Summary
В данной статье представлен пошаговый протокол прямой имплантации канюли в цистерну свиней.
Abstract
Глимфатическая система представляет собой систему очистки отходов в мозге, которая зависит от потока спинномозговой жидкости (CSF) в периваскулярных пространствах, связанных с астроцитами, и участвует в клиренсе нейротоксических пептидов, таких как бета-амилоид. Нарушение глимфатической функции усугубляет патологию заболевания на животных моделях нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, что подчеркивает важность понимания этой системы клиренса. Глимфатическая система часто изучается с помощью cisterna magna cannulations (CMc), где индикаторы доставляются непосредственно в спинномозговую жидкость (CSF). Большинство исследований, однако, были проведены на грызунах. Здесь мы демонстрируем адаптацию техники CMc у свиней. Используя CMc у свиней, глимфатическая система может быть изучена с высоким оптическим разрешением в гиренцефальном мозге и при этом преодолевает разрыв в знаниях между грызунами и человеческими глимфатиками.
Introduction
Спинномозговая жидкость (ликвор) представляет собой ультрафильтрат крови, который находится внутри и вокруг центральной нервной системы (ЦНС)1,2. Помимо придания плавучести мозгу или поглощения повреждающих механических сил, ликвор также играет ключевую роль в очистке метаболических отходов из ЦНС3. Очистка отходов облегчается недавно охарактеризованной глимфатической системой, которая позволяет конвективному потоку ликвора через паренхиму мозга через периваскулярные пространства (PVS), которые окружают проникающие артерии3,4,5. Было показано, что этот процесс зависит от аквапорина-4 (AQP4), водного канала, экспрессируемого главным образом на астроцитарном конце, связанном с PVS4,6. Исследование глимфатической системы достигается с помощью визуализации in vivo и ex vivo с использованием либо усовершенствованной световой микроскопии, либо магнитно-резонансной томографии (МРТ) после введения флуоресцентного/радиоактивного индикатора или контрастного вещества в CSF7,8,9,10,11.
Эффективным способом введения индикатора в ликвор без повреждения паренхимы головного мозга является канюляция cisterna magna (CMc)12,13. Подавляющее большинство всех глимфатических исследований до сих пор проводилось на грызунах и избегалось у высших млекопитающих из-за инвазивности CMc в сочетании с практической простотой работы с мелким млекопитающим. Кроме того, тонкие черепа мышей позволяют проводить визуализацию in vivo без необходимости в краниальном окне и впоследствии позволяют проводить неосложненную экстракцию мозга11,14. Эксперименты, проведенные на людях, дали ценные макроскопические данные in vivo о глимфатической функции, но опирались на инъекции интратекального индикатора в дистальный поясничный отдел позвоночника и, кроме того, использовали МРТ, которая не дает достаточного разрешения для захвата микроанатомии глимфатической системы7,15,16 . Понимание архитектуры и масштабов глимфатической системы у высших млекопитающих имеет важное значение для ее передачи людям. Чтобы облегчить глимфатическую трансляцию людям, важно применять методы, которые проводятся у грызунов, к высшим млекопитающим, чтобы можно было проводить прямые сравнения глимфатической системы между видами с возрастающим познанием и сложностью мозга17. Мозг свиньи и человека гиренцефален, обладая складчатой нейроархитектурой, в то время как мозг грызунов лиссенцефален, тем самым имея существенные различия между собой. С точки зрения общего размера, мозг свиньи также более сопоставим с человеческим, будучи в 10-15 раз меньше, чем человеческий мозг, в то время как мозг мыши в 3000 раз меньше18. Благодаря лучшему пониманию глимфатической системы у крупных млекопитающих, можно будет использовать глимфатическую систему человека для будущего терапевтического вмешательства в таких состояниях, как инсульт, черепно-мозговая травма и нейродегенерация. Прямой CMc у свиней in vivo - это метод, который позволяет проводить световую микроскопию с высоким разрешением глимфатической системы у более высокого млекопитающего. Кроме того, из-за размера используемых свиней можно применять системы мониторинга, аналогичные тем, которые используются в операциях на людях, что позволяет жестко документировать и регулировать жизненно важные функции, чтобы оценить, как они способствуют глимфатической функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Этическим комитетом Мальмё-Лунда по исследованиям на животных (Dnr 5.8.18-05527/2019) и проведены в соответствии с руководящими принципами CODEX Шведского исследовательского совета.
1. Подготовка
- Трассер
- Приготовить искусственный ликвор (126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 2 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2, 10 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3; рН 7,4)
- К 500 мкл искусственного ликвора добавляют 10 мг альбумина из бычьей сыворотки (BSA), конъюгированной с Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Центрифуга при 5000 х г в течение 5 мин и использование супернатанта.
- Канюля
- Прикрепите шприц объемом 1 мл к женскому соединению Luer внутривенной (IV) линии, 3-попутный кран с удлинением 10 см.
- Прикрепите иглу весом 18 г к мужскому концу.
- Откройте 3-позиционный стоп-замок, чтобы обеспечить непрерывность от иглы до шприца.
- Осторожно расстегните иглу и аспирируйте примерно 300 мкл физиологического раствора в внутривенную линию.
- Извлеките иглу из физиологического раствора и приступайте к введению некоторого количества воздуха, чтобы создать небольшой воздушный пузырь (5-10 мм) в капельнице.
- Поместите иглу в индикатор и аспирируйте все 500 мкл индикатора. Физиологический раствор в линии IV должен быть заметно разделен пузырьком воздуха.
- Отбросьте иглу и закройте 3-позиционный стоп-замок.
- Животное
- Успокоить свинью путем внутримышечной (т.m)инъекции тилетамина (3,75 мг/кг) и золазепама (3,75 мг/кг) и дексмедетомидина (37,5 мкг/кг). Подождите, пока он станет бессознательным.
- Подготовьте внутривенную линию, вставив канюлю весом 20 г в ушную вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что канюля находится в вене, введя 5-10 мл физиологического раствора через канюлю. Если вена была пропущена, это будет заметно по небольшому отеку в ткани уха. - Интубируйте свинью, чтобы гарантировать, что частота дыхания может регулироваться на протяжении всей операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте успешную интубацию, оказав давление на грудную клетку свиньи и подтвердив, что принудительно выдохший воздух выходит из интубационной трубки. - Прикрепите интубационную трубку к вентилятору, настроенному на частоту дыхания 14 вдохов/мин.
- Подключите пульсоксиметр и манжету к хвосту для мониторинга частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД) и насыщения кислородом (сат). Вставьте ректальный термометр для контроля температуры ядра.
- Подготовьте внутривенный пакет кетамина (5 мг/кг/мин), мидазолама (0,25 мг/кг/мин) и фентанила (2,5 мкг/кг/мин) в физиологическом растворе и начните настаивать через ушную вену примерно со скоростью 2 капли/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции скорость инфузии может потребоваться увеличить или уменьшить в зависимости от жизненных сил животного. - Когда свинья находится в положении лежа, пальпируйте затылок и шею животного, чтобы найти и отметить затылочный гребень и позвоночник первых грудных позвонков и основание каждого уха.
- Проведите прямую линию между гребнем и позвонками вдоль продольной оси. Нарисуйте две линии от гребня до основания каждого уха, следуя за основанием черепа (рисунок 1А).
- Проверьте, что животное находится в глубоком сне, тщательно зажав хвост и следя за отсутствием хвостового рефлекса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное все еще рефлексивно, скорость инфузии анестетика должна постепенно увеличиваться до тех пор, пока животное больше не будет проявлять рефлекс.
2. Хирургия
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции необходимо иметь хотя бы одного помощника, чтобы отсасывать легкое кровотечение и прижигать любые разорванные сосуды.
- Используя скальпель с лезвием No 21, сделайте дермальный разрез вдоль продольной линии вплоть до мышцы.
- Вытяните два перпендикулярных дермальных разреза дальше вдоль плеч, 10-15 см в длину.
- От затылочных гребней сделайте дермальные разрезы вдоль линии вплоть до основания каждого уха.
- Захватив уголки кожи, образовавшиеся на затылочном гребне анатомическими щипцами, аккуратно отделяют кожу от нижележащей мышцы, слегка проводя лезвием скальпеля по фасции, перемещаясь от ростральной к каудальной. После того, как кожа была разрезана после каждого из пяти разрезов, части трапециевидных мышц должны быть видны.
- Сделайте продольный разрез скальпелем, глубиной примерно 1 см, где трапеция сходится по средней линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При разрезании мышц наблюдается повышенная склонность к кровотечениям, поэтому прижигатель должен быть готов. Если более крупный сосуд разорван, один человек должен быстро сжать его марлей, в то время как другой человек использует прижигатель. - Используя комбинацию прямых и изогнутых хирургических щипцов, выполняют тупое рассечение, работая вдоль продольного разреза в мышцах. Это разделит животы трапеции, а также лежащую в основе полуспиналистную мышцу капитула бивентера.
- Разрежьте все оставшиеся мышечные волокна скальпелем и продолжайте тупое рассечение до тех пор, пока не станет виден полуспиналисный капитусный комплекс.
- Разрежьте происхождение трапециевидных и полуспиналисных капитуловых бивентерных мышц вдоль заднего аспекта черепа. Аккуратно отделяйте их продольно скальпелем, выполняя тупое рассечение до тех пор, пока полуспиналисный капитусный комплекс не будет полностью виден.
- Втягивайте трапециевидные и полуспиналисные капитутные бивентерные мышцы с помощью самоудерживающихся ретракторов.
- Там, где брюха полуспиналисного капитуса сходятся в средней линии, делают продольный разрез скальпелем глубиной примерно 1 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте в курсе любых дополнительных кровотечений здесь. Кровотечением можно управлять с помощью комбинации ватных тампонов и прижигания. - Используя хирургические щипцы, выполните тупое рассечение, работающее вдоль продольного разреза между мышечными животами до тех пор, пока дорсальный аспект атласа (CI) не станет ощутимым.
- Разрежьте истоки мышц полуспиналисного капитусного комплекса вдоль заднего аспекта черепа и отделите его продольно от нижележащих позвонков скальпелем и тупым рассечением.
- Втягивайте мышцы комплекса полуспиналис капитуса, используя другой набор самоудерживающихся втягивающих устройств.
- Используя скальпель, осторожно удалите все оставшиеся ткани, выходящие за область, где атлас встречается с основанием черепа.
- Поместив одну руку под шею животного и один палец на стыке атласа и черепа, одновременно поднимите голову и согните шею, пальпируя пальцем, чтобы выявить cisterna magna другой рукой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Cisterna magna узнаваема при пальпации как сильная упругая структура с небольшим количеством отскока, когда давление высвобождается пальцем.
3. Каннуляция и инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап также требует не менее двух человек и проводится с поднятой головой животного и согнутой шеей.
- Убедитесь, что один человек поднимает и сгибает голову и шею животного, в то время как другой пальпирует для cisterna magna, отмечая его анатомическое местоположение.
- Медленно и осторожно вводите канюлю 22 G через твердую мозговую оболочку и в cisterna magna под косым углом к продольной оси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте канюлю слишком глубоко, так как это может привести к повреждению мозга. Знание того, как далеко вставить канюлю, приходит с опытом понимания того, как это чувствует канюля, чтобы пронзить твердую мозговую оболочку. По сути, так же, как твердая мозговая оболочка была проколота, канюля становится достаточно глубокой для успешной инъекции индикатора. Эта глубина составляет примерно 3-5 мм, но будет отличаться в зависимости от размера или возраста животного. Успешная канюляция должна быть сразу очевидна через визуализацию прозрачного, пульсирующего ликвора, поднимающегося по канюле. Для достижения наилучшего результата рекомендуется заранее практиковать несколько канюляций у усыпленных животных, чтобы получить представление о дуральном пирсинге. - Вытащите иглу из канюли и поместите колпачок на замок.
- Сначала применяют суперклей и ускоритель, где канюля попадает в ткани, после чего наносится зубной цемент. Подождите 5 минут, пока цемент затвердеет.
- Аккуратно снимите колпачок с канюли и прикрепите к канюле мужской конец заранее подготовленного крана IV line с удлинителем на 10 см, с трассером.
- Медленно вводите индикатор вручную или с помощью микроинфузионного насоса со скоростью 100 мкл/мин. Снимите 3-позиционную линию IV с удлинителем 10 см и замените ее колпачком. Теперь индикатор должен быть виден пульсирующим у основания канюли (Дополнительное видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении вручную делайте это до тех пор, пока индикатор не будет еще виден в валу канюли, примерно на 1-2 мм выше, где зубной цемент покрывает вал. - После инъекции поместите мешки с песком под шею, чтобы сохранить некоторое сгибание. Затем голова может быть освобождена, и животное оставлено в положении лежа.
- Отпустите самоудерживающиеся ретракторы и поместите мышцы так, как они лежали раньше. Соберите кожу вместе над мышцами с помощью хирургических зажимов для полотенец.
- Накройте полотенцесушители и разрез марлей, а затем одеялом, чтобы ограничить потерю тепла.
- Позвольте индикатору циркулировать в течение желаемого времени, прежде чем усыплять животное с помощью i.v. Пентобарбитал для инъекций (140 мг/кг). Подтверждают эвтаназию отсутствием сердечных звуков при аускультации стетоскопом.
4. Извлечение и обработка мозга
- С помощью скальпеля с 20 лезвиями вытяните продольный дермальный разрез от затылочного гребня примерно до 7 см над носом.
- Отразите кожу, покрывающую спинной аспект черепа, с помощью скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько способов разрезания и удаления дорсального аспекта черепа свиньи на животной основе. Далее следует процедура, которая чаще всего работала для этого эксперимента. - Используя ручную компактную пилу, сделайте корональный разрез в черепе, примерно на 3 см выше двух больших вен, выходящих из черепа. Расширьте до двух дополнительных вертикальных разрезов от корональных разрезов и еще двух дополнительных разрезов, чтобы объединить вертикальные разрезы в средней линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте прочный захват пилы при разрезании кости черепа, так как она будет иметь тенденцию оттягиваться при первом контакте с костью или тканью, что может привести к серьезной травме. - Убедитесь, что разрезы черепа проходят через всю толщину кости, следуя молотком и узким зубилом (10 мм) к каждому из разрезов.
- С помощью молотка, наконец, выбивайте широкое зубило (25-30 мм) в корональный разрез. Когда один человек поддерживает голову, убедитесь, что другой человек применяет рычаг на зубило, чтобы вздрогнуть спинным черепом.
- После того, как фрагмент спинного черепа был удален, рассекните вышележащую твердую мозговую оболочку с помощью изогнутых хирургических ножниц.
- Используйте шпатель для тяжелого поражения спинного мозга от мозжечка в ростральном аспекте. Затем приступайте к направлению шпателя под мозг спереди, разрывая обонятельные луковицы, гипофиз и черепно-мозговые нервы.
- Поместите шпатель за мозжечок и приложите изрядное количество давления, чтобы выбить мозг из полости черепа, осторожно поднимая его после освобождения.
- Немедленно зафиксируйте весь мозг путем погружения тканей в 4% параформальдегид на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага можно провести визуализацию всего мозга с помощью стереоскопа (рисунок 1E). - На следующий день сделайте корональные срезы мозга с помощью лососевого ножа и зафиксируйте срезы на ночь погружением в ткань 4% параформальдегида.
- Наконец, поместите ломтики в 0,01% азида в PBS для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как только свинья теряет сознание, ее пальпируют, и ее поверхностная анатомия отмечается, начиная с затылочного гребня (OC) и работая в направлении грудных позвонков (TV) и каждого основания уха (EB). Именно по этим линиям делаются дермальные разрезы (рисунок 1А). Три мышечных слоя, включая трапецию, полуспиналис капитул бивентер и полуспиналис капитус комплекс, резецируются и удерживаются открытыми двумя наборами самоудерживающихся ретракторов, чтобы обнажить cisterna magna (CM) (рисунок 1B). Затем голова сгибается, чтобы открыть пространство между задней частью черепа и атласом и облегчить доступ к CM (рисунок 1C). Канюля весом 18 г аккуратно вставляется на 3-5 мм в СМ и фиксируется на месте как суперклеем, так и зубным цементом (DC). Затем индикатор может быть введен с фиксированной скоростью. После того, как индикатор был введен, IV-line и шприц заменяются колпачком канюли (рисунок 1C-D). Затем мышцы помещают обратно в место, а свинью покрывают и держат в тепле в течение времени циркуляции индикатора. После кровообращения животное усыпляется, а мозг быстро удаляется. Можно генерировать сшитые макроскопические изображения дорсальной поверхности мозга, которые облегчают подробное представление о моделях распределения индикатора на дорсальной поверхности мозга по бороздам и трещинам (рисунок 1E). Подобные изображения могут быть получены из вентральной и боковой поверхностей мозга, где распределение индикаторов может быть исследовано в височной доле (TL) и боковой трещине (LF) (рисунок 1E). Стереоскоп может быть дополнительно использован для получения изображений с более высоким увеличением поверхности мозга, где можно увидеть индикатор в PVS вдоль артерий (рисунок 1F-G). Макроскопические корональные участки мозга, толщиной около 8 мм, разрезаются с помощью лососевого ножа и обеспечивают дальнейшее понимание глубины проникновения индикатора в межполушарную трещину (IHS), а также распределения подкоркового индикатора в таких структурах, как гиппокамп (HPC) и полосатое тело (STR) (рисунок 1H).
Иммуногистохимическое окрашивание для AQP4, экспрессируемое на астроцитарных конечностях, глиально-фибриллярный кислый белок (GFAP), экспрессируемый во всех астроцитах, и актин гладких мышц (СМА), расположенный вокруг артериол, показали, что индикатор локализуется как внутри PVS, так и перемещается в паренхиму головного мозга (рисунок 1I-M). Окрашивание AQP4 и GFAP используется для идентификации астроцитов и, более конкретно, процессов стопы астроцитов, которые образуют внешнюю поверхность PVS, в то время как лектин и GLUT-1 окрашивают эндотелиальные клетки, которые образуют внутреннюю поверхность PVS (рисунок 1I-L). Проводя эти пятна для определения границ PVS, можно затем идентифицировать трассер с впрыском CSF, локализованный в пространстве PVS. Это подтверждает представление о том, что ликвор получает доступ к гиренцефальному мозгу через обширный транспорт PVS, который затем облегчает глимфатический приток в паренхиму мозга. Окрашивание СМА идентифицирует артерии и артериолы путем связывания с гладкомышечными клетками, обнаруженными в артериальных стенках, и может быть использовано, чтобы показать, что приток PVS происходит вдоль артерий, в отличие от вен, что составляет основную физиологию нормальной глимфатической функции (рисунок 1M).
Рисунок 1. Cisterna magna cannulation у свиней. (A) Свинья, подготовленная до начала операции и отмеченная, где будут выполняться дермальные разрезы, начиная с затылочного гребня (OC), затем сзади до грудных позвонков (TV) и латерально до каждого основания уха (EB). (B) Голова в расслабленном положении с трапецией, полуспиналис капитюсом бивентер и полуспиналис капитус комплексом мышц втягивается, тем самым обнажая cisterna magna (CM). (C) Головка сгибается вручную для расширения доступа к КМ для канюляции и инъекций. (D) Изображение канюли крупным планом, вставленной в КМ после инъекции и закрепленной на месте зубным цементом (DC). (E) Дорсальные, вентральные и боковые поверхности мозга, соответственно, после флуоресцентной визуализации с сопутствующими структурными изображениями белого света. Области интереса, которые видны на этих поверхностях, включают межполушарную трещину (IHS), височную долю (TL) и боковую трещину (LF). (F) Структурное изображение артерии и вен белого света на поверхности мозга. (G) Флуоресцентное изображение (F), показывающее распределение индикаторов вдоль поверхностной артерии. (H) Макроскопические срезы из передней и задней областей головного мозга показывают двумерную дисперсию и распределение индикаторов в трещинах (LF, IHS) и подкорковых структурах, таких как полосатое тело (STR) и гиппокамп (HPC). (I-J). Конфокальные изображения, показывающие индикатор в PVS, ограниченный лектин-окрашенными эндотелиальными клетками внутри и AQP4 на астроцитарной стопе процессами снаружи. (К-Л). Конфокальные изображения, показывающие индикатор в PVS, ограниченный эндотелиальными клетками внутри с астроцитарными ножными процессами, окрашенными для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), видимого, образуя внешнюю границу. (M) Конфокальное изображение, показывающее индикатор в PVS вокруг артериолы, окрашенной для актина гладких мышц (СМА), с индикатором, также видимым внутри и вокруг, окружающим паренхиму мозга. СМ, цистерна магна; DC, зубной цемент; EB, основание для уха; GFAP, глиальный фибриллярный кислый белок; HPC, гиппокамп; IHS, межполушарная трещина; ЛФ, боковая трещина; OLB, обонятельная лампа; OC, затылочный гребень; СТР, полосатое тело; ТЛ, височная доля; ТВ, грудные позвонки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1: Пульсация ликвора после инъекции индикатора. Видео cisterna magna крупным планом после инъекции трассера. Синий индикатор виден в шее канюли, пульсируя в ритме ликвора и свидетельствует об успешной канюляции и инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан подробный протокол выполнения прямой канюляции cisterna magna у свиней, включающий необходимую подготовку, хирургическую процедуру, инфузию индикатора и извлечение из головного мозга. Для этого требуется кто-то с опытом и сертификацией для работы с крупными животными. При правильном выполнении это позволяет с уверенностью доставлять желаемые молекулы непосредственно в ликвор, после чего для изучения распределения СМЖ и глимфатической функции при высоком разрешении у крупного млекопитающего может быть использован ряд различных усовершенствованных методов визуализации света.
Важно отметить, что хотя это та же процедура, что и канюляция cisterna magna у грызунов, она немного сложнее и требует нескольких часов тренировок. Такое обучение включает в себя обращение с крупными млекопитающими в лабораторных условиях, понимание анатомии и опорно-двигательного аппарата, особенно у свиней, и некоторую степень мастерства в использовании хирургических инструментов. Как только эти критерии были выполнены, можно выполнить эту технику, которая до сих пор имеет 100% успех по сравнению с 80-90% успехом у мышей. Наиболее критическим моментом для правильного выполнения процедуры является поднятие головы и сгибание шеи при введении канюли и введении индикатора. Хотя индикатор вводился сюда вручную, это делалось контролируемым образом 100 мкл в минуту. Мышам обычно вводят 10 мкл индикатора, и при непосредственном сравнении размеров мозга это приведет к примерно 2 мл в свинье весом 50 кг6,11,18. Таким образом, инъекция 500 мкл индикатора на самом деле была консервативным объемом и не должна была вызывать длительных возмущений при внутричерепном давлении (ВЧД). Кроме того, недавно было показано, что периваскулярная глимфатическая функция является не просто артефактом преходящего увеличения ВЧД, но сохраняется, когда ВЧД поддерживается на исходном уровне с использованием метода двойного шприца, что еще больше укрепляет представление о том, что эти результаты не отражают артефакты измененного ИКП19.
Это не единственный метод, который может быть использован для выполнения CMc у свиней, и, хотя он значительно более инвазивный, он, по-видимому, дает более точную инфузию индикатора. Еще один способ выполнить CMc у свиней - это положить их на бок в боковом положении лежачих мышц и войти в слепой с помощью спинномозговой иглы 150 мм20. Хотя это был привлекательный метод из-за его минимальной инвазивности, потенциальный показатель успеха воспринимался как более низкий. Поскольку задняя часть головы свиньи плоская, а СМ находится очень глубоко (10-12 см) от поверхности, спинномозговая игла имеет большое расстояние, прежде чем проникнуть в КМ, тем самым ограничивая уверенность в успешной канюляции. Помимо большого расстояния до КМ, диаметр самого СМ составляет всего около 10 мм, что еще больше снижает вероятность успешного каннюляции. Напротив, используя метод прямого CMc, можно непосредственно визуализировать канюляцию и, таким образом, с уверенностью знать, что она была успешной и что агенты были доставлены в ликвор, а не просочились в окружающие мягкие ткани. Обеспечение успешного консервирования важно для таких экспериментов из-за высокой стоимости свиней, хирургического оборудования и флуоресцентных индикаторов, а также для минимизации количества используемых свиней.
Ограничения этого метода, помимо инвазивности, заключаются в том, что стоимость и время не поощряют многие повторения по сравнению с грызунами. Первая операция заняла около 3 часов, но в настоящее время она выполняется примерно за 45 минут. Это представляет собой значительное улучшение времени, однако для выполнения канюляции у мыши требуется менее 5 минут для опытного исследователя, что означает, что фактическое время операции после достижения квалификации все еще в 9 раз больше, чем у мышей. Кроме того, большой мозг означает, что время циркуляции индикатора у свиньи более обширно, например, 2-6 часов, в то время как у мышей стандартное время циркуляции составляет 30 минут. Помимо высокой стоимости индикатора, необходимого в больших объемах для свиньи, фактическая стоимость самой свиньи, а также ее содержания, анестетиков и стоимость использования полной операционной камеры делают конечную стоимость этой процедуры для одной свиньи в 15 раз дороже, чем для одной мыши. Дополнительной проблемой, связанной со временем, является время, затрачиваемое на извлечение мозга после циркуляции индикатора. Предыдущие отчеты показали, что некоторое движение индикатора через PVS сохраняется после эвтаназии21. Это делает важным извлечение мозга как можно быстрее, чтобы свести к минимуму любые смешанные эффекты от этого явления. В то время как извлечение мозга мыши составляет всего несколько минут, извлечение мозга свиньи занимает примерно 15-20 минут времени. Мозг должен быть удален как можно быстрее, чтобы ограничить этот эффект, но с толщиной и архитектурой черепа свиньи трудно сократить текущее время экстракции.
Хотя прямая каннуляция делает процедуру довольно инвазивной, общая кровопотеря составляет в среднем только 100 мл за операцию, что составляет потерю менее 3% от общего объема крови. Кроме того, животное получает непрерывную инфузию физиологического раствора с анестетиками и дополнительную внутривенную линию лактата Рингера, снижая риск развития гиповолемии.
Будущие исследования необходимы для изучения трансляции глимфатических физиологических факторов, идентифицированных у мышей, а также глимфатической функции у бодрствующих или естественно спящих свиней, чтобы устранить влияние анестетиков22,23. Чтобы исследовать естественный сон или бодрствование, необходимо будет адаптировать текущий протокол таким образом, чтобы индикатор можно было доставлять менее инвазивными средствами, сохраняя при этом высокий уровень успеха. Это потенциально может быть достигнуто путем проведения инъекций КМ под компьютерной томографией рентгеноскопии, которая ранее использовалась для люмбальной пункции у свиней24. В будущем было бы очень интересно объединить эту технику с генетическими манипуляциями водного канала AQP4, чтобы понять его роль в глимфатической функции у крупного млекопитающего. Исследуя всю степень глимфатической системы у крупного млекопитающего, область приближается к пониманию глимфатической функции у людей и того, как она может быть использована терапевтически.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом Кнута и Алисы Валленберг, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations и Фондом Crafoord.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
