Summary
We presenteren een methode om ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van de tussenwervelschijf te onderzoeken met behulp van een optische sectioningmethode.
Abstract
Intervertebral disc (IVD) degeneratie is een belangrijke oorzaak van lage rugpijn en het brengt een hoge mate van stoornis met zich mee voor de getroffen personen. Om schijfdegeneratie te decoderen en regeneratieve benaderingen te kunnen ontwikkelen, is een grondig begrip van de cellulaire biologie van de IVD essentieel. Een aspect van deze biologie dat nog steeds onbeantwoord blijft, is de vraag hoe cellen ruimtelijk zijn gerangschikt in een fysiologische toestand en tijdens degeneratie. De biologische eigenschappen van de IVD en de beschikbaarheid ervan maken dit weefsel moeilijk te analyseren. De huidige studie onderzoekt de ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadium degeneratie. Een optische sectioningmethode (Apotome) wordt toegepast om kleuringsanalyses met hoge resolutie uit te voeren met behulp van runderembryonaal weefsel als diermodel en menselijk schijfweefsel verkregen van patiënten die een wervelkolomoperatie ondergaan. Van een zeer hoge chondrocytendichtheid in de vroege embryonale runderschijf neemt het aantal cellen af tijdens de dracht, groei en rijping. In menselijke schijven ging een toename van de cellulaire dichtheid gepaard met de progressie van weefseldegeneratie. Zoals al was aangetoond in gewrichtskraakbeen, vertegenwoordigt clustervorming een kenmerkend kenmerk van geavanceerde schijfdegeneratie.
Introduction
De tussenwervelschijf (IVD) is een op kraakbeen gebaseerde structuur die biochemisch en met betrekking tot cellulaire architectuur op het eerste gezicht in veel opzichten lijkt op het gewrichtskraakbeen1. Inderdaad, zowel IVD-degeneratie als artrose (OA) van gewrichtskraakbeen worden gekenmerkt door gewrichtsruimtevernauwing als gevolg van kraakbeenslijtage, subchondrale cyste en osteofytvorming en subchondrale sclerose2,3. Ondanks deze schijnbare overeenkomsten verschillen de architectuur en de functionele rol van beide weefsels. Terwijl de matrix van gewrichtskraakbeen voornamelijk wordt gevormd door een arcadevormend collageen type II-netwerk, bestaat de IVD uit drie verschillende soorten weefsel: de collageentype II-rijke nucleus pulposus in het midden neemt axiale belastingen op en brengt ze over naar een omvattende ring van dicht opeengepakte cirkelvormige collageen type I-vezels die anulus fibrosus wordt genoemd. Hun functie is om de vertaalde axiale drukken te absorberen die worden ontvangen door de proteoglycaan- en waterrijke kern met hun treklengte vezelsterkte. Aan de boven- en onderkant van elke kern en anulus vormt een hyalien kraakbeenachtige endplate de kruising met de aangrenzende wervels4 (figuur 1).
In gewrichtskraakbeen zijn vier verschillende ruimtelijke chondrocytenpatronen te vinden: paren, snaren, dubbele snaren, kleine respectievelijk grote clusters5,6,7 ( figuur2). Veranderingen in dit patroon zijn geassocieerd met het begin en de progressie vanartrose 8,9. Ruimtelijke chondrocytenorganisatie is ook indicatief voor een directe functionele eigenschap van kraakbeen, namelijk de stijfheid ervan, wat de functionele relevantie van deze beeldgebaseerde beoordelingsbenadering10,11onderstreept. Deze patronen kunnen bovendien worden geïdentificeerd met reeds bestaande klinisch beschikbare technologie12. Vanwege de overeenkomsten tussen de IVD en gewrichtskraakbeen, kan worden verondersteld dat karakteristieke chondrocytenpatronen ook aanwezig zijn in de IVD. Clustervorming is een fenomeen dat ook wordt waargenomen in de gedegenereerde IVD13,14.
Bij het analyseren van ruimtelijke cellulaire organisatie in de IVD, is het noodzakelijk om verschillende technische problemen te overwinnen die niet aanwezig zijn bij het onderzoeken van gewrichtskraakbeen:
Ten eerste is de verwerking van het weefsel zelf veel uitdagender dan bij het homogene hyaliene kraakbeen dat grotendeels bestaat uit collageen type II. De belangrijkste vezelcomponent van de IVD is collageen type I, waardoor het veel moeilijker wordt om dunne histologische secties te genereren. Terwijl in het hyaliene gewrichtskraakbeen zelfs dikke delen gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd vanwege de "glasachtige" aard van het weefsel, is het collageentype I-netwerk van de IVD optisch zeer ondoordringbaar. Om deze reden is een sterk achtergrondgeluid een veel voorkomend probleem in de histologie van de IVD. Een snelle en goedkope manier om dit optisch dichte weefsel binnen te dringen is het gebruik van een optisch sectioning apparaat, bijvoorbeeld door middel van een Apotome. In zo'n Apotome wordt een raster ingevoegd in het verlichtingspad van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Voor het rooster is een vlak-parallelle glasplaat geplaatst. Deze kantelt heen en weer waardoor het raster in het beeld in drie verschillende posities wordt geprojecteerd. Voor elke z-positie worden drie raw-afbeeldingen met het geprojecteerde raster gemaakt en over elkaar heen gelegd. Door middel van speciale software kan het onscherpe licht worden uitgerekend. Het onderliggende principe is dat, als het raster zichtbaar is, die informatie in focus is, zo niet wordt het als onscherp beschouwd. Met deze techniek kunnen goed gefocuste en hoge resolutie beelden in een redelijke hoeveelheid tijd worden verkregen.
Ten tweede is het weefsel moeilijk te verkrijgen van menselijke donoren. Bij het uitvoeren van totale knievervanging kan het volledige oppervlak van het gewricht worden verkregen voor verdere analyse tijdens de operatie. Hoewel artrose van een diarthrodiaal gewricht ook een ziekte van het hele gewricht is, zijn er toch sterke focale verschillen in de kwaliteit van het kraakbeen waarbij meestal sommige delen van het gewricht nog intact zijn, bijvoorbeeld door verminderde belasting in dat gebied. Deze situatie is anders in de IVD, waar een operatie meestal alleen wordt uitgevoerd wanneer de schijf wereldwijd is vernietigd. Bij het verkrijgen van weefsel van menselijke donoren uit de operatiekamer, is het weefsel ook sterk gefragmenteerd en is het noodzakelijk om het weefsel correct toe te wijzen aan een van de drie kraakbeentypen van de IVD voordat verdere analyses worden uitgevoerd. Om meer gedetailleerde analyses van ook grotere weefselsecties mogelijk te maken en om de embryonale ontwikkeling van de IVD te onderzoeken, is de keuze van een diermodelorganisme daarom noodzakelijk.
Bij het kiezen van een dergelijk modelorganisme is het belangrijk om een systeem te hebben dat vergelijkbaar is met de menselijke schijf met betrekking tot zijn anatomie en afmetingen, zijn mechanische belasting, de huidige celpopulatie en zijn weefselsamenstelling. Voor het doel van de gepresenteerde techniek hier stellen we het gebruik van bovien lumbaal schijfweefsel voor: een kritieke eigenschap van de menselijke schijf die resulteert in zijn lage regeneratieve potentieel is het verlies van notochordale cellen tijdens rijping in de kern. In tal van modelorganismen kunnen notochordale cellen echter hun hele leven lang worden gedetecteerd. De meeste van de weinige dieren die hun notochordale cellen verliezen, zoals schapen, geiten of chondrodystrofehonden, hebben een IVD die veel kleiner is dan menselijke schijven. Alleen lumbale runderschijven aanwezig met een vergelijkbare sagittale schijfdiameter als die van menselijke IVD's15.
Een belangrijke factor die leidt tot vroege schijfdegeneratie is overmatige mechanische belasting. De intradiscale druk van een staande koe in de lumbale wervelkolom is ongeveer 0,8 MPa met de wervelkolom horizontaal uitgelijnd. Verrassend genoeg zijn deze drukken vergelijkbaar met de lumbale intradiscale drukken gerapporteerd voor de rechtopstaande menselijke wervelkolom (0,5 MPa)15,16. Ook de hoeveelheid water en proteoglycanen in runderschijven is vergelijkbaar met die van de IVD van jonge mensen17. Daarom, hoewel het werkelijke bewegingspatroon van de bewegingssegmenten bij viervoetige dieren kan verschillen van de tweevoetige mens, staat de koe met betrekking tot de totale belasting en schijfkenmerken veel dichter bij de menselijke biologie dan andere gevestigde diermodellen voor de IVD zoals schapen en honden.
In dit protocol presenteren we een techniek hoe veranderingen in de IVD kunnen worden geanalyseerd vanuit het oogpunt van ruimtelijke chondrocytenorganisatie van vroege embryonale ontwikkeling tot eindstadiumdegeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor de analyse van de embryonale ontwikkeling en rijping werden runderschijven gebruikt. Om de degeneratie van de IVD te evalueren, werden menselijke monsters geanalyseerd.
Humaan IVD-weefsel werd verkregen van patiënten die een operatie ondergingen voor lumbale schijfdegeneratie, schijfverzakking of ruggenmergtrauma op de afdeling Orthopedische Chirurgie, het Universitair Ziekenhuis van Tübingen en het BG Traumacentrum Tübingen. Volledige goedkeuring van de ethische commissie werd verkregen voor de start van de studie (projectnummer 244/2013BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten vóór deelname. De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.
Runderweefsel is verkregen van het Beierse staatsbureau voor gezondheid en voedselveiligheid/Oberschleißheim en van een destructiebedrijf in Warthausen (Duitsland). De goedkeuring van lokale en veterinaire autoriteiten werd ontvangen voor weefsel van dode dieren.
1. Monsteroogst
- Humaan IVD-weefsel: Plaats intraoperatief verkregen IVD-monsters onmiddellijk in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2% (v/v) penicilline-streptomycine en 1,2% (v/v) amfotericine B. Bewaren bij 4 °C tot verdere verwerking. Verwerk het weefsel binnen 48 uur. U kunt de weefsels ook enkele weken bewaren bij -20 °C.
- Runder IVD-weefsel: Zorg ervoor dat het weefsel van de dieren binnen 24 uur na de dood wordt geoogst.
Reseceer de runderschijven met de omringende wervels van de dode dieren en-bloc. Transporteer het ingevroren weefsel op droogijs en bewaar bij -20 °C tot verdere verwerking.
OPMERKING: Als alleen fluorescentieanalyses zijn bedoeld en er geen verdere biochemische kwantificeringsmethoden zoals ELISA of PCR zijn gepland, voert u de weefselfixatie uit zoals hieronder wordt uitgelegd. Dit maakt het mogelijk om het weefsel langer in opslag te houden voordat het moet worden verwerkt. Om verslechtering van de weefselmatrix te voorkomen, voert u fixatie uit binnen 48 uur na de oogst, tenzij het weefsel direct wordt ingevroren.
2. Monstervoorbereiding
- Ontdooi het bevroren weefsel bij kamertemperatuur. Verwerk het weefsel zodra er geen ijskristallen meer voelbaar zijn bij digitale zachte compressie van het weefsel.
OPMERKING: Voer de bereiding van het weefsel in DMEM uit in een petrischaaltje. - Identificeer de oorsprong van het menselijke IVD-weefsel (anulus fibrosus, tussenzone, nucleus pulposus of kraakbeenachtige endplate) op basis van macroscopische eigenschappen zoals collageendichtheid en oriëntatie.
- Neem het bewegingssegment bestaande uit de runder IVD-schijf met zijn twee aangrenzende wervels en ontleed de schijf als geheel van het subchondrale bot met behulp van een chirurgisch mes (bladnummer 15).
- Gebruik twee anatomische tangen om de schijf om te draaien om gebieden te bereiken die meer gecentreerd zijn. Voer de dissectie uit. Zorg ervoor dat u de nucleus pulposus als laatste reseceert, omdat deze veel dunner is dan de anulus, gevoelig is voor scheuren en deze niet gemakkelijk op een gedefinieerde manier loskomt.
- Identificeer de verschillende gebieden van het kraakbeen.
- Knip het interessegebied uit de hele schijf met behulp van een chirurgisch mes (mes nummer 20 of 22). U kunt ook een cryomaanblad gebruiken.
OPMERKING: Omdat runderschijven en-bloc komen als onderdeel van de wervelkolom, kunnen de schijven in-toto worden bereid. Dit maakt een correcte identificatie van de verschillende soorten kraakbeen veel gemakkelijker. Bij het ontleden van de schijf op de hierboven beschreven manier blijft de kraakbeenachtige endplaat op de wervels. Indien dit gebied moet worden onderzocht, kan het het best van het onderliggende bot worden verwijderd met een beitel die in een licht gebogen tangentiële richting werkt.
- In het geval dat embryo's een kroon-romplengte hebben van kleiner dan 20 cm, zorg er dan voor dat de embryo's in toto worden verwerkt om de weefselarchitectuur van de IVD te behouden. Voer in deze gevallen geen dissectie van de wervels uit.
- Zodra de schijf in-toto is gereseceerd, identificeert u de verschillende delen van het kraakbeen.
- Voer de ontkalking uit in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (20% (w/ v); pH = 7,4) bij kamertemperatuur. Kies het volume afhankelijk van de steekproefgrootte - het hele weefsel moet goed bedekt zijn met EDTA.
- Vervang de ontkalkingsoplossing dagelijks, wat tot 5 dagen kan duren, afhankelijk van de grootte van het weefsel.
- Controleer of de ontkalking succesvol is met een naald van 20 gauge die zonder noemenswaardige weerstand de wervels binnendringt.
OPMERKING: De dagelijkse verandering van de ontkalkingsoplossing is belangrijk om te voorkomen dat het chelaatbindmiddel EDTA verzadigd raakt om de reactie-effectiviteit te behouden. Het voorkomt ook bacteriële kolonisatie.
3. Indeling van de leeftijd, integriteit en degeneratie van de steekproef
- Deel het menselijke schijfweefsel in een van de vijf volgende categorieën in met behulp van klinische informatie en röntgen- en magnetische resonantiebeeldvorming18 (figuur 3).
OPMERKING: Categorie I: Om te dienen als bijna-gezond monster gebruik anulus zonder enig radiologisch teken van IVD-degeneratie afgeleid van acuut spinale trauma.
Categorie II: Om een situatie van acute ontsteking met beginnende degeneratie te illustreren, gebruikt u weefsel uit de tussenzone van patiënten met klinische symptomen met een duur van minder dan 4 weken.
Categorie III: Om een situatie te beschrijven waarin de ontstekingsreactie al de tijd had gehad om het weefsel te beïnvloeden en cellen weefsel afnemen van patiënten die werden geopereerd voor een nucleaire verzakking, maar met een symptoomduur van meer dan 4 weken.
Categorie IV: Selecteer voor matige schijfdegeneratie anulus verkregen uit chirurgie met interlichaamsfusie voor degeneratieve schijfziekte met een Pfirrmann-score van 3 of 4 in magnetische resonantiebeeldvorming19.
Categorie V: Voor het eindstadium degeneratieproces anulus verkregen uit chirurgie met interbody fusion voor degeneratieve schijfziekte met een Pfirrmann score van 5. - Indeling van het weefsel van runderen op basis van het ontwikkelingsstadium/de leeftijd van het dier in een van de acht categorieën, zoals weergegeven in tabel 1.
- Bereken de drachtleeftijd op de kruin-romplengte van de embryo's op basis van de door Keller voorgestelde formule:
Draagtijd in maanden =
OPMERKING: Dieren in de eerste 4 weken van de dracht aanwezig met een kroon-romplengte van 0,8-2,2 cm20.
- Bereken de drachtleeftijd op de kruin-romplengte van de embryo's op basis van de door Keller voorgestelde formule:
4. Weefselfixatie
- Fixeer de monsters in 10x het volume van het monster van 4% (w/v) formaldehyde-oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende de nacht bij 4 °C.
OPMERKING: De formaldehyde-oplossing dringt weefsel binnen met een snelheid van ongeveer 1 mm / uur van elke richting. Voor zeer kleine of zeer grote monsters kan een aanpassing van de belichtingstijd noodzakelijk zijn. - Bewaar het weefsel in PBS bij 4 °C tot verdere verwerking.
5. Histologische sectie
- Sluit de monsters in in wateroplosbaar inbeddingsmedium op de cryotome-knop.
- Plaats het weefsel op de knop zodat er een axiale vlak wordt gegenereerd of een vlak dat het collageen type I lamellen loodrecht snijdt (bijvoorbeeld een mediaan sagittale sectievlak).
OPMERKING: Het weefsel moet volledig worden bedekt door het inbeddingsmedium.
- Plaats het weefsel op de knop zodat er een axiale vlak wordt gegenereerd of een vlak dat het collageen type I lamellen loodrecht snijdt (bijvoorbeeld een mediaan sagittale sectievlak).
- Sectie van het ingebedde weefsel met een dikte van 70 μm in menselijke monsters en 40 μm in rundermonsters met behulp van een standaard cryotoom.
OPMERKING: Het verschil in sectiedikte is te wijten aan het verschil in weefselintegriteit tussen de intacte runderschijf en het sterk gedegenereerde menselijke weefsel. - Verzamel de secties op een glasplaat.
- Omcirkel de weefselsecties met een hydrofobe pen.
- Spoel de secties 3 keer af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om het in water oplosbare inbeddingsmedium te verwijderen.
6. Fluorescentiekleuring
- Voeg 60 μL van 1% (v/v) DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) en 1% (v/v) Actin Tracking-kleuring (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) toe aan PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het hier beschreven kleuringsprotocol is om de kern te visualiseren met behulp van DAPI nucleaire kleuring (blauw) en het cytoplasma met behulp van Actin Tracking Stain (rood). De IVD heeft een sterke autofluorescentie door de collageenvezels in het groene kanaal. De hoeveelheid vloeistof die aan de secties in dit protocol wordt toegevoegd, is bedoeld voor secties met een afmeting van ongeveer 5 mm x 5 mm. Voor grotere secties moet dit bedrag dienovereenkomstig worden verhoogd. Voer alle werken uit in kamers zonder directe blootstelling aan zonlicht en met gedimde lichten om bleken van de kleurstof te voorkomen. - Verwijder de kleurvloeistof met een pipet en was drie keer met telkens 60 μL PBS.
- Voeg een geschikt montagemedium toe en bedek de secties met een afdekslip.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn ingesloten bij het toevoegen van de afdekslip. Dit kun je het beste doen door contact te maken met de slip met de glijbaan op één velg en vervolgens de slip langzaam naar beneden te laten komen.
7. Microscopische beeldvorming en verwerking
- Plaats een dia met een gekleurd gedeelte op de monsterhouder van de microscoop.
OPMERKING: Vanwege het dichte collageen type I-netwerk van de IVD, maakt het verstrooide licht het weefsel moeilijk te visualiseren met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. Een manier om dit probleem aan te pakken, is door optische secties uit te voeren met behulp van gestructureerde verlichting. Dit maakt het ook mogelijk om een driedimensionale projectie van het hele monster in beide kanalen (blauw en rood) weer te geven. Dit kan het beste worden gedaan met behulp van de gestructureerde verlichtingsinstelling en de Mozaïek-modus met een 10x vergrotingsobjectieve lens om een overzicht van het monster te krijgen, evenals 3D-reconstructies van individuele patronen. - Start het gestructureerde verlichtingsapparaat.
- Voer beeldvorming met één gezichtsveld uit met een geschikte fluorescentiemicroscoop, fluorescentiefilters en voldoende verlichting.
OPMERKING: Pas de belichtingstijd aan voor alle gebruikte filters om de beeldacquisitie te standaardiseren. Om een nauwkeurige weergave van het monster te krijgen bij een afbeelding met een hogere resolutie, zijn de secties met een hogere vergroting (bijvoorbeeld 20x objectief). - Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
- Voer beeldvorming met één gezichtsveld uit met een geschikte fluorescentiemicroscoop, fluorescentiefilters en voldoende verlichting.
- Om de sectie als geheel te visualiseren, gebruikt u de mozaïekbeeldvormingstechniek
- Open de acquisitie-instellingen (druk op 6D- Acquisitie) in het werkbalkpaneel.
- Pas de mozaïekinstellingen aan (in MosaiX Register)en definieer het aantal kolommen en rijen met gezichtsveldafbeeldingen die later worden samengevoegd tot één overzichtsafbeelding.
- Druk op Instellen en pas de scherpstelcorrectie van afzonderlijke tegels aan.
OPMERKING: Het is bijna onmogelijk voor een groot weefselgedeelte om het hele weefseloppervlak in één focusvlak te hebben. Beeldtegels op verschillende brandpuntsniveaus kunnen worden gemaakt door 'MosaiX Acquisition'. - Als u de verwerving van de afbeeldingstegels wilt starten, drukt u op Start.
- Naai de afgebeelde tegels met behulp van de stikfunctie(stikknop) met 20% overlap die in de software is opgenomen.
- Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
- Om de ruimtelijke chondrocytenorganisatie te analyseren, gebruikt u de 3D-functie die in de software is opgenomen.
- Pas de z-stack-instellingen aan. Definieer de scanparameters: definieer de start- en stopposities in de z-as en de segmentafstand door de Knop Start/Stop te activeren.
OPMERKING: De software berekent automatisch het aantal segmenten. - Als u wilt beginnen met het verkrijgen van de z-stacks van de afbeelding, drukt u op Start.
- Nabewerking van de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren met behulp van een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de fluorescentiemicroscoop.
- Pas de z-stack-instellingen aan. Definieer de scanparameters: definieer de start- en stopposities in de z-as en de segmentafstand door de Knop Start/Stop te activeren.
- Exporteer de afbeeldingen met een bestandsindeling die compatibel is met de beeldverwerkingssoftware.
OPMERKING: Exporteer de 3D-reconstructies als afzonderlijke afbeeldingen en/of als een interactief 3D-model of in een videoformaat.
8. Cellulaire patroonidentificatie en dichtheidsbeoordeling
- Open de geëxporteerde mozaïekafbeeldingen van het hele weefselgedeelte in een geschikt beeldverwerkingsprogramma.
- Definieer de gebieden die worden onderworpen aan celdichtheidsbeoordeling door gebieden van belang van 500 μm x 500 μm in de afbeeldingen te definiëren.
OPMERKING: Alle tegels die geen adequate beeldkwaliteit hebben, zijn uitgesloten van analyse. - Identificeer individuele cellulaire patronen.
OPMERKING: Afzonderlijke cellen worden gedefinieerd als individuele cellen - volledig ingekapseld in de aangrenzende matrix. Paren worden gedefinieerd als twee aangrenzende cellen in de nabijheid (<25 μm) waarbij de cellen met elkaar verbonden zijn via hun matrixen (zie figuur 2). Snaarformaties zijn ten minste drie chondrocyten die in lijn zijn uitgelijnd (vanaf het midden van de kernen <25 μm). Deze cellen zijn omgeven door een intacte matrix en matrixinterconnecties zijn te zien tussen elke cel. Clusters vertegenwoordigen meerdere cellen die zich in de directe nabijheid van elkaar bevinden (<25 μm) en zijn ingekapseld in een grote lacune zonder matrix. - Gebruik een plug-in voor het aantal cellen voor de kwantitatieve analyse van de cellulaire patronen.
