Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Abstract

Retinale pigmentepitheel (RPE) transplantatie is veelbelovend voor de behandeling van erfelijke en verworven retinale degeneratieve ziekten. Deze aandoeningen omvatten retinitis pigmentosa (RP) en geavanceerde vormen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), zoals geografische atrofie (GA). Samen vertegenwoordigen deze aandoeningen een aanzienlijk deel van de momenteel onbehandelbare blindheid wereldwijd. Deze onvervulde medische behoeften hebben geleid tot verhoogde academische interesse in het ontwikkelen van methoden voor RPE-vervanging. Onder de diermodellen die vaak worden gebruikt voor preklinische testen van therapeutica, is de niet-menselijke primaat (NHP) het enige diermodel met een macula. Omdat het deze anatomische gelijkenis met het menselijk oog deelt, is het NHP-oog een belangrijk en geschikt preklinisch diermodel voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor geavanceerde therapie (ATMP's) zoals RPE-celtherapie.

Dit manuscript beschrijft een methode voor de submaculaire transplantatie van een RPE monolaag, gekweekt op een polyethyleentereftalaat (PET) celdrager, onder de macula op een chirurgisch gecreëerde RPE-wond in immunosuppressieve NHPs. De fovea - het centrale avasculaire deel van de macula - is de plaats van de grootste mechanische zwakte tijdens de transplantatie. Foveaal trauma zal optreden als de initiële subretinale vloeistofinjectie een overmatige kracht op het netvlies genereert. Daarom wordt langzame injectie onder perfluorkoolstofvloeistof (PFCL) glasvochttamponade aanbevolen met een subretinale injectiecanule met dubbele boring bij lage intraoculaire druk (IOP) om een retinale bleb te creëren.

Voorbehandeling met een intravitreale plasminogeeninjectie om parafoveale RPE-fotoreceptorverklevingen vrij te maken, wordt ook geadviseerd. Deze gecombineerde strategieën kunnen de kans op foveale scheuren verminderen in vergelijking met conventionele technieken. Het NHP is een belangrijk diermodel in de preklinische fase van de ontwikkeling van RPE-celtherapie. Dit protocol behandelt de technische uitdagingen in verband met de levering van RPE cellulaire therapie in het NHP-oog.

Introduction

RPE-transplantatie is veelbelovend voor de behandeling van erfelijke en verworven retinale degeneratieve ziekten. Deze aandoeningen omvatten retinitis pigmentosa (RP, staaf-kegeldystrofie) en geavanceerde vormen van LMD zoals GA. Gezamenlijk vertegenwoordigen deze aandoeningen een aanzienlijk deel van de momenteel onbehandelbare blindheid wereldwijd1,2. De gevorderde stadia van AMD zijn onderverdeeld in neovasculaire AMD (nAMD) en GA. Hoewel er effectieve behandelingsopties zijn voor nAMD, zoals anti-vasculaire endotheliale groeifactor (anti-VEGF) injecties, hebben patiënten met GA beperkte behandelingsopties. RP is een zeer heterogene groep van erfelijke retinale aandoeningen die worden gekenmerkt door progressieve retinale fotoreceptordegeneratie. Bij sommige patiënten bevindt het oorzakelijke genetische defect zich in de RPE in plaats van in de fotoreceptoren; vandaar dat RPE-vervangingstherapie een alternatieve strategie kan zijn als gentherapie niet haalbaar is.

Er is veel interesse in het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor deze aandoeningen. In het bijzonder heeft RPE-transplantatie aan kracht gewonnen als een potentiële therapeutische benadering3,4,5,6,7,8. Sinds de eerste rapporten over RPE-transplantatie in de jaren 19809 verschenen, is het veld uitgebreid met verschillende RPE-celbronnen, leveringsstrategieën en experimentele modellen van ziekte en transplantatie10,11,12,13,14. Van de verschillende diermodellen heeft alleen het NHP een 'macula lutea' met een 'fovea centralis', een anatomische specialisatie aan de achterpool van het netvlies die met mensen wordt gedeeld. De fovea bevat een zeer hoge dichtheid van kegelfotoreceptoren die centrale visie met hoge resolutie mogelijk maken15. De NHP heeft ook een vergelijkbare genomische en proteomische samenstelling16 in vergelijking met mensen. Deze overeenkomsten maken het een belangrijk en geschikt diermodel voor de studie van oogziekten die het menselijk netvlies aantasten17,18.

Dit manuscript beschrijft een methode voor de submaculaire transplantatie van een RPE xenograft, ondersteund door een PET-celdrager, in immunosuppressieve NHP's. Een transvitreale techniek voor subretinale RPE-transplantatie bij konijnen is beschreven in een eerder manuscript19. Bij NHP's vereist de aanwezigheid van de fovea echter bijzondere zorg tijdens intraoperatieve manipulatie20. In het bijzonder is er een hoog risico op een foveale scheur als subretinale vloeistofinjectiemethoden een overmatige kracht op het netvlies genereren20. De focus van dit manuscript ligt daarom op strategieën om het risico op onbedoeld foveaal trauma bij NHP te verminderen.

Deze omvatten het gebruik van preoperatieve intravitreale plasminogeeninjectie voor de afgifte van parafoveale verklevingen en chirurgische microscoop-geïntegreerde optische coherentietomografie (miOCT) intraoperatief voor real-time visualisatie van de foveale anatomie. Een op maat gemaakte 25/41 G dual-bore subretinale canule met intraoculaire PFCL-tamponade onder lage IOP-instellingen wordt voorgesteld om een meer gecontroleerd proces van foveale loslating mogelijk te maken. Bovendien wordt chirurgische verwijdering van native RPE aanbevolen vóór implantatie om een betere integratie tussen de getransplanteerde RPE-cellen en gastheerfotoreceptoren mogelijk te maken. Ten slotte wordt een peri- en postoperatief systemisch immunosuppressieprotocol voor NHP-modellen beschreven om de overleving van het RPE xenograft na transplantatie te verbeteren11,21.

Protocol

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association of Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek. Ethische goedkeuring werd verkregen van de Institutional Animal Care and Use Committee, SingHealth, Singapore. Dieren werden gehuisvest in het SingHealth Experimental Medicine Centre, goedgekeurd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Deze goedkeuring benadrukt dat alle dierproeven voldoen aan de normen van de richtlijnen van het National Advisory Committee for Laboratory Animal Research van de Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore. Het volgende experimentele protocol werd opgesteld op basis van experimenten uitgevoerd in 6 ogen van 6 Macaca fascicularis (4 mannen en 2 vrouwen, 4 tot 6 jaar oud, 2,8 tot 4,0 kg).

1. Het bereiken van immunosuppressie in het NHP-model

  1. Start de immunosuppressie 7 dagen voor de operatie en ga door met immunosuppressie gedurende de follow-upperiode.
  2. Weeg de NHP vóór de toediening van systemische immunosuppressie om een nauwkeurige medicatiedosering te garanderen. Het dier wordt gewogen bij baseline en daarna wekelijks.
  3. Gebruik orale sirolimus, doxycycline en minocycline om systemische immunosuppressie te bereiken.
    1. Dien een oplaaddosis van 2 mg orale sirolimus toe, gevolgd door een dagelijkse onderhoudsdosering van 1 mg. Verkrijg het baseline bloed sirolimus niveau vóór toediening en controleer dit gedurende de follow-up periode. Zorg voor een concentratie van ten minste 5 μg/l voor adequate immunosuppressie.
      OPMERKING: De dosis Sirolimus is niet aangepast aan het gewicht.
    2. Dien een dosis van 7,5 mg/kg oraal doxycycline per dag toe, tweemaal daags.
    3. Dien een dosis van 7,5 mg/kg oraal minocycline per dag toe, tweemaal daags.
  4. Controleer tijdens immunosuppressie alle NHP's op nadelige systemische effecten. Zoek naar aanzienlijk gewichtsverlies (>10%), verminderde eetlust en waterverbruik, onaangetaste haaruitval en abnormaal gedrag zoals agressie en lethargie. Assessments worden gedaan op dag 3, 14 en 1 maand, gevolgd door maandelijkse assessments.

2. Sterilisatie van instrumenten

  1. Spoel de chirurgische instrumenten met gedestilleerd water.
  2. Plaats de instrumenten in een ultrasoon bad gevuld met 500 ml gedestilleerd water en 2 ml instrumentdesinfectiemiddel. Reinig de instrumenten met behulp van de veegfunctie van het ultrasone bad gedurende 15 minuten.
  3. Verwijder de instrumenten uit het ultrasoonbad. Spoel tweemaal grondig met gedestilleerd water gedurende 5 minuten per spoeling. Droog de instrumenten aan de lucht na het spoelen.
  4. Plaats de instrumenten in een instrumentenkast. Autoclaaf de doos met behulp van de universele programma-instelling (sterilisatie van instrumenten bij 134 °C gedurende 50 min: 30 min voor autoclaveren, 20 min voor drogen).

3. Bereiding van conserveermiddelvrije triamcinolon (40 mg / ml)

  1. Zuig met behulp van een spuit van 1 ml 1 ml triamcinolonoplossing (10 mg / ml) op. Breng het over in een conische buis van 15 ml en meng het met 4 ml steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS).
  2. Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 120 × g . Zorg ervoor dat alle triamcinolondeeltjes zich op de bodem van de conische buis bevinden. Gooi het supernatant (BSS) uit de conische buis.
  3. Suspensie de triamcinolondeeltjes opnieuw met 5 ml steriel BSS in de conische buis. Centrifugeer de oplossing bij 120 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weer weg.
  4. Herhaal stap 3.3 om het wassen van de triamcinolondeeltjes met BSS (3x) te voltooien.
  5. Suspensie de triamcinolondeeltjes opnieuw met 0,25 ml steriel BSS om een concentratie van 40 mg / ml te bereiken.
  6. Zuig de opnieuw gesuspendeerde triamcinolon (40 mg / ml) op met een nieuwe spuit van 1 ml. Bevestig een 25 G stompe fluitnaald en houd de spuit met de triamcinolonoplossing klaar voor intraoperatief gebruik.

4. Voorbehandeling van NHP-ogen met intravitreaal plasminogeen (0,25 μg/μL)

  1. Dien een week voor de operatie een intravitreale injectie (20 μL) apenplasminogeen (0,25 μg/μL) toe.
  2. Verdoof de NHP vóór de procedure met een intramusculaire injectie van ketamine (10-20 mg/kg LG) en een subcutane injectie van atropine (0,05 mg/kg LG). Dien tetracaïne oogdruppels toe voor lokale anesthesie.
  3. Vóór intravitreale injectie, desinfecteer het periorbitale gebied met 10% povidon-jodium. Desinfecteer het oog door 5% povidon-jodium toe te dienen aan de conjunctivale fornices van de NHP. Zorg ervoor dat de oplossing ten minste 1 minuut in de fornices blijft voordat u grondig spoelt met steriel BSS.
  4. Gebruik een spuit van 250 μL om het voorverwijde apenplasminogeen (0,25 μg/μL) uit de injectieflacon te zuigen. Bevestig een naald van 30 G aan de spuit en houd het apenplasminogeen klaar voor intravitreale toediening.
  5. Gebruik een paar remklauwen om de injectieplaats op het oog te identificeren. Dien de intravitreale injectie toe op 3 mm afstand van de limbus.
  6. Ga verder met de injectie met de naald gericht op het midden van de wereldbol. Gebruik bij het verwijderen van de naald van de wereldbol een katoenen applicatorstok om de injectieplaats te te tamponeren en de reflux van de intraoculaire inhoud te voorkomen.
  7. Dien een glijmiddelgel of zalf toe om onmiddellijke postoperatieve oculaire oppervlakteirritatie te verminderen.

5. Chirurgische tafel en apparatuur setup

  1. Stel een steriel veld in. Wanneer u zich in het steriele veld bevindt, draag dan te allen tijde chirurgische scrubs, masker en haarbedekking.
  2. Bereid het conserveermiddelvrije triamcinolon (40 mg/ml) voor voor intraoperatieve visualisatie van glasvocht (zie rubriek 3). Bereid de steriele BSS voor in een spuit van 10 ml en glijmiddel in een spuit van 5 ml. Leg ze op een gordijn.
  3. Houd andere instrumenten klaar op een drape, waaronder 3-0 zijde, 7-0 vicryl hechtingen, katoen applicator sticks, wondsluiting strips en kroonluchter endoillumination vezeldraad.
  4. Sluit de vitrectomieset, inclusief de high-speed vitrector, Venturi-cassette en de 25 G kroonluchter endoilluminator, met behulp van steriele techniek aan op de vitrectomiemachine.
  5. Open een BSS-fles van 500 ml en sluit deze aan op de Venturi-cassette volgens de instructies van de fabrikant. Ga verder met het voorbereiden van het systeem.
  6. Schakel de miOCT/chirurgische microscoop in. Selecteer vooraf ingestelde configuraties van de chirurgische microscoop voor chirurgie en verlichting van het achterste segment. Voer de details van de procedure in, waaronder ID, geslacht, lateraliteit van het dieroog en de naam van de procedure.
  7. Monteer een contactloze, groothoekige funduslens van 128 graden.
  8. Bevestig steriele wegwerphandstukdeksels op de chirurgische microscoop/miOCT. Pas de microscooppositie en focus aan met behulp van het voetpedaal. Ga verder met een operatie.

6. Voorbereiding van de anesthesie en positionering van het dier (bij voorkeur uitgevoerd door een dierenartsteam)

  1. Zorg ervoor dat de NHP ten minste 8 uur voor de inductie van de anesthesie wordt vastgemaakt om regurgitatie en braken te voorkomen. Verdoof de NHP vóór de inductie van de anesthesie (zie stap 4.2 voor sedatie-instructies).
  2. Breng 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine oogdruppels ten minste 3x met intervallen van 5 minuten aan om pupilverwijding te bereiken.
  3. Dien 30 minuten voor de operatie een intramusculaire injectie van buprenorfine (0,005-0,03 mg/kg LG) toe om analgesie te bereiken.
  4. Intubeer de NHP met een endotracheale buis, meestal 3-5 mm groot. Wanneer u intubatie probeert, moet u ervoor zorgen dat er verschillende maten beschikbaar zijn. Gebruik de grootste maat die door het strottenhoofd kan worden gevoerd zonder trauma te veroorzaken. Meet de co2-getijden om de juiste plaatsing van de endotracheale buis te garanderen.
  5. Lever 2% isofluorgas via de endotracheale buis om algemene anesthesie te induceren. Bevestig de toestand van algemene anesthesie (gebrek aan respons op aanraking) door de reactie van de NHP op omringende stimuli, inclusief geluiden en aanraking, te beoordelen. Gebruik 0,5-2% isofluoreergas om de toestand van algemene anesthesie te handhaven.
  6. Controleer continu het NHP-elektrocardiogram, de ademhalingsfrequentie, de bloeddruk en de zuurstofverzadiging tijdens de hele operatie.
  7. Plaats de NHP op de operatietafel zodat het oog loodrecht staat op de operatiemicroscoop. Dien een glijmiddelgel of zalf toe aan het oog, die niet wordt geopereerd om irritatie van het oculaire oppervlak tijdens anesthesie te verminderen.
  8. Knip de wimpers met een schaar om de kans op infecties te verkleinen.
  9. Desinfecteer het periorbitale gebied met 10% povidon-jodium. Desinfecteer het oog door 5% povidon-jodium toe te dienen aan de conjunctivale fornices van de NHP. Zorg ervoor dat de oplossing ten minste 1 minuut in de fornices blijft voordat u grondig spoelt met steriel BSS.
  10. Plaats een steriel gordijn zodanig dat de voorgesneden opening over het oog is gecentreerd om een operatie te ondergaan. Bedek het oog met een zelfklevende chirurgische incisie drape.
  11. Voer een laterale canthotomie op het oog uit om een operatie te ondergaan.
  12. Breng het Lieberman speculum in om ervoor te zorgen dat de oogleden voldoende worden geopend voor de visualisatie van het oog.

7. Vitrectomie

OPMERKING: Om toegang te krijgen tot de subretinale ruimte voor de levering van het PET-scaffold RPE-transplantaat, beveelt dit protocol een 4-poorts (valved) 25 G vitrectomie aan die moet worden uitgevoerd met behulp van een standaard vitreoretinale chirurgische opstelling en een contactloze, groothoekige 128 ° funduslens. Het protocol beveelt ook het gebruik aan van een chirurgische microscoop uitgerust met miOCT om verschillende kritieke chirurgische stappen te begeleiden, waaronder de inductie van foveale loslating, implantatie van het RPE-transplantaat en subretinale vloeistofdrainage.

  1. Voer een 360° conjunctivale peritomie uit door het bindvlies in de buurt van de limbus te snijden met behulp van een vannasschaar. Vergroot de peritomie door een stompe dissectie uit te voeren.
  2. Voer met behulp van een microvitreoretinaal mesje van 25 G een sclelerotomie uit om 8 uur voor het rechteroog of 4 uur voor het linkeroog. Voer de sclerotomie 3 mm uit vanaf de limbus van het oog.
  3. Plaats en hecht een 25 G aangepaste port-infusie canule met behulp van 7-0 vicryl hechtdraad. Na bevestiging van de intravitreale locatie, start u de BSS-infusie en stelt u het systeem in op een IOP van 20 mmHg.
  4. Voer met behulp van een 25 G platte hoofdtrofechar een sclerogotomie uit om 2 uur voor het rechteroog of 10 uur voor het linkeroog, zoals in stap 7.2.
  5. Steek het 25 G kroonluchterlicht in de flathead trochar en zet deze vast met plakband. Stel de lichtbron in op ongeveer 60%.
  6. Voer nog een sclerotomie uit, vergelijkbaar met stap 7.2, om 10 uur voor het rechteroog of 2 uur voor het linkeroog. Plaats U-vormige vicryl 7-0 hechtingen rond de sclerotomie zonder de knopen te binden. Steek de tip van de vitrectomiesnijder door deze sclerotomie.
  7. Start de vitrectomie rond de ingangspoorten, gevolgd door een korte kern vitrectomie met de volgende instellingen: maximaal 5000 sneden per minuut, maximale aspiratie bij 400 mmHg.
  8. Injecteer 20-50 μL triamcinolon (40 mg / ml) voor een betere visualisatie van het glasvocht.
  9. Induceer een achterste glasvochtloslating (PVD) door het glasvochtlichaam van het netvlies te scheiden.
    1. Plaats de vitrector boven de optische schijf om een zachte inductie van de PVD mogelijk te maken. Houd de vitrector alleen op aspiratie op de maximale instelling van 400 mmHg zonder dat er snijden aan te pas komt.
    2. Gebruik indien nodig een intraoculaire tang van 25 G om het glasvocht aan de schijfrand te manipuleren om een scheur in de glasvochtschors te creëren om loslating te vergemakkelijken.
      OPMERKING: PVD wordt als succesvol beschouwd als triamcinolonkristallen ongehinderd over het netvliesoppervlak glijden.
  10. Open het achterste hyalusniveau met de snijder en verwijder de losgemaakte glasvochtrok tot aan de glasvochtbasis (bij de retinale evenaar). Aspirateer eventuele resterende triamcinolon op het retinale oppervlak.

8. miOCT-geleide foveale detachement

  1. Injecteer 1-2 ml PFCL om de achterste pool tot aan het voorste, mid-perifere netvlies te bedekken.
  2. Voer het oog in met een subretinale injectiecanule. Stel de IOP in op 0-4 mmHg op de vitrectomiemachine (zorg voor een perfect waterdicht systeem; bind indien nodig hechtingen rond de poorten).
  3. Met behulp van de 25/41 G aangepaste dual-bore subretinale injectiecanule of 25/38 G subretinale injectiecanule aangesloten op een spuit van 250 μL, voert u voorzichtig een subretinale injectie van BSS uit om een gelokaliseerde netvliesloslating te induceren. Zodra de bleb net de fovea kruist, stopt u met de injectie. Maak een tweede bleb vanuit een andere richting. Voeg beide blebs samen om de fovea volledig los te maken.
  4. Schakel de functie miOCT in om blebvorming te visualiseren. Zorg ervoor dat de lijn- en kubusscans in HD-modus staan met de instellingen (512 x 128 pixels, scanbreedte 4 mm) om een beeld te verkrijgen bij de fovea. Observeer het miOCT-beeld voor een volledige loslating van het neurale netvlies van de RPE-laag bij de fovea.
  5. Vergroot de retinotomie tot 1,5 mm met een verticale 25 G vitreoretinale schaar om toegang te krijgen tot de subretinale ruimte voor transplantatie.

9. Verwijdering van native RPE

  1. Stel de IOP in op 50 mmHg op de vitrectomiemachine.
  2. Verwijder de PFCL via actieve extrusie met behulp van een canule met geborstelde siliconen punt.
  3. Verleng de sclerotomie met een incisiemes van 1,4 mm om de ingang van een 20 G-instrument mogelijk te maken.
  4. Gebruik een aangepast 20 G uitbreidbaar lusinstrument om de submaculaire host RPE te schrapen voor verwijdering. Schraap een gebied dat minstens 2 x 3 mm meet.

10. Laden van de shooter voor levering van RPE cel monolayer transplantatie

  1. Voor algemene instructies over het laden van een kogelvormig transplantaat dat uit RPE-culturen op PET-celdragers is gesneden, raadpleegt u een eerdere publicatie22.

11. miOCT-geleide transplantaatimplantatie en positieaanpassing

  1. Steek de punt van het schietapparaat door de sclerotomie bij een IOP van 20 mmHg. Injecteer het implantaat in de richting van de subretinale ruimte via de retinotomierand die wordt gecreëerd door het retinale oppervlak.
  2. Injecteer het implantaat met de celdragerzijde naar het membraan van De Bruch en de RPE xenograft zijde naar de fotoreceptoren.
  3. Schakel de miOCT-functie in om de locatie van het implantaat te visualiseren. Zorg ervoor dat het implantaat plat op het membraan van de Bruch in de subretinale ruimte rust, met een intact bovenliggend netvlies. Zorg ervoor dat het zich op een redelijke afstand van de gecreëerde retinotomie bevindt en niet wordt beïnvloed door de retinotomieplaats.
  4. Pas de positie van het implantaat aan met de subretinale injectiecanule of een 25 G gebogen intraoculaire schaar om ervoor te zorgen dat deze goed onder de macula is gepositioneerd.

12. miOCT-geleide drainage van subretinale vloeistof

  1. Gebruik een canule met geborstelde siliconentip, voer een vloeistof-luchtuitwisseling en zorgvuldige subretinale vloeistofafvoer uit. Probeer zachte subretinale vloeistofaspiratie van de bleb retinale loslating en retinotomie rand appositie.
  2. Schakel de miOCT-functie in voor real-time visualisatie van adequate subretinale vloeistofafvoer totdat het netvlies opnieuw over het implantaat is bevestigd.

13. De bewerking beëindigen

  1. Sluit de werkende poortsclelerotomie met behulp van de vooraf geplaatste 7-0 vicryl hechting. Verwijder de 25 G kroonluchter en 25 G infusiecanule. Sluit deze sclerotomieën met 7-0 vicryl hechtingen.
  2. Dien 2 mg in 0,05 ml intravitreale conserveermiddelvrije triamcinolon (40 mg/ml) toe bij de sclerotomie van 8 uur voorafgaand aan het hechten.
  3. Palpeer het oog om ervoor te zorgen dat de IOP binnen het acceptabele bereik ligt. Injecteer gefilterde lucht (of BSS) indien nodig via een naald van 30 G.
  4. Hecht het bindvlies met 7-0 vicryl hechtingen en canthotomie met 5-0 prolene (verwijder na 10-14 dagen).

14. Postoperatieve dierverzorging

  1. Plaats de NHP 1 uur na de operatie met de voorkant naar beneden. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het bewustzijn is herwonnen. Zorg ervoor dat een dierenarts en dierverzorgingstechnicus beschikbaar zijn voor observatie en ondersteuning tijdens het postoperatieve proces.
  2. Breng topisch antibioticum (tobramycine), steroïde (dexamethason) zalf en homatropine oogdruppels tweemaal daags gedurende 5 dagen postoperatief.
  3. Dien 6 uur na de operatie nog een subcutane injectie buprenorfine (0,005-0,03 mg/kg LICHAAMSGEWICHT) toe voor adequate pijnbestrijding.
  4. Breng de NHP pas terug naar het gezelschap van andere dieren als het volledig weer bij bewustzijn is gekomen.
  5. Voer multimodale beeldvormingsopvolgingen uit op dag 3, 14 en maand 1 na de procedure, gevolgd door maandelijkse controles. Voer ELKE MAAND NA DE PROCEDURE ERG's uit. Verwijder de 5-0 prolene hechtingen voor de canthotomie op dag 14 gelijktijdig met de sedatieperiode die wordt gebruikt voor multimodale beeldvorming. De resterende hechtingen zijn resorbeerbare, 7-0 vicryl hechtingen, die niet hoeven te worden verwijderd.

15. Postoperatieve monitoringmethoden voor multimodale beeldvorming

  1. Snel de NHP 's nachts. Verdoof de NHP vlak voor de beeldvorming (zie stap 4.2 voor geneesmiddel en concentratie voor sedatie). Als sedatie onvoldoende is om de oogbeweging te stoppen, overweeg dan het gebruik van algemene anesthesie.
  2. Breng 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine-oogdruppels aan om pupilverwijding te bereiken vóór beeldvorming (zie stap 6.2).
  3. Voer autofluorescentie (AF), fundusfluoresceïneangiografie (FFA) en optische coherentietomografie (OCT) uit met behulp van een OCT-machine met hoge resolutie met een 55° veldlens en 30° veldlens.
    1. Dien intraveneus 10% fluoresceïne (0,1 ml/kg LG) toe voor FFA. Om een vroegfasebeeld te verkrijgen, legt u een beeld vast binnen 30 s na injectie. Voor een laatfasebeeld legt u 5-10 minuten na de injectie een beeld vast.
  4. Voer fundusfotografie uit met een funduscamera tussen de vroege en late fase van FFA.

16. Postoperatieve monitoringmethoden voor full-field electroretinogramstudies (ERG)

  1. Snel de NHPs 's nachts. Verdoof het NHP vóór ERG-onderzoeken (zie stap 4.2 voor geneesmiddel en concentratie voor sedatie). Dien tijdens de ERG-opnames sedatie indien nodig opnieuw toe.
  2. Afzonderlijke multimodale beeldvorming en ERG-opnames met een interval van ten minste 2-3 dagen.
  3. Eenmaal verdoofd, zorg ervoor dat de NHP gedurende 30 minuten voor de ERG-opname donker is aangepast.
  4. Plaats de roestvrijstalen subdermale naaldelektroden links en rechts lateraal canthi (referentie-elektroden) en de achterkant van het NHP-lichaam (grondelektrode). Plaats de ERG-contactlenselektroden op het NHP-hoornvlies met behulp van vidisische gel om contact en hechting te bevorderen.
  5. Baseer alle ERG-tests op de menselijke protocollen die worden aanbevolen door de International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Begin met ERG-opname onder scotopische omstandigheden en begin met de dimmerflitsen. Volg de ISCEV-aanbevelingen voor aanbevolen interstimulusintervallen.
  6. Zorg ervoor dat de NHP gedurende 10 minuten voor het testen van fotopische kleuren lichtgevoelig is, opnieuw met behulp van standaard ISCEV-aanbevelingen voor achtergrondsterkte.

17. Euthanasie van NHP

  1. Om de NHP voor enucleatie te euthanaseren, dient u intraveneus natriumpentobarbital (75 mg / kg) toe, zoals aanbevolen door het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association.

Representative Results

De multimodale beeldvormingsmodaliteiten (fundusfotografie, fundusautofluorescentiebeeldvorming (FAF), fundusfluocesineangiografie (FFA)-vroege fase en late fase, en optische coherentietomografie (OCT)) benadrukken de kenmerken van een succesvolle submaculaire RPE-transplantaattransplantatie (figuur 1). Fundusfotografie toont de positionering van de RPE-transplantaattransplantatie bij de fovea zonder migratie in de loop van de tijd. FAF-beeldvorming toont minimale veranderingen in hyperautofluorescentie (aangetoond door witte, hoge intensiteitsgebieden) die het RPE-transplantaat overlappen. Vroege en late fase FFA vertonen geen duidelijke lekkage (aangetoond door witte, hoge intensiteitsgebieden die met de tijd groter worden) rond het RPE-transplantaat. De eerste beelden op dag 3 tonen een raamdefect als gevolg van de verwijdering van native RPE vóór de implantatie van het transplantaat. Maculaire OCT-beelden tonen het behoud van buitenste retinale lagen (in het bijzonder de fotoreceptorlaag) over het RPE-transplantaat naarmate de tijd vordert. Hematoxyline- en eosinekleuring vertoont intacte retinale lagen zonder bewijs van microtears. Het behoud van de buitenste nucleaire laag boven de periferie van het transplantaat suggereert dat de RPE-cellen hun fysiologische functies uitvoeren om de gezondheid van de fotoreceptor te behouden.

De intraoculaire en externe weergaven van de 25/41 G canule met dubbele boring benadrukken het mechanisme waarmee de IOP wordt gecontroleerd tijdens subretinale injectie (figuur 2). BSS komt de subretinale ruimte binnen tijdens subretinale vloeistofinjectie via de centrale langere canule. Aanzienlijke verhogingen van de intraoculaire druk zorgen ervoor dat de BSS in de glasvochtholte het oog verlaat via de grotere metalen boring van de canule. BSS reist vervolgens langs de canule en wordt uiteindelijk uit de uitgang bij de canulehub geworpen. Om te beoordelen of de canule werkt zoals verwacht, moet u ervoor zorgen dat er vloeistof uit de uitgang in de buurt van de canulehub stroomt.

Het miOCT maakt de visualisatie van de blebafmetingen en een potentiële foveale scheur intraoperatief mogelijk tijdens foveale loslating (figuur 3). Figuur 3A1-A3 markeert een geval van bleb met een foveale scheur. In figuur 3A1, terwijl de inferieure bleb zichtbaar is onder de chirurgische microscoop, is visualisatie van de scheur moeilijk. Figuur 3A2 toont het longitudinale gedeelte van een bleb zonder scheuren. Figuur 3A3 toont een foveale scheur bij het beoordelen van het verticale gedeelte van de bleb. Figuur 3B1-B3 toont een succesvol gecreëerde bleb zonder de aanwezigheid van tranen.

De afwezigheid van significante verslechtering van de ERG-golfvormen suggereert dat de globale functie van zowel staaf- als kegelfotoreceptoren wordt gehandhaafd met subretinale RPE-xenotransplantaten (figuur 4). De ERG-golfvormen tonen de algehele functie van het netvlies. In het bijzonder moet aandacht worden besteed aan de A-golven om een eventueel verlies van fotoreceptorfunctie te bepalen.

Figure 1
Figuur 1: Postoperatieve in vivo analyse met multimodale beeldvorming. (A) In vivo beeldvorming van de linkeroog submaculaire RPE grafttransplantatie (geel op fundusfotografie) op verschillende beeldvormingsmodaliteiten (kolommen van links naar rechts: fundusfotografie, autofluorescentie, fundus fluoresceïneangiografie-vroege fase, fundusfluocesceïne angiografie-late fase, optische coherentietomografie) voor tijdspunten tot 3 maanden (bovenste tot onderste rijen: dag 3, 14; Maand 1, 3). Het sterretje op de fundusfoto geeft de plaats van de retinotomie aan; de witte stippelpijl geeft de richting van de lijnscan aan. De geel getekende vorm op fundus autofluorescentie beeldvorming benadrukt de locatie van de transplantatie. De witte driehoeken op de OCT-afbeeldingen geven de respectieve zijranden van het transplantaat aan (volgens de lijnscan op de kleurenfundusafbeelding). (B) Hematoxyline- en eosinekleuring van de transplantatie onder atrofische fovea (als gevolg van intraoperatieve scheur) met gelabelde lagen. Schaalbalken = 1 mm in A (autofluorescentie- en FA-beelden), 200 μm in A (OCT-beelden) en 100 μm in B. Afkortingen: FA = fundus angiografie; OCT = optische coherentietomografie; RGC = retinale ganglion cellaag; INL = binnenste kernlaag; ONL = buitenste kernlaag; RPE = retinaal pigmentepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Intraoculaire en externe weergaven van de 25/41 G dual-bore canule. (A) Intraoculaire weergave van de 25/41 G dual-bore canule tijdens subretinale blebcreatie. De witte pijl wijst naar de langere centrale canule voor subretinale injectie. De onderbroken pijl wijst naar de opening van de uitgaande canule waar de BSS doorheen gaat om het oog te verlaten. (B) Uitwendig zicht van de 25/41 G canule met dubbele boring. Het sterretje markeert de uitgaande poort in de buurt van de canulehub waaruit het intraoculaire BSS wordt afgevoerd. Afkorting: BSS = gebalanceerde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Intraoperatieve microscoopbeelden en miOCT-beelden van subretinale bleb gecompliceerd door een foveale scheur. (A1) Een intraoperatieve microscoopafbeelding met de positie van longitudinale (blauwe) en transversale (rode) scans in een bleb met een foveale scheur. (A2) Longitudinale miOCT-scan met een subretinale bleb in het foveale gebied (gele pijl). (A3) Transversale miOCT-scan die een foveale scheur (witte pijlpunt) vastlegt, samen met een retinotomie (asterisk en een subretinale bleb (gele pijl). (B1) Een intraoperatief microscopisch beeld van de positie van longitudinale (blauwe) en transversale (rode) scans in een succesvol gevormde bleb. (B2) Longitudinale miOCT-scan met een subretinale bleb in het foveale gebied (gele pijl). (B3) Transversale miOCT-scan met een succesvol gecreëerde subretinale bleb met een intacte fovea superieur (witte diamant). Afkorting: miOCT = microscoop-geïntegreerde optische coherentie tomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: ERG van RPE xenograft-getransplanteerd oog. Voor de functionele beoordeling van het netvlies tonen full-field ERG-beoordelingen van het RPE-xenogetransplanteerde oog uitgevoerd bij baseline (bovenste rij) en 3 maanden na transplantatie (onderste rij) geen significant effect van de RPE xenografttransplantatie op responsamplitudes, timing of golfvorm onder donker-aangepaste of licht-aangepaste omstandigheden. Afkortingen: RPE = retinaal pigment epithelium; ERG = elektroretinogram; DA = donker-aangepast; LA = licht-aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Er zijn twee hoofdbenaderingen die worden geëvalueerd voor submaculaire RPE-transplantatie- de injectie van een RPE-suspensie en de transplantatie van een monolaagS RPE-transplantaat. Een gedetailleerde vergelijking tussen de twee methoden valt buiten het bestek van dit manuscript. De transplantatie van een monolaag RPE-transplantaat kan echter voordelig zijn omdat de RPE-cellen meer georganiseerd zijn in een monolaag dan in een suspensie. RPE-cellen in het transplantaat zijn georganiseerd in een confluent monolaag, die lijkt op de organisatie van de fysiologische RPE-cellaag en de getransplanteerde RPE-cellen in staat stelt hun fysiologische functies uit te voeren. Dit maakt nauwkeurigere doseerparameters mogelijk in vergelijking met celsuspensies, wat zeer relevant is voor regelgevingswerk en industriële opschaling.

Toediening van de RPE-patchtransplantaat in de subretinale ruimte vereist zorgvuldige manipulatie van de macula en nauwkeurige inbrenging van het transplantaat in de subretinale ruimte. Technologische vooruitgang in microchirurgie, zoals miOCT, en een beter begrip van intraoperatieve retinale weefseldynamica hebben de leercurve van deze procedure verminderd. In deze discussie zullen de beweegredenen van de volgende aspecten worden uitgelegd: i) pre-operatieve plasminogeeninjectie; ii) het gebruik van intraoperatief miOCT; iii) het gebruik van een aangepaste 41 G canule met dubbele boring, lage IOP-instellingen en PFCL voor het maken van subretinale bleb; iv) schrapen van de inheemse RPE-cellaag vóór transplantatie; v) het gebruik van sirolimus, triamcinolon, doxycycline en minocycline om immunogene transplantaatafstoting te verminderen.

Preoperatieve plasminogeen injecties geven parafoveale retinale verklevingen af
In de eerste experimenten was het een uitdaging om de fovea los te maken met een enkele vloeistofgolf. Bij beoordeling met miOCT onthulden de beelden de aanwezigheid van parafoveale buitenste retinale verklevingen aan de inheemse RPE, samen met bewijs van intraretinaal trauma20. Deze verklevingen kunnen hebben geleid tot een verticale expansie van de bleb in plaats van de subretinale vloeistofgolf die zich over de retinale contour verspreidt, wat resulteert in veuveuma. Plasminogeen is de inactieve voorloper van plasmine, een protease gericht op fibronectine en laminine. Ocriplasmine is een bio-technische variant van humaan plasmine, goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) voor de behandeling van symptomatische vitreomaculaire tractie met of zonder een gelijktijdig maculagat. Postgoedkeuringsrapporten van de ontwikkeling van cystoïd macula-oedeem na ocriplasmine-injectie hebben echter een uitgebreider effect van het enzym op het netvlies gesuggereerd23.

Hoewel de exacte mechanismen niet zijn geïdentificeerd, werd gesuggereerd dat plasmine de retinale adhesie zou kunnen verzwakken door de afbraak van de interfotoreceptormatrixelementen die verantwoordelijk zijn voor fotoreceptor-RPE-adhesie24. In dit protocol werden NHP-ogen 1 week voor de operatie behandeld met intravitreaal plasminogeen om de parafoveale buitenste retinale verklevingen vrij te geven. In de veronderstelling dat de adhesie van de fotoreceptor-RPE verzwakt is, is een lagere kracht nodig om het neurosensorische netvlies los te maken, inclusief de distale parafoveale ring, die meestal weerstand biedt aan de subretinale vloeistofgolf20. De kracht die wordt toegediend tijdens retinale blebloslating resulteert dus in de uitzetting van de bleb over de retinale contour in plaats van het netvlies tangentieel uit te rekken. Dit vermindert het risico op foveale scheuren. Er moet echter worden opgemerkt dat het effect van plasminogeen op de overleving van transplantaten op lange termijn niet in dit protocol is bestudeerd. Toekomstige studies moeten proberen dit effect te bepalen.

miOCT biedt anatomische feedback om subretinale blebvorming, transplantaatimplantatie en subretinale vloeistofafvoer te begeleiden
Intraoperatieve, atraumatische manipulatie van de macula is de sleutel tot het bereiken van goede transplantatieresultaten. Microstructurele veranderingen van de macula in verband met manipulatie zijn echter niet altijd zichtbaar op de operatiemicroscoop. In dergelijke procedures is het miOCT een belangrijk hulpmiddel dat real-time, driedimensionale, intraoperatieve feedback van de maculaire structuur biedt. miOCT is vooral nuttig tijdens de stappen van foveale loslating, transplantaatimplantatie en drainage van de subretinale vloeistof met behulp van een vloeistof-luchtuitwisseling. Tijdens foveale loslating kan miOCT de verticale en horizontale afmetingen van de bleb bepalen. Foveale microtears, die mogelijk niet duidelijk worden gevisualiseerd op de chirurgische microscoop, kunnen worden bevestigd door miOCT (figuur 3). Tijdens de implantatie van het transplantaat leiden miOCT-beelden door de locatie van het transplantaat of de nabijheid van de fovea te tonen, via het vaak minder transparante, losgemaakte netvlies. miOCT kan ook mogelijke gebieden van retinale adhesie markeren tijdens een moeilijk transplantatieproces25. Ten slotte kan miOCT in het subretinale vloeistofdrainageproces op betrouwbare wijze subretinale vloeistofdrainage begeleiden totdat volledig retinaal-RPE-transplantaatcontact is bereikt.

De combinatie van een canule met dubbele boring, lage IOP-instellingen en PFCL-glasvochttamponade vermindert synergetisch maculatrauma tijdens het maken van subretinale bleb
Tangentiële retinale stretching en vloeistofturbulentie kunnen optreden tijdens de subretinale BSS-injectie voor foveale loslating die leidt tot ongewenste foveale tranen. Om deze verschijnselen tegen te gaan, zijn factoren, zoals de relatieve positie en afstand tot het foveale centrum waar de injectie wordt gestart, injectievolume en -snelheid, glasvochttamponade, keuze van subretinale instrumentatie en IOP allemaal relevant gebleken20,26,27. De subretinale bleb voor foveale loslating moet zich op een locatie bevinden die voldoende ver van de fovea verwijderd is, aangezien de retinale stretching het hoogst kan zijn op de bleb-initiatieplaats27. IOP moet ook laag worden gehouden tijdens het maken van de subretinale bleb. Wanneer de IOP van het oog hoog is, wordt een hogere verticale toename van de blebgrootte waargenomen in plaats van uitzetting langs de contouren van het netvlies, terwijl blebs ondieper zijn bij lagere drukken20. Bovendien, hoewel een intravitreale injectie van 50 μL de IOP bij mensen effectief zal verdubbelen28, gezien de kortere ooglengte bij NHPs, zal de IOP-stijging tijdens subretinale injectie waarschijnlijk hoger en sneller zijn dan bij mensen. Hoewel de meeste vitrectomiemachines zich aanpassen aan IOP-fluctuatie, is de aanpassing geen gelijktijdig, maar eerder een reactief proces dat optreedt naarmate subretinale injectie vordert. Vandaar dat hoe hoger de IOP, hoe hoger het risico op retinale overstretching en resulterend foveaal trauma. Het is dus essentieel om een stabiele lage IOP te behouden tijdens subretinale injectie.

Een commerciële 20/41 G (DORC) of een op maat gemaakte 25/41 G dual-bore subretinale canule wordt aanbevolen voor subretinale injectie. De canule zorgt ervoor dat vloeistof de glasvochtholte kan verlaten in ruil voor BSS geïnjecteerd in de subretinale ruimte. Dit zorgt voor de 'gelijktijdige' regulatie van IOP tijdens de subretinale injectie. Een schema van de canule met dubbele boring is te zien in figuur 2. Ten slotte wordt PFCL gebruikt om het risico op foveale tranen20,26,27 te verminderen. Omdat PFCL's, zoals octaline, een hoger soortelijk gewicht hebben, oefenen ze een neerwaartse kracht uit op het netvlies tijdens foveale loslating29. Dit stabiliseert verder het foveale loslaat bleb-creatieproces en verbetert de uitzetting van de bleb langs de retinale contour. Deze techniek is met succes gebruikt voor de subretinale injectie van rtPA in de setting van massale submaculaire bloeding als gevolg van nAMD30.

Pretransplantatie verwijdering van native RPE maakt het herstel van RPE-fotoreceptor complex mogelijk
Gastheer RPE moet worden verwijderd vóór transplantaattransplantatie. Dit komt omdat het herstel van het RPE-fotoreceptorcomplex nodig is om de RPE-transplantatie in staat te stellen zijn fysiologische functies van ondersteuning van de fotoreceptoren uit te voeren21. De gastheer RPE, indien niet verwijderd, kan zich voordoen als een mechanische barrière, die het herstel van dit complex verhindert. Het kan worden verwijderd door de toediening van RPE-toxische chemicaliën of door fysieke verwijderingsmiddelen te gebruiken. Chemische verwijderingsmethoden omvatten de systemische of subretinale toediening van natriumjodaat31,32. Aangezien natriumjodaat wijdverspreide degeneratie van fotoreceptoren, RPE-cellen en Choriocapillaris veroorzaakt bij toediening, sluit de retinale en systemische toxiciteit het gebruik ervan voor menselijke proeven uit32,33. Daarom hebben fysieke intraoperatieve technieken de voorkeur. Verschillende fysische methoden zijn geconceptualiseerd. Wanneer fysieke methoden worden gebruikt, is het cruciaal dat het membraan van de Bruch onbeschadigd blijft. Veel in vitro studies hebben de afhankelijkheid aangetoond van RPE graft overleving op een intact Bruch's membraan34,35,36.

Pogingen tot hydraulisch debridement werden geassocieerd met breuken in het membraan van Bruch, een verhoogde snelheid van epiretinale membraanontwikkeling en proliferatieve vitreoretinopathie, resulterend in tractief retinale loslating37. Een met diamant bestofte spatel voorgesteld voor RPE-debridement leidde ook tot breuken in het membraan van de Bruch, wat resulteerde in cellulaire proliferatie van het vaatvlies naar de subretinale ruimte38. Interessant is dat een op maat gemaakt uitschuifbaar lusinstrument de bovenliggende RPE zou kunnen verwijderen met behoud van het membraan van Bruch in de ogen van konijnen en varkens11,39. De verwijdering van de onderliggende RPE is ook nuttig voor het vaststellen van diermodellen met RPE en buitenste retinale atrofie, vergelijkbaar met de geavanceerde atrofische vorm van AMD. Wanneer een brandpuntsgebied van RPE uit de macula wordt verwijderd, sluit de RPE-wond zich via de hypertrofie van de resterende RPE-cellen. Deze wondgenezingsreactie wordt echter geassocieerd met atrofie van de buitenste nucleaire laag40. Hoewel het maken van een diermodel buiten het bestek van dit manuscript valt, kan een vergelijkbare procedure een diermodel van een geavanceerd atrofisch AMD-fenotype creëren voor het testen van RPE-afgeleide celtherapieën.

Het gebruik van sirolimus, triamcinolon, doxycycline en minocycline om immunogene transplantaatafstoting te verminderen
De subretinale ruimte wordt beschouwd als een immuun-bevoorrechte site, onderhouden door een intacte bloed-retinale barrière en andere factoren41. In veel studies met betrekking tot de subretinale transplantatie van stamcelderivaten met een intacte bloed-retinale barrière, spelen immunosuppressieve geneesmiddelen een verwaarloosbare rol bij de overleving van het transplantaat42. De buitenste bloed-retinale barrière wordt vermoedelijk gevormd door de inheemse RPE-laag en de tight junctions tussen de RPE-cellen. Terwijl native RPE-verwijdering een betere integratie van de getransplanteerde RPE en gastheerfotoreceptoren mogelijk maakt, wordt de bloed-retinale barrière in het proces verstoord, waardoor de kans op een immuunafstoting toeneemt. Klassiek staan T-cellen centraal in het proces van transplantatieafstoting van andere organen zoals de nier en lever43. Vandaar dat de initiële immunosuppressieve regimes voor retinale weefseltransplantatie gericht waren op het verminderen van deze adaptieve immuunresponsen.

Sirolimus, een mechanistisch doelwit van rapamycineremmer, en tacrolimus, een calcineurineremmer, zijn voorbeelden van immunosuppressieve geneesmiddelen die zich richten op adaptieve immuunresponsen. Ondanks adequate T-celonderdrukking blijven de overlevingskansen van het transplantaat echter laag. Bovendien is bekend dat RPE-cellen de activering van T-cellen onderdrukken door het vrijkomen van remmende factoren en de generatie van regulerende T-cellen bevorderen44. Daarom is het steeds duidelijker geworden dat adaptieve immuniteit mogelijk niet de enige bijdrage levert aan transplantaatafstoting42. Subretinale transplantatie van cellulaire producten kan resulteren in de accumulatie en activering van microglia45.

Microglia zijn de macrofagen van het netvlies. Ze bestaan uit twee hoofdpopulaties: 1) de perivasculaire microglia van de binnenste retinale vasculatuur en 2) de microglia in het retinale weefselparenchym. Omdat microglia deel uitmaken van de aangeboren immuunrespons, kunnen intravitreale glucocorticoïden, zoals triamcinolon, cytokine-gemedieerde proliferatie onderdrukken46. Doxycycline en minocycline kunnen ook microgliale activering onderdrukken en moeten worden overwogen47,48. Ten slotte zijn de verschillen in immuunafstoting van RPE-allografts versus xenotransplantaten onvolledig begrepen49. Alloantilichamen tegen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE-cellen zijn bijvoorbeeld gemeld in het serum van in vivo immuunafstotingsmodellen. De rol van deze antilichamen en het belang van antilichaamgemedieerde afstoting in de overleving van transplantaten blijft echter onbekend50. Daarom wordt een multidrugsregime voorgesteld met behulp van sirolimus voor de onderdrukking van adaptieve immuniteit en een combinatie van triamcinolon, doxycycline en minocycline voor aangeboren immuniteitsonderdrukking. Dit regime is met succes gebruikt bij konijnen met goede uitkomsten van de overleving van het transplantaat en minimale systemische effecten11.

Beperkingen van deze chirurgische techniek
Dit artikel beschrijft een mogelijke chirurgische methode om een RPE-transplantaatvel af te leveren in de subretinale ruimte van NHP; dit betekent echter niet dat dit de enige geoptimaliseerde manier is. Verschillende vitreo-retinale chirurgen kunnen andere voorkeuren hebben voor instrumentatie en techniek. Dit ontwerp van implantatieapparatuur kan bijvoorbeeld alleen platte implantaten leveren die worden ondersteund met een stijvere celdrager en daarom mogelijk niet geschikt zijn voor relatief flexibele (of gerolde) implantaten. RPE-suspensietransplantaties kunnen veel van deze techniek weglaten. Dienovereenkomstig zullen chirurgische details moeten worden aangepast op basis van elke toedieningsstrategie.

Naarmate de interesse in cellulaire therapieën voor de behandeling van degeneratieve retinale ziekten blijft groeien, zal het NHP-diermodel essentieel zijn in preklinische studies voor het bestuderen van de factoren die de overleving van RPE-transplantaten beïnvloeden. In dit manuscript worden strategieën voorgesteld om de soepelere afgifte van een submaculair monolaag RPE-transplantaat in het NHP-oog mogelijk te maken. Methoden voor een betere visualisatie van intraoperatieve complicaties worden ook aanbevolen. Er wordt verwacht dat deze methoden zullen blijven verbeteren naarmate het gebruik van cellulaire therapieën zich uitbreidt. Toekomstige method papers moeten ook overwegen om een uitgebreide lijst van onderzoeken voor te stellen om verschillende structurele en functionele aspecten van het transplantaat te beoordelen.

Disclosures

Boris Stanzel heeft een Us Patent 9980851 op een instrument (RPE scraper) dat in deze studie wordt gebruikt. Spreker honoraria van C. Zeiss Meditec en Geuder tot Boris Stanzel. De andere auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), de NUS Start-up grant NUHSRO/2016/100/SU/01, NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) grant en National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) aan X.S., Hong Leong Endowed Professorship funds aan G.E.H. en B.V.S. We willen graag het veterinaire team van het Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapore) bedanken voor het bieden van ondersteuning bij de voorbereiding van NHP-chirurgie en de follow-up van dieren. We willen graag onze waardering uitspreken voor Jill Teo en collega's van C. Zeiss Meditec Singapore voor technische ondersteuning voor de OPMI-Lumera 700 met geïntegreerd intraoperatief OCT-apparaat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Tags

Geneeskunde Nummer 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter