Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

OnePot PURE Cell-Free System

Published: June 23, 2021 doi: 10.3791/62625
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en hurtig og omkostningseffektiv metode til at producere det rekombinante PURE cellefrie TX-TL-system ved hjælp af standard laboratorieudstyr.

Abstract

Det definerede PURE (proteinsyntese ved hjælp af rekombinante elementer) transskription-oversættelsessystem giver et tiltalende chassis til cellefri syntetisk biologi. Desværre er kommercielt tilgængelige systemer dyre, og deres tunability er begrænset. Til sammenligning kan en hjemmelavet tilgang tilpasses baseret på brugernes behov. Forberedelsen af hjemmelavede systemer er imidlertid tidskrævende og besværlig på grund af behovet for ribosomer samt 36 mellemstore proteinrensninger. Strømlining af proteinrensning ved kokulturering og co-rensning giver mulighed for at minimere tid og arbejdskraft krav. Her præsenterer vi en nem, justerbar, tids- og omkostningseffektiv metode til at producere alle PURE-systemkomponenter inden for 1 uge ved hjælp af standard laboratorieudstyr. Desuden kan OnePot PURE's ydeevne sammenlignes med kommercielt tilgængelige systemer. OnePot PURE-forberedelsesmetoden udvider tilgængeligheden af PURE-systemet til flere laboratorier på grund af dets enkelhed og omkostningseffektivitet.

Introduction

Cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) systemer udgør en lovende platform for undersøgelse og engineering biologiske systemer. De giver forenklede og tunable reaktionsforhold, da de ikke længere er afhængige af livsopretholdende processer, herunder vækst, homøostase eller reguleringsmekanismer1. Det forventes således, at cellefrie systemer vil bidrage til undersøgelsen af biomolekyllære systemer, tilbyde en ramme for at teste rationelle biodesignstrategier2og give et chassis til en fremtidig syntetisk celle3,4. Det fuldt rekombinante PURE-system tilbyder et særligt tiltalende chassis på grund af dets definerede og minimale sammensætning samt dets indstillingsmuligheder og tuneability5.

Siden det første funktionelle, fuldt rekombinante PURE-system blev etableret i 20015, er der gjort en indsats for at udvide systemgrænserne og optimere systemets sammensætning for at forbedre systemets udbytter6,7,8, give mulighed for transskriptionel regulering9,membran 10,11 og sekretorisk proteinsyntese12og for at lette proteinfoldning13,14 . I dag er der tre kommercielt tilgængelige systemer: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) og Magic PURE (Creative Biolabs). Disse systemer er imidlertid dyre, deres nøjagtige sammensætning er proprietær og dermed ukendt, og tilpasningsevnen er begrænset.

PURE-systemer, der er fremstillet internt, viste sig at være den mest omkostningseffektive og tunableløsningsmodel 15,16. Men de krævede 37 rensningstrin til protein- og ribosomfraktioner er tidskrævende og kedelige. Der er gjort adskillige forsøg på at forbedre effektiviteten af PURE-systemforberedelsen17,18,19. Vi har for nylig vist, at det er muligt at coculture og co-rense alle nødvendige ikke-ribosomale proteiner til stede i PURE-systemet. Denne OnePot-metode har vist sig at være omkostningseffektiv og tidseffektiv og reducere forberedelsestiden fra flere uger til 3 arbejdsdage. Tilgangen genererer et PURE-system med en proteinproduktionskapacitet svarende til det kommercielt tilgængelige PURExpress system20. I modsætning til de tidligere metoder til at forenklePURE-præparatet 17,18,19i OnePot-tilgangen udtrykkes alle proteiner stadig i separate stammer. Dette gør det muligt for brugeren at justere sammensætningen af OnePot PURE-systemet ved blot at udelade eller tilføje specifikke stammer eller justere podningsmængderne og dermed generere dropout PURE-systemer eller ændre de endelige proteinforhold.

Protokollen præsenteres her giver en detaljeret metode til at skabe OnePot PURE-systemet som beskrevet tidligere20, selv om β-mercaptoethanol blev erstattet med tris (2-carboxyethyl)fosphin (TCEP). Desuden er to metoder til ribosomrensning beskrevet: traditionel tagfri ribosomrensning ved hjælp af hydrofobisk interaktion og saccharosepude, tilpasset fra Shimizu et al.15, og Ni-NTA ribosomrensning baseret på Wang et al.18 og Ederth et al.21, men væsentligt modificeret. Sidstnævnte metode letter yderligere udarbejdelsen af PURE-systemet og gør det tilgængeligt for flere laboratorier, da der kun kræves standardlaboratorieudstyr.

Forsøgsprotokollen opsummerer forberedelsen af et alsidigt PURE cellefrit TX-TL-system for at give en enkel, tunable, omkostningseffektiv cellefri platform, som kan fremstilles ved hjælp af standard laboratorieudstyr inden for en uge. Udover at introducere standard PURE-sammensætningen, angiver vi, hvordan og hvor den kan justeres, med primært fokus på kritiske trin i protokollen for at sikre systemets funktionalitet.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol beskriver forberedelsen af cellefrit TX-TL-system fra rekombinante komponenter. For nemheds skyld er arbejdet opdelt i fem dele. Den første del beskriver forberedelsestrin, som skal udføres, før protokollen startes. Den anden del beskriver forberedelsen af OnePot-proteinopløsningen. Den tredje del beskriver ribosomrensninger, den fjerde del beskriver forberedelsen af energiopløsningen, og den sidste del giver en manual til opsætning af en PURE-reaktion. For nemheds skyld er protokollerne opdelt i dage og opsummeret i daglige tidsplaner i tabel 1. Efter tidsplanen kan hele systemet udarbejdes om 1 uge af en person.

1. Indledende arbejde

  1. Forbered bakteriekulturmediet og medietillæggene som beskrevet i supplerende tabel 1. Forbered og sterilisere de nødvendige materialer, herunder pipettespidser, 96 dybbårne plader.
  2. Belastningspræparat
    1. Transformer de udtryksstammer, der er angivet i tabel 2, med de tilsvarende udtryksvektorer ved hjælp af varmestødsmetoden.
      1. Tilsæt renset plasmid til de kemisk kompetente bakterier og inkuber på is i 20-30 min.
      2. Anbring blandingen ved 42 °C i 30 s (varmechok), og læg den derefter tilbage på isen i 2 min.
      3. Pipette 20 μL af bakterierne direkte på agarplader indeholdende ampicillin (AMP) og inkuberes ved 37 °C natten over. Pladerne opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
      4. Pode 3 mL af LB medier, der indeholder AMP med en enkelt koloni af bakterier fra agar plader. Inkuberes ved 37 °C, mens du ryster ved 260 omdr./min natten over.
      5. Miks 250 μL af kulturen med 250 μL på 50% (v/v) glycerol og opbevares ved -80 °C.
        BEMÆRK: For hurtigere forberedelse i fremtiden skal stammerne opbevares i en 96-brønds plade samt glycerollagre.
    2. Bekræft alle vektortransformationer efter koloni-PCR og sekventering. Sekvens genet, promotor region, og ribosom bindende site.
  3. Test af udtryk
    1. Pod 300 μL LB-medier, der indeholder AMP, med ca. 1 μL af de forberedte glycerollagre i en 1,3 mL dyb brøndplade. Forsegl pladen med en åndbar membran, og inkuber derefter ved 37 °C, mens den ryster ved 260 omdr./min natten over.
      BEMÆRK: Alle udtryk udføres separat på dette tidspunkt.
    2. Pod 300 μL friske LB-medier, der indeholder AMP, med 1 μL af nattens kulturer. Inkuberes ved 37 °C, mens du ryster ved 260 omdr./min natten over. Efter 2 timer fremkaldes cellerne med 100 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og vokser i yderligere 3 timer.
    3. 10 μL af kulturen blandes med 10 μL 2x Laemmli buffer og varme til 95 °C i 10 min. Spin prøverne i 1 min ved hjælp af en bordcentrifuge og læg 10 μL af supernatanten på en PAGE gel. Kør gelen i Tris/Glycin/SDS buffer ved 200 V i 30 min. Skyl det godt med deioniseret vand. Dæk gelen med en Coomassie proteinplet og inkuber i 1 time. Afsmit gelen i vand, hvis det er nødvendigt (repræsentative resultater for udtrykstesten i figur 1).
      BEMÆRK: Brug gradient (4%-15% eller 4%-20%) PAGE geler for at opnå en god adskillelse.
  4. Restaurering og rengøring af IMAC Sepharose-harpiks
    1. Kolonneforberedelse.
      1. Bland Sepharose harpiks godt ved hvirvlen.
      2. Pipette den nødvendige mængde harpiks i en tom tyngdekraft flow kolonne.
        BEMÆRK: Den nødvendige mængde harpiks varierer mellem hans ribosomrensning og proteinrensning og er specificeret i de respektive sektioner.
      3. Vask harpiksen med 30 mL deioniseret vand.
      4. Fortsæt med kolonneopladning som angivet i punkt 1.4.4.
        BEMÆRK: Lad altid al væsken passere gennem kolonnen, før du fortsætter med det næste trin. Sørg dog for, at kolonnen aldrig løber tør. Når du kører væske gennem kolonnen, skal du sørge for at stoppe strømmen eller fortsætte til næste trin, så snart væsken når harpiksen.
    2. Restaurering.
      1. Vask kolonnen med 30 mL deioniseret vand.
      2. Påfør 10 mL af en 0,2 M EDTA og 0,5 M NaCl-opløsning.
      3. Tilføj 30 mL af en 0,5 M NaCl-løsning.
      4. Vask søjlen med 50 mL deioniseret vand.
      5. Opbevares i 20% (v/v) ethanol ved 4 °C eller fortsæt med næste trin.
    3. Rensning.
      FORSIGTIG: Brug værnemidler.
      1. Vask kolonnen med 30 mL på 0,5 M NaOH.
      2. Vask kolonnen med 30 mL deioniseret vand.
      3. Kolonnen vaskes med 30 ml 0,1 M eddikesyre.
      4. Vask kolonnen med 30 mL deioniseret vand.
      5. Kolonnen vaskes med 30 mL 70% (v/v) ethanol.
      6. Vask søjlen med 50 mL deioniseret vand.
      7. Opbevares i 20% (v/v) ethanol ved 4 °C eller fortsæt med næste trin.
    4. Genopladning.
      1. Kolonnen tilsættes 10 mL 0,1 M nikkelsulfatopløsning.
        ADVARSEL: Nikkelsulfat er giftigt. Nikkelsulfataffald skal kasseres med de forholdsregler, som leverandøren har angivet.
      2. Vask søjlen med 50 mL deioniseret vand.
      3. Opbevares i 20% (v/v)) ethanol ved 4 °C eller fortsættes med søjle ekvilibrering.
        BEMÆRK: Hvis kolonnen opbevares i ethanol mellem trinene, skal du sørge for at fjerne alle spor af ethanol ved at vaske kolonnen med vand.

2. OnePot proteinopløsning udtryk og rensning

BEMÆRK: Protokollen består af tre dele opdelt i dage (figur 2). En ideel præparation giver 1,5 mL 13,5 mg/mL OnePot proteinopløsning, hvilket svarer til mere end tusind 10 μL PURE-reaktioner. Mængden og den ideelle koncentration af opløsningen varierer dog fra batch til batch. Erfarne brugere kan udføre flere OnePot PURE-forberedelser ad gangen.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskud som beskrevet i supplerende tabel 1.
  2. Forbered og sterilisere de nødvendige materialer, herunder pipettespidser, to 96 dybbårne plader og en 1 L forvirret Erlenmeyer kolbe.
  3. Forbered buffere og tillæg som beskrevet i supplerende tabel 2. Filtrer sterilisere alle buffere ved hjælp af flaske top filtre (0,45 μm) og opbevares ved 4 °C. Suppler alle buffere med 1 mM TCEP lige før brug, medmindre andet er angivet.
  4. Brug 2 mL sepharoseharpiks til OnePot proteinrensning. Forbered kolonnen som beskrevet i afsnit 1.4.
  5. For at forberede startkulturerne skal du kombinere 20 mL LB-medier med 20 μL AMP. I en steril 96, 1,3 mL dyb brøndplade tilsættes 300 μL af mediet i 35 brønde. Pod hver af dem med sin respektive stamme, undtagen forlængelse faktor termo ustabil (EF-Tu), og forsegle pladen med en åndbar membran.
    BEMÆRK: Pod pladen ved hjælp af en 96-brønd replikator (se Materialetabel). Brøndvolumen af dyb brøndpladen og startkulturens volumen er afgørende. Større medievolumener eller mindre brøndvolumener vil føre til en anden bakterietæthed på grund af befrugtning uoverensstemmelser.
  6. For EF-Tu-kulturen podes 3 mL LB-medier i et 14 mL kulturrør med en snap cap. En enkelt kultur på 3 mL for EF-Tu er tilstrækkelig til én OnePot-udtrykskultur.
  7. Inkuberes ved 37 °C, mens du ryster ved 260 omdr./min natten over.

Dag 2:
BEMÆRK: Udfør alle trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Overfør 500 mL LB-medier og 500 μL AMP til den sterile forvirrede kolbe.
  2. Pode OnePot PURE-kulturen med 1675 μL af EF-Tu-kulturen og 55 μL af hver af kulturerne fra dybbårspladen (tabel 2).
    BEMÆRK: I løbet af dette trin kan den samlede proteinsammensætning justeres ved at indstille podningsforholdet. Sørg for, at den samlede podningsvolumen forbliver konstant på 3,6 mL.
    VALGFRIT: For at bekræfte, at alle stammer er vokset fra den ene dag til den anden, måles den optiske tæthed af nattens kulturer ved 600 nM (OD600)i en 96-brønds plade ved hjælp af en pladelæser. Brug en fortynding på 10x til målingen af den optiske tæthed.
  3. Inkuberes kulturen i 2 timer ved 37 °C med en rysten på 260 omdrejninger, eller indtil OD600 af kulturen når 0,2-0,3.
  4. Fremkald kulturen med 500 μL på 0,1 mM IPTG og vokse i yderligere 3 timer.
  5. Høst cellerne ved centrifugering ved 4 °C og 3220 x g i 10 min og opbevar cellepillen ved -80 °C, indtil den er yderligere udnyttet.
    BEMÆRK: For at optimere timingen skal den energiopløsning, der er beskrevet i afsnit 4, forberedes i inkubationstiderne på dag 2 (tabel 1).

Dag 3:

  1. Mål de mængder buffere , der er nødvendige for den rensning , der er beskrevet i nedenstående trin , og tilføj TCEP til dem alle som angivet i supplerende tabel 2. Opbevar de resterende buffere uden TCEP ved 4 °C til fremtidige rensninger.
  2. Ekvilibrere den ladede kolonne (punkt 2.4) med 30 mL buffer A. Når 25 mL buffer A er gået igennem, skal du lukke kolonnen fra bunden. Parallelt hermed fortsætte med trin 2.15-2.17.
  3. Optø cellerne og bruge en serologisk pipette til at genbruge cellepillen i 7,5 mL buffer A.
  4. Lyse cellerne ved hjælp af en 130-watt sonde soniker (se Tabel af materialer, sonde tip diameter: 6 mm) med følgende parametre: 4 x 20 s puls på, 20 s puls off, 70% amplitud. Hvis sonikering lykkes, bliver opløsningen mørkere (Figur 2).
    BEMÆRK: Sørg for at holde cellerne på is under sonikering. Anbring sonden dybt nok ind i opløsningen uden at røre røret. Hvis der genereres en stor mængde skum, vil energioverførslen blive dæmpet. I så fald lad skummet bosætte sig, sænk sonden dybere ind i opløsningen og forlænge sonikeringstiden.
  5. Celleaffaldet fjernes ved centrifugering ved 21130 x g i 20 min ved 4 °C umiddelbart efter sonikering. Hold lysatet på is.
  6. Føj supernatanten til den ekvilibrerede kolonne. Luk kolonnen fra toppen, og sørg for, at der ikke er nogen lækage. Inkuberes kolonnen i 3 timer ved 4 °C under rotation ved hjælp af en rørrotator.
  7. Elute ubundne komponenter fra kolonnen og vask med 25 mL buffer A.
  8. Kolonnen vaskes med 25 mL 25 mM imidazolebuffer (23,95 mL buffer A og 1,25 mL buffer B).
  9. Elitummerne med 5 mL 450 mM imidazolebuffer (0,5 mL buffer A og 4,5 mL buffer B). Hold de eluted proteiner på is på alle tidspunkter.
  10. Fortynd eluatet med 25 mL HT buffer, hold blandingen på is. Der tilsættes 15 mL til et 15 mL centrifugalfilter, og koncentrat koncentrat til et volumen på 1,5 mL. De resterende 15 mL til filteret tilsættes med den koncentrerede opløsning, og koncentraten koncentreres igen til 1,5 mL.
  11. Tilsættes 10 mL HT-buffer til den koncentrerede prøve og koncentrat til 1 mL. Tilsæt en tilsvarende mængde lagerbuffer B, og opbevar ved -80 °C, indtil den er yderligere udnyttet.
    BEMÆRK: En runde udveksling/koncentration tager ca. 60 min spinding ved 3220 x g ved 4 °C.
  12. Under bufferudvekslingen skal du gendanne kolonnen som angivet i afsnit 1.4.

Dag 4:

  1. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen som beskrevet af leverandøren. Koncentrer prøven med et 0,5 mL 3 kDa cutoff centrifugalfilter til 20 mg/mL.
    BEMÆRK: Proteinopløsningen fortyndes 25 gange eller 50 gange før koncentrationsmålingerne for at undgå overmættet Bradford-analysen.
  2. For at fastslå den ideelle proteinkoncentration skal der på dette stadium (afsnit 5.2) udføres en ekspressionstest med forskellige koncentrationer af proteinopløsningen. For at udføre titreringen skal opløsningens samlede volumen holdes konstant og pipette OnePot-proteinopløsningen, herunder lagerbuffer B, ved fem forskellige nøgletal (supplerende tabel 7).
  3. Kontroller OnePot PURE-proteinsammensætningen ved hjælp af SDS-PAGE (Figur 3A). Prøven fortyndes med 7,5 μL vand, blandes med 10 μL 2x Laemmli-bufferen, og 5 μL og 2,5 μL af prøverne på gelen. Kør SDS-PAGE som angivet i afsnit 1.3.3.
  4. Aliquot proteinopløsningen i 50 μL aliquots efter at have kontrolleret udtrykket og justering af koncentrationen. Gem OnePot PURE-proteinopløsningen ved -80 °C, indtil den anvendes yderligere.
    BEMÆRK: Hvis der er mistanke om, at en proteinkomponent ikke er til stede eller er til stede i en koncentration, der er lavere end forventet i OnePot PURE, skal du udføre følgende trin.
  5. Kontroller, om nattens kultur for den respektive stamme er vokset med en sammenlignelig hastighed som de andre kulturer ved at udføre optiske tæthedsmålinger (OD600)af alle kulturer.
  6. Udfør en yderligere ekspressionstest af den specifikke stamme for at kontrollere det mistænkelige proteins udtryk.

3. Ribosomopløsning

BEMÆRK: To forskellige ribosom rensning strategier er indført, en for hexahistidin-tagged og en for ikke-mærkede ribosomer. Den største fordel ved rensningsmetoden ved hjælp af Hans-rensning på en standard affinitet Ni-NTA tyngdekraft flow kolonne er, at rensningen er let, hurtig, og kræver ikke yderligere laboratorieudstyr, såsom en FPLC system og en ultracentrifuge. Proteinproduktionskapaciteten i OnePot PURE-reaktioner er dog omkring en tredjedel sammenlignet med tagfrie ribosomer. Vælg derfor metoden til ribosomproduktion baseret på, om et højt udbytte er vigtigt for den givne anvendelse.

  1. Hans mærkede ribosom rensning
    BEMÆRK: Denne protokol udnytter E. coli RB1 stamme, en gave fra professor Wang (Columbia University, USA)18. Denne stamme har en genomisk indsættelse af en hexahistidin tag på C-endestationen af 50S ribosomale protein (L7/L12), giver mulighed for rensning ved hjælp af en Ni-NTA tyngdekraft-flow kolonne. Det sædvanlige udbytte er ca. 0,5 mL af 3,45 μM ribosomer, hvilket er tilstrækkeligt til mere end fem hundrede 10 μL PURE reaktioner.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskud som beskrevet i supplerende tabel 1.
  2. Forbered og sterilisere de nødvendige materialer, herunder pipettespidser, en 5 L Erlenmeyer kolbe og en 100 mL Erlenmeyer kolbe.
  3. Forbered buffere og tillæg som beskrevet i supplerende tabel 2. Filtrer sterilisere alle buffere ved hjælp af flaske top filtre (0,45 μm) og opbevare dem ved 4 °C.

Dag 2:

  1. Pipette 5 mL harpiks til en kolonne og forberede kolonnen som angivet i punkt 1.4.
    BEMÆRK: På grund af den højere mængde af harpiksen tager restaureringen og rensningen betydeligt længere tid. Brug en anden kolonne til ribosomrensning for at undgå krydskontaminering og rengør den grundigt før rensningen.
  2. Forbered en overnatning kultur E. coli RB1 stamme ved at pode 35 mL af LB medier i en 100 mL Erlenmeyer kolbe. Inkuberes ved 37 °C, mens du ryster ved 260 omdrejninger.

Dag 3:
BEMÆRK: Udfør alle trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Tilsæt 2 L LB-medier i en steril kolbe på 5 L, podes med 12 mL af nattens kultur, og inkuber derefter i 3-4 timer ved 37 °C, mens der rystes ved 260 omdrejninger.
    BEMÆRK: Alternativt kan du udføre bakteriel dyrkning i 4 x 500 mL kulturer i 1 L forvirrede kolber.
  2. Pjecellerne ved centrifugering i 10 min ved 3220 x g og 4 °C. Opbevares ved -80 °C, indtil den er videre.

Dag 4:

  1. Ekvilibrere den kolonne, der er udarbejdet i trin 3.1.4. med 30 mL lysis buffer.
  2. Brugpillen i 20 mL lysisbuffer ved hjælp af en serologisk pipette.
  3. Lyse cellerne med en 130-watt sonde soniker (se Tabel over materialer, sondespids diameter: 6 mm) på is med følgende parametre: 11 x 20 s puls på; 20'ere puls off, 70% amplitud (se trin 2.16 for procedure detaljer).
  4. Umiddelbart efter sonikering fjernes celleaffaldet ved centrifugering i 20 min ved 21130 x g ved 4 °C. Hold lysatet på is.
  5. Læg supernatanten på kolonnerne, og lad den passere igennem.
  6. Kolonnen vaskes med følgende blandinger af lysis- og elutionbuffere.
    1. Vask 0: Brug 30 mL lysis buffer.
    2. Vask 1: Brug 30 mL 5 mM imidazole (29 mL lysis buffer, 1 mL elution buffer).
    3. Vask 2: Brug 60 mL 25 mM imidazole (50 mL lysis buffer, 10 mL elution buffer).
    4. Vask 3: Brug 30 mL 40 mM imidazole (22 mL lysis buffer, 8 mL elution buffer).
    5. Vask 4: Brug 30 mL 60 mM imidazole (18 mL lysis buffer, 12 mL elution buffer).
  7. Ribosomer med 7,5 mL af elutionbufferen. Hold de eluted proteiner på is på alle tidspunkter.
  8. Der tilsættes 22 μL ren β-mercaptoethanol til 45 mL ribosombuffer.
    FORSIGTIG: β-mercaptoethanol er giftigt. Tag sikkerhedsforanstaltninger og arbejde i en røghætte.
  9. Eluatet tilsættes til et 15 mL centrifugalfilter og koncentrat til 1 mL.
  10. Tilsæt 15 mL ribosombuffer til den koncentrerede prøve, og koncentrer den igen til 1 mL.
    BEMÆRK: Gentag det forrige trin to gange.
  11. Opbevares ved -80 °C, indtil den er videre.
    BEMÆRK: En runde udveksling/koncentration tager ca. 60 min centrifugering ved 3220 x g ved 4 °C.
  12. Under bufferudvekslingen skal du gendanne kolonnen som angivet i afsnit 1.4.

Dag 5:

  1. Ribosomkoncentrationen bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nM af en prøve fortyndet 1:100 i ribosombuffer. En absorbansværdi på 10 af den fortyndede opløsning svarer til 23 μM ufortyndet opløsning som tidligere beskrevet16.
  2. Der gennemføres en endelig bestandskoncentration på 3,45 μM. For at justere koncentrationen fortyndes ribosomer med ribosombuffer eller koncentreres yderligere ved centrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa 0,5 mL centrifugalfilter ved 4 °C.
    BEMÆRK: For at opnå optimalt systemudtryk skal der udføres en ribosomkoncentrationstitterration (punkt 5.2, supplerende tabel 7).
  3. Ribosomsammensætningen kontrolleres ved hjælp af SDS-PAGE (Figur 3A) som angivet i punkt 1.3.3. 2,5 μL af prøven med 7,5 μL vand, blandes med 10 μL 2x Laemmli buffer, og læg derefter 5 μL og 2,5 μL af prøverne på gelen.

  1. Tagfri ribosomrensning
    BEMÆRK: Tagfri ribosomrensning udføres ved hjælp af et FPLC-system (Materialetabel) og er baseret på hydrofobisk interaktionskromatografi ved hjælp af 2 x 5 ml Butyl-kolonner (Materialetabel). Selv om ribosomer kan renses fra enhver stamme, ved hjælp af E. coli A19 (E. coli Genetiske Ressourcer på Yale CGSC) stamme er fordelagtigt på grund af sin RNase I sletning22. Udfør rensningen ved 4 °C i enten et kølerum eller et køleskab. Det sædvanlige udbytte er ca. 0,5 mL af 10 μM ribosomer, hvilket svarer til mere end fem hundrede 10 μL PURE-reaktioner.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskud som beskrevet i supplerende tabel 1.
  2. Forbered og sterilisere de nødvendige materialer, herunder pipettespidser, 5 L Erlenmeyer kolbe og 100 mL Erlenmeyer kolbe.
  3. Forbered buffere og tillæg som beskrevet i supplerende tabel 2. Filtrer sterilisere alle buffere ved hjælp af flaske top filtre (0,45 μm) og opbevare dem ved 4 °C.

Dag 2:

  1. For at forberede en overnatning kultur af E. coli A19 stamme, pode 35 mL af LB medier i en 100 mL Erlenmeyer kolbe. Inkuberes ved 37 °C, mens du ryster ved 260 omdrejninger.

Dag 3:

  1. Overfør 2 L LB-medier til den sterile baffled kolbe på 5 L, pod med 30 mL af nattens kultur, og inkuber derefter i 3-4 timer ved 37 °C, mens den ryster ved 200 omdrejninger.
  2. Pellet cellerne ved centrifugering ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C. Brug pillet i 25 mL af suspensionsbufferen og opbevares ved -80 °C, indtil den anvendes yderligere.

Dag 4:

  1. Udfør trin 3.2.8-3.2.12 parallelt med trin 3.2.13-3.2.19.
  2. Tø og lyse cellerne ved hjælp af en 130-watt sonde soniker (se Tabel over materialer og sonde tip diameter: 6 mm) på is med følgende parametre: 12 x 20 s puls på; 20'ere puls off, 70% amplitud (se trin 2.16 procedure detaljer).
  3. Fjern straks celleaffaldet ved centrifugering ved 20000 x g i 20 min ved 4 °C.
  4. Aspirere supernatanten og måle lydstyrken. Tilsæt en lige stor mængde af suspension buffer (højt salt) for at justere den endelige koncentration af ammonium sulfat til 1,5 M og bland godt.
  5. Bundfaldet fjernes ved centrifugering ved 20000 x g i 20 min ved 4 °C.
  6. Supernatanten filtreres med et 0,45 μm polyethersulfonmembransprøjtefilter før FPLC-rensning, og filtratet opsamles i en 100 mL glasflaske. Hold supernatanten på 4 °C hele tiden.
  7. Konfigurer FPLC-systemet til hydrofobisk interaktion kromatografirensning ved hjælp af en dobbelt Butyl kolonne (2 x 5 ml) som følger. I forbindelse med denne opsætning refererer en kolonnevolumen (CV) til en diskenhed på 10 mL.
  8. Der er behov for tre indløb: to som bufferlinjer og en som prøvelinje. På grund af renserens standardindstillinger er det praktisk at vælge linjerne A1 og B1 til henholdsvis buffer C og buffer D og linje A2 som eksempellinje. Anvende en standardstrømningshastighed på 4 mL/min, bortset fra pumpevask (10 mL/min), eller medmindre andet er angivet.
    BEMÆRK: Da TCEP er et dyrt reagens, skal du først tilføje det tilsvarende beløb til bufferE C og D efter ækvilibreringstrinnet.
  9. Udfør en systempumpevask i 20 % ethanol(v/v)) for at rense systemet og fjerne potentiel forurening fra tidligere rensninger. Indstil manuelt en strømningshastighed på 0,2 mL/min, og monter kolonnen. Stop strømmen.
  10. Udfør en systempumpe vask med vand. Vask kolonnen med 3 CV vand.
  11. Ekvilibrering: Placer indløb A1 og A2 i buffer C og indløb B1 i buffer D uden TCEP. Udfør en pumpe vask og ekvilibrere kolonnen med 4 CV af buffer C.
  12. Føj TCEP til bufferne C og D.
  13. Forbered 15 ML rør eller klare runde fraktion samlerrør til fraktionen samler til at indsamle 4-5 mL elution fraktioner.
  14. Lastning: Anbring indløbet A2 i flasken med den filtrerede prøve. Læg ca. 90 % af prøvevolumenet på kolonnen. Prøven fortyndes med 20 mL TCEP-holdige buffer C, og prøvens 10 mL på kolonnen. Gentag fortyndingstrinnet mindst to gange, og læg så meget prøve på kolonnen som muligt. Det er afgørende at sikre, at der ikke suges luft ind i maskinen.
  15. Vasketrin 1: Vask med 3 CV buffer C for at fjerne de ubundne komponenter.
  16. Vasketrin 2: vask med 5 CV med 80% buffer C og 20% buffer D.
  17. Elution: Eluter produktet ved at anvende 50% af buffer C og 50% af buffer D, med en samlet udløsning volumen på 5 CV. Saml denne fraktion i opsamlerrørene.
  18. Vasketrin 3: Elute alle stærkt interagerende forurenende stoffer ved hjælp af 100% buffer D med en samlet volumen på 5 CV.
  19. Prøvefraktionens absorptionsspektrum analyseres ved 260 eller 280 nM (figur 4). Den første top viser de ikke-absorberede proteiner, der er eluteret under lastning og det første vasketrin; den anden top viser forurenende stoffer, der er blevet eluted under det andet vasketrin. Den tredje top overvåger det endelige produkt, og den sidste top viser de stærkt interagerende forurenende stoffer. Pulje alle prøvefraktioner svarende til den tredje top til videre behandling. Hold de eluted proteiner på is på alle tidspunkter.
  20. Overlejr forsigtigt den genvundne fraktion på 15 mL af pudebufferen i fire polycarbonat ultracentrifugeringsrør. Der må maksimalt tilføjes 15 mL af prøven til 15 mL af pudebufferen. Sørg for at afbalancere vægten af røret godt. Pellet ribosomer ved ultracentrifugering ved 100000 x g ved 4 °C i 16 timer.
    BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er revner i ultracentrifugeringsrørene.
  21. Rengør og nulstil kolonnen på følgende måde. En strømningshastighed på 5 mL/min fungerer godt. Placer alle indløb i vandet og udføre en pumpe vask. Vask kolonnen med 2 CV vand.
    1. Anbring indløbet i en 0,5 M NaOH-opløsning, udfør en pumpevask, og vask derefter kolonnen med 3 CV fra NaOH.
    2. Placer indløbet i vand, udfør en pumpe vask, og vask derefter kolonnen i 2 CV af vand.
    3. Indløbet placeres på en 0,1 M eddikesyreopløsning, udfør en pumpevask, og vask derefter kolonnen med 3 CV eddikesyreopløsning.
    4. Pump vask og vask kolonnen med 2 CV vand.
    5. Placer alle indløb i 20% ((v/v)) ethanol, udfør et pumpevasketrin, og opbevar kolonnen i 20% ((v/v)) ethanol ved at vaske den med 3 CV af en ethanolopløsning på 20 % (v/v)).
      BEMÆRK: Sørg for, at systemet aldrig løber tør eller suger luft ind. Anvend aldrig buffer direkte på ethanol eller ethanol på bufferen. Tilsæt altid et vandvask trin imellem, da der ellers er risiko for bundfald, der tilstopper kolonnen. Sørg for at tilføje nok prøveopsamlingsrør.

Dag 5:

  1. Kassér supernatanten, og vask hver pille med 0,5 mL iskold ribosombuffer uden at forstyrre den gennemsigtige pellet. Gentag dette trin to gange.
  2. Resuspend hver af de klare pellets i 100 μL ribosom buffer på is ved hjælp af en magnetisk rørstang (3 mM diameter, 10 mM længde) på en magnetisk omrører ved hjælp af den lavest mulige hastighed. Saml de genophængte ribosomer og vask rørene med yderligere 50 μL ribosombuffer.
    BEMÆRK: Den gennemsigtige pellet er svær at se. Vask derfor forsigtigt pelleten fra siderne af røret.
  3. Ribosomkoncentrationen bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nM af den udvandede prøve i et forhold på 1:100 i ribosombuffer. En absorbans på 10 af den fortyndede opløsning svarer til 23 μM ufortyndet opløsning som tidligere beskrevet16.
  4. Der gennemføres en endelig bestandskoncentration på 10 μM. For at justere koncentrationen fortyndes ribosomer med ribosombuffer eller koncentreres yderligere ved centrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa centrifugalfilter ved 4 °C.
    BEMÆRK: For at opnå optimalt systemudtryk skal der udføres ribosomtitering (punkt 5.2, supplerende tabel 7).
  5. Ribosomsammensætningen med SDS-PAGE (Figur 3A) som angivet i punkt 1.3.3. Prøven fortyndes med 7,5 μL vand, blandes med 10 μL 2x Laemmli-bufferen, og 5 μL og 2,5 μL af prøverne på gelen.

4. Energiløsning

BEMÆRK: Sammensætningen af den 2,5x energiløsning, der introduceres her, er et eksempel på en løsning, der fungerede godt for en standard TX-TL-reaktion. For at optimere timingen skal energiløsningen forberedes i løbet af dag 2. Forberedelsen af aminosyreopløsningen forklares i detaljer efterfulgt af den endelige forberedelsesprocedure.

  1. Aminosyreopløsning
    BEMÆRK: Forbered aminosyreopløsningen i bulk. Ved tilberedning af den mængde aminosyrelageropløsninger, der er nødvendige for et endeligt volumen på mindst 2000 μL, reduceres vejefejlen for de ellers meget små mængder. Den samlede koncentration af aminosyreopløsningen er begrænset af aminosyrernes opløselighed og de respektive lageropløsningskoncentrationer. Til standard PURE-systemet skal du forberede en opløsning med en endelig koncentration på 3,25 mM. Brug beregningstabellen for aminosyreopløsning (supplerende tabel 3) som skabelon. Brug cystein i saltformen for at sikre tilstrækkelig opløselighed. Undgå at bruge KOH-baserede aminosyre præparat metoder. Det er muligt direkte at veje de nøjagtige mængder aminosyrer ind i den endelige aminosyreopløsning uden at forberede lageropløsning til alle aminosyrerne. Dette er dog mere udfordrende og mindre præcist.
    1. Forbered lageropløsninger for hver aminosyre som beskrevet i supplerende tabel 3, undtagen tyrosin.
      BEMÆRK: På grund af de forskellige opløseligheder af aminosyrerne i vand er de respektive foreslåede koncentrationer af lageropløsningen forskellige.
    2. Minimal masse [mg] giver den omtrentlige minimumsmasse, der kræves for at opnå en tilstrækkelig mængde lageropløsning til målets samlede volumen som reference.
      BEMÆRK: Den minimale masse beregnes med et overskud på 10%.
    3. For en lettere forberedelse af opløsningerne skal du ikke veje den nøjagtige mængde aminosyre, men juster i stedet for den foreliggende masse mængden af vand for at opnå den ønskede koncentration. Beregn den mængde deioniseret vand (Vand, der skal tilsættes [μL]), baseret på den faktiske masse udfyldt (lysegule celler) og den ønskede koncentration ved hjælp af regnearket i supplerende tabel 3.
    4. Opløse aminosyre lagerløsninger ved vortexing indtil alle bundfald er opløst. De enkelte aminosyre lageropløsninger kan opbevares ved -20 °C i flere uger.
      BEMÆRK: Nogle aminosyrer er vanskelige at opløse i vand; processen kan tage lidt tid.
    5. Afvej den nøjagtige mængde tyrosin, der kræves for at opnå en endelig koncentration på 3,25 mM direkte ind i røret til aminosyreopløsningen.
      BEMÆRK: Tyrosin er meget vanskeligt at opløse i vand. Tilføj det direkte i stedet for at forberede en lagerløsning.
    6. Tilsæt de tilsvarende mængder aminosyre lageropløsninger og vand som angivet i det endelige volumen for at tilføje [μL] kolonne (lyseblå celler) og hvirvle opløsningen godt. Opbevar den færdige aminosyreopløsning ved -80 °C indtil videre brug.
  2. Forberedelse af energiløsningen
    BEMÆRK: I alt indeholder 2,5x energiopløsningen 0,75 mM af hver aminosyre, 29,5 mM magnesiumacetat, 250 mM kaliumglutamat, 5 mM ATP og GTP hver, 2,5 mM CTP, UTP og TCEP, henholdsvis 8,75 mg/ml tRNA fra E. coli MRE 600, 50 mM kreatinphosphat, 0,05 mM folinsyre, 5 mM spermidin og 125 mM HEPES. Førstegangsbrugere forbereder energiopløsningen i små partier på 200 μL. Opbevar de enkelte løsninger, der er fremstillet i henhold til supplerende tabel 4, ved -20 °C eller -80 °C til senere brug.
    1. Optø alle vandige løsninger, der er nævnt i supplerende tabel 5, på is.
    2. I mellemtiden forberedes lagerløsningerne til de resterende komponenter, der er anført i supplerende tabel 4. Opbevar alle løsningerne på is efter tilberedning.
      BEMÆRK: Der tilsættes 500 μL RNase og DNasefrit vand direkte til hætteglasset for at opløse de lyfile tRNAs. Bland godt ved blid hvirvlen; begrænse pipettering for at undgå at indføre RNases.
    3. Tilsæt de beregnede mængder (supplerende tabel 5) af lageropløsninger og vand og bland godt ved hjælp af en vortex. Hold opløsningen på is hele tiden.
    4. Opløsningens pH-pc ved at pipettere 1 μL på en pH-strimmel for at sikre, at opløsningens pH-pc er neutral.
    5. Aliquot energiopløsningen ved 50-100 μL pr. rør på is og opbevares ved -80 °C, indtil den anvendes yderligere. Mens aliquoting, hvirvle de vigtigste materiel ofte for at forhindre komponenterne i at fremskynde.
      BEMÆRK: Eventuelt skal du foretage en aktivitetsanalyse af den nylavede energiløsning mod kommercielle energiløsninger, f.eks. løsning A i PURExpress. Hvis der observeres en betydeligt lavere ydeevne af systemet med energiopløsningen, kan optimering af ionkoncentrationerne, især magnesiumioner, ved titrering (5-20 mM) være fordelagtig.