OPMERKING: De cytoplasmakleuring vertegenwoordigt een verificatiemethode om de verschillende ruimtelijke patronen te identificeren. - Bereken de celdichtheid door de getelde cellen te delen door de grootte van het gekozen interessegebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van mozaïekbeelden is de architectuur van de IVD met zijn dichte collageenvezelnetwerk in de anulus en de zachtere kern duidelijk te herkennen(figuur 4). Een continue afname van de cellulaire dichtheid kan worden waargenomen tijdens de embryonale ontwikkeling(figuur 5). Terwijl in de vroege stadia van IVD-ontwikkeling een celdichtheid van 11.435 cellen/mm² in de bovine anulus fibrosus en 17.426 cellen/mm² in de runderkern pulposus kan worden gevonden, nemen deze aantallen snel af tot 1.011 cellen/mm² (bovine anulus fibrosus) en 488 cellen/mm² (bovine nucleus pulposus) tot de geboorte. Bij volwassen runderen worden 71 cellen/mm² (anulus fibrosus) resp. 106 cellen/mm² (nucleus pulposus) gezien (figuur 6 A-B). Het gebruik van bi-channel imaging met de Apotome maakt het mogelijk om de 3D-architectuur van de ruimtelijke patronen te visualiseren(Figuur 7).
Figuur 1. Macroscopische anatomie van de tussenwervelschijf. Schematische tekening van de tussenwervelschijf met de nucleus pulposus (rood), direct eromheen de tussenzone (roze), en vervolgens in cirkelvormige lagen eromheen de anulus fibrosus. Let op de plly-hoekrichting van de collageen type I vezels in de anulus fibrosus. De axiale belasting van de kern kan dus worden vertaald naar axiale trekkrachten van de collageenvezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische illustratie van verschillende ruimtelijke organisatiepatronen van chondrocyten. Afhankelijk van het weefsel worden chondrocyten gevonden als enkele cellen, paren of snaren in gezond kraakbeen. Met beginnende degeneratie veranderen deze patronen in dubbele snaren, kleine clusters en vervolgens grote clusters in eindstadiumdegeneratie. Dit cijfer is gewijzigd van Danalache, M. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Verschillende omstandigheden van de tussenwervelschijf (IVD). (A-D') Sagittale T2-gewogen magnetische resonantie beeldvorming van de menselijke lumbale wervelkolom (A-D), met het vergrote bewegingssegment L4/L5 (A'-D'). De ventrale kant van de patiënt is naar links gericht, de dorsale kant naar rechts met het wervelkanaal met zijn witte signaal voor het hersenvocht. (A,A') Intacte IVD met de anulus weergegeven met een hypointense (zwart) signaal vanwege het hoge collageen type I-gehalte en de kern vertoonde veel helderder (hyperintense) vanwege het hoge gehalte aan waterbindende proteoglycanen (Pfirrmann graad19 I). (B,B') Beginnende IVD-degeneratie met een verlies van het watersignaal van de nucleus pulposus en waarbij het onderscheid tussen de anulus en de kern verloren gaat (Pfirrmann graad19 IV). (C,C') Acute nucleaire verzakking met nog steeds een prominent watersignaal in het gebied van de kern, indicatief voor een verder intacte IVD en het schijfweefsel dat dorsaal in het wervelkanaal steekt. (D,D') Gevorderde schijfdegeneratie met een grotendeels vernietigde IVD met een volledig verlies van het watersignaal in de schijf, ventrale en dorsale spondylofyofytenvorming en subchondrale sclerose van de wervels overeenkomend met een Pfirrmann graad19 van V. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Mozaïek fluorescentie beeldvorming van de tussenwervelschijf (IVD). De architectuur van de IVD met zijn dichte collageenvezelnetwerk in de anulus fibrosus en de zachtere kern is duidelijk te herkennen. DAPI-nucleaire kleuring (wit) in het axiale (A1) en sagittale (A2) vlak toont de celverdeling en rangschikking binnen de IVD. Vergrote representatieve gebieden uit deze mozaïekafbeeldingen worden weergegeven in B1-B4 en C1-C4 ter illustratie van de ruimtelijke chondrocytenorganisatie - in dit geval enkele cellen (groen vak), paren (blauw vak) en tekenreeksen (geel vak). A: schaalbalk 1.000 μm, B1-B4: schaalbalk 200 μm, C1-C4: schaalbalk: 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Bonnaire, F.C. et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Verschillende ontwikkelings- en rijpingsstadia van runderanulus fibrosus en human degenererend anulus fibrosus. DAPI nucleaire kleuring. De mozaïekbeelden tonen een hele vroege embryonale schijf in een axiale sectie (A1) en representatieve beelden van de bovine anulus tijdens embryonale ontwikkeling, rijping en beginnende degeneratie (A2-A8). (B1-B3) Anulus van humane IVD's werd intraoperatief verkregen. Een continue afname van de cellulaire dichtheid kan worden waargenomen tijdens de ontwikkeling van de embryonale schijf. Een cellulair patroon van een hogere ruimtelijke organisatie lijkt vooral rond de geboorte aanwezig te zijn. In de volwassen menselijke schijf tijdens degeneratie neemt de cellulaire dichtheid weer toe en kan toenemende clustervorming worden waargenomen. Schaalbalk 100 μm. Wog: weken zwangerschap. Dit cijfer is gewijzigd van Bonnaire, F.C. et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vermindering van de cellulaire dichtheid gedurende de ontwikkeling en rijping van de tussenwervelschijf van runderen. Het gemiddelde (standaarddeviatie) celgetal per mm² wordt geïllustreerd door staafdiagrammen voor de bovine anulus fibrosus (A) en de runderkern pulposus (B). Een duidelijke vermindering van de cellulaire dichtheid kan worden waargenomen, vooral tijdens de embryonale periode die in mindere mate doorgaat, ten minste tot volledige rijping van de schijf (n = 72). Wog: weken zwangerschap. Dit cijfer is gewijzigd van Bonnaire, F.C. et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Apotome beeldvorming van de tussenwervelschijf (IVD). Bi-channel afbeelding met het cytoplasma (rood, actinekleuring) en de kern (blauw, DAPI nucleaire kleuring). (A) In de intacte IVD worden naast het overheersende ruimtelijke patroon van enkele chondrocyten ook paren gevonden. (B) In gedegenereerde anulus zijn celclusters te vinden. Schaalbalk 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1. Apotome beeldvorming van een paar in de tussenwervelschijf (IVD) als een 3D-model. Bi-channel beelden tonen het cytoplasma (rood, Actine kleuring) en de kern (blauw, DAPI nucleaire kleuring) van een paar. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2. Apotome beeldvorming van een cluster in de tussenwervelschijf (IVD) als een 3D-model. Bi-channel beelden tonen het cytoplasma (rood, Actine kleuring) en de kern (blauw, DAPI nucleaire kleuring) van een cluster. Klik hier om deze video te downloaden.
Tabel 1: Embryonale ontwikkeling, rijping en groei na de geboorte van runderen met zijn verschillende mijlpalen. Wog - weken van zwangerschap. Draagtijd ca. 283 dagen, natuurlijke levensverwachting 20-25 jaar20,23,24. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van fluorescentiemicroscopie aangevuld met mozaïekbeeldvorming en optische sectioning, evalueerden we de ruimtelijke rangschikking van chondrocyten in de anulus van de lumbale IVD gedurende ontwikkeling, rijping en degeneratie. Hoewel degeneratief weefsel kon worden geoogst van patiënten die een wervelkolomoperatie kregen voor schijfdegeneratie, vereiste analyse van de embryonale periode en rijpingsfase het gebruik van een modelorganisme (rund). Hoge cellulaire dichtheden werden opgemerkt in de anulus tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. In de verdere loop van de ontwikkeling, postnatale groei en rijping, kon een uitgesproken afname van de cellulaire dichtheid worden waargenomen. In menselijk weefsel met gevorderde schijfdegeneratie zouden we dan een toename van de cellulaire dichtheid in de anulus fibrosus kunnen kwantificeren.
De snelle toename van het weefselvolume in combinatie met actief delende en biosynthetisch actieve notochordale cellen zijn waarschijnlijke redenen voor de veranderingen in cellulaire dichtheid waargenomen in het embryo25. De mechanismen waardoor de cellulaire dichtheid weer toeneemt met degeneratie blijven echter onduidelijk. Degeneratieve processen van de anulus leiden tot een reeks pathologische veranderingen, waaronder verhoogde weefselinnervatie en ontsteking, upregulatie van matrixafbrekende enzymen en groeifactorproductie, en ook veranderingen in cellulariteit26,27,28.
Bij het beschouwen van celaanwezigheid als een functie van cellulaire ruimtelijke organisatie op basis van patronen bekend van gewrichtskraakbeen7,9 vonden we geen herkenbare ruimtelijke organisatie in vroege embryonale schijven waar de cellen dicht opeengepakt lijken te zijn en die we beschouwden als aanwezig als afzonderlijke cellen22. Deze bevinding komt overeen met de resultaten van embryonaal gewrichtskraakbeen7. In de gezonde volwassen anulus vertegenwoordigen afzonderlijke cellen het overheersende ruimtelijke patroon22. Paren en snaarformaties kunnen echter ook worden waargenomen22. Hoe meer het weefsel in menselijke schijven degenereert, hoe hoger het aandeel cellen dat in clusters kan worden gevonden22. Het fysiopathologische model voorgesteld door Rolauffs in gewrichtskraakbeen7,9,29 vertoont een intrigerende gelijkenis met onze bevindingen. Eerdere studies over IVD-degeneratie hadden ook al clustervorming geschetst als een kenmerk van schijfdegeneratie14,30,31,32,33. Aangezien deze clusters meestal te vinden zijn in sterk gedegenereerde weefsels, kan clustervorming wijzen op een mislukte poging van het weefsel om de degeneratieve schade te herstellen34. Door een sterke correlatie vast te stellen tussen het lokaal overheersende chondrocytenpatroon en de weefselelasticiteit, kon een hoge functionele relevantie van deze patronen worden aangetoond in gewrichtskraakbeen10,11. Er kan worden gespeculeerd dat een dergelijke functionele relevantie ook van toepassing is op ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de IVD.
Fluorescentie histologische analyses zijn een gemakkelijk te verkrijgen en aantrekkelijk middel om morfologische veranderingen in weefsels te analyseren. Bij het histologisch analyseren van de IVD zijn er verschillende technische problemen die moeten worden overwonnen: ten eerste maakt de beperkte beschikbaarheid van menselijk weefsel het belangrijk om een adequaat diermodelorganisme te kiezen waarmee die aspecten van de ziekte kunnen worden bestudeerd waar menselijke monsters niet kunnen worden verkregen. Voor de onderzoeksvraag die in deze studie aan de orde komt, kozen we voor een rundermodel.
Ten tweede is de verwerking van het collageentype I-rijke IVD veel uitdagender dan voor de meeste andere menselijke weefsels. Het dichte collageen type I-vezel netwerk verstrooit sterk het fluorescerende licht waardoor een hoog achtergrondruissignaal ontstaat. Dit probleem kan het beste worden aangepakt door een techniek te gebruiken waarmee een dergelijk achtergrondsignaal kan worden afgetrokken of geëlimineerd. Een bekende methode om dit te doen is confocale microscopie. Hoewel de beeldkwaliteit van confocale verkregen LASER-beelden meestal uitstekend is, zijn de nadelen van deze techniek dat het relatief tijdrovend is en als zodanig de analyse van grotere weefselgebieden door middel van mozaïekbeeldvorming niet mogelijk maakt. Ten tweede zijn confocale microscopen relatief duur en niet overal verkrijgbaar. Een veel snellere en goedkopere manier om achtergrondgeluid weg te filteren is het uitvoeren van optische sectioning, bijvoorbeeld door middel van een Apotome.
Om de bevindingen correct te kunnen interpreteren, is het essentieel om ook het te analyseren weefsel correct toe te wijzen aan de oorsprong ervan in de IVD. Hoewel deze taak relatief eenvoudig is bij het hebben van een hele runderschijf om uit te kiezen, kan het zeer uitdagend zijn bij het ontvangen van menselijk weefsel uit de operatiekamer. Het karakteristieke kenmerk van de anulus fibrosus is het zeer dichte collageen type I-netwerk in een hoek-laag vezeloriëntatie. De kern daarentegen is een amorfe gelatineuze structuur waarbij geen hogere collageenarchitectuur zichtbaar is voor het blote oog. De tussenzone ligt tussen die twee extrema en bezit ook een duidelijke collageenvezelarchitectuur, maar het is veel zachter en minder dicht dan de anulus fibrosus. De kraakbeenachtige eindplaat bestaat uit hyalien kraakbeen, presenteert zich niet met een collageenarchitectuur die met het blote oog herkenbaar is, maar is eerder "glasachtig" zoals de term "hyalien" suggereert. In tegenstelling tot de nucleus pulposus is het echter ook erg stijf, kan het niet worden vervormd en bevindt het zich op het subchondrale bot dat vaak nog kan worden herkend door inspectie van het weefsel.
Zodra de oorsprong van het weefsel correct is geïdentificeerd, moet het weefsel nog steeds correct worden georiënteerd voor sectie om gestandaardiseerde beelden te verkrijgen die ook een goede kwalitatieve en kwantitatieve uitlezing mogelijk maken. In oriëntatie op andere beeldvormingstechnieken zoals magnetische resonantie beeldvorming stellen we twee standaard analysevlakken voor: een mediaan-sagittale sectie en een in het axiale vlak. Deze twee vlakken zullen ook een goede indruk geven van de architectuur van het collageentype I-vezelnetwerk van de anulus. Bij het interpreteren van de bevindingen verkregen uit de F-actinekleuring moet in gedachten worden gehouden dat bevriezing van de weefselmonsters cytoskeletstructuurveranderingen35 kan veroorzaken, die echter geen invloed mogen hebben op de ruimtelijke chondrocytenorganisatie.
Het volledig begrijpen van de cellulaire biologie van de IVD is een van de nog steeds open uitdagingen in ons begrip van schijfdegeneratie en regeneratie36. Vragen die soms triviaal lijken, zoals de fysiologische rangschikking van cellen in gezond weefsel of de kwestie van cellulaire reorganisatie tijdens degeneratie, blijven tot op heden onbeantwoord. De verkregen kennis kan ons in staat stellen om deze beeldgebaseerde degeneratiemarker te gebruiken om de weefselkwaliteit te evalueren, de omkeerbaarheid van clustervorming te onderzoeken en zo mogelijk een therapeutisch venster te definiëren waarin de degenererende processen nog steeds met succes kunnen worden aangepakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken onze co-auteurs uit de originele publicaties voor hun hulp en steun. We bedanken Charlotte Emma Bamberger voor haar hulp bij het verkrijgen van de apotome-afbeeldingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S.
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N.
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
