #1 eller på CORT-nivåer i studie #2).

En möjlig bidragande faktor till effekten är experimentörens kön, i detta fall manligt. Det har visats av Sorge et al.25 att närvaron av manliga experimentörer kan leda till en ökning av CORT och ångest som beteenden hos manliga men inte kvinnliga möss. Detta står i kontrast till resultaten från den aktuella studien. Den största skillnaden mellan denna studie och studien från Sorge et al.25 är att det tillvägagångssätt som beskrivs här består i att vananda mössen till hantering, genom att främja positiv (icke-förstärkt) interaktion med experimenteraren, medan Sorge et al.25 använde naiva gnagare som aldrig interagerade med människor. Man kan förvänta sig att naiva möss kan få en stark reaktion mot mänskliga experimenterare om de inte lär sig att experimenteraren inte utgör ett hot. Den aktuella studien utfördes dock endast med en manlig experimenterare, och framtida studier bör undersöka om sådana effekter är reproducerbara med en kvinnlig experimenterare. Även om isolering av dessa faktorer ligger utanför detta dokuments tillämpningsområde, är det värt att betona vikten av att identifiera sådana variabilitetskällor när man implementerar hanteringstillvändelse eller i experimentell design mer allmänt.

Den aktuella studien bekräftade också effekten av tunnelhanteringstekniken för att minska ångestliknande beteenden och CORT-nivåer hos möss9,10,11. En ytterligare fördel med detta tillvägagångssätt är att tunneln kan lämnas i buret som berikning26, vilket också kan bidra till ett minskat stress/ ångestsvar, vilket helt bidrar till förbättradvälfärd 10,11. I det här fallet är experimentörens roll att manipulera tunneln endast, med varje djur, i en minut. Men som beskrivs av Gouveia et al19behöver tunneln inte nödvändigtvis stanna kvar i hemburen och kan istället presenteras för djuren endast när det krävs för att överföra djuret, utan att orsaka ytterligare stress. Båda metoderna, tunneln och 3D-hanteringstekniken, erbjuder fördelar som bör bedömas av labbet och experimenterarna för att avgöra vilket tillvägagångssätt som är mest lämpligt för deras behov. I den aktuella studien lämnades tunneln i buret, och de effekter vi observerade på ångestliknande beteenden kan bero på en kombination av tunnelhantering och berikning.

Båda ger positiva effekter, men 3D- och tunnelhanteringstekniken är inte utan begränsningar. En gemensam begränsning är att det kan vara tidskrävande och potentiellt avskräckande för djuranläggningar att genomföra sådana förfaranden. De extra fördelarna är dock ovärderliga, vilket förbättrar djurens välbefinnande genom att minska stressen och förbättra interaktionen med leverantörer av djur- och djurvård (som beskrivs i Spangenberg och Kelling27)och forskningens tillförlitlighet och reproducerbarhet. Bevis från vår anläggning tyder på att denna teknik förbättrar interaktioner mellan djur och djurhållningspersonal, vilket underlättar burbyte och hälsoövervakning. Från andra användare i vår anläggning rapporteras stridigheter och övergripande manipulation vara betydligt lättare med hanterade möss, i överensstämmelse med våra resultat att möss som hanteras med 3D-tekniken är mindre benägna att fly när de plockas upp och i vårt exempel är 6 månader gamla män mer benägna att interagera med sin experimenterare. Uppföljningsstudier kan kvantifiera sådana effekter för att ytterligare visa teknikens användbarhet. Sammantaget bidrar denna 3D-hanteringsmetod, liksom tunnelmetoden, till regeln för 3R, särskilt genom att förfina rutinmässiga djurinteraktioner för att minimera stressen som svar på hanteringen. Med tanke på den observerade minskningen av variabiliteten hos data har detta också potential att minska antalet djur som behövs för att uppnå konsekventa resultat och förfina det tillvägagångssätt som används för att begränsa variabiliteten.

En annan diskussionspunkt som bygger på de data som presenteras är att denna studie utfördes med djur som var enhus. Enstaka bostäder föredrogs eftersom det begränsar de potentiella agonistiska beteendena (särskilt hos hanmöss), som kan bidra till inter-individuellvariabilitet 28,29. För överensstämmelse mellan grupper var alla djur enkelhus. Det är också intressant att notera att positiva experimenter-djur interaktioner hos råttor i form av råtta kittlande, kunde mildra några av effekterna av social isolering hos enstaka inhysta råttor30,31. Det är möjligt att hanteringsmetoder som inbegriper direktkontakt mellan djur och experimenterare, såsom 3D-hanteringstekniken eller den koppmassageteknik som beskrivs av Ghosal et al.11 kan ha en liknande effekt. Framtida studier skulle kunna undersöka denna fråga genom att jämföra effekterna av hanteringstekniker hos enstaka djur och grupphus. Tidigare studier undersökte effekten av kopp- och tunnelhanteringsmetoder med möss i en gruppboende miljö och fick liknande resultat7,8. Detta bekräftar att det är möjligt att använda de hanteringsprotokoll som beskrivs häri med djur som hålls i enhus- eller grupphusförhållanden, med tanke på möjligheten till agonistiskt beteende när man tar ett djur ur buret och placerar det tillbaka i (särskilt hos hanmöss eller i aggressiva muslinjer). I sådana fall rekommenderas att du använder en tillfällig bur innan du omgrupperar alla djur tillsammans.

Sammanfattningsvis bidrar den föreslagna 3D-hanteringsmetoden till att minska reaktivitet och stress hos möss. Det ökar också datatillförlitligheten genom att minska variabiliteten efter 3 dagars hantering. Liknande resultat kan observeras med tunnelhanteringen, i vårt fall efter 10 dagars tunnelhantering. I jämförelse med tunnelhanteringstekniken gav 3D-hanteringstekniken fördelen att öka interaktionen med en experimenterare i våra 6 månader gamla hanmöss, vilket kan vara kritiskt i vissa fall. Om 3D- eller tunnelhanteringstekniken skulle implementeras i alla djuranläggningar skulle det innebära en stor förbättring för datagenereringen och i hög grad bidra till att minska djuranvändningen inom forskningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar CAMH:s djurvårdskommitté för att ha stött detta arbete, liksom djurvårdarna i CAMH som gav omfattande feedback om nyttan av förfarandet, motiverade utförandet av de beskrivna experimenten och inlämningen av det detaljerade protokollet för andra användare. Detta arbete finansierades delvis av CAMH BreakThrough Challenge, som tilldelades TP, och av interna medel från CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Beteende problem 175
Hanteringstekniker för att minska stress hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter