Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

OnePot PURE Hücresiz Sistem

Published: June 23, 2021 doi: 10.3791/62625
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Standart laboratuvar ekipmanları kullanarak rekombinant PURE hücresiz TX-TL sistemini üretmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

Tanımlanan PURE (rekombinant elementler kullanılarak protein sentezi) transkripsiyon-çeviri sistemi, hücresiz sentetik biyoloji için çekici bir şasi sağlar. Ne yazık ki, ticari olarak mevcut sistemler maliyetlidir ve bunların ayarlanabilirliği sınırlıdır. Buna karşılık, ev yapımı bir yaklaşım kullanıcı ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilir. Bununla birlikte, ev yapımı sistemlerin hazırlanması, ribozom ihtiyacının yanı sıra 36 orta ölçekli protein saflaştırması nedeniyle zaman alıcı ve meşakkatlidir. Protein saflaştırmayı birlikte kültüre ederek ve birlikte saflaştırma ile düzene sokmak, zaman ve işçilik gereksinimlerini en aza indirmeyi sağlar. Burada, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak tüm PURE sistem bileşenlerini 1 hafta içinde üretmek için kolay, ayarlanabilir, zaman ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, OnePot PURE'un performansı ticari olarak kullanılabilen sistemlerle karşılaştırılabilir. OnePot PURE hazırlama yöntemi, basitliği ve maliyet etkinliği nedeniyle PURE sisteminin erişilebilirliğini daha fazla laboratuvara genişletir.

Introduction

Hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sistemleri biyolojik sistemlerin araştırılması ve mühendisliği için umut verici bir platform oluşturmaktadır. Artık büyüme, homeostaz veya düzenleyici mekanizmalar da dahil olmak üzere yaşamı sürdüren süreçlere güvenmedikleri için basitleştirilmiş ve ayarlanabilir reaksiyon koşulları sağlarlar1. Bu nedenle, hücresiz sistemlerin biyomoleküler sistemlerin araştırılmasına katkıda bulunacağı, rasyonel biyodesarma stratejilerini test etmek için bir çerçeve sunacağı2ve gelecekteki bir sentetik hücre için bir şasi sağlayacağı öngörülmektedir3,4. Tamamen rekombinant PURE sistemi, tanımlanmış ve minimum bileşiminin yanı sıra ayarlanabilirliği ve ayarlanabilirliği nedeniyle özellikle çekici bir şasi sunar5.

İlk işlevsel, tamamen rekombinant PURE sistemi kurulduğundan beri 20015, sistem sınırlarını genişletmek ve sistem verimini iyileştirmek için sistemin bileşimini optimize etmek için çaba sarf edilmiştir6,7,8,transkripsiyonel düzenleme9için izin 9 , membran10,11 ve salgı protein sentezi12, ve protein katlama kolaylaştırmak için13,14 . Günümüzde piyasada bulunan üç sistem vardır: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) ve Magic PURE (Creative Biolabs). Bununla birlikte, bu sistemler maliyetlidir, tam bileşimleri tescillidir ve bu nedenle bilinmemektedir ve uyarlanabilirlik sınırlıdır.

Şirket içinde hazırlanan PURE sistemlerin en uygun maliyetli ve ayarlanabilir seçenek olduğu kanıtlanmıştır15,16. Bununla birlikte, protein ve ribozom fraksiyonları için gerekli 37 saflaştırma adımı zaman alıcı ve sıkıcıdır. PURE sistem hazırlığının verimliliğini artırmak için çeşitli girişimlerde bulunulmuş17,18,19. Yakın zamanda PURE sisteminde bulunan gerekli tüm ribozomal olmayan proteinleri birlikte şekillendirmenin ve birlikte saflaştırmanın mümkün olduğunu gösterdik. Bu OnePot yöntemi, uygun maliyetli ve zaman verimli olduğunu kanıtlamıştır ve hazırlık süresini birkaç haftadan 3 iş gününe düşürüp azaltmıştır. Yaklaşım, piyasada bulunan PURExpress sistemi20ile karşılaştırılabilir bir protein üretim kapasitesine sahip bir PURE sistemi oluşturur. PURE preparatını basitleştirmek için önceki yaklaşımların aksine17,18,19, OnePot yaklaşımında tüm proteinler hala ayrı suşlarla ifade edilir. Bu, kullanıcının OnePot PURE sisteminin bileşimini yalnızca belirli suşları atlayarak veya ekleyerek veya aşı hacimlerini ayarlayarak, böylece sırasıyla terk PURE sistemleri oluşturarak veya nihai protein oranlarını değiştirerek ayarlamasını sağlar.

Burada sunulan protokol, onepot PURE sistemini oluşturmak için daha önce açıklandığı gibi ayrıntılı bir yöntem sağlar20β-mercaptoethanol tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP) ile değiştirildi. Ayrıca, ribozom saflaştırma için iki yöntem tanımlanmıştır: hidrofobik etkileşim ve sakkaroz yastığı kullanılarak geleneksel etiketsiz ribozom saflaştırma, Shimizu ve ark.15'tenuyarlanmış ve Wang ve ark. 18 ve Ederth ve ark.21'e dayananNi-NTA ribozom saflaştırması, ancak önemli ölçüde değiştirilmiştir. İkinci yöntem, PURE sisteminin hazırlanmasını daha da kolaylaştırır ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiğinden daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirir.

Deneysel protokol, bir hafta içinde standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak hazırlanabilen basit, ayarlanabilir, uygun maliyetli bir hücresiz platform sağlamak için çok yönlü bir PURE hücresiz TX-TL sisteminin hazırlanmasını özetliyor. Standart PURE bileşimini tanıtmanın yanı sıra, sistemin işlevselliğini sağlamak için protokoldeki kritik adımlara odaklanarak nasıl ve nerede ayarlanabileceğini belirtiyoruz.

Protocol

NOT: Bu protokol, rekombinant bileşenlerden hücresiz TX-TL sisteminin hazırlanmasını açıklar. Kolaylık sağlamak için, iş beş bölüme ayrılır. İlk bölümde, protokole başlamadan önce yapılması gereken hazırlık adımları açıklanmaktadır. İkinci bölümde OnePot protein çözeltisinin hazırlanması açıklanmaktadır. Üçüncü bölümde ribozom saflaştırmaları, dördüncü bölümde enerji çözeltisinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanır ve son bölüm PURE reaksiyonu kurmak için bir kılavuz sağlar. Kolaylık sağlamak için, protokoller günlere ayrılır ve Tablo 1'dekigünlük programlarda özetlenir. Programa uygun olarak, tüm sistem bir kişi tarafından 1 haftada hazırlanabilir.