5. OnePot PURE reaktion

  1. DNA-skabelon
    BEMÆRK: Proteiner, der er kodet nedstrøms for T7-promotoren, kan udtrykkes i PURE fra enten lineært eller cirkulært DNA. Ved at generere en lineær DNA-skabelon ved hjælp af udvidelse PCR, kedelig kloning trin kan udelades. De lineære skabeloner til denne undersøgelse blev genereret af PCR som beskrevet nedenfor ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase (Tabel over materialer). Primersekvenser, smeltetemperaturer og de termocyklusindstillinger, der bruges i denne undersøgelse, er angivet i supplerende tabel 6. Forberedelsen af DNA-skabelonen er ikke inkluderet i den daglige tidsplan.
    1. Konfigurer en PCR-reaktion som anbefalet af polymeraseleverandøren.
      BEMÆRK: Optimerede parametre for en dna-polymerase (Materialetabel) er angivet i supplerende tabel 6.
    2. Forstærk målgenet (f.eks. eGFP) som en lineær skabelon fra et plasmid eller genom ved hjælp af genspecifikke primere (500 nM) (for parametrene, se supplerende tabel 6).
    3. Forstærkningen genererer korte udvidelser for at give udglødningssekvenser til følgende udvidelses-PCR-trin.
    4. Kontroller ampliconen på en agarosegel for korrekt størrelse og renhed.
    5. Brug det forstærkede DNA som skabelon til de efterfølgende udvidelsestrin. Der opstilles en reaktion på mindst 50 μL.
    6. Kør 10 PCR-forstærkningscyklusser med udvidelsesgrundere (2,5 nM). Når forstærkningscyklusserne er afsluttet, skal du straks tilføje de endelige primere (500 nM) til den samme reaktion og køre 30 cyklusser for at forstærke det udvidede PCR-produkt. Find smeltetemperaturer og primersekvenser i supplerende tabel 6.
    7. Rense DNA-fragmenter ved hjælp af en DNA-rensning kit og elute DNA i nuclease-fri vand i stedet for EDTA indeholder elution buffer.
    8. Kontroller den lineære skabelon på en agarosegel for korrekt størrelse og renhed.
    9. Mål DNA-koncentrationen i ng/μL ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer.
  2. Opsætning af PURE-reaktionen
    BEMÆRK: Den endelige reaktion sammensætning er 1x energi løsning, tag-fri ribosomer eller His-tag ribosomer, OnePot PURE proteiner, og DNA skabelon. Forholdet mellem reaktionsvolumen omfatter 40% energiopløsning, 30% protein og ribosomopløsning og 30% DNA og vand. Typiske reaktionsvolumener varierer mellem 5 μL og 25 μL. Kvantificer ekspressionen af et fluorescerende protein kontinuerligt på en pladelæser. Brug et grønt lys in vitro Oversættelse Mærkning System, som inkorporerer fluorescerende mærket Lysin rester i nyligt syntetiseret proteiner, for at kontrollere udtrykket af ikke-fluorescerende proteiner på en SDS-PAGE gel. Der gives et eksempel på reaktionsskabelonen i Supplerende tabel 7 for at hjælpe med at etablere en PURE cellefri udtryksreaktion. Celler i gul angiver brugerinputværdier, og celler i orange angiver yderligere reagenser, der eventuelt skal føjes til reaktionen. Hold volumenforholdet for komponenterne præcist for at sikre den korrekte ionbalance. For eksempel, for at opnå en højere proteinkoncentration, øge OnePot proteinopløsning koncentration; dog ikke øge mængden af proteinopløsning tilsat reaktionen.
    1. Udfyld DNA'ets koncentration [ng/μL] og længde [basispar] i de tilsvarende gule celler i regnearket. Brug 2-10 nM DNA til reaktionen.
    2. Udfyld det ønskede samlede reaktionsvolumen i μL.
    3. Fjern de nødvendige reagenser fra fryseren og optø dem på is.
      BEMÆRK: Det er muligt at genfryse komponenterne uden et fald i funktionaliteten. Men minimere antallet af fryse-optø cykler og tid prøver opbevares på is så meget som muligt.
    4. Pipette de beregnede mængder vand, DNA og energi løsning til den ene side af PCR-røret eller et hjørne af en brønd på 384-brønd plade. Tilsæt den nødvendige mængde af eventuelle ekstra reagens på samme side. Minimer antallet af prøver pr. eksperiment for at undgå fordampning af prøver og eksperimentel starttidspunktsbias.
      BEMÆRK: Det er afgørende at holde energikomponenten fysisk adskilt fra proteinkomponenterne for at undgå for tidligt forbrug af energikilderne og lavere udbytter.
    5. Pipette de beregnede mængder protein og ribosomopløsning til den anden side af et PCR-rør eller det modsatte hjørne af 384-brøndspladen.
      BEMÆRK: Brug masterblandinger, når det er muligt, for at reducere virkningen af pipetteringsfejl. Efter indledende test kan ribosom- og proteinopløsningerne blandes og opbevares som én løsning.
    6. Spin i kort tid (30 s) for at fusionere reaktionskomponenterne. For at undgå fordampning under pladelæserforsøg tilsættes 35 μL flydende voks og forsegles pladen med et gennemsigtigt fugemasse (se Materialetabel).
    7. Inkuberes i mindst 3 timer ved 37 °C.
    8. Ved udlæsning på en pladelæser måles fluorescensintensiteten ved den krævede bølgelængde hvert andet minut (repræsentative resultater er vist i figur 3B).
    9. Udfør følgende trin for Green Lys-mærkede eksempler.
    10. Efter cellefrit udtryk inkuberes prøven med 0,16 μg/μL RNase A i 30 min ved 37 °C for at fjerne lysstofrøret på Green Lys-mærkningssættet.
      BEMÆRK: Brug RNase A, da andre typer RNases ikke fjerner baggrunden tilstrækkeligt godt.
    11. Visualiser proteinudtrykket ved at køre SDS-PAGE som angivet i punkt 1.3.3. Vask den ufarvede gel forsigtigt i deioniseret vand, og billede den på en fluorescerende billedmager ved hjælp af en excitation bølgelængde på 488 nm.
    12. Efterfølgende plette gelen ved hjælp af konventionelle Coomassie farvning metoder. For de egnede parametre henvises til punkt 1.3.3.
      BEMÆRK: Udfør en titrering af proteinopløsningen med den anbefalede ribosomkoncentration og om nødvendigt titrere ribosomer med den optimale OnePot-proteinkoncentration bagefter. Brug det kommercielle PURExpress ΔRibosome-sæt som en positiv kontrol. Løsning A, Factor Mix og ribosomopløsningen svarer til henholdsvis den forberedte energi, OnePot-proteinopløsningen og de rensede ribosomer.

Representative Results

Ovenstående protokol er designet til at lette etableringen af PURE cellefri TX-TL-system i ethvert laboratorium. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af præparatet af de tre forskellige dele af PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosom- og energiopløsningen. En detaljeret daglig tidsplan, der optimerer arbejdsprocessen, vises i tabel 1. Arbejdsgangen er optimeret til rensning af hans mærkede ribosomer, og tidsrammerne kan variere lidt, hvis der udføres tagfri ribosomrensning. Et præparat giver en tilstrækkelig mængde PURE til mindst 500 μL-reaktioner. Desuden er de forberedte opløsninger stabile i mere end et år ved -80 °C og kan modstå flere fryse-optøningscyklusser.

Passende overekspressionsniveauer for alle stammer er afgørende for funktionaliteten af den endelige proteinopløsning. Figur 1 viser vellykket overekspression i alle 36 individuelle stammer, der efterfølgende anvendes til OnePot-proteinpræparatet. Variation i de over-udtrykte proteiners båndintensiteter forekom sandsynligvis på grund af en bias i indlæsningsmængderne på SDS-PAGE gelen. De forventede proteinstørrelser er sammenfattet i tabel 2. GlyRS og PheRS består af to underenheder af forskellig molekylvægt; de resterende 34 proteiner består af en enkelt underenhed. Nøglen til denne protokols enkelhed og tidseffektivitet er coculturing- og co-purification-trinnet (Figur 2). OnePot-proteinopløsningen blev fremstillet ved at øge forholdet mellem EF-Tu-stammen med hensyn til alle de andre udtryksstammer. Den samlede sammensætning af de endelige proteiner blev analyseret af SDS-PAGE (Figur 3A). Fra gelerne (vognbane 2, 3) er det mærkbart, at EF-Tu (43,3 kDa) er til stede i en højere koncentration sammenlignet med de andre proteiner som forventet. Mens gelen giver en god første indikation af proteinekspressionsforhold, er det svært at afgøre, om og på hvilket niveau hvert enkelt protein blev udtrykt. Derfor anbefales det stærkt at bekræfte overekspressionen i hver stamme før coculturing, som vist ovenfor.

E. coli ribosom er en kompleks molekylær maskine bestående af over 50 individuelle proteinunderenheder23. Et repræsentativt absorptionsspektrum ved 260 nm for tagfri ribosomrensning er vist i figur 4; den tredje top er karakteristisk for vellykket ribosom elution. For begge ribosomrensningsmetoder blev det forventede løbemønster på SDS-PAGE gelen (Figur 3A)18 observeret. Vi observerede forureninger for begge rensninger, omend i små mængder (<10%). Især var forskellige forurenende stoffer til stede i de tagfrie (vognbaner 5, 6) og hans mærkede (vognbaner 11, 12) ribosomer på grund af variationen i metoden. Til brugerreference er SDS-PAGE gelerne til de kombinerede systemer også inkluderet (vognbane 8, 9 og 14, 15).

Endelig sammenlignes de forberedte systemers ydeevne (figur 3) ved hjælp af de forskellige ribosomvarianter. Tidskurserne for in vitro eGFP-udtryk viser, at begge PURE-systemer er funktionelle og producerer fluorescerende eGFP. OnePot-proteinopløsningen kombineret med de hist mærkede ribosomer ved hjælp af ribosomkoncentrationen, der var optimeret ved titrering, gav imidlertid kun en tredjedel af udtryksniveauet i den ikke-mærkede ribosomversion (Figur 3B). Lignende resultater blev observeret, når tre proteiner af forskellig størrelse blev udtrykt og mærket ved hjælp af Green Lys tRNA in vitro-mærkningssystemet (Figur 3C). Som det ses på fluorescerende gel, blev produkter i fuld længde med succes udtrykt i begge systemer; Men kun omkring halvdelen af udtryksniveauet blev opnået med His-tag ribosom system. Ud over fluorescensmærkningen kan de forventede bånd for alle tre proteiner skelnes på en Coomassie-farvet gel (Figur 3D). Resultaterne viser, at det indførte ekspressionssystem, som kan fremstilles inden for en uge i et laboratorium med standardudstyr, kan bruges til in vitro-ekspression af proteiner, der er kodet nedstrøms af T7-promotoren fra lineære skabeloner.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative resultater for overekspressionstesten for alle ekspresstammer i PURE-systemet. PURE proteintal og -størrelser er sammenfattet i tabel 2. Proteinnumrene 21, 24 og 27 er markeret med en stjerne for bedre visualisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: OnePot proteinrensning. Den skematiske skildring og tilsvarende fotografier af alle trin, der er involveret i produktionen af OnePot-proteinopløsningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: De forberedte systemers ydeevne ved hjælp af de forskellige ribosomvarianter. (A) Coomassie blå farvede SDS-PAGE geler af OnePot-proteinopløsningen (vognbaner 2, 3), tagfri ribosomer uden proteinopløsning (vognbane 5, 6) og med proteinopløsning (vognbane 8, 9), Hans mærkede ribosomer uden proteinopløsning (vognbane 11, 12) og med proteinopløsning (vognbane 14, 15). Der blev indlæst to forskellige koncentrationer pr. prøve. (B) Sammenligning af eGFP udtryk af hans-tagged ribosomer og tag-fri ribosomer. Fluorescensintensiteten af in vitro eGFP-udtryk overvåges over tid for en PURE-reaktion ved hjælp af tagfrie ribosomer (1,8 μM, blå) og hans mærkede ribosomer (0,62 μM, rød). Koncentrationerne af den lineære skabelon og OnePot-proteinopløsningen var henholdsvis 4 nM og 2 mg/mL. Paneler (C) og (D) viser SDS-PAGE gel af proteiner syntetiseret i OnePot med tag-fri (1,8 μM, blå, baner 3, 4, 5) og His-tag ribosomer (0,62 μM, rød, baner 6, 7, 8) mærket med en GreenLys in vitro mærkning kit (C) og plettet med Coomassie blå (D), henholdsvis. De sorte pile angiver de forventede bånd af syntetiserede proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den lineære skabelon og OnePot proteinopløsning koncentrationer var henholdsvis 4 nM og 1,6 mg/mL. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Absorbansspektre ved 260 nm. Repræsentative resultater af absorbansspektre ved 260 nm under hydrofob interaktionsrensning af tagfrie ribosomer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: En daglig tidsoptimeret tidsplan for udarbejdelsen af alle OnePot PURE-løsninger.

Tabel 2: PURE protein liste Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 1: Reagenser. Tabellen viser koncentrationer, mængder og andre specifikke detaljer om de reagenser og komponenter, der blev anvendt i løbet af denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Buffere. Regnearket viser de nøjagtige buffersammensætninger for protein, tagfri ribosom og ribosomrensninger med hans tag samt koncentrationerne af de lageropløsninger, der anvendes til deres forberedelse. Derudover beregnes de nødvendige mængder komponenter baseret på buffervolumen. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: Aminosyreberegninger. Regnearket viser de aminosyrer og deres anbefalede lageropløsningskoncentrationer, der kræves til energiopløsningen. Den beregner mængden af vand, der skal tilsættes til hver aminosyre baseret på den faktiske vejede masse, og beregner også mængden af aminosyreopløsningen, der skal tilsættes til den endelige aminosyreblanding. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 4: Lagerløsninger til energiløsningen. Tabellen viser de koncentrationer og mængder af lagerløsninger, der er nødvendige for energiopløsningen, og angiver yderligere detaljer, herunder opbevaringsforhold. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 5: Energiløsning. Tabellen viser energiopløsningskomponenterne og deres anbefalede koncentrationer. Desuden beregner den deres krævede mængder, der skal føjes til den endelige løsning, baseret på deres lageropløsningskoncentrationer og mængden af energiopløsningen. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 6: PCR. Tabellen viser sekvenser og koncentrationer af de primere, der anvendes til udvidelses-PCR, og angiver smeltetemperaturer og termocyklustrin, der er optimeret til en DNA-polymerase med høj troskab. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 7: REN reaktion. Regnearket viser et eksempel opsætning af en PURE reaktion. Den opregner de anvendte koncentrationer og mængder af komponenterne til en PURE-reaktion ved hjælp af tagfri ribosomer eller His-tag ribosomer. Desuden beregner den volumenforholdet for protein- og ribosomtriter. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Protokollen præsenteres her beskriver en enkel, tid- og omkostningseffektiv metode til at forberede en alsidig PURE udtryk system20 baseret på standard sammensætning15. Ved at anvende protokollen sammen med de medfølgende daglige tidsplaner (tabel 1) kan alle komponenter fremstilles på 1 uge og udbyttemængder, der er tilstrækkelige til op til fem hundrede 10 μL PURE-reaktioner. Da de proteiner, der anvendes i denne protokol, er overekspresseret fra plasmider med høj kopi og har lav toksicitet til E. coli, observeres der gode ekspressionsniveauer for alle de krævede proteiner (Figur 1). Dette giver mulighed for nem justering af stammer, og derfor også proteinsammensætning i cocultures, blot ved at ændre forholdet mellem podning stammer20. Ud over ribosomale proteiner viste koncentrationen af EF-Tu sig at være af grundlæggende betydning for udtryksudbyttet6. Derimod havde ændringer i koncentrationen af de andre proteinkomponenter en relativt lav indvirkning på robustheden af PURE-systemet7,24. Ved at justere podningsforholdet mellem EF-Tu og alle de andre komponenter kan der derfor opnås en sammenlignelig sammensætning som standard PURE-sammensætningen, og der kan opnås et PURE-system med et lignende udbytte20. Ved tilberedningen af proteinopløsningen er det afgørende at sikre, at alle stammer vokser godt og overekspresserer det kodede protein efter induktion (Figur 1).

Ribosom funktion er nøglen til den samlede ydeevne af PURE system24. I denne protokol demonstreres to forskellige metoder til fremstilling af ribosomopløsningen, dvs. tagfri og his-tagged ribosomrensning. Den tagfri ribosomrensning er baseret på hydrofob interaktionskromatografi efterfulgt af centrifugering med en saccharosepude, som kræver adgang til et FPLC-rensningssystem og et ultracentrifuge15. I modsætning hertil kræver metoden, der anvender Hans-tagged ribosomer18 og tyngdekraftsstrøm affinitetskromatografirensning, ikke specialiseret udstyr og kan udføres i de fleste laboratorier. Sidstnævnte metode giver derfor fordele som enkelhed og tilgængelighed. Vi observerede dog et betydeligt lavere synteseudbytte, når du brugte de hist mærkede ribosomer i OnePot PURE sammenlignet med den tagfrie variant (Figur 3). Baseret på applikationstypen kan dette lavere udbytte være acceptabelt.

Energiløsningen giver de lav molekylvægt komponenter og tRNAs kræves for at brændstof in vitro TX-TL reaktioner. Denne protokol giver en opskrift på en typisk energiløsning, som nemt kan justeres baseret på brugernes behov. Sammen med tRNA, NTP og kreatinphosphat har overfloden og koncentrationen af Mg2+ ioner været afgørende for PURE-systemets samlede ydeevne8, da de er kritiske cofaktorer til transskription og oversættelse. I nogle tilfælde kan titreringen af ioner derfor i høj grad forbedre den samlede PURE-ydeevne. DNA-integritet er afgørende for PURE-ydeevnen. Sekvens, der verificerer promotorregionen, ribosombindingsstedet og målgen og sikrer, at en passende DNA-koncentration (<2 nM), vil således hjælpe med at fejlfinde problemer, der kan opstå, mens du opretter en PURE-reaktion.

PURE-systemet er et minimalt TX-TL-system, og specifikke applikationer kan derfor kræve yderligere justeringer25. Disse kan omfatte inkorporering af forskellige RNA-polymeraser9,26, chaperoner13og proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Selv om udtrykket stammer for disse proteiner kan indgå i cocultures, tilføje dem separat til det forberedte system kan give bedre kontrol over de krævede proteinniveauer. Desuden er inddragelse af vesikler afgørende for produktionen af membranproteiner10,11. Oxidering i stedet for at reducere miljøer og en disulfidbindingsoomerase letter korrekt disulfidbindingsdannelse, som for eksempel er påkrævet for sekretoriske proteiner12.

Det er vigtigt at sikre, at yderligere komponenter ikke forstyrrer reaktionen. De vigtigste faktorer at være opmærksom på, når du opretter en reaktion eller tilføjer andre komponenter, er angivet nedenfor. Sørg for, at der hverken anvendes inkompatible buffere eller ionkoncentrationerne forstyrres. Undgå opløsninger, der indeholder glycerol, høje koncentrationer af kalium, magnesium, calciumioner, osmolytter, pyrophosphat, antibiotika eller EDTA, så meget som muligt. For eksempel kan udskiftning af en elution buffer med vand under DNA-rensning være gavnligt, da EDTA er et almindeligt tilsætningsstof i denne buffer. At forsyne løsningerne med yderligere negativt ladede molekyler som NTP eller dNTP kræver justering af magnesiumkoncentrationen8, da de negativt ladede molekyler opfører sig som chelaterende midler og binder positivt ladede molekyler. En neutral pH er ideel til reaktionen. Derfor bør alle komponenter bufferlagres til den tilsvarende pH-værdi. Dette er især vigtigt for meget sure eller grundlæggende molekyler som NTPs. Endelig er temperatur og volumen nøgleparametre for reaktionen. For at opnå et godt udbytte bør man gennemføre en temperatur omkring 37 °C, da temperaturer under 34 °C vil reducere udbyttet27betydeligt .

Det er relevant at bemærke, at før man forbereder OnePot PURE, bør man overveje målansøgningen og de tilhørende krav, såsom volumen, renhed, let modifikation og inddragelse eller udeladelse af komponenter. For mange applikationer vil systemet være et glimrende valg, men andre kan kræve udbytter, indstillingsmuligheder og andre faktorer, som OnePot-systemet ikke kan give. Uanset hvad vil den indførte protokol være gavnlig for udarbejdelsen af ethvert hjemmelavet system, da alle kritiske trin til en sådan forberedelse opsummeres her.

En af de største fordele ved OnePot-systemet er dets kompatibilitet med det kommercielt tilgængelige PURExpress-system, som giver mulighed for at teste funktionaliteten og integriteten af alle komponenter separat ved sekventielt at erstatte hver PURExpress-komponent med sin OnePot-ækvivalent. Fordelene ved OnePot PURE-systemet, såsom tunability og nem, hurtig og omkostningseffektiv forberedelse, vil gøre cellefri TX-TL tilgængelig for flere laboratorier over hele verden og bidrage til at udvide implementeringen af denne kraftfulde platform i cellefri syntetisk biologi.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd under EU's Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant 723106, en Swiss National Science Foundation Grant (182019) og EPFL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer Bio-Rad Laboratories 1610732
15 mL centrifuge tubes VWR International 525-0309
384-well Black Assay Plates Corning 3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels Bio-Rad Laboratories 4561096
50 mL centrifuge tubes VWR International 525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate Nunc 260252
Acetic acid, 99.8 % Acros 222140010
Äkta purifier GE Healthcare purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC900324
Amino acids Sigma-Aldrich LAA21-1KT
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 09718-250G
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin Condalab 6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard ThermoFisher LC5928
Breathe-Easy sealing membrane Diversified Biotech Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate Beckman 355631 purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax Bio-Rad Laboratories CHO1411
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) Zymo ZYM-D4034-200TS
DTT SantaCruz Biotech sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns Bio-Rad Laboratories 7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich 03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes VWR International / Eppendorf 525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap Falcon 352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass Scilabware 9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System Promega L5001 optional
Folinic acid Sigma-Aldrich PHR1541
Glycerol Sigma-Aldrich G7757-1L
HEPES Gibco 15630-056
HiTrap Butyl HP Column GE Healthcare 28411005 purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-0921-07
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
InstantBlue Expedeon ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) Alfa Aesar B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer Sigma-Aldrich S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media AppliChem A0954
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M0631
Magnesium chloride Honeywell Fluka 63020-1L
Nickel Sulfate Alfa Aesar 15414469
NTP ThermoFisher R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) ThermoFisher F530S
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-1KG
Potassium glutamate Sigma-Aldrich 49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit NEB E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit NEB E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent Bio-Rad Laboratories 5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units ThermoFisher 564-0020
RNaseA solution Promega A7973
SealPlate film Excel Scientific Z369659-100EA
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 6203
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) Sigma-Aldrich 646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube Beckman 355631
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699
Tris base ThermoFisher BP152-500
tRNA Roche 10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80 Beckman purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters GE Whatman WHA68722504
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).
  2. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  3. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  4. Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  6. Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).
  7. Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
  8. Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006 (2017).
  9. de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
  10. Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
  11. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  12. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).
  13. Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
  14. Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).
  15. Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).
  16. Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
  17. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
  18. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
  19. Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  20. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
  21. Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).
  22. Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
  23. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  24. Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).
  25. Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).
  26. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  27. Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).

Tags

Bioengineering Udgave 172 cellefri transskription oversættelse PURE OnePot ren syntetisk biologi
OnePot PURE Cell-Free System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grasemann, L., Lavickova, B.,… More

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter