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Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

O teste de ativação basófila é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE com base na detecção de ativação basofílica na presença de um estímulo específico através da medida de marcadores de ativação por citometria de fluxo.

Abstract

O teste de ativação basofílica (BAT) é um teste complementar de diagnóstico in vitro que pode ser usado além da história clínica, teste cutâneo (ST) e determinação específica de IgE (sIgE) na avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE a alimentos, veneno de inseto, drogas, bem como algumas formas de urticária crônica. No entanto, o papel dessa técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinado.

A MTD baseia-se na determinação da resposta basófila à ativação de IgE de ligação transfronteiriça alérgeno/fármaco através da medição de marcadores de ativação (como CD63, CD203c) por citometria de fluxo. Este teste pode ser uma ferramenta útil e complementar para evitar testes de desafio controlados para confirmar o diagnóstico de alergia, especialmente em indivíduos que experimentam reações graves com risco de vida. Em geral, o desempenho da MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) não há fonte de alérgeno/fármaco a ser utilizada para determinação de ST ou sIgE; iii) há discordância entre a história do paciente e a determinação de ST ou sIgE; iv) os sintomas sugerem que o TS pode resultar em resposta sistêmica; v) antes de considerar uma TCC para confirmar o alérgeno/droga culpado. As principais limitações do teste estão relacionadas à sensibilidade não ótima, principalmente na alergia a medicamentos, à necessidade de realizar o teste não mais de 24 h após a extração da amostra e à falta de padronização entre os laboratórios em termos de procedimentos, concentrações e marcadores celulares.

Introduction

O diagnóstico de alergia mediada por IgE é baseado na história clínica, testes cutâneos (STs), quantificação de IgE sérica específica (sIgE) e, se necessário e indicado, testes de desafio controlado (CCTs)1,2,3,4,5,6. No entanto, a história clínica pode não ser confiável, uma vez que pode haver falta de informações precisas, e STs e CCTs não são procedimentos isentos de risco que podem ser contraindicados em indivíduos com reações graves com risco de vida 1,2,3,4,5,6 . Essas questões, juntamente com o fato de que a determinação de sIgE por imunoensaios fluoroenzimáticos validados e comerciais só está disponível para poucos alérgenos e drogas, destacaram o importante papel de outros ensaios funcionais in vitro, como o teste de ativação basófila (BAT).

Os basófilos são células-chave efetoras envolvidas em reações alérgicas mediadas por IgE que são ativadas após a reticulação de sIgE adjacente ligada a receptores de alta afinidade (FcεRI) na superfície celular após exposição a alérgenos/medicamentos. A ativação basófila desencadeia a degranulação celular e a liberação de mediadores inflamatórios pré-formados e novos sintetizados contidos nos grânulos de secreção intracitoplasmática 7,8,9. A MTD é um método in vitro que tenta mimetizar a ativação basófila na presença de um estímulo (alérgeno ou droga) e determina alterações na expressão de marcadores de ativação basófila por citometria de fluxo 7,10. Existem diferentes estratégias para identificar basófilos (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e medir a ativação celular (principalmente regulação positiva de CD63 e CD203c) usando combinações de anticorpos marcados com fluorocromo 7,10. O CD63, o melhor marcador de ativação clinicamente validado 11,12,13,14, é uma proteína de membrana ancorada nos grânulos secretores contendo histamina que, após ativação celular e fusão dos grânulos com a membrana, é expressa na superfície basófila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c é um marcador de superfície que é expresso constitutivamente em basófilos e regulado positivamente após a estimulação de FcεRI, que também mostrou resultados confiáveis em MTD 15,22,23,24,25. Além disso, parece co-expressar com CD6326.

Nas últimas décadas, o MTD tem se mostrado útil no diagnóstico de reações alérgicas mediadas por IgE induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica, conforme descrito a seguir. No entanto, a posição desta técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinada.

Hipersensibilidade a medicamentos
A MTD tem se mostrado útil como exame complementar para medicamentos e pacientes selecionados, particularmente para aqueles que apresentam reações graves, devido ao fato de que o valor diagnóstico do TS não está bem estabelecido para a maioria dos medicamentos, pois são validados e padronizados para um número limitado de medicamentos27,28,29,30. Além disso, a quantificação de sIgE está disponível apenas para um número limitado de fármacos, com menor sensibilidade que o ST 27,28,29,30,31,32. Portanto, o diagnóstico de hipersensibilidade medicamentosa geralmente depende do teste de provocação medicamentosa, que pode ser contraindicado em indivíduos que apresentam reações graves com risco de vida33.

Resultados promissores têm sido relatados para o uso de MTD em pacientes selecionados que relataram reações de hipersensibilidade imediata a diferentes fármacos como betalactâmicos (BLs)20,34,35,36,37,38,39, agentes bloqueadores neuromusculares (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonas (FQs)46,47,48,49, pirazolonas 50,51,52, meios de radiocontraste (RCM)53,54,55,56 e compostos de platina 57,58,59 . Foi relatado que a MTD tem uma sensibilidade e especificidade entre 51,7-66,9% e 89,2-97,8%, respectivamente; e os valores preditivos positivo e negativo variam entre 93,4% e 66,3%, respectivamente27,31. Além disso, o MTD tem sido proposto como um biomarcador preditivo para reações de avanço durante a dessensibilização com compostos de platina, uma vez que a expressão de CD203c é aumentada em comparação com CD63 em pacientes com alto risco de reações adversas durante a dessensibilização medicamentosa57.

É de notar que o MTD só é útil na hipersensibilidade a medicamentos quando a reação envolve degranulação basófila; portanto, não é útil em reações resultantes da inibição enzimática da ciclooxigenase 142.

Alergia alimentar
A MTD emergiu como uma potencial ferramenta diagnóstica para alergia alimentar, pois a determinação de sIgE sérica para todo o extrato alergênico ou alérgenos únicos é muitas vezes ambígua, exigindo desafio alimentar oral para confirmar o diagnóstico, o que, da mesma forma que a hipersensibilidade a medicamentos, é um procedimento caro e não isento de risco60. Vários estudos têm mostrado resultados relevantes com leite de vaca 61,62, ovo 61,63, trigo 64,65,66,67,68, amendoim 63,69,70,71,72, avelã 73,74,75,76 ,77, marisco78, pêssego 79,80,81, maçã21, aipo e cenoura 82,83.

O principal valor agregado da MTD no diagnóstico de alergia alimentar em comparação com STs e sIgE no soro é que ela apresenta maior especificidade e sensibilidade semelhante. Assim, a MTD é uma ferramenta útil para diferenciar pacientes clinicamente alérgicos de indivíduos sensibilizados, mas tolerantes, que apresentam alta especificidade (75-100%) e sensibilidade (77-98%)63,69,84. Os valores de sensibilidade e especificidade dependem do alérgeno e de outros fatores como fenótipos (por exemplo, síndrome de alergia oral versus anafilaxia), idade e padrões de sensibilização relacionados à geografia63,85.

A MTD usando componentes alergênicos únicos pode potencialmente melhorar a precisão diagnóstica para alguns alérgenos alimentares61,80. Existem estudos utilizando proteínas de armazenamento de sementes (por exemplo, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 do amendoim)86; proteínas de transferência lipídica (por exemplo, Pru p 3 do pêssego e Ara h 9 do amendoim)80,86; e Bet v 1 homólogos (por exemplo, Ara h 8 de amendoim)87. Outras utilidades potenciais estão relacionadas à identificação do alérgeno culpado em casos de síndrome de alergia alimentar ao pólen 21,87,88, alergia à carne vermelha 89 ou anafilaxia induzida por exercício dependente de alimentos66.

Curiosamente, a MTD pode fornecer informações sobre a gravidade e o limiar das reações alérgicas, uma vez que pacientes com reações mais graves apresentam maior proporção de basófilos ativados, como observado em estudos com pacientes alérgicos ao amendoim e ao leite de vaca 84,90,91; e os pacientes que reagem a vestígios do alérgeno apresentam maior sensibilidade basófila 84,90,92. Esses dados sugerem que a MTD pode ser útil para identificar pacientes alérgicos de alto risco que necessitam de acompanhamento mais próximo e educação mais intensificada93. Além disso, tem sido relatado que a MTD pode prever respostas de desafio alimentar 70,91,92,94 e limiares de reatividade90,95 para ajudar a determinar quando os alimentos podem ser (re)introduzidos com segurança 84. No entanto, esses achados são controversos em alguns estudos63,96 e mais pesquisas são necessárias.

Por outro lado, a MTD tem sido utilizada para monitorar a resolução da alergia alimentar, seja naturalmente ou sob tratamentos imunomoduladores, ao longo do tempo, que até o momento só tem sido avaliada por desafio alimentar oral, com os riscos e custos associados 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Além disso, também tem sido usado para monitorar o efeito do omalizumabe na alergia alimentar, pois a ativação basofílica diminui durante o tratamento com omalizumabe, mas aumenta após a cessação do tratamento109.

Alergia a inalantes
A MTD raramente é benéfica na alergia inalatória, pois o diagnóstico pode ser rotineiramente estabelecido pela quantificação de sIgE e ST. Entretanto, nos casos de rinite alérgica local (níveis indetectáveis de sIgE e STs negativos com testes de provocação nasal positivos), a MTD permitiu o diagnóstico em 50% dos casos110. Foi ainda relatada uma correlação entre a sensibilidade basofílica e a resposta aos testes de provocação nasal/brônquica, bem como entre a gravidade da asma e a eficácia do tratamento com omalizumabe111,112.

A MTD também tem sido usada para monitorar a imunoterapia alergênica para ácaros e pólenes da poeira doméstica, uma vez que a sensibilidade basófila diminui durante a imunoterapia, provavelmente devido à interferência dos anticorpos IgG bloqueadores 113,114,115,116,117.

Alergia ao veneno de himenópteros
O diagnóstico de alergia ao veneno de himenópteros é rotineiramente baseado em ST e sIgE sérica. A MTD mostrou alta sensibilidade (85-100%) e especificidade (83-100%) e tem sido relatada como útil em casos que produzem resultados equívocos ou em pacientes com história clínica sugestiva de alergia ao veneno, mas sIgE indetectável e ST118,119 negativos. No entanto, a MTD parece não ser preditiva de gravidade para essas reações120,121.

Até 60% dos pacientes apresentam sIgE tanto para o veneno de vespa quanto de abelha, e a identificação de alérgeno dominante é crucial para o tratamento adequado da imunoterapia. Nesses casos, a MTD tem sido relatada como útil na identificação do alérgeno dominante 119,122,123,124. Embora a sIgE para os principais alérgenos dos venenos de abelha e vespa possa reduzir a utilidade da MTD em pacientes com dupla positividade para ambos os venenos, ela fornece informações úteis principalmente em indivíduos com resultados negativos nas determinações de sIgE123.

Alguns estudos sugerem que o MTD pode ser útil como um biomarcador preditivo para efeitos colaterais durante a fase de acúmulo de imunoterapia com veneno, uma vez que essa opção de tratamento tem sido relatada para diminuir a sensibilidade basófila. No entanto, a reatividade não diminui e essa utilidade MTD é hoje controversa 13.120.125.126.127.128.129.130.

Urticária e angioedema
Um subconjunto de pacientes com urticária crônica apresenta fisiopatologia autoinsumível, devido a autoanticorpos IgE para autoalérgenos e autoanticorpos IgG que têm como alvo complexos FcεRI ou IgE-FcεRI presentes na superfície dos mastócitos131,132. Na prática clínica, o diagnóstico desse tipo de urticária crônica tem se baseado no ST sérico autólogo positivo, que apresenta risco de infecção acidental. A MTD tem sido proposta como um teste in vitro para diagnosticar e monitorar pacientes com suspeita de urticária crônica. Foi relatado que a expressão de CD63 e CD203c na superfície dos basófilos está aumentada após a estimulação com soros de pacientes com urticária crônica, mostrando a detecção de autoanticorpos ativos 133,134,135,136,137. Recentemente, tem sido relatado que pacientes com MTD positiva frequentemente experimentam o estado de doença mais ativo, avaliado pelo escore de atividade da urticária, e requerem doses mais altas de anti-histamínicos juntamente com tratamentos de terceira linha (ciclosporina A ou omalizumabe), em comparação com aqueles com MTD138 negativos.

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Protocol

O desempenho do protocolo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsínquia e aprovado pelo Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Espanha. Todos os sujeitos foram informados oralmente sobre o estudo de pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido correspondente.

NOTA: O presente protocolo detalha o procedimento BAT que os autores usam diariamente. No entanto, este não é um método padronizado e existem diferenças com os procedimentos publicados por outros autores. As principais modificações do protocolo estão relacionadas ao uso de IL-3 no tampão de estimulação, tempo de incubação com o estímulo, método de interrupção da degranulação basófila e estratégias de citometria de fluxo. Além disso, diferentes kits comercialmente disponíveis para MTD incluem protocolos específicos recomendados pelo fabricante.

1. Preparação da amostra

  1. Coletar sangue periférico em tubos heparinizados de 9 mL e manter a amostra à temperatura ambiente (RT) em rotor até que seja necessária para o protocolo experimental.
  2. Rotule tubos de citômetro de 5 mL para controles negativos (2 tubos), controles positivos (2 tubos) e diferentes concentrações de alérgeno/droga (1 tubo por cada concentração de alérgeno/droga testada). Coloque os tubos em um rack onde os tubos se encaixam perfeitamente sem escorregar.
  3. Preparar tampão de estimulação em água destilada dupla contendo 2% (v/v) de HEPES, 78 mg/L de NaCl, 3,7 mg/L de KCl, 7,8 mg/L de CaCl 2, 3,3 mg/L de MgCl2, 1 g/L de HSA. Ajuste o pH para 7,4 e adicione IL-3 a 2 ng/mL. Normalmente prepare 100 mL e divida em alíquotas de 2,5 mL para serem congeladas a -20 °C.
  4. Preparar controles positivos em PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Controle positivo 1, N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), para confirmar a qualidade dos basófilos; Controle positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/mL) como controle positivo mediado por IgE.
  5. Prepare o alérgeno/fármaco em PBS-T a 2x a concentração final desejada.
    NOTA: As concentrações ideais de alérgenos/fármacos a utilizar devem ser previamente determinadas utilizando uma vasta gama de concentrações, por curvas dose-resposta e por estudos de citotoxicidade seguindo os mesmos passos do protocolo139.

2. Preparação da mistura de coloração

  1. Adicione anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo ao tampão de estimulação após a concentração de anticorpos recomendada pelo fabricante ou por titulação prévia de anticorpos. Neste protocolo adicionamos 1 μL de cada anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE para identificação basofílica; CD63-FITC para ativação basofílica)140 por 20 μL de tampão de estimulação.
    NOTA: Proteja a preparação da mistura de coloração da luz.
  2. Adicionar 23 μL de mistura de coloração a cada tubo.

3. Estimulação sanguínea

  1. Adicionar 100 μL de PBS-T aos tubos 1 e 2 (controle negativo), 100 μL de fMLP ao tubo 3, 100 μL de anti-IgE ao tubo 4 e 100 μL das diferentes concentrações de alérgeno/droga aos tubos a seguir. Incubar durante 10 min a 37 °C em banho termostático com agitação média para pré-aquecer os reagentes.
  2. Adicione suavemente 100 μL de sangue a cada tubo para evitar a hemólise. Vórtice suavemente os tubos e incubar durante 25 min a 37 °C num banho termostático com agitação média.
  3. Parar a degranulação, mantendo os tubos a 4 °C durante, pelo menos, 5 min.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui a 4 °C por 30-45 min, se necessário141.142.143.

4. Lising de eritrócitos

  1. Adicione 2 mL de tampão lisante 1x a cada tubo para lisar os eritrócitos. Vórtice cada tubo e incubar por 5 min no RT.
    Observação : nesta etapa, as células são fixadas devido a agentes fixadores (formaldeído) contidos no buffer.
  2. Centrífuga a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar o sobrenadante, derrubando o rack em uma pia. As células permanecem na parte inferior dos tubos.
  3. Adicione 3 mL de PBS-T a cada tubo para lavar as células. Vórtice cada tubo.
  4. Centrífuga a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar o sobrenadante, derrubando o rack em uma pia.
    NOTA: Manter as amostras a 4 °C, protegidas da luz até à aquisição do citómetro de fluxo.

5. Aquisição da citometria de fluxo

  1. Adquira amostras por citômetro de fluxo (por exemplo, citômetro de fluxo BD FACSCalibur). Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e aguarde até que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento (Tabela 1).
  2. Inicie a aquisição de amostras.
  3. Utilizar as seguintes estratégias de citômetro para seleção de basófilos ativados139.
    1. Gate os linfócitos do gráfico Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
    2. Gatear os basófilos da população de linfócitos como células CCR3+CD203c+. Adquira pelo menos 500 basófilos por tubo.
    3. Mostre um gráfico CCR3 - CD63 para analisar a ativação usando CD63 como marcador de ativação. Defina o limiar negativo de CD63 para aproximadamente 2,5% usando os tubos de controle negativo.
    4. Adquira todas as amostras.

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Representative Results

A MTD realizada com alérgenos ou drogas permite a investigação de reações de hipersensibilidade dependentes de IgE. A reatividade basófila deve ser medida em pelo menos duas concentrações ótimas, a fim de obter os melhores resultados34 e a ativação é visualizada pela regulação positiva do CD63 na superfície celular. No caso dos alérgenos, além disso, para confirmar a reatividade basófila, a sensibilidade basófila deve ser analisada medindo-se a reatividade em múltiplas concentrações decrescentes de alérgenos114. Essa medida permite a determinação da concentração de alérgenos que induz a resposta de 50% de basófilos (CE50), que pode ser expressa como "CD-sens"141. A medida da área sob a curva de dose (AUC) foi recentemente proposta para avaliar a reatividade basofílica e a sensibilidade basofílica em conjunto58.

A estratégia de citometria de fluxo para análise dos resultados do MTD é mostrada na Figura 1 e na Figura 2 e inclui linfócitos gating do gráfico SSC-FSC (etapa 1), basófilos de gating da população de linfócitos como células CCR3+CD203c+ (passo 2), mostrando um gráfico CCR3 - CD63 para analisar a ativação utilizando CD63 como marcador de ativação (passo 3). As figuras mostram exemplos representativos dos resultados das MTD obtidos para medicamentos (Figura 1) e alérgenos (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Análise representativa do teste de ativação de basófilos de drogas por citometria de fluxo . (A) Gráfico SSC-FSC para selecionar a população de linfócitos+basófilos. (B) CCR3-CD203c plot para tratar basófilos da população de linfócitos como células CCR3+CD203c. (C) Gráfico de CCR3-CD63 para análise de ativação utilizando CD63 como marcador de ativação para controle negativo, controle positivo e fármaco. Os valores apresentados em cada painel representam a percentagem de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise representativa do teste de ativação de basófilos alergênicos por citometria de fluxo. (A) Gráfico SSC-FSC para selecionar a população de linfócitos+basófilos. (B) CCR3-CD203c plot para abrigar basófilos da população de linfócitos como células CCR3+CD203c+. (C) Gráfico de CCR3-CD63 para análise da ativação utilizando CD63 como marcador de ativação mostrando resultados para controle negativo e diminuição das concentrações de alérgeno (Ara h 9). Os valores apresentados em cada painel representam a percentagem de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fontes de Luz (lasers) Laser de iões de argónio argónio coerente SapphireTM refrigerado a ar de 488 nm; 20 mW; Laser refrigerado a ar JDS UniphaseTM HeNe de 633 nm; 17 mW
Comprimento de onda excitatório da luz Laser azul: 488 nm; Laser vermelho: 633 nm
Potência da fonte de luz no comprimento de onda excitatório Laser azul: 20 mW; Laser vermelho: 17 mW
Filtros ópticos CSC: 488/10; FITC: 530/30, PE: 585/42, APC: 660/20
Detectores ópticos FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Detectores ópticos de amarração laser de íons de argônio resfriado a ar
Caminhos ópticos Octógono BD (linha laser de 488 nm); BD Trigons (linha laser de 633 nm)

Quadro 1: Requisitos do citómetro de fluxo

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Discussion

A MTD é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE que tem se mostrado útil no diagnóstico de reações induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica. Em geral, o desempenho das MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) o alérgeno/fármaco não está disponível para ser utilizado para quantificação de ST ou sIgE; iii) existe discordância entre a história clínica e a determinação de ST ou sIgE; iv) os sintomas sugerem que o TS pode induzir uma reação sistêmica; v) prévia à TCC para confirmação de alérgeno/droga culpada10.

Em relação ao protocolo experimental, há diferentes aspectos importantes a serem considerados para a obtenção de amostras de sangue adequadas para o exame. Esteroides sistêmicos 146 e imunossupressores, incluindo corticosteroides orais,147 devem ser evitados antes do teste devido à diminuição da resposta basofílica 146 (anti-histamínicos e esteroides tópicos não afetam os resultados da MTD)146. O teste não deve ser realizado durante infecção ou condições inflamatórias crônicas ativas148. O intervalo de tempo entre a reação e o teste não deve ser superior a 1 ano devido à negativização relatada dos níveis de sIgE ao longo do tempo42,52,149. O teste é realizado com sangue total fresco e não deve ser realizado mais de 24 h após a extração do sangue150,151. O sangue tem que ser coletado em tubos estabilizados com heparina porque os basófilos não degranulam se EDTA ou ácido-citrato dextrose forem usados como estabilizador, embora possa ser usado após a adição de cálcio152. Por outro lado, o estímulo utilizado no teste não deve incluir excipientes; por esta razão, extratos de alérgenos padronizados, alérgenos recombinantes ou purificados, ingredientes ativos puros ou preparações de drogas injetáveis intravenosas são recomendados. Além disso, as características químicas das drogas precisam ser consideradas. Por exemplo, alguns medicamentos são instáveis em solução e devem ser preparados na hora antes de cada teste, e outros são fotolábeis e devem ser realizados enquanto protegem o ensaio da luz48. A toxicidade e a ativação inespecífica devem ser avaliadas para cada alérgeno/fármaco testado e as curvas ROC com pacientes confirmados e os controles tolerantes devem ser analisados para determinar o ponto de corte. Por último, a importância de ambos os controlos positivos deve ser realçada na análise das MTD. fMLP é um peptídeo bacteriano que induz a ativação basófila através do receptor fMLP acoplado à proteína G. Por esse motivo, é frequentemente utilizado como controle positivo da ativação não mediada por IgE16. Anti-IgE ou alternativamente anti-FcεRI são usados como controles positivos da ativação basófila mediada por IgE. Nenhuma ativação basofílica na presença de controles positivos não mediados por IgE e IgE sugere qualidade insuficiente dos basófilos ou erros no protocolo experimental. Em contraste, os basófilos ativados com fMLP, mas não com anti-IgE ou anti-FcεRI são designados como basófilos não respondedores, estimando-se que 6-17% da população geral não responda à estimulação através de FcεRI em MTD 63,84,153, embora expressem densidades normais de IgE superficial celular. A não responsividade pode estar relacionada a baixos níveis de Syk fosfatase 154,155,156, juntamente com o aumento dos níveis de CD45 157. Embora estudos tenham demonstrado que os basófilos não respondedores podem se transformar em respondedores na presença de IL-3158 em ensaios in vitro, os basófilos não respondedores ainda podem ser detectados na MTD e, nesses casos, os resultados não podem ser considerados para avaliação.

Em relação à inclusão de IL-3, uma citocina basófila priming, não existe consenso geral. O uso de IL-3 tem sido relatado para aumentar a responsividade basófila em MTD à base de CD63 sem induzir a regulação positiva de CD63 por si só após um curto pré-tratamento 7.159.160. No entanto, outro estudo sugere que a IL-3 regula positivamente a expressão de CD63 no início do estudo161. Em contraste, no caso das MTD à base de CD203c, estudos confirmam que o priming de IL-3 aumenta a expressão de CD203c por basófilos em repouso, diminuindo as diferenças entre basófilos não estimulados e estimulados e diminuindo a sensibilidade à MTD 159,161.

Diferentes estratégias de gating podem ser usadas para identificar a população basófila e analisar a ativação de basófilos por cyotmetria de fluxo. Os basófilos são células de baixa dispersão lateral que podem ser identificadas por meio de diferentes opções de marcadores de seleção 162,163,164, sendo um ponto-chave que pode afetar a eficiência diagnóstica da MTD165,166. A seleção de marcadores celulares deve ser baseada na especificidade para discriminar basófilos de outras populações celulares, bem como na expressão de marcadores celulares em células em repouso e ativadas. Os marcadores de seleção de basófilos mais conhecidos e comumente utilizados são: CD193 (CCR3) (também expresso em mastócitos, linfócitos Th2162 e eosinófilos), CD123 (também expresso em células dendríticas plasmocitóides HLA-DR+), CD203c (expresso exclusivamente em basófilos e regulado positivamente após ativação basófila) e FcεRI (também expresso em progenitores pluripotentes de mastócitos)139. Com base nesses marcadores celulares e em combinação com o SSC, as estratégias de seleção mais comuns são SSC baixo CCR3+, SSC baixo CCR3+CD203c+ (aplicado neste protocolo),SSC baixo CD123+HLA-DR−, SSC baixo CD203c+CD123+HLA-DR−, SSC baixoFcεRI+HLA-DR− (para descartar células apresentadoras de antígenos e monócitos 146,161 ,162,163), SSC baixo CD203c+CRTH2+CD3- (para excluir células T)164, SSC baixo CD203c+ ou SSC baixo CCR3+CD123+10,162,166, SSC baixoCD123+(CD3-CD14-CD19-CD20-)167,168, e CSCbaixoIgE+169,170, embora este último não seja recomendado devido a limitações em pacientes com baixos níveis de IgE. Após a seleção precisa da população basófila, a ativação geralmente é detectada por meio da detecção de CD63, localizado na membrana de grânulos secretores 16,171 cuja expressão na superfície basófila está diretamente correlacionada com a degranulação basófila e liberação de histamina16,172,173. Outra opção é a análise do CD203c, embora a sensibilidade seja menor devido à sua regulação positiva pela IL-3159.161, expressa constitutivamente em basófilos em repouso e regulada positivamente em basófilos ativados.

A ativação basófila é detectada medindo a porcentagem de células CD63 positivas (MTD baseadas em CD63) ou variações na intensidade média de fluorescência (MFI) CD203c (MTD baseada em CD203c) em comparação com um controle negativo definido como valor limite para cada ensaio. Recomenda-se um limiar de 2,5% de células CD63 positivas no controle negativo (células não estimuladas) para determinar os resultados mais precisos da MTD em comparação com um teste de desafio controlado. A consideração da positividade depende do estímulo testado. A ativação basófila é considerada positiva para um estímulo se a porcentagem de basófilos CD63 positivos na presença do estímulo dividida pela porcentagem de basófilos CD63 positivos no controle negativo for maior do que o ponto de corte calculado pela análise da curva ROC dos dados obtidos de pacientes alérgicos confirmados e doadores saudáveis.

O desempenho da MTD permite distinguir entre a ativação basófila dependente de IgE e independente de IgE analisando o efeito inibitório da wortmannin (WTM)16,174,175, um potente e específico inibidor da fosfoinositida 3-quinase envolvido na ativação basófila mediada por IgE. O ensaio de inibição é realizado por incubação do sangue com WTM (1 μM) a 37 °C por 5 min antes da incubação com o estímulo. Para confirmar que a inibição da MTD com a WTM está correta, deve-se observar a inibição da anti-IgE de controle positivo, mas não da fMLP de controle positivo.

Infelizmente, não há padronização entre diferentes laboratórios em termos de procedimentos, concentrações e marcadores. Estudos multicêntricos futuros são necessários para padronizar o método de comparação de resultados entre centros e para padronizar e validar clinicamente o teste.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Claudia Corazza por seu inestimável suporte em inglês. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Saúde ''Carlos III'' (ISCIII) do MINECO (subvenção co-financiada pelo FEDER: "Una manera de hacer Europa"; Subvenções n.º PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (Grant Nos. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). A ID é Investigadora Clínica (B-0001-2017) e a AA detém um Contrato de Pós-Doutoramento Sénior (RH-0099-2020), ambos apoiados pelo Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (cofinanciado pelo FSE: "Andalucía se mueve con Europa").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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References

  1. Mayorga, C., et al. In vitro tests for drug hypersensitivity reactions: an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 71 (8), 1103-1134 (2016).
  2. Romano, A., et al. Towards a more precise diagnosis of hypersensitivity to beta-lactams - an EAACI position paper. Allergy. 75 (6), 1300-1315 (2020).
  3. Garvey, L. H., et al. An EAACI position paper on the investigation of perioperative immediate hypersensitivity reactions. Allergy. 74 (10), 1872-1884 (2019).
  4. Gomes, E. R., et al. Drug hypersensitivity in children: report from the pediatric task force of the EAACI Drug Allergy Interest Group. Allergy. 71 (2), 149-161 (2016).
  5. Ansotegui, I. J., et al. IgE allergy diagnostics and other relevant tests in allergy, a World Allergy Organization position paper. World Allergy Organization Journal. 13 (2), 100080 (2020).
  6. Jeebhay, M. F., et al. Food processing and occupational respiratory allergy- An EAACI position paper. Allergy. 74 (10), 1852-1871 (2019).
  7. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61 (9), 1028-1039 (2006).
  8. Bochner, B. S. Systemic activation of basophils and eosinophils: markers and consequences. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 106 (5), Suppl 292-302 (2000).
  9. Ghannadan, M., et al. Detection of novel CD antigens on the surface of human mast cells and basophils. International Archives of Allergy and Immunology. 127 (4), 299-307 (2002).
  10. Hoffmann, H. J., et al. The clinical utility of basophil activation testing in diagnosis and monitoring of allergic disease. Allergy. 70 (11), 1393-1405 (2015).
  11. Sainte-Laudy, J., Sabbah, A., Drouet, M., Lauret, M. G., Loiry, M. Diagnosis of venom allergy by flow cytometry. Correlation with clinical history, skin tests, specific IgE, histamine and leukotriene C4 release. Clinical & Experimental Allergy. 30 (8), 1166-1171 (2000).
  12. Sturm, G. J., et al. The CD63 basophil activation test in Hymenoptera venom allergy: a prospective study. Allergy. 59 (10), 1110-1117 (2004).
  13. Erdmann, S. M., et al. The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy. 59 (10), 1102-1109 (2004).
  14. De Weck, A. L., et al. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. International Archives of Allergy and Immunology. 146 (3), 177-189 (2008).
  15. Buhring, H. J., Streble, A., Valent, P. The basophil-specific ectoenzyme E-NPP3 (CD203c) as a marker for cell activation and allergy diagnosis. International Archives of Allergy and Immunology. 133 (4), 317-329 (2004).
  16. Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., Roos, D. Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 88 (3), Pt 1 328-338 (1991).
  17. Fureder, W., Agis, H., Sperr, W. R., Lechner, K., Valent, P. The surface membrane antigen phenotype of human blood basophils. Allergy. 49 (10), 861-865 (1994).
  18. Sanz, M. L., et al. Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clinical & Experimental Allergy. 31 (7), 1007-1013 (2001).
  19. Monneret, G., et al. Monitoring of basophil activation using CD63 and CCR3 in allergy to muscle relaxant drugs. Clin Immunol. 102 (2), 192-199 (2002).
  20. Sanz, M. L., et al. Flow cytometric basophil activation test by detection of CD63 expression in patients with immediate-type reactions to betalactam antibiotics. Clinical & Experimental Allergy. 32 (2), 277-286 (2002).
  21. Ebo, D. G., et al. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 64 (1), 28-33 (2005).
  22. Sudheer, P. S., Hall, J. E., Read, G. F., Rowbottom, A. W., Williams, P. E. Flow cytometric investigation of peri-anaesthetic anaphylaxis using CD63 and CD203c. Anaesthesia. 60 (3), 251-256 (2005).
  23. Binder, M., Fierlbeck, G., King, T., Valent, P., Buhring, H. J. Individual hymenoptera venom compounds induce upregulation of the basophil activation marker ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (CD203c) in sensitized patients. International Archives of Allergy and Immunology. 129 (2), 160-168 (2002).
  24. Hauswirth, A. W., et al. Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 110 (1), 102-109 (2002).
  25. Boumiza, R., et al. Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clinical & Experimental Allergy. 33 (2), 259-265 (2003).
  26. Macglashan, D. Expression of CD203c and CD63 in human basophils: relationship to differential regulation of piecemeal and anaphylactic degranulation processes. Clinical & Experimental Allergy. 40 (9), 1365-1377 (2010).
  27. Mayorga, C., Dona, I., Perez-Inestrosa, E., Fernandez, T. D., Torres, M. J. The Value of In Vitro Tests to DiminishDrug Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  28. Brockow, K., et al. General considerations for skin test procedures in the diagnosis of drug hypersensitivity. Allergy. 57 (1), 45-51 (2002).
  29. Brockow, K., et al. Skin test concentrations for systemically administered drugs -- an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 68 (6), 702-712 (2013).
  30. Torres, M. J., et al. Approach to the diagnosis of drug hypersensitivity reactions: similarities and differences between Europe and North America. Clinical and Translational Allergy. 7, 7 (2017).
  31. Mayorga, C., et al. In vitro tests for drug hypersensitivity reactions: an ENDA/EAACI Drug Allergy Interest Group position paper. Allergy. 71 (8), 1103-1134 (2016).
  32. Mayorga, C., et al. Controversies in drug allergy: In vitro testing. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 56-65 (2019).
  33. Aberer, W., et al. Drug provocation testing in the diagnosis of drug hypersensitivity reactions: general considerations. Allergy. 58 (9), 854-863 (2003).
  34. De Week, A. L., et al. Diagnosis of immediate-type beta-lactam allergy in vitro by flow-cytometric basophil activation test and sulfidoleukotriene production: a multicenter study. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19 (2), 91-109 (2009).
  35. Abuaf, N., et al. Comparison of two basophil activation markers CD63 and CD203c in the diagnosis of amoxicillin allergy. Clinical & Experimental Allergy. 38 (6), 921-928 (2008).
  36. Torres, M. J., et al. The diagnostic interpretation of basophil activation test in immediate allergic reactions to betalactams. Clinical & Experimental Allergy. 34 (11), 1768-1775 (2004).
  37. Torres, M. J., et al. Clavulanic acid can be the component in amoxicillin-clavulanic acid responsible for immediate hypersensitivity reactions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 502-505 (2010).
  38. Eberlein, B., et al. A new basophil activation test using CD63 and CCR3 in allergy to antibiotics. Clinical & Experimental Allergy. 40 (3), 411-418 (2010).
  39. Sanchez-Morillas, L., et al. Selective allergic reactions to clavulanic acid: a report of 9 cases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 126 (1), 177-179 (2010).
  40. Leysen, J., et al. Allergy to rocuronium: from clinical suspicion to correct diagnosis. Allergy. 66 (8), 1014-1019 (2011).
  41. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted diagnostic management of anaphylaxis from rocuronium bromide. Allergy. 61 (8), 935-939 (2006).
  42. Kvedariene, V., et al. Diagnosis of neuromuscular blocking agent hypersensitivity reactions using cytofluorimetric analysis of basophils. Allergy. 61 (3), 311-315 (2006).
  43. Hagau, N., Gherman-Ionica, N., Sfichi, M., Petrisor, C. Threshold for basophil activation test positivity in neuromuscular blocking agents hypersensitivity reactions. Allergy Asthma Clin Immunol. 9 (1), 42 (2013).
  44. Uyttebroek, A. P., et al. Flowcytometric diagnosis of atracurium-induced anaphylaxis. Allergy. 69 (10), 1324-1332 (2014).
  45. Abuaf, N., et al. Validation of a flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of muscle relaxant allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), Pt 1 411-418 (1999).
  46. Aranda, A., et al. In vitro evaluation of IgE-mediated hypersensitivity reactions to quinolones. Allergy. 66 (2), 247-254 (2011).
  47. Fernandez, T. D., et al. Hypersensitivity to fluoroquinolones: The expression of basophil activation markers depends on the clinical entity and the culprit fluoroquinolone. Medicine (Baltimore). 95 (23), 3679 (2016).
  48. Mayorga, C., et al. Fluoroquinolone photodegradation influences specific basophil activation. International Archives of Allergy and Immunology. 160 (4), 377-382 (2013).
  49. Rouzaire, P., et al. Negativity of the basophil activation test in quinolone hypersensitivity: a breakthrough for provocation test decision-making. International Archives of Allergy and Immunology. 157 (3), 299-302 (2012).
  50. Hagau, N., Longrois, D., Petrisor, C. Threshold for positivity and optimal dipyrone concentration in flow cytometry-assisted basophil activation test. Allergy, Asthma & Immunology Research. 5 (6), 383-388 (2013).
  51. Gamboa, P. M., et al. Use of CD63 expression as a marker of in vitro basophil activation and leukotriene determination in metamizol allergic patients. Allergy. 58 (4), 312-317 (2003).
  52. Gomez, E., et al. Immunoglobulin E-mediated immediate allergic reactions to dipyrone: value of basophil activation test in the identification of patients. Clinical & Experimental Allergy. 39 (8), 1217-1224 (2009).
  53. Pinnobphun, P., Buranapraditkun, S., Kampitak, T., Hirankarn, N., Klaewsongkram, J. The diagnostic value of basophil activation test in patients with an immediate hypersensitivity reaction to radiocontrast media. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 106 (5), 387-393 (2011).
  54. Salas, M., et al. Diagnosis of immediate hypersensitivity reactions to radiocontrast media. Allergy. 68 (9), 1203-1206 (2013).
  55. Chirumbolo, S. Basophil activation test (BAT) in the diagnosis of immediate hypersensitivity reactions to radiocontrast media. Allergy. 68 (12), 1627-1628 (2013).
  56. Dona, I., et al. Hypersensitivity Reactions to Multiple Iodinated Contrast Media. Frontiers in Pharmacology. 11, 575437 (2020).
  57. Giavina-Bianchi, P., Galvao, V. R., Picard, M., Caiado, J., Castells, M. C. Basophil Activation Test is a Relevant Biomarker of the Outcome of Rapid Desensitization in Platinum Compounds-Allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 5 (3), 728-736 (2017).
  58. Iwamoto, T., et al. Evaluation of basophil CD203c as a predictor of carboplatin-related hypersensitivity reaction in patients with gynecologic cancer. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (9), 1487-1495 (2012).
  59. Iwamoto, T., et al. Carboplatin-induced severe hypersensitivity reaction: role of IgE-dependent basophil activation and FcepsilonRI. Cancer Science. 105 (11), 1472-1479 (2014).
  60. Muraro, A., et al. EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines: diagnosis and management of food allergy. Allergy. 69 (8), 1008-1025 (2014).
  61. Sato, S., et al. Basophil activation marker CD203c is useful in the diagnosis of hen's egg and cow's milk allergies in children. International Archives of Allergy and Immunology. 152, Suppl 1 54-61 (2010).
  62. Ciepiela, O., et al. Basophil activation test based on the expression of CD203c in the diagnostics of cow milk allergy in children. European Journal of Medical Research. 15, Suppl 2 21-26 (2010).
  63. Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical & Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
  64. Carroccio, A., et al. A comparison between two different in vitro basophil activation tests for gluten- and cow's milk protein sensitivity in irritable bowel syndrome (IBS)-like patients. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (6), 1257-1263 (2013).
  65. Tokuda, R., et al. Antigen-induced expression of CD203c on basophils predicts IgE-mediated wheat allergy. Allergology International. 58 (2), 193-199 (2009).
  66. Chinuki, Y., et al. CD203c expression-based basophil activation test for diagnosis of wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (5), 1404-1406 (2012).
  67. Carroccio, A., et al. Non-celiac wheat sensitivity diagnosed by double-blind placebo-controlled challenge: exploring a new clinical entity. Am J Gastroenterol. 107 (12), 1898-1906 (2012).
  68. Carroccio, A., et al. A cytologic assay for diagnosis of food hypersensitivity in patients with irritable bowel syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 254-260 (2010).
  69. Santos, A. F., et al. Basophil activation test discriminates between allergy and tolerance in peanut-sensitized children. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 645-652 (2014).
  70. Glaumann, S., et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, IgE-sensitization and DBPCFC in peanut-sensitized children. Allergy. 67 (2), 242-247 (2012).
  71. Javaloyes, G., et al. Performance of different in vitro techniques in the molecular diagnosis of peanut allergy. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 22 (7), 508-513 (2012).
  72. Glaumann, S., Nopp, A., Johansson, S. G., Borres, M. P., Nilsson, C. Oral peanut challenge identifies an allergy but the peanut allergen threshold sensitivity is not reproducible. PLoS One. 8 (1), 53465 (2013).
  73. Elizur, A., et al. NUT Co Reactivity - ACquiring Knowledge for Elimination Recommendations (NUT CRACKER) study. Allergy. 73 (3), 593-601 (2018).
  74. Cucu, T., De Meulenaer, B., Bridts, C., Devreese, B., Ebo, D. Impact of thermal processing and the Maillard reaction on the basophil activation of hazelnut allergic patients. Food Chem Toxicol. 50 (5), 1722-1728 (2012).
  75. Worm, M., et al. Impact of native, heat-processed and encapsulated hazelnuts on the allergic response in hazelnut-allergic patients. Clinical & Experimental Allergy. 39 (1), 159-166 (2009).
  76. Brandstrom, J., et al. Basophil allergen threshold sensitivity and component-resolved diagnostics improve hazelnut allergy diagnosis. Clinical & Experimental Allergy. 45 (9), 1412-1418 (2015).
  77. Lotzsch, B., Dolle, S., Vieths, S., Worm, M. Exploratory analysis of CD63 and CD203c expression in basophils from hazelnut sensitized and allergic individuals. Clinical and Translational Allergy. 6, 45 (2016).
  78. Ebo, D. G., Bridts, C. H., Hagendorens, M. M., De Clerck, L. S., Stevens, W. J. Scampi allergy: from fancy name-giving to correct diagnosis. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 18 (3), 228-230 (2008).
  79. Gamboa, P. M., et al. Component-resolved in vitro diagnosis in peach-allergic patients. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19 (1), 13-20 (2009).
  80. Gamboa, P. M., et al. Two different profiles of peach allergy in the north of Spain. Allergy. 62 (4), 408-414 (2007).
  81. Diaz-Perales, A., et al. Recombinant Pru p 3 and natural Pru p 3, a major peach allergen, show equivalent immunologic reactivity: a new tool for the diagnosis of fruit allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 111 (3), 628-633 (2003).
  82. Erdmann, S. M., Heussen, N., Moll-Slodowy, S., Merk, H. F., Sachs, B. CD63 expression on basophils as a tool for the diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and specificity. Clinical & Experimental Allergy. 33 (5), 607-614 (2003).
  83. Erdmann, S. M., et al. In vitro analysis of birch-pollen-associated food allergy by use of recombinant allergens in the basophil activation test. International Archives of Allergy and Immunology. 136 (3), 230-238 (2005).
  84. Rubio, A., et al. Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow's milk in allergic children. Allergy. 66 (1), 92-100 (2011).
  85. Decuyper, I. i, et al. Performance of basophil activation test and specific IgG4 as diagnostic tools in nonspecific lipid transfer protein allergy: Antwerp-Barcelona comparison. Allergy. 75 (3), 616-624 (2020).
  86. Mayorga, C., et al. Basophil response to peanut allergens in Mediterranean peanut-allergic patients. Allergy. 69 (7), 964-968 (2014).
  87. Glaumann, S., et al. Evaluation of basophil allergen threshold sensitivity (CD-sens) to peanut and Ara h 8 in children IgE-sensitized to Ara h 8. Clinical and Molecular Allergy. 13 (1), 5 (2015).
  88. Wolbing, F., et al. The clinical relevance of birch pollen profilin cross-reactivity in sensitized patients. Allergy. 72 (4), 562-569 (2017).
  89. Commins, S. P., et al. Delayed clinical and ex vivo response to mammalian meat in patients with IgE to galactose-alpha-1,3-galactose. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (1), 108-115 (2014).
  90. Santos, A. F., et al. Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (1), 179-186 (2015).
  91. Song, Y., et al. Correlations between basophil activation, allergen-specific IgE with outcome and severity of oral food challenges. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 114 (4), 319-326 (2015).
  92. Chinthrajah, R. S., et al. Development of a tool predicting severity of allergic reaction during peanut challenge. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 121 (1), 69-76 (2018).
  93. Santos, A. F., Shreffler, W. G. Road map for the clinical application of the basophil activation test in food allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (9), 1115-1124 (2017).
  94. Santos, A. F., et al. Biomarkers of severity and threshold of allergic reactions during oral peanut challenges. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 146 (2), 344-355 (2020).
  95. Reier-Nilsen, T., et al. Predicting reactivity threshold in children with anaphylaxis to peanut. Clinical & Experimental Allergy. 48 (4), 415-423 (2018).
  96. Chapuis, A., et al. h 2 basophil activation test does not predict clinical reactivity to peanut. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 6 (5), 1772-1774 (2018).
  97. Patil, S. U., et al. Early decrease in basophil sensitivity to Ara h 2 precedes sustained unresponsiveness after peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (5), 1310-1319 (2019).
  98. Chinthrajah, R. S., et al. Sustained outcomes in oral immunotherapy for peanut allergy (POISED study): a large, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet. 394 (10207), 1437-1449 (2019).
  99. Kim, E. H., et al. Long-term sublingual immunotherapy for peanut allergy in children: Clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (5), 1320-1326 (2019).
  100. Tsai, M., Mukai, K., Chinthrajah, R. S., Nadeau, K. C., Galli, S. J. Sustained successful peanut oral immunotherapy associated with low basophil activation and peanut-specific IgE. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (3), 885-896 (2020).
  101. Nachshon, L., et al. Efficacy and Safety of Sesame Oral Immunotherapy-A Real-World, Single-Center Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 7 (8), 2775-2781 (2019).
  102. Goldberg, M. R., et al. Efficacy of baked milk oral immunotherapy in baked milk-reactive allergic patients. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 136 (6), 1601-1606 (2015).
  103. Keet, C. A., et al. The safety and efficacy of sublingual and oral immunotherapy for milk allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (2), 448-455 (2012).
  104. Matsui, T., et al. Changes in passively-sensitized basophil activation to alphaS1-casein after oral immunotherapy. Immunity, Inflammation and Disease. 8 (2), 188-197 (2020).
  105. Giavi, S., et al. Oral immunotherapy with low allergenic hydrolysed egg in egg allergic children. Allergy. 71 (11), 1575-1584 (2016).
  106. Jones, S. M., et al. Clinical efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124 (2), 292-300 (2009).
  107. Burks, A. W., et al. Oral immunotherapy for treatment of egg allergy in children. New England Journal of Medicine. 367 (3), 233-243 (2012).
  108. Elizur, A., et al. Clinical and laboratory 2-year outcome of oral immunotherapy in patients with cow's milk allergy. Allergy. 71 (2), 275-278 (2016).
  109. Gernez, Y., et al. Basophil CD203c levels are increased at baseline and can be used to monitor omalizumab treatment in subjects with nut allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 154 (4), 318-327 (2011).
  110. Gomez, E., et al. Role of the basophil activation test in the diagnosis of local allergic rhinitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (4), 975-976 (2013).
  111. Nopp, A., et al. Basophil allergen threshold sensitivity: a useful approach to anti-IgE treatment efficacy evaluation. Allergy. 61 (3), 298-302 (2006).
  112. Dahlen, B., et al. Basophil allergen threshold sensitivity, CD-sens, is a measure of allergen sensitivity in asthma. Clinical & Experimental Allergy. 41 (8), 1091-1097 (2011).
  113. Lalek, N., Kosnik, M., Silar, M., Korosec, P. Immunoglobulin G-dependent changes in basophil allergen threshold sensitivity during birch pollen immunotherapy. Clinical & Experimental Allergy. 40 (8), 1186-1193 (2010).
  114. Schmid, J. M., Wurtzen, P. A., Dahl, R., Hoffmann, H. J. Early improvement in basophil sensitivity predicts symptom relief with grass pollen immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 741-744 (2014).
  115. Sharif, H., et al. Immunologic mechanisms of a short-course of Lolium perenne peptide immunotherapy: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 144 (3), 738-749 (2019).
  116. Kim, S. H., et al. Changes in basophil activation during immunotherapy with house dust mite and mugwort in patients with allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 8 (1), 6 (2018).
  117. Feng, M., et al. Allergen Immunotherapy-Induced Immunoglobulin G4 Reduces Basophil Activation in House Dust Mite-Allergic Asthma Patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 30 (2020).
  118. Korosec, P., et al. Clinical routine utility of basophil activation testing for diagnosis of hymenoptera-allergic patients with emphasis on individuals with negative venom-specific IgE antibodies. International Archives of Allergy and Immunology. 161 (4), 363-368 (2013).
  119. Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., De Clerck, L. S., Stevens, W. J. Hymenoptera venom allergy: taking the sting out of difficult cases. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 17 (6), 357-360 (2007).
  120. Ebo, D. G., et al. Flow-assisted quantification of in vitro activated basophils in the diagnosis of wasp venom allergy and follow-up of wasp venom immunotherapy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (3), 196-203 (2007).
  121. Ott, H., Tenbrock, K., Baron, J., Merk, H., Lehmann, S. Basophil activation test for the diagnosis of hymenoptera venom allergy in childhood: a pilot study. Klin Padiatr. 223 (1), 27-32 (2011).
  122. Eberlein-Konig, B., Rakoski, J., Behrendt, H., Ring, J. Use of CD63 expression as marker of in vitro basophil activation in identifying the culprit in insect venom allergy. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 14 (1), 10-16 (2004).
  123. Eberlein, B., Krischan, L., Darsow, U., Ollert, M., Ring, J. Double positivity to bee and wasp venom: improved diagnostic procedure by recombinant allergen-based IgE testing and basophil activation test including data about cross-reactive carbohydrate determinants. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), 155-161 (2012).
  124. Sturm, G. J., et al. Inconsistent results of diagnostic tools hamper the differentiation between bee and vespid venom allergy. PLoS One. 6 (6), 20842 (2011).
  125. Zitnik, S. E., et al. Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatric Allergy and Immunology. 23 (2), 166-172 (2012).
  126. Kosnik, M., Silar, M., Bajrovic, N., Music, E., Korosec, P. High sensitivity of basophils predicts side-effects in venom immunotherapy. Allergy. 60 (11), 1401-1406 (2005).
  127. Celesnik, N., et al. Short-term venom immunotherapy induces desensitization of FcepsilonRI-mediated basophil response. Allergy. 67 (12), 1594-1600 (2012).
  128. Nullens, S., et al. Basophilic histamine content and release during venom immunotherapy: insights by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (3), 173-178 (2013).
  129. Bidad, K., Nawijn, M. C., Van Oosterhout, A. J., Van Der Heide, S., Elberink, J. N. Basophil activation test in the diagnosis and monitoring of mastocytosis patients with wasp venom allergy on immunotherapy. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 86 (3), 183-190 (2014).
  130. Eberlein-Konig, B., Schmidt-Leidescher, C., Behrendt, H., Ring, J. Predicting side-effects in venom immunotherapy by basophil activation. Allergy. 61 (7), 897 (2006).
  131. Kikuchi, Y., Kaplan, A. P. Mechanisms of autoimmune activation of basophils in chronic urticaria. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 107 (6), 1056-1062 (2001).
  132. Huston, D. P., Sabato, V. Decoding the Enigma of Urticaria and Angioedema. Journal of Allergy and Clinical Immunology Practice. 6 (4), 1171-1175 (2018).
  133. Netchiporouk, E., et al. Positive CD63 Basophil Activation Tests Are Common in Children with Chronic Spontaneous Urticaria and Linked to High Disease Activity. International Archives of Allergy and Immunology. 171 (2), 81-88 (2016).
  134. Irinyi, B., et al. Extended diagnostic value of autologous serum skin test and basophil CD63 expression assay in chronic urticaria. British Journal of Dermatology. 168 (3), 656-658 (2013).
  135. Chen, Q., et al. Basophil CD63 expression in chronic spontaneous urticaria: correlation with allergic sensitization, serum autoreactivity and basophil reactivity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (3), 463-468 (2017).
  136. Wedi, B., Novacovic, V., Koerner, M., Kapp, A. Chronic urticaria serum induces histamine release, leukotriene production, and basophil CD63 surface expression--inhibitory effects ofanti-inflammatory drugs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 105 (3), 552-560 (2000).
  137. Yasnowsky, K. M., et al. Chronic urticaria sera increase basophil CD203c expression. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1430-1434 (2006).
  138. Curto-Barredo, L., et al. Basophil Activation Test identifies the patients with Chronic Spontaneous Urticaria suffering the most active disease. Immunity, Inflammation and Disease. 4 (4), 441-445 (2016).
  139. Santos, A. F., Alpan, O., Hoffmann, H. J. Basophil activation test: Mechanisms and considerations for use in clinical trials and clinical practice. Allergy. , (2021).
  140. Boumiza, R., Debard, A. L., Monneret, G. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clinical and Molecular Allergy. 3, 9 (2005).
  141. Aljadi, Z., et al. Activation of basophils is a new and sensitive marker of biocompatibility in hemodialysis. Artif Organs. 38 (11), 945-953 (2014).
  142. Rasmussen, P., Spillner, E., Hoffmann, H. J. Inhibiting phosphatase SHIP-1 enhances suboptimal IgE-mediated activation of human blood basophils but inhibits IgE-mediated activation of cultured human mast cells. Immunology Letters. 210, 40-46 (2019).
  143. Mueller-Wirth, N., et al. IgE-mediated chlorhexidine allergy-Cross-reactivity with other biguanide disinfectants. Allergy. 75 (12), 3237-3247 (2020).
  144. Johansson, S. G., et al. Passive IgE-sensitization by blood transfusion. Allergy. 60 (9), 1192-1199 (2005).
  145. Ariza, A., et al. Basophil activation after nonsteroidal anti-inflammatory drugs stimulation in patients with immediate hypersensitivity reactions to these drugs. Cytometry A. 85 (5), 400-407 (2014).
  146. Sturm, G. J., et al. The basophil activation test in the diagnosis of allergy: technical issues and critical factors. Allergy. 64 (9), 1319-1326 (2009).
  147. Iqbal, K., Bhargava, K., Skov, P. S., Falkencrone, S., Grattan, C. E. A positive serum basophil histamine release assay is a marker for ciclosporin-responsiveness in patients with chronic spontaneous urticaria. Clinical and Translational Allergy. 2 (1), 19 (2012).
  148. Korosec, P., et al. high-affinity IgE receptors, and CCL2 in human anaphylaxis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (3), 750-758 (2017).
  149. Fernandez, T. D., et al. Negativization rates of IgE radioimmunoassay and basophil activation test in immediate reactions to penicillins. Allergy. 64 (2), 242-248 (2009).
  150. Kwok, M., Lack, G., Santos, A. F. Improved standardisation of the whole blood basophil activation test to peanut. Clinical and Translational Allergy. 8 (26), Suppl 2 15-16 (2017).
  151. Mukai, K., et al. Assessing basophil activation by using flow cytometry and mass cytometry in blood stored 24 hours before analysis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 889-899 (2017).
  152. Sousa, N., Martinez-Aranguren, R., Fernandez-Benitez, M., Ribeiro, F., Sanz, M. L. Comparison of basophil activation test results in blood preserved in acid citrate dextrose and EDTA. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 20 (6), 535-536 (2010).
  153. Knol, E. F., Koenderman, L., Mul, F. P., Verhoeven, A. J., Roos, D. Differential activation of human basophils by anti-IgE and formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine. Indications for protein kinase C-dependent and -independent activation pathways. European Journal of Immunology. 21 (4), 881-885 (1991).
  154. Macglashan, D. W. Basophil activation testing. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (4), 777-787 (2013).
  155. Macglashan, D., Moore, G., Muchhal, U. Regulation of IgE-mediated signalling in human basophils by CD32b and its role in Syk down-regulation: basic mechanisms in allergic disease. Clinical & Experimental Allergy. 44 (5), 713-723 (2014).
  156. Macglashan, D. Subthreshold desensitization of human basophils re-capitulates the loss of Syk and FcepsilonRI expression characterized by other methods of desensitization. Clinical & Experimental Allergy. 42 (7), 1060-1070 (2012).
  157. Grochowy, G., Hermiston, M. L., Kuhny, M., Weiss, A., Huber, M. Requirement for CD45 in fine-tuning mast cell responses mediated by different ligand-receptor systems. Cell Signaling. 21 (8), 1277-1286 (2009).
  158. Schroeder, J. T., Chichester, K. L., Bieneman, A. P. Human basophils secrete IL-3: evidence of autocrine priming for phenotypic and functional responses in allergic disease. Journal of Immunology. 182 (4), 2432-2438 (2009).
  159. Ocmant, A., et al. Flow cytometry for basophil activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of cat allergy. Journal of Immunology Methods. 320 (1-2), 40-48 (2007).
  160. Gentinetta, T., et al. Individual IL-3 priming is crucial for consistent in vitro activation of donor basophils in patients with chronic urticaria. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 128 (6), 1227-1234 (2011).
  161. Sturm, E. M., et al. CD203c-based basophil activation test in allergy diagnosis: characteristics and differences to CD63 upregulation. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 78 (5), 308-318 (2010).
  162. Hausmann, O. V., et al. Robust expression of CCR3 as a single basophil selection marker in flow cytometry. Allergy. 66 (1), 85-91 (2011).
  163. Nucera, E., et al. Utility of Basophil Activation Test for monitoring the acquisition of clinical tolerance after oral desensitization to cow's milk: Pilot study. United European Gastroenterol Journal. 3 (3), 272-276 (2015).
  164. Imoto, Y., et al. Peripheral basophil reactivity, CD203c expression by Cryj1 stimulation, is useful for diagnosing seasonal allergic rhinitis by Japanese cedar pollen. Immunity, Inflammation and Disease. 3 (3), 300-308 (2015).
  165. Konstantinou, G. N., et al. EAACI taskforce position paper: evidence for autoimmune urticaria and proposal for defining diagnostic criteria. Allergy. 68 (1), 27-36 (2013).
  166. Santos, A. F., Becares, N., Stephens, A., Turcanu, V., Lack, G. The expression of CD123 can decrease with basophil activation: implications for the gating strategy of the basophil activation test. Clinical and Translational Allergy. 6, 11 (2016).
  167. Dijkstra, D., et al. Identification and quantification of basophils in the airways of asthmatics following segmental allergen challenge. Cytometry A. 85 (7), 580-587 (2014).
  168. Dijkstra, D., Meyer-Bahlburg, A. Human Basophils Modulate Plasma Cell Differentiation and Maturation. Journal of Immunology. 198 (1), 229-238 (2017).
  169. Sihra, B. S., Kon, O. M., Grant, J. A., Kay, A. B. Expression of high-affinity IgE receptors (Fc epsilon RI) on peripheral blood basophils, monocytes, and eosinophils in atopic and nonatopic subjects: relationship to total serum IgE concentrations. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (5), 699-706 (1997).
  170. Dehlink, E., Baker, A. H., Yen, E., Nurko, S., Fiebiger, E. Relationships between levels of serum IgE, cell-bound IgE, and IgE-receptors on peripheral blood cells in a pediatric population. PLoS One. 5 (8), 12204 (2010).
  171. Hoffmann, H. J., Frandsen, P. M., Christensen, L. H., Schiotz, P. O., Dahl, R. Cultured human mast cells are heterogeneous for expression of the high-affinity IgE receptor FcepsilonRI. International Archives of Allergy and Immunology. 157 (3), 246-250 (2012).
  172. Ebo, D. G., et al. Analyzing histamine release by flow cytometry (HistaFlow): a novel instrument to study the degranulation patterns of basophils. Journal of Immunology Methods. 375 (1-2), 30-38 (2012).
  173. Macglashan, D. Marked differences in the signaling requirements for expression of CD203c and CD11b versus CD63 expression and histamine release in human basophils. International Archives of Allergy and Immunology. 159 (3), 243-252 (2012).
  174. Torres, M. J., et al. Clavulanic acid can be the component in amoxicillin-clavulanic acid responsible for immediate hypersensitivity reactions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 502-505 (2010).
  175. Ariza, A., et al. Pyrazolones metabolites are relevant for identifying selective anaphylaxis to metamizole. Scientific Reports. 6, 23845 (2016).

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Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia
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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).

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