1. Ön çalışma

  1. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi bakteri kültürü medya ve medya takviyelerini hazırlayın. Pipet uçları, 96 derin kuyu plakası da dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
  2. Gerinim hazırlığı
    1. Tablo 2'de belirtilen ifade gerinimlerini ısı şoku yöntemini kullanarak ilgili ifade vektörleriyle dönüştürün.
      1. Kimyasal olarak yetkin bakterilere saflaştırılmış plazmid ekleyin ve 20-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın.
      2. Karışımı 30 s (ısı şoku) için 42 °C'ye yerleştirin ve ardından 2 dakika boyunca tekrar buza yerleştirin.
      3. Pipet 20 μL bakteri doğrudan ampisilin (AMP) içeren agar plakalarına ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yaslayın. Tabakları 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
      4. AMP içeren 3 mL LB medyayı agar plakalarından tek bir bakteri kolonisi ile aşılayın. Bir gecede 260 rpm'de sallanırken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
      5. Kültürün 250 μL'sini %50 (v/v) gliserolden oluşan 250 μL ile karıştırın ve -80 °C'de saklayın.
        NOT: Gelecekte daha hızlı hazırlık için, suşları gliserol stokları olarak 96 kuyulu bir tabakta saklayın.
    2. Koloni PCR ve sıralama ile tüm vektör dönüşümlerini onaylayın. Geni, promotör bölgesini ve ribozom bağlama bölgesini sıralayın.
  3. İfade testi
    1. 300 μL LB ortam içeren LB ortamını, hazırlanan gliserol stoklarının yaklaşık 1 μL'si ile 1,3 mL derin kuyu plakasında aşıla. Plakayı nefes alabilen bir zarla kapatın ve gece boyunca 260 rpm'de sallanırken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Tüm ifadeler bu noktada ayrı ayrı yapılır.
    2. 300 μL taze LB ortam aşılayarak AMP içeren ve 1 μL geceleme kültürüne sahip. Bir gecede 260 rpm'de sallanırken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. 2 saat sonra, hücreleri 100 μM İzopropil β-D-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) ile indükle ve ek 3 saat büyür.
    3. Kültürün 10 μL'sini 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve 10 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın. Bir masa santrifüjü kullanarak numuneleri 1 dakika döndürün ve bir PAGE jeline 10 μL süpernatan yükleyin. Jeli Tris/Glicine/SDS tamponunda 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Deiyonize su ile iyi durulayın. Jeli bir Coomassie protein lekesi ile örtün ve 1 saat kuluçkaya yatırın. Gerekirse jeli suda çözün (Şekil 1'dekiifade testi için temsili sonuçlar).
      NOT: İyi bir ayırma elde etmek için degrade (%4-%15 veya %4-%20) PAGE jelleri kullanın.
  4. IMAC Sepharose reçine restorasyonu ve temizliği
    1. Sütun hazırlığı.
      1. Sepharose reçinesini girdapla iyice karıştırın.
      2. Pipet gerekli miktarda reçine boş bir yerçekimi akış sütununa.
        NOT: Gerekli reçine miktarı His-ribozom saflaştırması ile protein saflaştırması arasında değişir ve ilgili bölümlerde belirtilir.
      3. Reçineyi 30 mL deiyonize su ile yıkayın.
      4. Bölüm 1.4.4'te belirtildiği gibi sütun yeniden şarjı ile devam edin.
        NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman tüm sıvının sütundan geçmesine izin verin. Ancak, sütunun hiçbir zaman kuru çalıştığından emin olun. Sütundan herhangi bir sıvı geçirirken, akışı durdurduğundan emin olun veya sıvı reçineye ulaşır ulaşmaz bir sonraki adıma geçin.
    2. Restorasyon.
      1. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın.
      2. 0,2 M EDTA ve 0,5 M NaCl çözeltisinin 10 mL'lik kısmını uygulayın.
      3. 0,5 M NaCl çözümünün 30 mL'lik kısmını ekleyin.
      4. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın.
      5. %20 (v/v) etanolde 4 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
    3. Temizleme.
      DİkKAT: Koruyucu ekipman giyin.
      1. Sütunu 30 mL 0,5 M NaOH ile yıkayın.
      2. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın.
      3. Kolonu 30 mL 0,1 M asetik asitle yıkayın.
      4. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın.
      5. Sütunu % 70 (v/v) etanolden 30 mL ile yıkayın.
      6. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın.
      7. %20 (v/v) etanolde 4 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
    4. Yeniden şarj oluyor.
      1. Sütuna 10 mL 0,1 M nikel sülfat çözeltisi ekleyin.
        DİkKAT: Nikel sülfat toksiktir. Nikel sülfat atıklarının tedarikçi tarafından belirtilen önlemlerle atılması gerekir.
      2. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın.
      3. 4 °C'de %20 ((v/v)) etanol depolayın veya sütun dengesine devam edin.
        NOT: Sütun adımlar arasında etanol içinde saklanırsa, sütunu suyla yıkayarak tüm etanol izlerini çıkardığınızdan emin olun.

2. OnePot protein çözeltisi ekspresyonu ve saflaştırma

NOT: Protokol günlere ayrılmış üç bölümden oluşur (Şekil 2). İdeal bir hazırlık prosedürü, bin 10 μL'den fazla PURE reaksiyona karşılık gelen 1,5 mL 13,5 mg/mL OnePot protein çözeltisi üretir. Bununla birlikte, çözeltinin miktarı ve ideal konsantrasyonu toplu işlemden toplu işleme değişecektir. Deneyimli kullanıcılar aynı anda birden fazla OnePot PURE hazırlığı gerçekleştirebilir.

1. Gün:

  1. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın.
  2. Pipet uçları, iki adet 96 derin kuyu plakası ve bir adet 1 L şaşkın Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
  3. Ek Tablo 2'de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize eder ve 4 °C'de saklar. Aksi belirtilmedikçe, kullanmadan hemen önce tüm tamponları 1 mM TCEP ile tamamlar.
  4. OnePot protein saflaştırması için 2 mL sepharose reçine kullanın. Sütunu bölüm 1.4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
  5. Başlangıç kültürlerini hazırlamak için 20 mL LB ortamı 20 μL AMP ile birleştirin. Steril 96, 1,3 mL derin kuyu plakasında, 35 kuyuya 300 μL ortam ekleyin. Uzama faktörü termo kararsız (EF-Tu) hariç her birini kendi suşuyla aşılayın ve plakayı nefes alabilir bir zarla kapatın.
    NOT: Plakayı 96 kuyulu bir çoğaltıcı kullanarak aşıla (bkz. Malzeme Tablosu). Derin kuyu plakasının kuyu hacmi ve başlangıç kültürünün hacmi esastır. Daha büyük ortam hacimleri veya daha küçük kuyu hacimleri, havalandırma tutarsızlıkları nedeniyle farklı bir bakteri yoğunluğuna yol açacaktır.
  6. EF-Tu kültürü için, 14 mL'lik bir kültür tüpünde 3 mL LB medyayı bir kapakla aşıla. EF-Tu için tek bir 3 mL kültür, bir OnePot ifade kültürü için yeterlidir.
  7. Bir gecede 260 rpm'de sallanırken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.

2. Gün:
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.

  1. Steril şaşkın şişeye 500 mL LB ortam ve 500 μL AMP aktarın.
  2. OnePot PURE kültürünü EF-Tu kültürünün 1675 μL'si ve derin kuyu plakasından kültürlerin her birinin 55 μL'si ile aşıla(Tablo 2).
    NOT: Bu adım sırasında, genel protein bileşimi aşılama oranları ayarlanarak ayarlanabilir. Genel aşılama hacminin 3,6 mL'de sabit kaldığından emin olun.
    İsteğE BAĞLI: Tüm suşların bir gecede büyüdüğünü doğrulamak için, bir plaka okuyucu kullanarak 96 kuyulu bir plakada gece kültürlerinin optik yoğunluğunu600nM (OD 600) olarak ölçün. Optik yoğunluk ölçümü için 10x'lik bir seyreltme kullanın.
  3. Kültürü 37 °C'de 2 saat boyunca 260 rpm sallayarak veya kültürün OD600'ü 0.2-0.3'e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
  4. 500 μL 0,1 mM IPTG ile kültürü teşvik edin ve ek 3 saat büyüyün.
  5. Hücreleri 4 °C ve 3220 x g'da santrifüjleme ile 10 dakika boyunca hasat edin ve hücre peletini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Zamanlamayı optimize etmek için, bölüm 4'te açıklanan enerji çözümünü2.

3. Gün:

  1. Aşağıdaki adımlarda açıklanan saflaştırma için gereken arabellek miktarlarını ölçün ve Ek Tablo 2'debelirtildiği gibi hepsine TCEP ekleyin. Kalan tamponları TCEP olmadan gelecekteki saflaştırmalar için 4 °C'de saklayın.
  2. Yüklü sütunu (bölüm 2.4) 30 mL arabellek A ile dengele. 25 mL arabellek A geçtikten sonra, sütunu alttan kapatın. Buna paralel olarak 2.15-2.17 adımlarına devam edin.
  3. Hücreleri çözün ve hücre peletini 7,5 mL tampon A'da yeniden kullanmak için serolojik bir pipet kullanın.
  4. Aşağıdaki parametrelerle 130 watt'lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu, prob ucu çapı: 6 mm) kullanan hücreleri lyse: 4 x 20 s darbe açık, 20 s darbe kapalı, 70% genlik. Sonication başarılı olursa, çözüm koyu hale gelecektir (Şekil 2).
    NOT: Sonication sırasında hücreleri buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Probu tüpe dokunmadan çözeltinin içine yeterince derine yerleştirin. Büyük miktarda köpük üretilirse, enerji transferi sönümlenir. Bu durumda, köpüğün yerleşmesine izin verin, probu çözeltinin daha derinlerine haline haline alın ve sonikasyon süresini uzatın.
  5. Sonication hemen sonra 4 °C'de 20 dakika boyunca 21130 x g'da santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın. Lisatı buzda tut.
  6. Üst katmanı eşdeğer sütuna ekleyin. Sütunu üstten kapatın ve sızıntı olmadığından emin olun. Bir tüp rotator kullanarak sütun 4 °C'de 3 saat boyunca rotasyon altında kuluçkaya yaslayın.
  7. İlişkisiz bileşenleri kolondan alın ve 25 mL tampon A ile yıkayın.
  8. Sütunu 25 mL 25 mM imidazol tamponu (23,95 mL tampon A ve 1,25 mL B tamponu) ile yıkayın.
  9. Proteinleri 5 mL 450 mM imidazol tamponu (0,5 mL tampon A ve 4,5 mL tampon B) ile elute edin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun.
  10. Eluat'ı 25 mL HT tampon ile seyreltin, karışımı buzda tutun. 15 mL santrifüj filtreye 15 mL ekleyin ve 1,5 mL hacme konsantre edin. Kalan 15 mL'yi konsantre çözelti ile filtreye ekleyin ve bir kez daha 1,5 mL'ye konsantre edin.
  11. Konsantre numuneye 10 mL HT tampon ekleyin ve 1 mL'ye konsantre edin. Eşit miktarda stok tamponU B ekleyin ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bir tur değişim/konsantrasyon, 4 °C'de 3220 x g'da yaklaşık 60 dakika döner.
  12. Arabellek değişimi sırasında, sütun bölüm 1.4'te belirtildiği gibi geri yükleyin.

4. Gün:

  1. Tedarikçi tarafından açıklandığı gibi Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün. Numuneyi 0,5 mL 3 kDa kesme santrifüj filtresi ile 20 mg/mL'ye konsantre edin.
    NOT: Bradford testini aşırı doymamak için konsantrasyon ölçümlerinden önce protein çözeltisini 25 kat veya 50 kat seyreltin.
  2. İdeal protein konsantrasyonu oluşturmak için, bu aşamada (bölüm 5.2) protein çözeltisinin farklı konsantrasyonlarında bir ifade testi gerçekleştirin. Titrasyon yapmak için, çözeltinin toplam hacmini sabit tutun ve stok tampon B de dahil olmak üzere OnePot protein çözeltisini beş farklı oranda pipetlayın(Tamamlayıcı Tablo 7).
  3. SDS-PAGE (Şekil 3A) kullanarak OnePot PURE protein bileşimini doğrulayın. Numunenin 2,5 μL'sini 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL'yi jel içine yükleyin. Bölüm 1.3.3'te belirtildiği gibi SDS-PAGE'i çalıştırın.
  4. Aliquot protein çözeltisi 50 μL aliquots ifadeyi doğruladıktan ve konsantrasyonu ayarladıktan sonra. OnePot PURE protein çözeltisini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bir protein bileşeninin bulunmadığından şüphelenilirse veya OnePot PURE'da beklenenden daha düşük bir konsantrasyonda varsa, aşağıdaki adımları uygulayın.
  5. Tüm kültürlerin optik yoğunluk ölçümlerini (OD600)gerçekleştirerek, ilgili türün geceleme kültürünün diğer kültürlerle karşılaştırılabilir bir oranda büyüyüp büyümediğini kontrol edin.
  6. Şüpheli proteinin ifadesini doğrulamak için belirli bir suşun ek bir ifade testini gerçekleştirin.

3. Ribozom çözeltisi

NOT: Biri heksahistidin etiketli, diğeri etiketsiz ribozomlar için olmak üzere iki farklı ribozom saflaştırma stratejisi getirilmiştir. Standart bir benzeşim Ni-NTA yerçekimi akış sütununda His-saflaştırmasını kullanan arıtma yönteminin en büyük avantajı, saflaştırmanın kolay, hızlı olması ve FPLC sistemi ve ultra merkezirifuge gibi ek laboratuvar ekipmanı gerektirmemesidir. Bununla birlikte, OnePot PURE reaksiyonlarındaki protein üretim kapasitesi etiketsiz ribozomlara kıyasla üçte bir civarındadır. Bu nedenle, verilen uygulama için yüksek verim önemli olup olmadığına bağlı olarak ribozom üretimi için yöntemi seçin.

  1. Onun etiketli ribozom saflaştırması
    NOT: Bu protokol, Profesör Wang'ın (Columbia Üniversitesi, ABD)18hediyesi olan E. coli RB1 suşunu kullanır. Bu suş, 50S ribozomal proteinin (L7/L12) C terminusuna bir heksahistidin etiketinin genomik olarak yerleştirilmesine sahiptir ve ni-NTA yerçekimi akış sütunu kullanılarak saflaştırılmasına izin verir. Normal verim, beş yüz 10 μL'den fazla PURE reaksiyon için yeterli olan 3,45 μM ribozomların yaklaşık 0,5 mL'dir.

1. Gün:

  1. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın.
  2. Pipet uçları, bir adet 5 L Erlenmeyer şişesi ve bir adet 100 mL Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
  3. Ek Tablo 2'de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.

2. Gün:

  1. Pipet 5 mL reçine bir sütuna ve bölüm 1.4'te belirtildiği gibi sütunu hazırlayın.
    NOT: Reçinenin daha yüksek hacmi nedeniyle, restorasyon ve saflaştırma önemli ölçüde daha uzun sürer. Çapraz kontaminasyonu önlemek için ribozom saflaştırma için farklı bir sütun kullanın ve saflaştırmadan önce iyice temizleyin.
  2. 100 mL Erlenmeyer şişesinde 35 mL LB ortam aşılayarak E. coli RB1 suşunun bir gecelik kültürünü hazırlayın. 260 rpm'de titrerken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.

3. Gün:
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.

  1. 5 L steril şişeye 2 L LB ortam ekleyin, gece kültürünün 12 mL'si ile aşıleyin ve ardından 260 rpm'de sallanırken 37 °C'de 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Alternatif olarak, 1 L şaşkın şişelerde 4 x 500 mL kültürde bakteriyel kültleme gerçekleştirin.
  2. Hücreleri 3220 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile peletle. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

4. Gün:

  1. Adım 3.1.4'te hazırlanan sütunu dengele. 30 mL lizis tamponu ile.
  2. Peletin serolojik pipet kullanılarak 20 mL lizis tamponunda yeniden kullanılması.
  3. Aşağıdaki parametrelerle buz üzerinde 130 watt'lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu, prob ucu çapı: 6 mm) olan hücreleri lyse: 11 x 20 s darbe açık; 20 s darbe kapalı, 70% genlik (prosedür ayrıntıları için adım 2.16'ya bakın).
  4. Sonication hemen sonra, 4 °C'de 21130 x g'da 20 dakika santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın. Lisatı buzda tut.
  5. Üst saltant sütunlara yükleyin ve geçmesine izin verin.
  6. Sütunu aşağıdaki lizis ve elüsyon tamponları karışımlarıyla yıkayın.
    1. Yıkama 0: 30 mL lizis tamponu kullanın.
    2. Yıkama 1: 30 mL 5 mM imidazol kullanın (29 mL lizis tamponu, 1 mL elütion tampon).
    3. Yıkama 2: 60 mL 25 mM imidazol kullanın (50 mL lizis tamponu, 10 mL elütion tampon).
    4. Yıkama 3: 30 mL 40 mM imidazol kullanın (22 mL lizis tamponu, 8 mL elütion tampon).
    5. Yıkama 4: 30 mL 60 mM imidazol kullanın (18 mL lizis tamponu, 12 mL elüsyon tamponu).
  7. Ribozomları 7,5 mL elution tamponu ile elute edin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun.
  8. 45 mL ribozom tampona 22 μL saf β-mercaptoethanol ekleyin.
    DİkKAT: β-mercaptoethanol toksiktir. Güvenlik önlemlerini alın ve duman kaputunda çalışın.
  9. Eluat'ı 15 mL santrifüj filtreye ekleyin ve 1 mL'ye konsantre edin.
  10. Konsantre numuneye 15 mL ribozom tamponu ekleyin ve 1 mL'ye tekrar konsantre olun.
    NOT: Önceki adımı iki kez tekrarlayın.
  11. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bir tur değişim/konsantrasyon, 4 °C'de 3220 x g'da yaklaşık 60 dakika santrifüjleme gerektirir.
  12. Arabellek değişimi sırasında, sütun bölüm 1.4'te belirtildiği gibi geri yükleyin.

5. Gün:

  1. Ribozom tamponunda 1:100 seyreltilmiş bir numunenin 260 nM'lik emiciliğini ölçerek ribozom konsantrasyonunun belirlenmesi. Seyreltilmiş çözeltinin 10 absorbans değeri, daha önce açıklandığı gibi 23 μM seyreltilmemiş çözeltiye karşılık gelir16.
  2. 3,45 μM'lik son bir stok konsantrasyonu uygulayın. Konsantrasyonu ayarlamak için ribozomları ribozom tamponu ile seyreltin veya 4 °C'de 3 kDa 0,5 mL santrifüj filtrede 14000 x g'da santrifüjleme ile daha fazla konsantre edin.
    NOT: Optimum sistem ekspresyonu elde etmek için ribozom konsantrasyon titrasyonu gerçekleştirin (bölüm 5.2, Tamamlayıcı Tablo 7).
  3. Bölüm1.3.3'tebelirtildiği gibi SDS-PAGE ( Şekil 3A ) kullanarak ribozom bileşimini doğrulayın. Numunenin 2,5 μL'lik kısmını 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL'lik kısmını jel üzerine yükleyin.

  1. Etiketsiz ribozom saflaştırma
    NOT: Etiketsiz ribozom saflaştırması bir FPLC sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir ve 2 x 5 mL Butil sütunlar ( Malzeme Tablosu ) kullanılarak hidrofobik etkileşim kromatografisitemel alınır. Ribozomlar herhangi bir suştan arındırılsa da, E. coli A19 (Yale CGSC'dekiE. coli Genetik Kaynakları) suşunu kullanmak RNase I silme22nedeniyle avantajlıdır. Saflaştırmayı soğuk bir odada veya soğutma kabininde 4 °C'de gerçekleştirin. Normal verim, beş yüz 10 μL PURE reaksiyona karşılık gelen 10 μM ribozomların yaklaşık 0,5 mL'dir.

1. Gün:

  1. Ek Tablo 1'de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın.
  2. Pipet uçları, 5 L Erlenmeyer şişesi ve 100 mL Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
  3. Ek Tablo 2'de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.

2. Gün:

  1. E. coli A19 suşunun bir gecede kültürünü hazırlamak için, 100 mL Erlenmeyer şişesinde 35 mL LB ortam aşıla. 260 rpm'de titrerken 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.

3. Gün:

  1. 2 L LB medyayı 5 L steril şaşkın şişeye aktarın, gece kültürünün 30 mL'si ile aşılanın ve ardından 200 rpm'de titrerken 37 °C'de 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleme ile pelet. Peletin 25 mL süspansiyon tamponunda yeniden depolayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

4. Gün:

  1. 3.2.13-3.2.19 adımlarına paralel olarak 3.2.8-3.2.12 adımlarını gerçekleştirin.
  2. Aşağıdaki parametrelerle buz üzerinde 130 watt'lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu ve prob ucu çapı: 6 mm) kullanarak hücreleri çözün ve verin: 12 x 20 s darbe açık; 20 s darbe kapalı, 70% genlik (bkz. adım 2.16 prosedür ayrıntıları).
  3. Hücre kalıntılarını 20000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleme ile derhal çıkarın.
  4. Üstnatantı aspire edin ve hacmi ölçün. Amonyum sülfatın son konsantrasyonu 1,5 M'ye ayarlamak ve iyice karıştırmak için eşit miktarda süspansiyon tamponu (yüksek tuz) ekleyin.
  5. Çökeltmeyi 20000 x g'da santrifüjleme ile 4 °C'de 20 dakika boyunca çıkarın.
  6. FPLC saflaştırmadan önce 0,45 μm poliethersülfon membran şırınna filtresi kullanarak süpernatantı filtreleyin ve filtratı 100 mL'lik bir cam şişede toplayın. Süpernatant'ı her zaman 4 °C'de tutun.
  7. Hidrofobik etkileşim kromatografisi saflaştırması için FPLC sistemini aşağıdaki gibi çift Butil sütun (2 x 5 mL) kullanarak kurun. Bu kurulum için, bir sütun birimi (CV) 10 mL'lik bir hacme başvurur.
  8. Üç girişe ihtiyaç duyulacaktır: ikisi tampon hattı, biri örnek hat olarak. Temizleyicinin varsayılan ayarları nedeniyle, sırasıyla C ve arabellek D için A1 ve B1 satırlarını ve örnek çizgi olarak A2 satırını seçmek uygundur. Pompa yıkamaları (10 mL/dk) hariç veya aksi belirtilmedikçe varsayılan 4 mL/dk akış hızı uygulayın.
    NOT: TCEP maliyetli bir reaktif olduğundan, C ve D arabelleklerine karşılık gelen tutarı yalnızca denge adımından sonra ekleyin.
  9. Sistemi temizlemek ve önceki saflaştırmalardan kaynaklanan olası kirlenmeyi gidermek için %20 ((v/v)) etanolde bir sistem pompası yıkaması gerçekleştirin. Manuel olarak 0,2 mL/dk akış hızı ayarlayın ve sütunu monte edin. Akışı durdurun.
  10. Su ile bir sistem pompası yıkama gerçekleştirin. Kolonu 3 CV su ile yıkayın.
  11. Denge: A1 ve A2 girişlerini C tamponu ve B1 girişlerini TCEP olmadan D tamponunda yerleştirin. Bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve sütunu 4 CV tampon C ile dengelayın.
  12. C ve D arabelleklerine TCEP ekleyin.
  13. 4-5 mL elution fraksiyonlarını toplamak için fraksiyon toplayıcıya 15 mL tüpler veya şeffaf yuvarlak fraksiyon toplayıcı tüpleri hazırlayın.
  14. Yükleme: A2 girişini filtrelenmiş numune ile şişeye yerleştirin. Örnek birimin yaklaşık %90'ını sütuna yükleyin. Numuneyi 20 mL TCEP içeren C tamponu ile seyreltin ve numunenin 10 mL'lik kısmını sütuna yükleyin. Seyreltme adımını en az iki kez tekrarlayın ve sütuna mümkün olduğunca fazla örnek yükleyin. Makineye hava emilmemesini sağlamak önemlidir.
  15. Yıkama adımı 1: İlişkisiz bileşenleri çıkarmak için 3 CV C tamponu ile yıkayın.
  16. Yıkama adımı 2: %80 tampon C ve %20 tampon D 5 CV ile yıkayın.
  17. Elution: Toplam elution hacmi 5 CV olan C tamponunun% 50'sini ve D tamponunun% 50'sini uygulayarak ürünü elüte edin.
  18. Yıkama adımı 3: Toplam 5 CV hacme sahip% 100 tampon D kullanarak güçlü bir şekilde etkileşime giren tüm kirleticileri elute edin.
  19. Örnek fraksiyonun emilim spektrumunu 260 veya 280 nM olarak analiz edin (Şekil 4). İlk tepe, yükleme sırasında ele geçirilmeyen proteinleri ve ilk yıkama adımını gösterir; ikinci tepe, ikinci yıkama adımı sırasında elde edilen kirleticileri gösterir. Üçüncü tepe son ürünü izler ve son tepe güçlü etkileşime giren kirleticileri gösterir. Daha fazla işlem için üçüncü tepe noktasına karşılık gelen tüm örnek kesirleri birleyin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun.
  20. Kurtarılan fraksiyonu dört polikarbonat ultrasantrifüj tüpünde minder tamponunun 15 mL'sine hafifçe bindirin. Yastık tamponunun 15 mL'sine maksimum 15 mL numune ekleyin. Tüpün ağırlığını iyi dengeleyen olduğundan emin olun. Ribozomları 16 saat boyunca 4 °C'de 100000 x g'da ultracentrifugation ile pelet.
    NOT: Ultracentrifugation tüplerinde çatlak olmadığından emin olun.
  21. Sütunu aşağıdaki gibi temizleyin ve sıfırlayın. 5 mL/dk'lık bir akış hızı iyi çalışır. Tüm girişleri suya yerleştirin ve bir pompa yıkama işlemi gerçekleştirin. Kolonu 2 CV su ile yıkayın.
    1. Girişi 0,5 M NaOH çözeltisine yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve daha sonra kolonu 3 CV NaOH ile yıkayın.
    2. Girişi suya yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve ardından kolonu 2 CV suda yıkayın.
    3. Girişi 0,1 M asetik asit çözeltisine yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve daha sonra kolonu 3 CV asetik asit çözeltisi ile yıkayın.
    4. Pompalayın ve kolonu 2 CV su ile yıkayın.
    5. Tüm girişleri% 20 ((v / v) etanol içine yerleştirin, bir pompa yıkama adımı uygulayın ve sütunu% 20 ((v / v) etanol çözeltisinin 3 CV'si ile yıkayarak% 20 ((v / v) etanol içinde saklayın.
      NOT: Sistemin asla kuru veya havada emici olmadığından emin olun. Tamponu asla doğrudan etanol veya etanol tampona uygulamayın. Her zaman arada bir su yıkama adımı ekleyin, aksi takdirde sütunu tıkayan çökeltme riski vardır. Yeterli örnek toplama tüpü eklediğinizden emin olun.

5. Gün:

  1. Süpernatant atın ve yarı saydam peleti bozmadan dikkatlice, her peleti 0,5 mL buz gibi ribozom tamponu ile yıkayın. Bu adımı iki kez yineleyin.
  2. Mümkün olan en düşük hızı kullanarak manyetik bir karıştırıcı üzerinde manyetik bir karıştırma çubuğu (3 mM çapında, 10 mM uzunluk) kullanarak buz üzerinde 100 μL ribozom tamponunda net peletlerin her birini yeniden dürt. Yeniden sulanan ribozomları toplayın ve tüpleri ek 50 μL ribozom tamponu ile yıkayın.
    NOT: Yarı saydam peleti görmek zordur. Bu nedenle, peletin tüpün yanlarından dikkatlice yıkayın.
  3. Ribozom tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş numunenin 260 nM'sinde emiciliği ölçerek ribozom konsantrasyonunun belirlenmesi. Seyreltilmiş çözeltinin 10'unun emiciliği, daha önce açıklandığı gibi 23 μM seyreltilmemiş çözeltiye karşılık gelir16.
  4. 10 μM'lik son bir stok konsantrasyonu uygulayın. Konsantrasyonu ayarlamak için ribozomları ribozom tamponu ile seyreltin veya 4 °C'de 3 kDa santrifüj filtresinde 14000 x g'da santrifüjleme ile daha fazla konsantre edin.
    NOT: Optimum sistem ekspresyonu elde etmek için ribozom titrasyonu gerçekleştirin (bölüm 5.2, Tamamlayıcı Tablo 7).
  5. Ribozom bileşimini bölüm1.3.3'tebelirtildiği gibi SDS-PAGE ( Şekil 3A ) ile doğrulayın. Numunenin 2,5 μL'sini 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL'yi jel için yükleyin.

4. Enerji çözümü

NOT: Burada tanıtılan 2,5x enerji çözümünün bileşimi, standart bir TX-TL reaksiyonu için iyi çalışan bir çözüm örneğidir. Zamanlamayı optimize etmek için, 2. Amino asit çözeltisinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanır ve ardından son hazırlık prosedürü açıklanır.

  1. Amino asit çözeltisi
    NOT: Amino asit çözeltisini toplu olarak hazırlayın. En az 2000 μL'lik son hacim için gereken amino asit stok çözeltilerinin miktarının hazırlanması, aksi takdirde çok küçük miktarlarda tartım hatasını azaltacaktır. Amino asit çözeltisinin genel konsantrasyonu, amino asitlerin çözünürlüğü ve ilgili stok çözelti konsantrasyonları ile sınırlıdır. Standart PURE sistemi için, 3,25 mM'lik son konsantrasyona sahip bir çözelti hazırlayın. Şablon olarak amino asit çözeltisi hesaplama tablosunu (Tamamlayıcı Tablo 3)kullanın. Yeterli çözünürlük sağlamak için tuz formunda sistein kullanın. KOH bazlı amino asit hazırlama yöntemlerini kullanmaktan kaçının. Tüm amino asitler için stok çözeltisi hazırlamadan amino asitlerin kesin miktarlarını doğrudan nihai amino asit çözeltisine tartmak mümkündür. Ancak, bu daha zorlu ve daha az kesindir.
    1. Tirozin hariç, Ek Tablo 3'teaçıklandığı gibi her amino asit için stok çözeltileri hazırlayın.
      NOT: Sudaki amino asitlerin farklı çözünürlükleri nedeniyle, stok çözeltisinin önerilen konsantrasyonları farklılık gösterir.
    2. Minimum kütle [mg], referans olarak hedef genel hacim için yeterli miktarda stok çözümü elde etmek için gereken yaklaşık minimum kütleyi sağlar.
      NOT: Minimum kütle% 10 fazla ile hesaplanır.
    3. Çözeltilerin daha kolay hazırlanması için, tam amino asit miktarını tartmayın, bunun yerine eldeki kütle için istenen konsantrasyonu elde etmek için su miktarını ayarlayın. Ek Tablo 3'tekielektronik tabloyu kullanarak doldurulduğu gerçek kütleye (açık sarı hücreler) ve istenen konsantrasyona bağlı olarak gereken deiyonize su miktarını ([μL] eklemek için su) hesaplayın.
    4. Amino asit stok çözeltilerini, tüm çökelti çözünene kadar girdaplayarak çözün. Bireysel amino asit stok çözeltileri birkaç hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
      NOT: Bazı amino asitlerin suda çözülmesi zordur; işlem biraz zaman alabilir.
    5. Amino asit çözeltisi için doğrudan tüpe 3,25 mM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için gereken tam tirozin miktarını tartın.
      NOT: Tirozin suda çözünmesi çok zordur. Stok çözümü hazırlamak yerine doğrudan ekleyin.
    6. [μL] sütunu (açık mavi hücreler) eklemek ve çözeltiyi iyi bir şekilde girdaplamak için Son hacimde belirtildiği gibi ilgili miktarda amino asit stok çözeltisi ve su ekleyin. Tamamlanan amino asit çözeltisini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Enerji çözeltisinin hazırlanması
    NOT: Toplamda, 2,5x enerji çözeltisi her bir amino asidin 0,75 mM'si, 29,5 mM magnezyum asetat içerir, 250 mM potasyum glutamat, her biri 5 mM ATP ve GTP, sırasıyla 2,5 mM CTP, UTP ve TCEP, E. coli MRE 600'den 8,75 mg/mL tRNA, 50 mM kreatin fosfat, 0,05 mM folik asit, 5 mM spermidin ve 125 mM HEPES. İlk kez kullananlar enerji çözeltisini 200 μL'lik küçük gruplar halinde hazırlar.
    1. Ek Tablo 5'te belirtilen tüm sulu çözeltileri buz üzerinde çözün.
    2. Bu arada, Tamamlayıcı Tablo 4 'te listelenen kalan bileşenler için stok çözümlerini hazırlayın. Hazırlık sonrası tüm çözeltileri buzda tutun.
      NOT: Liyofilize tRNA'ları çözmek için doğrudan şişeye 500 μL RNaz ve DNaz içermeyen su ekleyin. Nazik girdap ile iyice karıştırın; RNases'in tanıtılmasını önlemek için pipetlemeyi sınırlayın.
    3. Stok çözeltilerinin ve suyun hesaplanan hacimlerini(Tamamlayıcı Tablo 5)ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Çözeltiyi her zaman buzda tutun.
    4. Çözeltinin pH'ının nötr olduğundan emin olmak için bir pH şeridine 1 μL pipetleme yaparak çözeltinin pH'ını ölçün.
    5. Enerji çözeltisini buz üzerinde tüp başına 50-100 μL'de aliquotlayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Aliquoting yaparken, bileşenlerin çökeltmelerini önlemek için ana stoğu sık sık girdap.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, PURExpress'teki Çözüm A gibi ticari enerji çözümlere karşı yeni yapılan enerji çözümünün bir faaliyet testini gerçekleştirin. Sistemin enerji çözeltisi ile önemli ölçüde daha düşük bir performansı gözlenirse, iyon konsantrasyonlarının, özellikle magnezyum iyonlarının titrasyon (5-20 mM) ile optimize edilmesi avantajlı olabilir.

5. OnePot PURE reaksiyon

  1. DNA şablonu
    NOT: T7 promotörünün aşağı akışında kodlanmış proteinler doğrusal veya dairesel DNA'dan PURE ile ifade edilebilir. Uzantı PCR kullanarak doğrusal bir DNA şablonu oluşturarak, sıkıcı klonlama adımları atlanabilir. Bu çalışmanın doğrusal şablonları, aşağıda açıklandığı gibi PCR tarafından yüksek kaliteli bir DNA polimerazı (Malzeme Tablosu)kullanılarak oluşturulmuştır. Astar dizileri, erime sıcaklıkları ve bu çalışmada kullanılan termosikler ayarları Ek Tablo 6 'da belirtilmiştir. DNA şablonunun hazırlanması günlük programa dahil değildir.
    1. Polimeraz tedarikçisi tarafından önerildiği şekilde bir PCR reaksiyonu ayarlayın.
      NOT: Yüksek kaliteli DNA polimeraz(Malzeme Tablosu)için optimize edilmiş parametreler Ek Tablo 6'da verilmiştir.
    2. Hedef geni (örneğin, eGFP) genlere özgü astarlar (500 nM) kullanarak plazmid veya genomdan doğrusal bir şablon olarak yükseltin (parametreler için bkz. Ek Tablo 6).
    3. Amplifikasyon, aşağıdaki uzantı PCR adımları için tavlama dizileri sağlamak için kısa uzantılar oluşturur.
    4. Doğru boyut ve saflık için bir agarose jel üzerindeki amplicon'ı kontrol edin.
    5. Sonraki uzantı adımları için yükseltilmiş DNA'yı şablon olarak kullanın. En az 50 μL reaksiyon ayarlayın.
    6. Uzatma astarları (2,5 nM) ile 10 PCR amplifikasyon döngüsü çalıştırın. Amplifikasyon döngülerini tamamladıktan sonra, aynı reaksiyona hemen son astarları (500 nM) ekleyin ve genişletilmiş PCR ürününü yükseltmek için 30 döngü çalıştırın. Erime sıcaklıklarını ve astar dizilerini Ek Tablo 6'dabulun.
    7. DNA parçalarını DNA arıtma kiti kullanarak arındırın ve DNA'yı elüasyon tamponu içeren EDTA yerine nükleaz içermeyen suda elüte edin.
    8. Doğru boyut ve saflık için bir agarose jel üzerindeki doğrusal şablonu kontrol edin.
    9. UV-Vis spektrofotometre kullanarak NG/μL'deki DNA konsantrasyonunu ölçün.
  2. PURE reaksiyonun ayarlanması
    NOT: Son reaksiyon bileşimi 1x enerji çözeltisi, etiketsiz ribozomlar veya His etiketi ribozomları, OnePot PURE proteinleri ve DNA şablonudur. Reaksiyon hacmi oranı %40 enerji çözeltisi, %30 protein ve ribozom çözeltisi ve %30 DNA ve sudan oluşmaktadır. Tipik reaksiyon hacimleri 5 μL ile 25 μL arasında değişir. Yeşil Lys Kullanın in vitro Bir SDS-PAGE jelinde floresan olmayan proteinlerin ekspresyonunun doğrulanması için floresan etiketli Lizin kalıntılarını yeni sentezlenmiş proteinlere dahil eden Çeviri Etiketleme Sistemi. Örnek bir reaksiyon şablonu Tamamlayıcı Tablo 7 PURE hücresiz ifade reaksiyoni oluşturmaya yardımcı olmak için. Sarı renkteki hücreler kullanıcı giriş değerlerini, turuncudaki hücreler ise isteğe bağlı olarak reaksiyona eklenecek ek reaktifleri gösterir. Doğru iyon dengesini sağlamak için bileşenlerin hacim oranlarını hassas tutun. Örneğin, daha yüksek bir protein konsantrasyonu elde etmek için OnePot protein çözelti konsantrasyonu artar; ancak reaksiyona eklenen protein çözeltisinin hacmini arttırmayın.
    1. Elektronik tablodaki ilgili sarı hücrelerde DNA'nın konsantrasyon [ng/μL] ve uzunluğunu [baz çiftleri] doldurun. Reaksiyon için 2-10 nM DNA kullanın.
    2. İstenilen toplam reaksiyon hacmini μL olarak doldurun.
    3. Gerekli reaktifleri dondurucudan çıkarın ve buzda çözün.
      NOT: İşlevsellik azalmadan bileşenlerin yeniden freezing mümkündür. Bununla birlikte, donma-çözülme döngülerinin sayısını ve zaman örneklerinin buz üzerinde depolanmasını mümkün olduğunca en aza indirin.
    4. Hesaplanan miktarda su, DNA ve enerji çözeltisini PCR tüpünün bir tarafına veya 384 kuyu plakasındaki bir kuyunun bir köşesine pipetlayın. Aynı tarafa gerekli miktarda ek reaktif ekleyin. Numune buharlaşmasını ve deneysel başlangıç zamanı önyargısını önlemek için deney başına numune sayısını en aza indirin.
      NOT: Enerji kaynaklarının erken tüketimini ve daha düşük verimleri önlemek için enerji bileşenini protein bileşenlerinden fiziksel olarak ayrı tutmak çok önemlidir.
    5. Pipet, hesaplanan protein ve ribozom çözeltisini bir PCR tüpünün diğer tarafına veya 384 kuyu plakasının karşı köşesine koyun.
      NOT: Pipetleme hatalarının etkisini azaltmak için mümkün olduğunda ana karışımları kullanın. İlk testlerden sonra ribozom ve protein çözeltileri karıştırılabilir ve tek bir çözelti olarak saklanabilir.
    6. Reaksiyon bileşenlerini birleştirmek için kısa bir süre (30 s) döndürün. Plaka okuyucu deneyleri sırasında buharlaşmayı önlemek için 35 μL sıvı balmumu ekleyin ve plakayı şeffaf bir dolgu macunu ile kapatın (bkz. Malzeme Tablosu).
    7. 37 °C'de en az 3 saat kuluçkaya yatırın.
    8. Bir plaka okuyucuda okuma için, floresan yoğunluğunu her 2 dakikada bir gerekli dalga boyunda ölçün (temsili sonuçlar Şekil 3B'degösterilmiştir).
    9. Green Lys etiketli örnekler için aşağıdaki adımları uygulayın.
    10. Hücresiz ifadeden sonra, Green Lys etiketleme kitinin floresan arka planını çıkarmak için numuneyi 37 °C'de 30 dakika boyunca 0,16 μg/μL RNase A ile kuluçkaya yatırın.
      NOT: Diğer RNase türleri arka planı yeterince iyi kaldırmadığı için RNase A kullanın.
    11. Bölüm 1.3.3'te belirtildiği gibi SDS-PAGE'i çalıştırarak protein ifadesini görselleştirin. Lekelenmemiş jeli deiyonize suda hafifçe yıkayın ve 488 nm'lik bir heyecan dalga boyu kullanarak floresan bir görüntüleyicide görüntüleyin.
    12. Daha sonra, geleneksel Coomassie boyama yöntemlerini kullanarak jeli lekele. Uygun parametreler için bölüm 1.3.3'e bakın.
      NOT: Protein çözeltisinin önerilen ribozom konsantrasyonu ile titrasyonunu gerçekleştirin ve gerekirse daha sonra optimal OnePot protein konsantrasyonu ile ribozomları titrat edin. Pozitif kontrol olarak ticari PURExpress ΔRibosome kitini kullanın. Çözelti A, Faktör Karışımı ve ribozom çözeltisi sırasıyla hazırlanan enerjiye, OnePot protein çözeltisine ve saflaştırılmış ribozomlara karşılık gelir.

Representative Results

Yukarıdaki protokol, PURE hücresiz TX-TL sisteminin herhangi bir laboratuvarda kurulmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Protokol, PURE sisteminin üç farklı parçasının hazırlanmasının ayrıntılı bir açıklamasını içerir: OnePot proteini, ribozom ve enerji çözeltisi. İş akışını optimize eden ayrıntılı bir günlük zamanlama Tablo 1'de gösterilir. İş akışı, Etiketli ribozomların saflaştırılması için optimize edilmiştir ve etiketsiz ribozom saflaştırması yapılırsa zaman dilimleri biraz farklılık gösterebilir. Bir preparat, en az beş yüz 10 μL reaksiyon için yeterli miktarda SAF sağlar. Ayrıca, hazırlanan çözeltiler -80 ° C'de bir yıldan fazla bir süre stabildir ve birden fazla donma-çözülme döngüsüne dayanabilir.

Tüm suşlar için yeterli aşırı ekspresyon seviyeleri, nihai protein çözeltisinin işlevselliği için çok önemlidir. Şekil 1, OnePot protein hazırlanması için daha sonra kullanılan 36 bireysel suşun hepsinde başarılı bir aşırı ekspresyon göstermektedir. Aşırı eksprese proteinlerin bant yoğunluklarındaki değişim, büyük olasılıkla hacimlerin SDS-PAGE jeline yüklenmesindeki bir önyargı nedeniyle meydana geldi. Beklenen protein boyutları Tablo 2'deözetlenmiştir. GlyRS ve PheRS çeşitli moleküler ağırlıklarda iki alt bireden oluşur; kalan 34 protein tek bir alt birlikten oluşur. Bu protokolün basitliğinin ve zaman etkinliğinin anahtarı, birlikte kültürleme ve birlikte arınma adımıdır (Şekil 2). OnePot protein çözeltisi, EF-Tu suşunun diğer tüm ifade suşlarına göre oranını artırarak hazırlanmıştır. Nihai proteinlerin genel bileşimi SDS-PAGE (Şekil 3A) tarafından analiz edildi. Jellerden (şerit 2, 3), EF-Tu'nun (43.3 kDa) beklendiği gibi diğer proteinlere kıyasla daha yüksek konsantrasyonda mevcut olduğu fark edilir. Jel protein ekspresyon oranlarının iyi bir ilk göstergesini sağlarken, her bir proteinin ifade edilip edilmediğini ve hangi seviyede ifade edildiğini belirlemek zordur. Bu nedenle, yukarıda gösterildiği gibi, birlikte yaşamadan önce her bir suştaki aşırı ifadenin onaylanması şiddetle tavsiye edilir.

E. coli ribozom, 50'den fazla bireysel protein alt bireyi23'tenoluşan karmaşık bir moleküler makinedir. Etiketsiz ribozom saflaştırma için 260 nm'de temsili bir emilim spektrumu Şekil 4'tegösterilmiştir; üçüncü tepe başarılı ribozom elution karakteristiğidir. Her iki ribozom saflaştırma yönteminde de SDS-PAGE jelinde beklenen çalışma düzeni (Şekil 3A)18 gözlenmiştir. Küçük miktarlarda da olsa her iki saflaştırma için kontaminasyon gözlemledik (%<10). Özellikle, etiketsiz (şerit 5, 6) ve His etiketli (şerit 11, 12) ribozomlarda, yöntemdeki değişiklik nedeniyle farklı kirleticiler mevcuttu. Kullanıcı referansı için, birleşik sistemler için SDS-PAGE jelleri de dahildir (şerit 8, 9 ve 14, 15).

Son olarak, farklı ribozom varyantları kullanılarak hazırlanan sistemlerin performansı (Şekil 3) karşılaştırılır. in vitro eGFP ekspresyonunun zaman kursları, her iki PURE sisteminin de işlevsel olduğunu ve floresan eGFP ürettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, OnePot protein çözeltisi, titrasyon tarafından optimize edilen ribozom konsantrasyonunu kullanarak His etiketli ribozomlarla birleştiğinde, etiketlenmemiş ribozom versiyonunun ifade seviyesinin sadece üçte birini verdi (Şekil 3B). Benzer sonuçlar, Green Lys tRNA in vitro etiketleme sistemi kullanılarak farklı boyutlarda üç protein ifade edildiğinde ve etiketlendiğinde gözlenmiştir (Şekil 3C). Floresan jelde görüldüğü gibi, tam boy ürünler her iki sistemde de başarıyla ifade edildi; ancak His-tag ribozom sistemi ile ifade seviyesinin sadece yarısına ulaşılmıştır. Floresan etiketlemeye ek olarak, her üç protein için beklenen bantlar Coomassie lekeli bir jel üzerinde ayırt edilebilir (Şekil 3D). Sonuçlar, standart ekipmanlarla bir laboratuvarda bir hafta içinde hazırlanabilen tanıtılan ifade sisteminin, doğrusal şablonlardan T7 promotörünün aşağı akışında kodlanmış proteinlerin in vitro ekspresyonu için kullanılabileceğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: PURE sisteminin tüm ifade suşları için aşırı ifade testi için temsili sonuçlar. PURE protein sayıları ve boyutları Tablo 2'deözetlenmiştir. Protein sayıları 21, 24 ve 27 daha iyi görselleştirme için bir yıldızla işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: OnePot protein saflaştırma. OnePot protein çözeltisinin üretiminde yer alan tüm adımların şematik tasviri ve karşılık gelen fotoğrafları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farklı ribozom varyantları kullanılarak hazırlanan sistemlerin performansı. (A) OnePot protein çözeltisinin Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jelleri (şerit 2, 3), protein çözeltisi olmayan etiketsiz ribozomlar (şerit 5, 6) ve protein çözeltisi (şerit 8, 9), protein çözeltisi olmayan his etiketli ribozomlar (şerit 11, 12) ve protein çözeltisi (şeritler 14, 15). Numune başına iki farklı konsantrasyon yüklendi. (B) Etiketli ribozomların ve etiketsiz ribozomların eGFP ifadesinin karşılaştırılması. İn vitro eGFP ekspresyonunun floresan yoğunluğu, etiketsiz ribozomlar (1,8 μM, mavi) ve His etiketli ribozomlar (0,62 μM, kırmızı) kullanılarak PURE reaksiyonu için zaman içinde izlenir. Doğrusal şablonun ve OnePot protein çözeltisinin konsantrasyonları sırasıyla 4 nM ve 2 mg/mL'ydi. Paneller (C) ve (D) OnePot'ta sentezlenen proteinlerin SDS-PAGE jelini etiketsiz (1,8 μM, mavi, şerit 3, 4, 5) ve His-tag ribozomlar (0.62 μM, kırmızı, şeritler 6, 7, 8) sırasıyla GreenLys in vitro etiketleme kiti (C) ile etiketlenmiş ve Coomassie mavisi (D) ile boyanmıştır. Siyah oklar beklenen sentezlenmiş protein bantlarını gösterir: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Doğrusal şablon ve OnePot protein çözelti konsantrasyonları sırasıyla 4 nM ve 1.6 mg/mL'ydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Absorbans spektrumu 260 nm'de. Etiketsiz ribozomların hidrofobik etkileşim saflaştırılması sırasında 260 nm'de emici spektrumun temsili sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tüm OnePot PURE çözümlerinin hazırlanması için günlük zaman için optimize edilmiş bir program.

Tablo 2: PURE protein listesi Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Tablo 1: Reaktifler. Tablo, bu çalışma sırasında kullanılan reaktiflerin ve bileşenlerin konsantrasyonlarını, hacimlerini ve diğer özel ayrıntılarını listeler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Tablo 2: Arabellekler. Elektronik tablo, protein, etiketsiz ribozom ve His-tag ribozom saflaştırmaları için tam tampon bileşimlerini ve bunların hazırlanması için kullanılan stok çözeltilerinin konsantrasyonlarını listeler. Ayrıca, arabellek hacmine göre gerekli bileşen miktarlarını hesaplar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 3: Amino asit hesaplamaları. Elektronik tabloda amino asitler ve enerji çözeltisi için gerekli olan önerilen stok çözeltisi konsantrasyonları listelenmiştir. Her amino aside eklenecek su miktarını gerçek tartılan kütleye göre hesaplar ve ayrıca nihai amino asitlerin karışımına eklenecek amino asit çözeltisinin hacmini hesaplar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Tablo 4: Enerji çözümü için stok çözümleri. Tablo, enerji çözümü için gereken stok çözümlerinin konsantrasyonlarını ve hacimlerini listeler ve depolama koşulları da dahil olmak üzere daha fazla ayrıntıyı gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 5: Enerji çözümü. Tablo, enerji çözeltisi bileşenlerini ve önerilen konsantrasyonlarını listeler. Ek olarak, stok çözelti konsantrasyonlarına ve enerji çözeltisinin hacmine bağlı olarak nihai çözüme eklenmesi gereken hacimlerini hesaplar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Tablo 6: PCR. Tablo, PCR uzantısı için kullanılan astarların dizilerini ve konsantrasyonlarını listeler ve yüksek kaliteli bir DNA polimeraz için optimize edilmiş erime sıcaklıklarını ve termosikler adımları gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Tablo 7: PURE reaksiyonu. Elektronik tablo, PURE reaksiyonunun örnek bir kurulumunu gösterir. Etiketsiz ribozomlar veya His etiketi ribozomları kullanarak PURE reaksiyonu için bileşenlerin kullanılan konsantrasyonlarını ve hacimlerini listeler. Ayrıca, protein ve ribozom titrasyonları için hacim oranlarını hesaplar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada sunulan protokol, standart bileşime dayalı çok yönlü bir PURE ifade sistemi20 hazırlamak için basit, zaman ve uygun maliyetli bir yöntemi açıklar15. Protokolün sağlanan günlük programlarla birlikte kullanılmasıyla (Tablo 1), tüm bileşenler 1 hafta içinde hazırlanabilir ve beş yüz 10 μL PURE reaksiyona kadar yeterli verim miktarları. Bu protokolde kullanılan proteinler yüksek kopya plazmidlerden fazla ifade edildiğinden ve E. coli'yedüşük toksisiteye sahip olduğundan, gerekli tüm proteinler için iyi ifade seviyeleri gözlenir (Şekil 1). Bu, suşların kolay ayarlanmasına ve dolayısıyla sadece aşılama suşlarının oranlarını değiştirerek kokültürlerde protein bileşimine izin verir20. Ribozomal proteinlerin yanı sıra, EF-Tu konsantrasyonunun ifade için temel öneme sahip olduğu göstermiştir6. Buna karşılık, diğer protein bileşenlerinin konsantrasyonundaki değişiklikler PURE sisteminin sağlamlığı üzerinde nispeten düşük bir etkiye sahipti7,24. Bu nedenle, EF-Tu'nun diğer tüm bileşenlerle ilgili aşılama oranını ayarlayarak, standart PURE bileşimi ile karşılaştırılabilir bir bileşim elde edilebilir ve benzer verim20'ye sahip bir PURE sistemi elde edilebilir. Protein çözeltisinin hazırlanmasında, tüm suşların iyi büyümesini sağlamak ve indüksiyondan sonra kodlanmış proteini aşırı ifade etmek çok önemlidir (Şekil 1).

Ribozom fonksiyonu PURE sisteminin genel performansı için anahtardır24. Bu protokolde ribozom çözeltisini hazırlamak için etiketsiz ve His etiketli ribozom saflaştırma olmak üzere iki farklı yöntem gösterilmiştir. Etiketsiz ribozom saflaştırma, hidrofobik etkileşim kromatografisine ve ardından bir FPLC arıtma sistemine ve ultracentrifuge15'eerişim gerektiren sakkaroz yastığı ile santrifüjlemeye dayanır. Buna karşılık, His etiketli ribozomlar18 ve yerçekimi akış benzeşimi kromatografisi saflaştırmasını kullanan yöntem özel ekipman gerektirmez ve çoğu laboratuvarda yapılabilir. Bu nedenle, ikinci yöntem basitlik ve erişilebilirlik gibi avantajlar getirir. Bununla birlikte, OnePot PURE'daki His etiketli ribozomları etiketsiz varyanta kıyasla kullanırken önemli ölçüde daha düşük bir sentez verimi gözlemledik (Şekil 3). Uygulama türüne bağlı olarak, bu düşük verim kabul edilebilir olabilir.

Enerji çözümü, in vitro TX-TL reaksiyonlarını körüklemek için gereken düşük moleküler ağırlıklı bileşenleri ve tRNA'ları sağlar. Bu protokol, kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca ayarlanabilen tipik bir enerji çözümü için bir reçete sağlar. tRNA, NTP ve kreatin fosfat ile birlikte, Mg2+ iyonlarının bolluğu ve konsantrasyonu PURE sisteminin genel performansı için çok önemli olmuştur8, transkripsiyon ve çeviri için kritik kofaktörler oldukları için. Bazı durumlarda, iyonların titrasyonu, bu nedenle genel PURE performansını büyük ölçüde artırabilir. DNA bütünlüğü PURE performansı için çok önemlidir. Bu nedenle, promotör bölgesini, ribozom bağlama bölgesini ve hedef geni doğrulamak ve yeterli bir DNA konsantrasyonu (<2 nM) sağlamak, PURE reaksiyonu kurarken ortaya çıkabilecek sorunları gidermeye yardımcı olacaktır.

PURE sistemi minimum bir TX-TL sistemidir ve bu nedenle belirli uygulamalar ek ayarlamalar gerektirebilir25. Bunlar farklı RNA polimerazları9,26,refakatçiler13ve EF-P veya ArfA8gibi protein faktörlerini dahil etmeyi içerebilir. Bu proteinler için ifade suşları kokültürlere dahil edilebilse de, bunları hazırlanan sisteme ayrı ayrı eklemek gerekli protein seviyelerinin daha iyi kontrol etmesini sağlayabilir. Ayrıca, veziklinlerin dahil edilmesi membran proteinlerinin üretimi için gereklidir10,11. Ortamları azaltmak yerine oksitleyici ve disülfid bir bağ isomerase, örneğin salgı proteinleri için gerekli olan uygun disülfid bağ oluşumunu kolaylaştırır12.

Herhangi bir ek bileşenin reaksiyona müdahale etmemesini sağlamak önemlidir. Reaksiyon kurarken veya başka bileşenler eklerken dikkat etmesi gereken en önemli faktörler aşağıda listelenmiştir. Uyumsuz tamponların kullanılmadığından veya iyon konsantrasyonlarının bozulmadığından emin olun. Gliserol, yüksek potasyum, magnezyum, kalsiyum iyonları, ozmolitler, pirofosfat, antibiyotikler veya EDTA içeren çözeltilerden mümkün olduğunca kaçının. Örneğin, DNA saflaştırması sırasında bir elüasyon tamponu su ile değiştirmek, EDTA bu tamponda yaygın bir katkı maddesi olduğu için faydalı olabilir. Çözeltilere NTP veya dNTP gibi ek negatif yüklü moleküller sağlamak, magnezyum konsantrasyonunu ayarlamayı gerektirir8Negatif yüklü moleküller şelatlama ajanları gibi davrandığından ve pozitif yüklü molekülleri bağladıklarından. Nötr bir pH reaksiyon için idealdir. Buna göre, tüm bileşenler ilgili pH'a tamponlanmalıdır; Bu özellikle NTP'ler gibi yüksek asidik veya temel moleküller için önemlidir. İyi bir verim elde etmek için, 34 ° C'nin altındaki sıcaklıklar verimi önemli ölçüde azaltacağından,37° C civarında bir sıcaklık uygulanmalıdır.

OnePot PURE'ı hazırlamadan önce, hedef uygulamayı ve hacim, saflık, değişiklik kolaylığı ve bileşenlerin dahil edilmesi veya ihmal edilmesi gibi ilgili gereksinimleri göz önünde bulundurmak gerekir. Birçok uygulama için sistem mükemmel bir seçim olacaktır, ancak diğerleri OnePot sisteminin sağlayamadığı verim, ayarlanabilirlik ve diğer faktörleri gerektirebilir. Ne olursa olsun, tanıtılan protokol herhangi bir ev yapımı sistemin hazırlanması için faydalı olacaktır, çünkü bu tür bir hazırlık için tüm kritik adımlar burada özetlenmiştir.

OnePot sisteminin ana avantajlarından biri, her PURExpress bileşenini OnePot eşdeğeriyle sırayla değiştirerek tüm bileşenlerin işlevselliğini ve bütünlüğünü ayrı ayrı test etme imkanı sağlayan ticari olarak kullanılabilen PURExpress sistemiyle uyumluluğudur. OnePot PURE sisteminin kolay, hızlı ve uygun maliyetli hazırlık gibi avantajları, hücresiz TX-TL'yi dünya çapında daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirecek ve bu güçlü platformun hücresiz sentetik biyolojide uygulanmasının genişletilmesine katkıda bulunacaktır.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı Grant 723106, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibesi (182019) ve EPFL kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer Bio-Rad Laboratories 1610732
15 mL centrifuge tubes VWR International 525-0309
384-well Black Assay Plates Corning 3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels Bio-Rad Laboratories 4561096
50 mL centrifuge tubes VWR International 525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate Nunc 260252
Acetic acid, 99.8 % Acros 222140010
Äkta purifier GE Healthcare purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC900324
Amino acids Sigma-Aldrich LAA21-1KT
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 09718-250G
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin Condalab 6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard ThermoFisher LC5928
Breathe-Easy sealing membrane Diversified Biotech Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate Beckman 355631 purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax Bio-Rad Laboratories CHO1411
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) Zymo ZYM-D4034-200TS
DTT SantaCruz Biotech sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns Bio-Rad Laboratories 7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich 03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes VWR International / Eppendorf 525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap Falcon 352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass Scilabware 9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System Promega L5001 optional
Folinic acid Sigma-Aldrich PHR1541
Glycerol Sigma-Aldrich G7757-1L
HEPES Gibco 15630-056
HiTrap Butyl HP Column GE Healthcare 28411005 purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-0921-07
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
InstantBlue Expedeon ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) Alfa Aesar B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer Sigma-Aldrich S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media AppliChem A0954
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M0631
Magnesium chloride Honeywell Fluka 63020-1L
Nickel Sulfate Alfa Aesar 15414469
NTP ThermoFisher R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) ThermoFisher F530S
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-1KG
Potassium glutamate Sigma-Aldrich 49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit NEB E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit NEB E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent Bio-Rad Laboratories 5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units ThermoFisher 564-0020
RNaseA solution Promega A7973
SealPlate film Excel Scientific Z369659-100EA
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 6203
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) Sigma-Aldrich 646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube Beckman 355631
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699
Tris base ThermoFisher BP152-500
tRNA Roche 10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80 Beckman purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters GE Whatman WHA68722504
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).
  2. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  3. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  4. Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  6. Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).
  7. Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
  8. Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006 (2017).
  9. de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
  10. Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
  11. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  12. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).
  13. Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
  14. Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).
  15. Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).
  16. Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
  17. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
  18. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
  19. Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  20. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
  21. Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).
  22. Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
  23. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  24. Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).
  25. Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).
  26. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  27. Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).

Tags

Biyomühendislik Sayı 172 hücresiz transkripsiyon çevirisi PURE OnePot saf sentetik biyoloji
OnePot PURE Hücresiz Sistem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grasemann, L., Lavickova, B.,… More

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter