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Medicine

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Il primate non umano (NHP) è un modello ideale per lo studio delle terapie cellulari retiniche umane a causa delle somiglianze anatomiche e genetiche. Questo manoscritto descrive un metodo per il trapianto submaculare di cellule epiteliali pigmentate retiniche nell'occhio NHP e strategie per prevenire le complicanze intraoperatorie associate alla manipolazione maculare.

Abstract

Il trapianto di epitelio pigmentato retinico (RPE) è molto promettente per il trattamento delle malattie degenerative della retina ereditarie e acquisite. Queste condizioni includono la retinite pigmentosa (RP) e forme avanzate di degenerazione maculare legata all'età (AMD), come l'atrofia geografica (GA). Insieme, questi disturbi rappresentano una percentuale significativa della cecità attualmente incurabile a livello globale. Queste esigenze mediche insoddisfatte hanno generato un maggiore interesse accademico nello sviluppo di metodi di sostituzione dell'RPE. Tra i modelli animali comunemente utilizzati per i test preclinici delle terapie, il primate non umano (NHP) è l'unico modello animale che ha una macula. Poiché condivide questa somiglianza anatomica con l'occhio umano, l'occhio NHP è un modello animale preclinico importante e appropriato per lo sviluppo di medicinali per terapie avanzate (ATMP) come la terapia cellulare RPE.

Questo manoscritto descrive un metodo per il trapianto submaculare di un monostrato RPE, coltivato su un vettore cellulare di polietilene tereftalato (PET), sotto la macula su una ferita RPE creata chirurgicamente in NHP immunosoppressi. La fovea - la porzione avascolare centrale della macula - è il sito della maggiore debolezza meccanica durante il trapianto. Il trauma foveale si verifica se l'iniezione iniziale di liquido subretinico genera una forza eccessiva sulla retina. Pertanto, l'iniezione lenta sotto tamponamento vitreo liquido perfluorocarburo (PFCL) è raccomandata con una cannula di iniezione subretinica a doppio foro a basse impostazioni di pressione intraoculare (IOP) per creare un bleb retinico.

Si consiglia inoltre il pretrattamento con un'iniezione intravitreale di plasminogeno per rilasciare aderenze parafoveali RPE-fotorecettore. Queste strategie combinate possono ridurre la probabilità di strappi foveali rispetto alle tecniche convenzionali. L'NHP è un modello animale chiave nella fase preclinica dello sviluppo della terapia cellulare RPE. Questo protocollo affronta le sfide tecniche associate alla somministrazione della terapia cellulare RPE nell'occhio NHP.

Introduction

Il trapianto di RPE è molto promettente per il trattamento delle malattie degenerative della retina ereditarie e acquisite. Queste condizioni includono la retinite pigmentosa (RP, distrofia rod-cono) e forme avanzate di AMD come GA. Collettivamente, questi disturbi rappresentano una percentuale significativa della cecità attualmente non curabile a livello globale1,2. Gli stadi avanzati di AMD sono classificati in AMD neovascolare (nAMD) e GA. Mentre ci sono opzioni di trattamento efficaci per nAMD, come iniezioni di fattore di crescita endoteliale anti-vascolare (anti-VEGF), i pazienti con GA hanno opzioni di trattamento limitate. La RP è un gruppo altamente eterogeneo di disturbi ereditari della retina caratterizzati da progressiva degenerazione dei fotorecettori retinici. In alcuni pazienti, il difetto genetico causale si trova all'interno dell'RPE piuttosto che dei fotorecettori; quindi, la terapia sostitutiva RPE può essere una strategia alternativa se la terapia genica non è fattibile.

C'è un interesse significativo nello sviluppo di trattamenti efficaci per queste condizioni. In particolare, il trapianto di RPE sta guadagnando terreno come potenziale approccio terapeutico3,4,5,6,7,8. Da quando i primi rapporti sul trapianto di RPE sono apparsi nel 19809, il campo si è ampliato per includere varie fonti di cellule RPE, strategie di consegna e modelli sperimentali di malattia e trapianto10,11,12,13,14. Tra i vari modelli animali, solo l'NHP ha una "macula lutea" con una "fovea centralis", una specializzazione anatomica al polo posteriore della retina condivisa con l'uomo. La fovea contiene una densità molto elevata di fotorecettori a cono che consentono una visione centrale ad alta risoluzione15. L'NHP ha anche una composizione genomica e proteomica simile16 rispetto agli esseri umani. Queste somiglianze lo rendono un modello animale importante e appropriato per lo studio delle malattie oculari che colpiscono la retina umana17,18.

Questo manoscritto descrive un metodo per il trapianto submaculare di uno xenotrapianto RPE, supportato da un vettore di cellule PET, in NHP immunodepressi. Una tecnica transvitreale per il trapianto subretinico di RPE nei conigli è stata descritta in un precedente manoscritto19. Tuttavia, negli NHP, la presenza della fovea richiede particolare attenzione durante la manipolazione intraoperatoria20. In particolare, vi è un alto rischio di lacerazione foveale se i metodi di iniezione di liquido subretinico generano una forza eccessiva sulla retina20. Il focus di questo manoscritto è, quindi, sulle strategie per ridurre il rischio di traumi foveali involontari in NHP.

Questi includono l'uso dell'iniezione preoperatoria intravitreale di plasminogeno per il rilascio di aderenze parafoveali e la tomografia a coerenza ottica integrata nel microscopio chirurgico (miOCT) intraoperatoriamente per la visualizzazione in tempo reale dell'anatomia foveale. Viene proposta una cannula subretinica a doppio foro 25/41 G su misura con tamponamento intraoculare PFCL con basse impostazioni IOP per consentire un processo più controllato di distacco foveale. Inoltre, si raccomanda la rimozione chirurgica dell'RPE nativo prima dell'impianto per consentire una migliore integrazione tra le cellule RPE trapiantate e i fotorecettori dell'ospite. Infine, viene descritto un protocollo di immunosoppressione sistemica peri- e postoperatoria per modelli NHP per migliorare la sopravvivenza dello xenotrapianto RPE post-trapianto11,21.

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. L'approvazione etica è stata ottenuta dall'Institutional Animal Care and Use Committee, SingHealth, Singapore. Gli animali sono stati ospitati presso il Centro di medicina sperimentale SingHealth approvato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). Questa approvazione evidenzia che tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi agli standard del Comitato consultivo nazionale per le linee guida per la ricerca sugli animali da laboratorio stabilite dall'Autorità agroalimentare e veterinaria di Singapore. Il seguente protocollo sperimentale è stato stabilito sulla base di esperimenti condotti in 6 occhi di 6 Macaca fascicularis (4 maschi e 2 femmine, da 4 a 6 anni, da 2,8 a 4,0 kg ).

1. Raggiungere l'immunosoppressione nel modello NHP

  1. Iniziare l'immunosoppressione 7 giorni prima dell'intervento chirurgico e continuare l'immunosoppressione per tutto il periodo di follow-up.
  2. Pesare l'NHP prima della somministrazione di immunosoppressione sistemica per garantire un dosaggio accurato del farmaco. L'animale viene pesato al basale e successivamente settimanalmente.
  3. Utilizzare sirolimus orale, doxiciclina, e minociclina per ottenere immunosoppressione sistemica.
    1. Somministrare una dose di carico di 2 mg di sirolimus orale seguita da un dosaggio giornaliero di mantenimento di 1 mg. Ottenere il livello basale di sirolimus nel sangue prima della somministrazione e monitorarlo durante tutto il periodo di follow-up. Garantire una concentrazione di almeno 5 μg/L per un'adeguata immunosoppressione.
      NOTA: La dose di Sirolimus non è adattata al peso.
    2. Somministrare una dose di 7,5 mg/kg di doxiciclina orale al giorno, due volte al giorno.
    3. Somministrare una dose di 7,5 mg/kg di minociclina orale al giorno, due volte al giorno.
  4. Durante l'immunosoppressione, monitorare tutti gli NHP per effetti sistemici avversi. Cerca una significativa perdita di peso corporeo (>10%), diminuzione dell'appetito e del consumo di acqua, perdita di capelli non glorificata e comportamenti anormali come aggressività e letargia. Le valutazioni saranno effettuate nei giorni 3, 14 e 1 mese, seguite da valutazioni mensili.

2. Sterilizzazione dello strumento

  1. Risciacquare gli strumenti chirurgici con acqua distillata.
  2. Posizionare gli strumenti in un bagno ad ultrasuoni riempito con 500 ml di acqua distillata e 2 ml di disinfettante per strumenti. Pulire gli strumenti utilizzando la funzione sweep del bagno ad ultrasuoni per 15 min.
  3. Rimuovere gli strumenti dal bagno ad ultrasuoni. Risciacquare due volte abbondantemente con acqua distillata per 5 minuti ogni risciacquo. Asciugare all'aria gli strumenti dopo il risciacquo.
  4. Posizionare gli strumenti in una scatola degli strumenti. Autoclave della scatola utilizzando l'impostazione del programma universale (sterilizzazione degli strumenti a 134 °C per 50 min: 30 min per l'autoclave, 20 min per l'essiccazione).

3. Preparazione di triamcinolone senza conservanti (40 mg/mL)

  1. Utilizzando una siringa da 1 mL, prelevare 1 mL di soluzione di triamcinolone (10 mg/mL). Trasferirlo in un tubo conico da 15 mL e mescolarlo con 4 mL di soluzione salina bilanciata sterile (BSS).
  2. Centrifugare la soluzione a 120 × g per 5 min. Assicurarsi che tutte le particelle di triamcinolone siano sul fondo del tubo conico. Scartare il surnatante (BSS) dal tubo conico.
  3. Sospendere nuovamente le particelle di triamcinolone con 5 ml di BSS sterile nel tubo conico. Centrifugare la soluzione a 120 × g per 5 min. Scartare di nuovo il surnatante.
  4. Ripetere il passaggio 3.3 per completare il lavaggio delle particelle di triamcinolone con BSS (3x).
  5. Sospendere nuovamente le particelle di triamcinolone con 0,25 mL di BSS sterile per raggiungere una concentrazione di 40 mg/mL.
  6. Aspirare il triamcinolone ri-sospeso (40 mg/mL) con una nuova siringa da 1 mL. Attaccare un ago per flauto a punta smussata da 25 G e tenere la siringa con la soluzione di triamcinolone pronta per l'uso intraoperatorio.

4. Pretrattamento degli occhi NHP con plasminogeno intravitreale (0,25 μg/μL)

  1. Una settimana prima dell'intervento chirurgico, somministrare un'iniezione intravitreale (20 μL) di plasminogeno di scimmia (0,25 μg/μL).
  2. Sedare l'NHP prima della procedura con un'iniezione intramuscolare di ketamina (10-20 mg/kg di peso corporeo) e un'iniezione sottocutanea di atropina (0,05 mg/kg di peso corporeo). Somministrare colliri tetracaina per l'anestesia locale.
  3. Prima dell'iniezione intravitreale, disinfettare la regione periorbitale con il 10% di povidone-iodio. Disinfettare l'occhio somministrando il 5% di povidone-iodio ai fornice congiuntivali della NHP. Assicurarsi che la soluzione rimanga nei fornices per almeno 1 minuto prima di risciacquare accuratamente con BSS sterile.
  4. Utilizzare una siringa da 250 μL per aspirare il plasminogeno di scimmia prediluilato (0,25 μg/μL) dal flaconcino. Attaccare un ago da 30 G alla siringa e tenere il plasminogeno della scimmia pronto per la somministrazione intravitreale.
  5. Utilizzare un paio di pinze per identificare il sito di iniezione sull'occhio. Somministrare l'iniezione intravitreale a 3 mm di distanza dal limbus.
  6. Procedere con l'iniezione con l'ago diretto verso il centro del globo. Dopo la rimozione dell'ago dal globo, utilizzare un bastoncino applicatore di cotone per tamponare il sito di iniezione e prevenire il reflusso del contenuto intraoculare.
  7. Somministrare un gel lubrificante o un unguento per ridurre l'irritazione immediata della superficie oculare postoperatoria.

5. Configurazione del tavolo chirurgico e dell'attrezzatura

  1. Stabilire un campo sterile. Quando sei in campo sterile, indossa sempre scrub chirurgici, maschera e copertura per capelli.
  2. Preparare il triamcinolone senza conservanti (40 mg/mL) per la visualizzazione intraoperatoria del vitreo (vedere paragrafo 3). Preparare la BSS sterile in una siringa da 10 mL e il lubrificante in una siringa da 5 mL. Mettili su un drappo.
  3. Tieni pronti altri strumenti su un drappo, tra cui seta 3-0, suture vicryl 7-0, bastoncini applicatori di cotone, strisce di chiusura avvolte e filo in fibra di endoilluminazione del lampadario.
  4. Collegare il set di vitrectomia, incluso il vitrettore ad alta velocità, la cassetta Venturi e l'endoilluminatore a lampadario da 25 G alla macchina per vitrectomia utilizzando una tecnica sterile.
  5. Aprire un flacone BSS di grado oftalmico da 500 ml e collegarlo alla cassetta Venturi secondo le istruzioni del produttore. Procedere con l'adescamento del sistema.
  6. Accendere il microscopio miOCT/chirurgico. Selezionare le configurazioni preimpostate del microscopio chirurgico per la chirurgia e l'illuminazione del segmento posteriore. Inserisci i dettagli della procedura, inclusi ID, sesso, lateralità dell'occhio animale e il nome della procedura.
  7. Montare un obiettivo senza contatto, grandangolare, a 128 gradi.
  8. Attaccare le coperture sterili monouso sul microscopio chirurgico / miOCT. Regolare la posizione del microscopio e mettere a fuoco utilizzando il pedale. Procedere con l'intervento chirurgico.

6. Preparazione dell'anestesia e posizionamento dell'animale (preferibilmente eseguita da un team veterinario)

  1. Assicurarsi che l'NHP sia a digiuno per almeno 8 ore prima dell'induzione dell'anestesia per prevenire il rigurgito e il vomito. Sedare l'NHP prima dell'induzione dell'anestesia (vedere il punto 4.2 per le istruzioni di sedazione).
  2. Applicare l'1% di tropicamide e il 2,5% di fenilefrina collirio almeno 3 volte con intervalli di 5 minuti per ottenere la dilatazione della pupilla.
  3. Somministrare un'iniezione intramuscolare di buprenorfina (0,005-0,03 mg/kg di peso corporeo) 30 minuti prima dell'intervento chirurgico per ottenere l'analgesia.
  4. Intubare l'NHP con un tubo endotracheale, di solito di 3-5 mm di dimensione. Quando si tenta l'intubazione, assicurarsi che siano disponibili diverse dimensioni. Utilizzare la dimensione più grande che può essere fatta passare attraverso la laringe senza causare traumi. Misurare la CO2 di marea terminale per garantire un posizionamento appropriato del tubo endotracheale.
  5. Erogare il 2% di gas isofluorano attraverso il tubo endotracheale per indurre l'anestesia generale. Conferma lo stato di anestesia generale (mancanza di risposta al tatto) valutando la risposta dell'NHP agli stimoli circostanti, inclusi suoni e tatto. Utilizzare lo 0,5-2% di gas isofluorano per mantenere lo stato di anestesia generale.
  6. Monitorare continuamente l'elettrocardiogramma NHP, la frequenza respiratoria, la pressione sanguigna e la saturazione di ossigeno durante l'intero intervento chirurgico.
  7. Posizionare l'NHP sul tavolo chirurgico in modo tale che l'occhio sia perpendicolare al microscopio chirurgico. Somministrare un gel lubrificante o un unguento all'occhio, che non viene operato per ridurre l'irritazione della superficie oculare durante l'anestesia.
  8. Tagliare le ciglia usando le forbici per ridurre la possibilità di infezioni.
  9. Disinfettare la regione periorbitale con il 10% di povidone-iodio. Disinfettare l'occhio somministrando il 5% di povidone-iodio ai fornice congiuntivali della NHP. Assicurarsi che la soluzione rimanga nei fornices per almeno 1 minuto prima di risciacquare accuratamente con BSS sterile.
  10. Posizionare un drappo sterile in modo tale che l'apertura pretagliata sia centrata sull'occhio per sottoporsi a un intervento chirurgico. Coprire l'occhio con un drappo adesivo per incisione chirurgica.
  11. Eseguire una cantotomia laterale sull'occhio per sottoporsi a un intervento chirurgico.
  12. Inserire lo speculum Lieberman per garantire un'adeguata apertura delle palpebre per la visualizzazione dell'occhio.

7. Vitrectomia

NOTA: Per accedere allo spazio subretinico per la consegna dell'innesto RPE pet-scaffold, questo protocollo raccomanda una vitrectomia a 4 porte (valvolata) da 25 G da eseguire utilizzando una configurazione chirurgica vitreoretinica standard e una lente a fondo 128° grandangolare senza contatto. Il protocollo raccomanda inoltre l'uso di un microscopio chirurgico dotato di miOCT per guidare diverse fasi chirurgiche critiche, tra cui l'induzione del distacco foveale, l'impianto dell'innesto RPE e il drenaggio del liquido subretinico.

  1. Eseguire una peritomia congiuntivale a 360° incidendo la congiuntiva vicino al limbus utilizzando un paio di forbici vannas. Ingrandire la peritomia eseguendo una dissezione smussata.
  2. Utilizzando una lama microvitreoretinica da 25 G, eseguire una sclerotomia a ore 8 per l'occhio destro o a ore 4 per l'occhio sinistro. Eseguire la sclerotomia a 3 mm dal limbus dell'occhio.
  3. Inserire e suturare una cannula per infusione laterale personalizzata da 25 G utilizzando la sutura 7-0 vicryl. Dopo aver confermato la posizione intravitreale, avviare l'infusione di BSS e impostare il sistema per mantenere una IOP di 20 mmHg.
  4. Utilizzando un trochar a testa piatta da 25 G, eseguire una sclerotomia a ore 2 per l'occhio destro o a ore 10 per l'occhio sinistro, come al punto 7.2.
  5. Inserire la luce del lampadario 25 G nel trochar a testa piatta e fissarlo con nastro adesivo. Regolare la sorgente luminosa a circa il 60%.
  6. Eseguire un'altra sclerotomia, simile al passaggio 7.2, a ore 10 per l'occhio destro o alle ore 2 per l'occhio sinistro. Posizionare le suture vicryl 7-0 a forma di U attorno alla sclerotomia senza legare i nodi. Inserire la punta della fresa per vitrectomia attraverso questa sclerotomia.
  7. Avviare la vitrectomia intorno alle porte di ingresso, seguita da una vitrectomia a nucleo corto con le seguenti impostazioni: massimo 5000 tagli al minuto, aspirazione massima a 400 mmHg.
  8. Iniettare 20-50 μL di triamcinolone (40 mg/mL) per una migliore visualizzazione vitrea.
  9. Indurre un distacco vitreo posteriore (PVD) separando il corpo vitreo dalla retina.
    1. Posizionare il vitrettore sopra il disco ottico per consentire una delicata induzione del PVD. Mantenere il vitrettore solo su aspirazione all'impostazione massima di 400 mmHg senza alcun taglio.
    2. Se necessario, utilizzare una pinza intraoculare da 25 G per manipolare il vitreo al margine del disco per creare una lacerazione nella corteccia vitrea per facilitare il distacco.
      NOTA: PVD è considerato di successo se i cristalli di triamcinolone scivolano senza ostacoli sulla superficie retinica.
  10. Aprire la membrana ialoide posteriore con la fresa e rimuovere la gonna vitrea staccata fino alla base vitrea (all'equatore retinico). Aspirare l'eventuale triamcinolone residuo sulla superficie retinica.

8. distacco foveale guidato da miOCT

  1. Iniettare 1-2 ml di PFCL per coprire il polo posteriore fino alla retina anteriore, medio-periferica.
  2. Entra nell'occhio con una cannula di iniezione subretinica. Impostare la IOP su 0-4 mmHg sulla macchina per vitrectomia (garantire un sistema perfettamente impermeabile; se necessario, legare le suture attorno alle porte).
  3. Utilizzando la cannula per iniezione subretinica personalizzata da 25/41 G o la cannula per iniezione subretinica da 25/38 G collegata a una siringa da 250 μL, eseguire delicatamente un'iniezione subretinica di BSS per indurre un distacco di retina localizzato. Una volta che il bleb attraversa la fovea, interrompere l'iniezione. Create una seconda soffusa da una direzione separata. Unire entrambi i blebs per staccare completamente la fovea.
  4. Abilitare la funzione miOCT per visualizzare la formazione di bleb. Assicurarsi che le scansioni di linee e cubi siano in modalità HD con le impostazioni (512 x 128 pixel, larghezza di scansione 4 mm) per acquisire un'immagine sulla fovea. Osservare l'immagine miOCT per un completo distacco della retina neurale dallo strato RPE alla fovea.
  5. Allargare la retinotomia a 1,5 mm con un paio di forbici vitreoretiniche verticali da 25 G per consentire l'accesso allo spazio subretinico per il trapianto.

9. Rimozione dell'RPE nativo

  1. Impostare la IOP su 50 mmHg sulla macchina per vitrectomia.
  2. Rimuovere il PFCL tramite estrusione attiva utilizzando una cannula con punta in silicone spazzolato.
  3. Estendere la sclerotomia con un coltello da incisione da 1,4 mm per consentire l'ingresso di uno strumento da 20 G.
  4. Utilizzando uno strumento ad anello estensibile personalizzato da 20 G, raschiare l'RPE host submaculare per la rimozione. Raschiare un'area che misura almeno 2 x 3 mm.

10. Caricamento del tiratore per la consegna del trapianto monostrato di cellule RPE

  1. Per istruzioni generali sul caricamento di un innesto a forma di proiettile tagliato da colture RPE su portatori di cellule PET, fare riferimento a una pubblicazione precedente22.

11. Impianto di innesto guidato da miOCT e regolazione della posizione

  1. Inserire la punta del dispositivo sparatutto attraverso la sclerotomia ad una IOP di 20 mmHg. Iniettare l'impianto verso lo spazio subretinico attraverso il bordo della retinotomia creato dalla superficie retinica.
  2. Iniettare l'impianto con il lato portacellulare rivolto verso la membrana di Bruch e il lato dello xenotrapianto RPE rivolto verso i fotorecettori.
  3. Abilitare la funzione miOCT per visualizzare la posizione dell'impianto. Assicurarsi che l'impianto sia appoggiato sulla membrana di Bruch nello spazio subretinico, con una retina sovrastante intatta. Assicurarsi che si trovi a una distanza ragionevole dalla retinotomia creata e non interferisca con il sito di retinotomia.
  4. Regolare la posizione dell'impianto con la cannula di iniezione subretinica o una forbice intraoculare curva da 25 G per assicurarsi che sia ben posizionata sotto la macula.

12. drenaggio guidato da miOCT del fluido subretinico

  1. Utilizzando una cannula con punta in silicone spazzolato, eseguire uno scambio fluido-aria e un attento drenaggio del fluido subretinico. Tentare una delicata aspirazione del fluido subretinico dal distacco di retina bleb e dall'apposizione del bordo della retinotomia.
  2. Abilitare la funzione miOCT per la visualizzazione in tempo reale di un adeguato drenaggio del liquido subretinico fino a quando la retina non viene riattaccata sopra l'impianto.

13. Termine dell'operazione

  1. Chiudere la sclerotomia della porta di lavoro usando la sutura vicryl 7-0 preposta. Rimuovere il lampadario da 25 G e la cannula per infusione da 25 G. Chiudere queste sclerotomie con suture vicryl 7-0.
  2. Somministrare 2 mg in 0,05 ml di triamcinolone intravitreale senza conservanti (40 mg/ml) alla sclerotomia delle 8 prima della sutura.
  3. Palpare l'occhio per assicurarsi che la IOP rientri nell'intervallo accettabile. Iniettare aria filtrata (o BSS) tramite un ago da 30 G, se necessario.
  4. Suturare la congiuntiva con suture 7-0 vicryl e cantotomia con 5-0 prolene (rimuovere dopo 10-14 giorni).

14. Cura postoperatoria degli animali

  1. Posizionare l'NHP a faccia in giù per 1 ora dopo l'intervento chirurgico. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando la coscienza non è stata riacquistata. Assicurarsi che un veterinario e un tecnico per la cura degli animali siano disponibili per l'osservazione e il supporto durante il processo postoperatorio.
  2. Applicare antibiotico topico (tobramicina), steroide (desametasone) unguento, e omatropina collirio due volte al giorno per 5 giorni postoperatorio.
  3. Somministrare un'altra iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,005-0,03 mg/kg BW) 6 ore dopo l'intervento chirurgico per un adeguato controllo del dolore.
  4. Restituire l'NHP alla compagnia di altri animali solo quando ha ripreso pienamente conoscenza.
  5. Condurre follow-up di imaging multimodale il giorno 3, 14 e il mese 1 dopo la procedura, seguiti da controlli mensili. Eseguire ERG ogni mese dopo la procedura. Rimuovere le suture di prolene 5-0 per la mitotomia al giorno 14 in concomitanza con il periodo di sedazione utilizzato per l'imaging multimodale. Le suture rimanenti sono riassorbibili, 7-0 suture vicryl, che non richiedono rimozione.

15. Metodi di monitoraggio postoperatorio per l'imaging multimodale

  1. Velocizza l'NHP durante la notte. Sedare l'NHP poco prima dell'imaging (vedere il passaggio 4.2 per il farmaco e la concentrazione per la sedazione). Se la sedazione è insufficiente per fermare il movimento degli occhi, considerare l'uso dell'anestesia generale.
  2. Applicare colliri all'1% di tropicamide e al 2,5% di fenilefrina per ottenere la dilatazione della pupilla prima dell'imaging (vedere il passaggio 6.2).
  3. Eseguire l'autofluorescenza (AF), l'angiografia con fluoresceina del fondo (FFA) e la tomografia a coerenza ottica (OCT) utilizzando una macchina OCT ad alta risoluzione con una lente di campo a 55 ° e una lente di campo a 30 °.
    1. Somministrare fluoresceina per via endovenosa al 10% (0,1 ml/kg di peso corporeo) per FFA. Per ottenere un'immagine in fase iniziale, acquisire un'immagine entro 30 s dall'iniezione. Per un'immagine in fase avanzata, acquisire un'immagine 5-10 minuti dopo l'iniezione.
  4. Esegui la fotografia del fondo utilizzando una fotocamera del fondo tra le fasi iniziali e tardive dell'FFA.

16. Metodi di monitoraggio postoperatorio per studi di elettroretinogramma a pieno campo (ERG)

  1. Velocizza gli NHP durante la notte. Sedare l'NHP prima degli studi ERG (vedere il passo 4.2 per il farmaco e la concentrazione per la sedazione). Durante le registrazioni ERG, ri-somministrare la sedazione quando appropriato.
  2. Imaging multimodale separato e registrazioni ERG con un intervallo di almeno 2-3 giorni.
  3. Una volta sedato, assicurarsi che l'NHP sia adattato al buio per 30 minuti prima della registrazione ERG.
  4. Posizionare gli elettrodi ad ago sottodermico in acciaio inossidabile sul canthi laterale sinistro e destro (elettrodi di riferimento) e sul retro del corpo NHP (elettrodo di terra). Posizionare gli elettrodi delle lenti a contatto ERG sulla cornea NHP utilizzando gel vidisico per facilitare il contatto e l'adesione.
  5. Basare tutti i test ERG sui protocolli umani raccomandati dall'International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Inizia la registrazione ERG in condizioni scotopiche e inizia con i flash dimmer. Seguire le raccomandazioni ISCEV per gli intervalli di interstimolo raccomandati.
  6. Assicurarsi che l'NHP sia adattato alla luce per 10 minuti prima del test fotopico, sempre utilizzando le raccomandazioni ISCEV standard per la resistenza dello sfondo.

17. Eutanasia di NHP

  1. Per l'eutanasia dell'NHP per l'enucleazione, somministrare pentobarbital di sodio per via endovenosa (75 mg/kg), come raccomandato dal gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.

Representative Results

Le modalità di imaging multimodale (fotografia del fondo, imaging a autofluorescenza del fondo (FAF), angiografia con fluoresceina del fondo (FFA) in fase iniziale e in fase avanzata e tomografia a coerenza ottica (OCT)) evidenziano le caratteristiche di un trapianto di innesto rpE submaculare di successo (Figura 1). La fotografia del fondo oculare mostra il posizionamento del trapianto di innesto RPE alla fovea senza migrazione nel tempo. L'imaging FAF mostra cambiamenti minimi nell'iper-autofluorescenza (dimostrata da aree bianche ad alta intensità) che si sovrappongono all'innesto RPE. L'FFA in fase iniziale e tardiva non mostra alcuna perdita evidente (dimostrata da aree bianche ad alta intensità che si ingrandiscono con il tempo) che circondano l'innesto RPE. Le immagini iniziali al giorno 3 mostrano un difetto della finestra dovuto alla rimozione dell'RPE nativo prima dell'impianto dell'innesto. Le immagini OCT maculari mostrano la conservazione degli strati retinici esterni (in particolare, lo strato di fotorecettore) sopra l'innesto RPE con il passare del tempo. La colorazione di ematossilina ed eosina mostra strati retinici intatti senza evidenza di microtesti. La conservazione dello strato nucleare esterno sopra le periferie dell'innesto suggerisce che le cellule RPE stanno svolgendo le loro funzioni fisiologiche di mantenimento della salute dei fotorecettori.

Le viste intraoculari ed esterne della cannula a doppio foro 25/41 G evidenziano il meccanismo con cui la IOP è controllata durante l'iniezione subretinica (Figura 2). La BSS entra nello spazio subretinico durante l'iniezione di liquido subretinico attraverso la cannula centrale più lunga. Aumenti significativi della pressione intraoculare fanno sì che la BSS all'interno della cavità vitrea esca dall'occhio attraverso il foro metallico più grande della cannula. BSS viaggia quindi lungo la cannula e alla fine viene espulso dalla porta di uscita vicino all'hub della cannula. Per valutare se la cannula funziona come previsto, assicurarsi che il fluido scorra dalla porta di uscita vicino all'hub della cannula.

Il miOCT permette la visualizzazione delle dimensioni bleb e di una potenziale lacrima foveale intraoperatoria durante il distacco foveale (Figura 3). La Figura 3A1-A3 evidenzia un caso di bleb con una lacerazione foveale. Nella Figura 3A1, mentre il bleb inferiore è visibile al microscopio chirurgico, la visualizzazione della lacrima è difficile. La Figura 3A2 mostra la sezione longitudinale di un bleb senza strappi. La Figura 3A3 mostra una lacerazione foveale quando si valuta la sezione verticale del bleb. La Figura 3B1-B3 mostra un bleb creato con successo senza la presenza di lacrime.

L'assenza di un deterioramento significativo delle forme d'onda ERG suggerisce che la funzione globale dei fotorecettori sia a bastoncello che a cono è mantenuta con xenotrapianti RPE subretinici (Figura 4). Le forme d'onda ERG mostrano la funzione complessiva della retina. In particolare, si dovrebbe prestare attenzione alle onde A per determinare qualsiasi perdita della funzione dei fotorecettori.

Figure 1
Figura 1: Analisi postoperatoria in vivo con imaging multimodale. (A) Imaging in vivo del trapianto di innesto di RPE submaculare dell'occhio sinistro (giallo sulla fotografia del fondo) su varie modalità di imaging (colonne da sinistra a destra: fotografia del fondo, autofluorescenza, angiografia del fondo fluoresceina-fase iniziale, angiografia del fondo fluoresceina-fase tardiva, tomografia a coerenza ottica) per punti temporali fino a 3 mesi (righe dall'alto verso il basso: giorni 3, 14; Mesi 1, 3). L'asterisco sulla fotografia del fondo indica il sito della retinotomia; la freccia bianca tratteggiata indica la direzione della scansione della linea. La forma disegnata in giallo sull'imaging ad autofluorescenza del fondo oculare evidenzia la posizione del trapianto. I triangoli bianchi sulle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office indicano i rispettivi bordi laterali dell'innesto (come da scansione della linea sull'immagine del fondo a colori). (B) Colorazione di ematossilina ed eosina del trapianto sotto fovea atrofica (a causa di lacerazione intraoperatoria) con strati etichettati. Barre di scala = 1 mm in A (autofluorescenza e immagini FA), 200 μm in A (immagini OCT) e 100 μm in B. Abbreviazioni: FA = angiografia del fondo; OCT = tomografia a coerenza ottica; RGC = strato di cellule gangliari retiniche; INL = strato nucleare interno; ONL = strato nucleare esterno; RPE = epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Viste intraoculari ed esterne della cannula a doppio foro 25/41 G. (A) Vista intraoculare della cannula a doppio alesaggio 25/41 G durante la creazione di bleb subretinici. La freccia bianca indica la cannula centrale più lunga per l'iniezione subretinica. La freccia tratteggiata indica l'apertura della cannula in uscita attraverso la quale passa il BSS per uscire dall'occhio. (B) Vista esterna della cannula a doppio alesaggio 25/41 G. L'asterisco segna la porta di uscita vicino al mozzo della cannula da cui viene drenato il BSS intraoculare. Abbreviazione: BSS = soluzione salina bilanciata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini al microscopio intraoperatorio e immagini miOCT di bleb subretinico complicato da una lacerazione foveale. (A1) Un'immagine al microscopio intraoperatorio che mostra la posizione delle scansioni longitudinali (blu) e trasversali (rosse) in un bleb con una lacerazione foveale. (A2) Scansione longitudinale miOCT che mostra un bleb subretinico nella regione foveale (freccia gialla). (A3) Scansione miOCT trasversale che cattura una lacrima foveale (punta di freccia bianca), insieme a una retinotomia (asterisco e un bleb subretinico (freccia gialla). (B1) Un'immagine microscopica intraoperatoria che mostra la posizione delle scansioni longitudinali (blu) e trasversali (rosse) in una bleb formata con successo. (B2) Scansione longitudinale miOCT che mostra un bleb subretinico nella regione foveale (freccia gialla). (B3) Scansione miOCT trasversale che mostra un bleb subretinico creato con successo con una fovea intatta superiore (diamante bianco). Abbreviazione: miOCT = tomografia a coerenza ottica integrata al microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ERG dell'occhio trapiantato con xenotrapianto RPE. Per la valutazione funzionale della retina, le valutazioni ERG a pieno campo dell'occhio xenotrapiantato RPE eseguite al basale (riga superiore) e 3 mesi dopo il trapianto (riga inferiore) non mostrano alcun effetto significativo del trapianto di xenotrapianto RPE su qualsiasi ampiezza di risposta, temporizzazione o forma d'onda in condizioni adattate al buio o adattate alla luce. Abbreviazioni: RPE = epitelio pigmentato retinico; ERG = elettroretinogramma; DA = adattato al buio; LA = adattato alla luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Esistono due approcci principali in fase di valutazione per il trapianto submaculare di RPE: l'iniezione di una sospensione di RPE e il trapianto di un innesto di RPE monostrato. Un confronto dettagliato tra i due metodi esula dallo scopo di questo manoscritto. Tuttavia, il trapianto di un innesto RPE monostrato può essere vantaggioso in quanto le cellule RPE sono più organizzate in un monostrato che in una sospensione. Le cellule RPE nell'innesto sono organizzate in un monostrato confluente, che assomiglia all'organizzazione dello strato cellulare RPE fisiologico e consente alle cellule RPE trapiantate di svolgere le loro funzioni fisiologiche. Ciò consente parametri di dosaggio più precisi rispetto alle sospensioni cellulari, il che è molto rilevante per il lavoro normativo e lo scale-up industriale.

La consegna dell'innesto di cerotto RPE nello spazio subretinico richiede un'attenta manipolazione della macula e un accurato inserimento dell'innesto nello spazio subretinico. I progressi tecnologici nella microchirurgia, come il miOCT, e una migliore comprensione delle dinamiche intraoperatorie del tessuto retinico hanno ridotto la curva di apprendimento di questa procedura. In questa discussione verranno spiegati i razionali dei seguenti aspetti: i) iniezione pre-operatoria di plasminogeno; ii) l'uso di miOCT intraoperatori; iii) l'uso di una cannula a doppio foro personalizzata da 41 G, impostazioni IOP basse e PFCL per la creazione di bleb subretinici; iv) raschiatura dello strato cellulare RPE nativo prima del trapianto; v) l'uso di sirolimus, triamcinolone, doxiciclina e minociclina per ridurre il rigetto immunogenico dell'innesto.

Le iniezioni preoperatorie di plasminogeno rilasciano aderenze retiniche parafoveali
Negli esperimenti iniziali, era difficile staccare la fovea con una singola onda fluida. Sulla valutazione con miOCT, le immagini hanno rivelato la presenza di aderenze retiniche esterne parafoveali all'RPE nativo insieme a prove di trauma intraretinico20. Queste aderenze possono aver portato a un'espansione verticale del bleb piuttosto che all'onda fluida sottoretinica che si diffonde attraverso il contorno retinico, con conseguente trauma foveale. Il plasminogeno è il precursore inattivo della plasmina, una proteasi che prende di mira la fibronectina e la laminina. L'ocriplasmina è una variante bioingegnerizzata della plasmina umana, approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) e dall'Agenzia europea per i medicinali (EMA) per il trattamento della trazione vitreomaculare sintomatica con o senza un foro maculare concomitante. Tuttavia, i rapporti post-approvazione dello sviluppo di edema della macula cistoide dopo l'iniezione di ocriplasmina hanno suggerito un effetto più esteso dell'enzima sulla retina23.

Sebbene i meccanismi esatti non siano stati identificati, è stato suggerito che la plasmina potrebbe indebolire l'adesione retinica attraverso la degradazione degli elementi della matrice interfotorecettore responsabili dell'adesione fotorecettore-RPE24. In questo protocollo, gli occhi NHP sono stati trattati con plasminogeno intravitreale 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per rilasciare le aderenze retiniche esterne parafoveali. Nell'ipotesi che l'adesione fotorecettore-RPE sia indebolita, è necessaria una forza inferiore per staccare la retina neurosensoriale, incluso l'anello parafoveale distale, che in genere resiste all'onda fluida sottoretinica20. Pertanto, la forza somministrata durante il distacco del bleb retinico provoca l'espansione del bleb attraverso il contorno retinico piuttosto che allungare la retina tangenzialmente. Questo riduce il rischio di lacrime foveali. Tuttavia, va notato che l'effetto del plasminogeno sulla sopravvivenza a lungo termine del trapianto non è stato studiato in questo protocollo. Studi futuri dovrebbero tentare di determinare questo effetto.

miOCT fornisce un feedback anatomico per guidare la creazione di bleb subretinici, l'impianto di innesto e il drenaggio del fluido subretinico
La manipolazione intraoperatoria e atraumatica della macula è la chiave per ottenere buoni risultati di trapianto. Tuttavia, i cambiamenti microstrutturali della macula legati alla manipolazione potrebbero non essere sempre evidenti sul microscopio operatorio. In tali procedure, il miOCT è uno strumento importante che fornisce un feedback intraoperatorio in tempo reale, tridimensionale, della struttura maculare. miOCT è particolarmente utile durante le fasi di distacco foveale, impianto di innesto e drenaggio del fluido subretinico utilizzando uno scambio fluido-aria. Durante il distacco foveale, miOCT può determinare le dimensioni verticali e orizzontali del bleb. Le microtestaine foveali, che potrebbero non essere visualizzate chiaramente al microscopio chirurgico, possono essere confermate da miOCT (Figura 3). Durante l'impianto dell'innesto, le immagini miOCT guidano mostrando la posizione dell'innesto o la vicinanza alla fovea, attraverso la retina spesso meno trasparente e distaccata. miOCT può anche evidenziare possibili aree di adesione retinica durante un difficile processo di trapianto25. Infine, nel processo di drenaggio del fluido subretinico, miOCT può guidare in modo affidabile il drenaggio del fluido subretinico fino al raggiungimento del completo contatto dell'innesto retinale-RPE.

La combinazione di una cannula a doppio foro, impostazioni IOP basse e tamponamento vitreo PFCL riduce sinergicamente il trauma maculare durante la creazione di bleb subretinici
Lo stiramento retinico tangenziale e la turbolenza del fluido possono verificarsi durante l'iniezione di BSS subretinica per il distacco foveale che porta a lacrime foveali indesiderate. Per contrastare questi fenomeni, fattori come la posizione relativa e la distanza dal centro foveale in cui viene avviata l'iniezione, il volume e la velocità dell'iniezione, il tamponamento vitreo, la scelta della strumentazione subretinica e la IOP hanno tutti dimostrato di essere rilevanti20,26,27. Il bleb subretinico per il distacco foveale deve essere situato in una posizione adeguatamente distante dalla fovea, poiché lo stiramento retinico può essere più elevato nel sito di inizio del bleb27. La IOP dovrebbe anche essere mantenuta bassa durante la creazione del bleb subretinico. Quando la IOP dell'occhio è alta, si osserva un aumento verticale più elevato delle dimensioni del bleb piuttosto che l'espansione lungo il contorno della retina, mentre i bleb sono meno profondi a pressioni più basse20. Inoltre, sebbene un'iniezione intravitreale di 50 μL raddoppierà efficacemente la IOP nell'uomo28, data la lunghezza dell'occhio più breve nelle NHP, l'aumento della IOP durante l'iniezione subretinica sarà probabilmente più alto e più rapido che negli esseri umani. Mentre la maggior parte delle macchine per vitrectomia si adattano alla fluttuazione della IOP, la regolazione non è un processo simultaneo ma piuttosto reattivo che si verifica mentre l'iniezione subretinica procede. Quindi, maggiore è la IOP, maggiore è il rischio di sovraccarico retinico e conseguente trauma foveale. Pertanto, è essenziale mantenere una IOP bassa stabile durante l'iniezione subretinica.

Per l'iniezione subretinica è raccomandata una cannula subretinica commerciale da 20/41 G (DORC) o una cannula subretinica da 25/41 G su misura. La cannula consente al fluido di uscire dalla cavità vitrea in cambio di BSS iniettato nello spazio subretinico. Ciò garantisce la regolazione "simultanea" della IOP durante l'iniezione subretinica. Uno schema della cannula a doppio foro è visibile nella Figura 2. Infine, PFCL viene utilizzato per ridurre il rischio di lacrime foveali20,26,27. Poiché le PUCL, come l'ottalina, hanno un peso specifico più elevato, esercitano una forza verso il basso sulla retina durante il distacco foveale29. Ciò stabilizza ulteriormente il processo di creazione del bleb di distacco foveale e migliora l'espansione del bleb lungo il contorno retinico. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per l'iniezione subretinica di rtPA nell'ambito di una massiccia emorragia submaculare dovuta a nAMD30.

La rimozione pre-trapianto di RPE nativo consente il ripristino del complesso RPE-fotorecettore
L'RPE dell'ospite deve essere rimosso prima del trapianto di innesto. Questo perché il ripristino del complesso RPE-fotorecettore è necessario per consentire al trapianto di RPE di svolgere le sue funzioni fisiologiche di supporto ai fotorecettori21. L'RPE host, se non rimosso, può porsi come una barriera meccanica, che impedisce il ripristino di questo complesso. Può essere rimosso attraverso la somministrazione di sostanze chimiche tossiche RPE o utilizzando mezzi fisici di rimozione. I metodi di rimozione chimica comprendono la somministrazione sistemica o subretinica di iodato di sodio31,32. Poiché lo iodato di sodio provoca una degenerazione diffusa dei fotorecettori, delle cellule RPE e della coriocapillare quando somministrato, la sua tossicità retinica e sistemica ne preclude l'uso per studi sull'uomo32,33. Quindi, le tecniche intraoperatorie fisiche sono preferite. Sono stati concettualizzati vari metodi fisici. Quando vengono utilizzati metodi fisici, è fondamentale che la membrana di Bruch rimanga intatta. Molti studi in vitro hanno dimostrato la dipendenza della sopravvivenza dell'innesto di RPE da una membrana di Bruch intatta34,35,36.

I tentativi di debridement idraulico sono stati associati a rotture nella membrana di Bruch, un aumento del tasso di sviluppo della membrana epiretinica e vitreoretinopatia proliferativa, con conseguente distacco della retina da trazione37. Una spatola spolverata di diamanti proposta per lo sbrigliamento dell'RPE ha anche portato a rotture nella membrana di Bruch, con conseguente proliferazione cellulare dalla coroide nello spazio subretinico38. È interessante notare che uno strumento ad anello estensibile su misura potrebbe rimuovere l'RPE sovrastante con la conservazione della membrana di Bruch agli occhi di conigli e maiali11,39. La rimozione dell'RPE sottostante è utile anche per stabilire modelli animali con RPE e atrofia retinica esterna, simile alla forma atrofica avanzata di AMD. Quando un'area focale di RPE viene rimossa dalla macula, la ferita RPE si chiude attraverso l'ipertrofia delle cellule RPE rimanenti. Tuttavia, questa risposta di guarigione delle ferite è associata all'atrofia dello strato nucleare esterno40. Mentre la creazione di un modello animale esula dallo scopo di questo manoscritto, una procedura simile può creare un modello animale di un fenotipo AMD atrofico avanzato per la sperimentazione di terapie cellulari derivate da RPE.

L'uso di sirolimus, triamcinolone, doxiciclina e minociclina per ridurre il rigetto dell'innesto immunogenico
Si ritiene che lo spazio subretinico sia un sito immuno-privilegiato, mantenuto da una barriera emato-retinica intatta e da altri fattori41. In molti studi che coinvolgono il trapianto subretinico di derivati di cellule staminali con una barriera emato-retinica intatta, i farmaci immunosoppressori svolgono un ruolo trascurabile nella sopravvivenza del trapianto42. Si pensa che la barriera emato-retinica esterna sia formata dallo strato nativo di RPE e dalle giunzioni strette tra le cellule RPE. Mentre la rimozione nativa dell'RPE consente una migliore integrazione dell'RPE trapiantato e dei fotorecettori dell'ospite, la barriera emato-retinica viene interrotta nel processo, aumentando la probabilità di un rigetto immunitario. Classicamente, le cellule T sono fondamentali per il processo di rigetto del trapianto di altri organi come il rene e il fegato43. Quindi, i regimi immunosoppressivi iniziali per il trapianto di tessuto retinico erano mirati a ridurre queste risposte immunitarie adattative.

Sirolimus, un bersaglio meccanicistico dell'inibitore della rapamicina, e tacrolimus, un inibitore della calcineurina, sono esempi di farmaci immunosoppressori che mirano alle risposte immunitarie adattative. Tuttavia, nonostante un'adeguata soppressione delle cellule T, i tassi di sopravvivenza del trapianto rimangono bassi. Inoltre, le cellule RPE sono note per sopprimere l'attivazione delle cellule T attraverso il rilascio di fattori inibitori e promuovere la generazione di cellule T regolatorie44. Pertanto, è diventato sempre più evidente che l'immunità adattativa potrebbe non essere l'unico fattore che contribuisce al rigetto dell'innesto42. Il trapianto subretinico di prodotti cellulari può provocare l'accumulo e l'attivazione di microglia45.

Le microglia sono i macrofagi della retina. Sono costituiti da due popolazioni principali: 1) la microglia perivascolare della vascolarizzazione retinica interna e 2) la microglia all'interno del parenchima del tessuto retinico. Poiché le microglia fanno parte della risposta immunitaria innata, i glucocorticoidi intravitreali, come il triamcinolone, possono sopprimere la proliferazione mediata dalle citochine46. Doxiciclina e minociclina possono anche sopprimere l'attivazione microgliale e devono essere considerate47,48. Infine, le differenze nel rigetto immunitario degli alloinnesti RPE rispetto agli xenotrapianti non sono completamente comprese49. Ad esempio, alloanticorpi contro cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte sono stati riportati nel siero di modelli di rigetto immunitario in vivo. Tuttavia, il ruolo di questi anticorpi e l'importanza del rigetto mediato da anticorpi nella sopravvivenza del trapianto rimangono sconosciuti50. Quindi, viene proposto un regime multifarmaco che utilizza sirolimus per la soppressione dell'immunità adattativa e una combinazione di triamcinolone, doxiciclina e minociclina per la soppressione dell'immunità innata. Questo regime è stato utilizzato con successo nei conigli con buoni risultati di sopravvivenza dell'innesto e effetti sistemici minimi11.

Limitazioni di questa tecnica chirurgica
Questo documento descrive un possibile metodo chirurgico per consegnare un foglio di innesto RPE nello spazio subretinico di NHP; tuttavia, questo non significa che questo sia l'unico modo ottimizzato. Diversi chirurghi vitreo-retinici possono avere altre preferenze per la strumentazione e la tecnica. Ad esempio, questo design del dispositivo di impianto può fornire solo impianti piatti supportati da un supporto cellulare più rigido e quindi potrebbe non essere adatto per impianti relativamente flessibili (o laminati). I trapianti in sospensione RPE possono omettere gran parte di questa tecnica. Di conseguenza, i dettagli chirurgici richiederanno modifiche in base a ciascuna strategia di consegna.

Poiché l'interesse per le terapie cellulari per il trattamento delle malattie degenerative della retina continua a crescere, il modello animale NHP sarà essenziale negli studi preclinici per studiare i fattori che influenzano la sopravvivenza del trapianto di RPE. In questo manoscritto, vengono proposte strategie per consentire la consegna più fluida di un innesto RPE monostrato submaculare nell'occhio NHP. Si raccomandano anche metodi per una migliore visualizzazione delle complicanze intraoperatorie. Si prevede che questi metodi continueranno a migliorare man mano che l'uso di terapie cellulari si espande. I futuri documenti di metodo dovrebbero anche prendere in considerazione la proposta di un elenco completo di indagini per valutare vari aspetti strutturali e funzionali dell'innesto.

Disclosures

Boris Stanzel detiene un brevetto statunitense 9980851 su uno strumento (raschietto RPE) utilizzato in questo studio. Relatore onorario da C. Zeiss Meditec e Geuder a Boris Stanzel. Gli altri autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgments

Questo studio è stato supportato da IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), la sovvenzione NUS Start-up NUHSRO/2016/100/SU/01, nuhs Clinical Scientist Program (NCSP) grant e National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) a X.S., Hong Leong Endowed Professorship fondi a G.E.H. e B.V.S. Vorremmo ringraziare il team veterinario della Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapore) per aver fornito supporto nella preparazione alla chirurgia NHP e nel follow-up degli animali. Vorremmo estendere il nostro apprezzamento a Jill Teo e ai colleghi di C. Zeiss Meditec Singapore per il supporto tecnico per OPMI-Lumera 700 con dispositivo OCT intraoperatorio integrato.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

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References

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Medicina Numero 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina
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Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

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