Summary
Dit artikel presenteert een stap-voor-stap protocol voor de directe canule implantatie in de cisterna magna van varkens.
Abstract
Het glymfatische systeem is een afvalopruimingssysteem in de hersenen dat afhankelijk is van de stroom van hersenvocht (CSF) in astrocytengebonden perivasculaire ruimtes en is betrokken bij de klaring van neurotoxische peptiden zoals amyloïde-bèta. Verminderde glymfatische functie verergert de ziektepathologie in diermodellen van neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, wat het belang van het begrijpen van dit klaringssysteem benadrukt. Het glymfatische systeem wordt vaak bestudeerd door cisterna magna cannulaties (CMc), waarbij tracers rechtstreeks in het hersenvocht (CSF) worden afgeleverd. De meeste studies zijn echter uitgevoerd bij knaagdieren. Hier demonstreren we een aanpassing van de CMc-techniek bij varkens. Met behulp van CMc bij varkens kan het glymfatische systeem met een hoge optische resolutie in gyrencephalische hersenen worden bestudeerd en daarmee de kenniskloof tussen knaagdier en menselijke glymfatica overbruggen.
Introduction
Hersenvocht (CSF) is een ultrafiltraat van bloed dat wordt aangetroffen in en rond het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. Afgezien van het geven van drijfvermogen aan de hersenen of het absorberen van schadelijke mechanische krachten, speelt CSF ook een cruciale rol bij het opruimen van metabolisch afval uit het CZS3. Afvalopruiming wordt vergemakkelijkt door het recent gekarakteriseerde glymfatische systeem dat de convectieve stroom van CSF door het hersenparenchym mogelijk maakt via perivasculaire ruimten (PVS), die doordringende slagaders omringen3,4,5. Van dit proces is aangetoond dat het afhankelijk is van aquaporine-4 (AQP4), een waterkanaal dat voornamelijk wordt uitgedrukt op de astrocytische eindvoet, gebonden aan de PVS4,6. De studie van het glymfatische systeem wordt bereikt door zowel in vivo als ex vivo beeldvorming, met behulp van geavanceerde lichtmicroscopie of magnetische resonantie beeldvorming (MRI), na de introductie van een fluorescerende / radioactieve tracer of contrastmiddel in de LIQUOR7,8,9,10,11.
Een effectieve manier om een tracer in de liquor te introduceren zonder schade aan het hersenparenchym op te lopen, is door middel van cisterna magna cannulation (CMc)12,13. Een grote meerderheid van alle glymfatische studies tot nu toe zijn uitgevoerd bij knaagdieren en vermeden bij hogere zoogdieren vanwege de invasiviteit van CMc in combinatie met de praktische eenvoud van het werken met een klein zoogdier. Bovendien maken de dunne schedels van muizen in vivo beeldvorming mogelijk zonder dat een schedelvenster nodig is en maken vervolgens een ongecompliceerde hersenextractie mogelijk11,14. Experimenten uitgevoerd bij mensen hebben waardevolle macroscopische in vivo gegevens opgeleverd over de glymfatische functie, maar vertrouwden op intrathecale tracere injecties in de distale lumbale wervelkolom en maakten bovendien gebruik van MRI die niet voldoende resolutie oplevert om de microanatomie het glymfatische systeem vast te leggen7,15,16 . Het begrijpen van de architectuur en omvang van het glymfatische systeem bij hogere zoogdieren is essentieel voor de vertaling naar de mens. Om de vertaling van glymfatische stoffen naar mensen te vergemakkelijken, is het belangrijk om technieken die worden uitgevoerd bij knaagdieren toe te passen op hogere zoogdieren om directe vergelijkingen van het glymfatische systeem tussen soorten met toenemende cognitie en hersencomplexiteit mogelijk te maken17. Varkens- en menselijke hersenen zijn gyrencephalisch en bezitten een gevouwen neuroarchitectuur, terwijl knaagdierhersenen dissident zijn, waardoor ze aanzienlijk van elkaar verschillen. In termen van de totale grootte zijn varkenshersenen ook meer vergelijkbaar met mensen, 10-15 keer kleiner dan het menselijk brein, terwijl muizenhersenen 3.000 keer kleiner zijn18. Door het glymfatische systeem bij grote zoogdieren beter te begrijpen, kan het mogelijk zijn om het menselijke glymfatische systeem te gebruiken voor toekomstige therapeutische interventie bij aandoeningen zoals beroerte, traumatisch hersenletsel en neurodegeneratie. Direct CMc bij varkens in vivo is een methode die de hoge resolutie lichtmicroscopie van het glymfatische systeem in een hoger zoogdier mogelijk maakt. Bovendien is het vanwege de grootte van de gebruikte varkens mogelijk om monitoringsystemen toe te passen die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt bij menselijke operaties, waardoor het mogelijk is om vitale functies strak te documenteren en te reguleren om te beoordelen hoe deze bijdragen aan de glymfatische functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU en werden goedgekeurd door de Ethische commissie voor dieronderzoek van Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) en uitgevoerd volgens de CODEX-richtlijnen van de Zweedse Onderzoeksraad.
1. Voorbereiding
- Tracer
- Bereid kunstmatige CSF voor (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- Voeg aan 500 μL kunstmatige liquor 10 mg albumine uit runderserum (BSA) geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (BSA-647) toe.
- Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 5 minuten en gebruik het supernatant.
- Canule
- Bevestig een spuit van 1 ml aan de vrouwelijke Luer-aansluiting van de intraveneuze (IV) lijn, 3-weg kraan met 10 cm verlenging.
- Bevestig een naald van 18 G aan het mannelijke uiteinde.
- Open het 3-weg stopslot om continuïteit van de naald naar de spuit mogelijk te maken.
- Maak de naald voorzichtig los en zuig ongeveer 300 μL van de zoutoplossing in de infuuslijn.
- Verwijder de naald van de zoutoplossing en breng wat lucht in om een kleine luchtbel (5-10 mm) in de IV-lijn te creëren.
- Plaats de naald in de tracer en zuig alle 500 μL van de tracer op. De zoutoplossing in de iv-lijn moet zichtbaar worden gescheiden door een luchtbel.
- Gooi de naald weg en sluit de 3-weg stopvergrendeling.
- Dier
- Verdoof een varken door intramusculaire (i.m.) injectie van tiletamine (3,75 mg/kg) en zolazepam (3,75 mg/kg) en dexmedetomidine (37,5 μg/kg). Wacht tot het bewusteloos wordt.
- Bereid een intraveneuze lijn voor door een 20 G canule in de oorader in te brengen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de canule zich in de ader bevindt door 5-10 ml zoutoplossing door de canule te injecteren. Als de ader is gemist, zal dit merkbaar zijn door klein oedeem in het oorweefsel. - Intubeer het varken om ervoor te zorgen dat de ademhalingssnelheid tijdens de operatie kan worden gereguleerd.
OPMERKING: Zorg voor een succesvolle intubatie door druk uit te oefenen op de thorax van het varken en bevestig dat er geforceerd verlopen lucht uit de intubatiebuis komt. - Bevestig de intubatiebuis aan een ventilator die is ingesteld op een ademfrequentie van 14 ademhalingen / min.
- Sluit een pulsoximeter en manchet aan op de staart om de hartslag (HR), bloeddruk (BP) en zuurstofverzadiging (sats) te controleren. Plaats een rectale thermometer om de kerntemperatuur te controleren.
- Bereid een infuuszak ketamine (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) en fentanyl (2,5 μg/kg/min) in zoutoplossing en begin met ongeveer 2 druppels/s door de oorader te trekken.
OPMERKING: Gedurende de hele operatie kan het nodig zijn om de infusiesnelheid te verhogen of te verlagen op basis van de vitale functies van het dier. - Met het varken in buikligging, palpeert u de achterkant van het hoofd en de nek van het dier om de occipitale top en wervelkolom van de eerste thoracale wervels en de basis van elk oor te lokaliseren en te markeren.
- Teken een rechte lijn tussen de top en de wervels langs de lengteas. Teken twee lijnen van de top naar de basis van elk oor door de basis van de schedel te volgen (figuur 1A).
- Controleer of het dier in een diepe slaap is door de staart voorzichtig vast te klemmen en te letten op de afwezigheid van een staartreflex.
OPMERKING: Als het dier nog steeds reflexief is, moet de infusiesnelheid van de verdoving stapsgewijs worden verhoogd totdat het dier geen reflex meer vertoont.
2. Chirurgie
OPMERKING: Gedurende de hele operatie is het noodzakelijk om ten minste één assistent te hebben om de lichte bloeding op te zuigen en eventuele afgehakte bloedvaten dicht te schroeien.
- Gebruik een scalpel met een # 21 mesje en maak een dermale incisie langs de lengtelijn naar de spier.
- Verleng twee loodrechte dermale incisies verder langs de schouders, 10-15 cm lang.
- Maak vanuit de achterhoofdsknobbels dermale incisies langs de lijn naar de basis van elk oor.
- Het vastpakken van de huidhoeken gevormd op de occipitale top met anatomische tang, zorgvuldig scheiden van de huid van de onderliggende spier door het scalpelblad lichtjes over de fascia te laten lopen, van de rostrale naar caudale. Zodra de huid na elk van de vijf incisies is gereseceerd, moeten delen van de trapeziusspieren zichtbaar zijn.
- Maak een longitudinale incisie met het scalpel, ongeveer 1 cm diep, waar de trapezius samenkomt op de middellijn.
OPMERKING: Bij het doorsnijden van de spieren is er een verhoogde neiging tot bloeden, dus de cauterizer moet klaar zijn. Als een groter vat wordt doorgesneden, moet de ene persoon het snel samendrukken met het gaas, terwijl de andere persoon de cauterizer gebruikt. - Gebruik een combinatie van rechte en gebogen chirurgische tang en voer stompe dissectie uit langs de longitudinale snede in de spieren. Dit zal de buiken van de trapezius scheiden, evenals de onderliggende semispinalis capitus biventer spier.
- Breek eventuele aanhoudende spiervezels af met een scalpel en ga door met stompe dissectie totdat semispinalis capitus complexus zichtbaar wordt.
- Breek de oorsprong van de trapezius en semispinalis capitus biventer spieren langs het achterste aspect van de schedel. Scheid ze zorgvuldig in de lengterichting met het scalpel dat stompe dissectie uitvoert totdat de semispinalis capitus complexus volledig zichtbaar is.
- Trek de trapezius- en semispinalis capitus biventerspieren in met behulp van zelfklevende retractors.
- Waar de buiken van de semispinalis capitus complexus samenkomen in de middellijn, maak een longitudinale incisie met het scalpel ongeveer 1 cm diep.
OPMERKING: Let op eventuele extra bloedingen hier. Bloeden kan worden beheerd met behulp van een combinatie van wattenstaafjes en cauterisatie. - Voer met behulp van een chirurgische tang een stompe dissectie uit langs de longitudinale snede tussen de spierbuiken totdat het dorsale aspect van de atlas (CI) voelbaar is.
- Scheid de oorsprong van de semispinalis capitus complexus spieren langs het achterste aspect van de schedel en scheid deze in de lengterichting van de onderliggende wervels door scalpel en stompe dissectie.
- Trek de semispinalis capitus complexus spieren in met behulp van een andere set zelfklevende retractors.
- Verwijder met behulp van een scalpel voorzichtig al het resterende weefsel boven het gebied waar de atlas de schedelbasis ontmoet.
- Plaats een arm onder de nek van het dier en een vinger op het kruispunt van de atlas en schedel, til tegelijkertijd het hoofd op en buig de nek terwijl je palpeert met de vinger om de cisterna magna met de andere hand te onthullen.
OPMERKING: De cisterna magna is herkenbaar bij het palperen als een sterke elastische structuur met een kleine hoeveelheid rebound als er druk wordt vrijgegeven met de vinger.
3. Cannulatie en injectie
OPMERKING: Deze stap vereist ook ten minste twee personen en wordt uitgevoerd met het hoofd van het dier verhoogd en de nek gebogen.
- Zorg ervoor dat de ene persoon het hoofd en de nek van het dier verheft en buigt, terwijl de andere palpeert voor de cisterna magna en een notitie maakt van de anatomische locatie.
- Breng langzaam en voorzichtig een 22 G canule door de dura en in de cisterna magna in een schuine hoek ten opzichte van de lengteas.
OPMERKING: Breng de canule niet te diep in, omdat dit schade aan de hersenen kan veroorzaken. Weten hoe ver de canule moet worden ingebracht, komt met ervaring in het begrijpen hoe het voelt voor de canule om de dura te doorboren. In wezen, net zoals de dura is doorboord, is de canule dan diep genoeg voor een succesvolle traceretinjectie. Deze diepte is ongeveer 3-5 mm, maar zal verschillen op basis van de grootte of leeftijd van het dier. Succesvolle cannulatie moet onmiddellijk duidelijk zijn door de visualisatie van heldere, pulsatiele CSF die de canule beklimt. Voor het beste resultaat wordt aanbevolen om vooraf verschillende cannulaties te oefenen bij geëuthanaseerde dieren om inzicht te krijgen in durale piercings. - Trek de naald van de canule en plaats een dop op het slot.
- Breng eerst secondelijm en een versneller aan waarbij de canule het weefsel binnenkomt, gevolgd door het aanbrengen van het tandcement. Wacht 5 minuten tot het cement is uitgehard.
- Verwijder voorzichtig de dop van de canule en bevestig het mannelijke uiteinde van de eerder voorbereide IV-lijnkraan met 10 cm verlenging, met de tracer, aan de canule.
- Injecteer de tracer langzaam met de hand of met behulp van een micro-infusiepomp met een snelheid van 100 μL/min. Verwijder de 3-weg IV-lijnkraan met 10 cm verlenging en vervang deze door de dop. Tracer moet nu zichtbaar pulserend zijn aan de basis van de canule (aanvullende video 1).
OPMERKING: Als u met de hand injecteert, doe dit dan totdat de tracer nog steeds zichtbaar is in de canuleschacht, ongeveer 1-2 mm boven waar het tandcement de schacht bedekt. - Plaats na de injectie zandzakken onder de nek om wat flexie te behouden. Het hoofd kan dan worden losgelaten en het dier wordt in een rustligging achtergelaten.
- Laat de zelfklevende retractors los en plaats de spieren zoals ze ervoor liggen. Breng de huid samen over de spieren met behulp van chirurgische handdoekklemmen.
- Bedek handdoekklemmen en incisie met gaas en vervolgens een deken om warmteverlies te beperken.
- Laat de tracer de gewenste tijd circuleren alvorens het dier te euthanaseren door i.v. Pentobarbital injectie (140 mg/kg). Bevestig euthanasie door de afwezigheid van hartgeluiden bij auscultatie met een stethoscoop.
4. Hersenextractie en -verwerking
- Gebruik een scalpel met 20 messen en verleng de longitudinale dermale incisie van de achterhoofdskop tot ongeveer 7 cm boven de neus.
- Reflecteer de huid boven het dorsale aspect van de schedel met behulp van het scalpel.
OPMERKING: Er zijn verschillende manieren om het dorsale aspect van de varkensschedel per dier te snijden en te verwijderen. Wat volgt is de procedure die het vaakst heeft gewerkt voor dit experiment. - Maak met behulp van een compacte zaag een coronale snede in de schedel, ongeveer 3 cm boven de twee grote aderen die de schedel verlaten. Breid uit naar nog twee verticale sneden van de coronale sneden en nog twee andere sneden om de verticale sneden samen te brengen in de middellijn.
OPMERKING: Houd de zaag stevig vast bij het maken van de schedelbotsneden, omdat deze de neiging heeft weg te trekken bij het eerste contact met het bot of weefsel, wat kan leiden tot een ernstig letsel. - Zorg ervoor dat de schedelsneden door de gehele dikte van het bot zijn door met een hamer en smalle beitel (10 mm) aan elk van de sneden te volgen.
- Klop met de hamer ten slotte een brede beitel (25-30 mm) in de coronale snede. Met één persoon die het hoofd ondersteunt, zorg ervoor dat de andere persoon een hefboom op de beitel toepast om de dorsale schedel te openen.
- Zodra het dorsale schedelfragment is verwijderd, ontleedt u de bovenliggende dura mater met behulp van een gebogen chirurgische schaar.
- Gebruik een spatel om het ruggenmerg van het cerebellum bij het rostrale aspect te verwijderen. Ga vervolgens verder met het begeleiden van de spatel onder de hersenen van voren, waarbij de reukbollen, hypofyse en hersenzenuwen worden doorgesneden.
- Plaats de spatel achter het cerebellum en oefen een behoorlijke hoeveelheid druk uit om de hersenen uit de schedelholte te verwijderen en til het voorzichtig op zodra het los is.
- Repareer onmiddellijk de hele hersenen door weefselonderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht.
OPMERKING: Na deze stap is het mogelijk om de hele hersenen af te beelden met behulp van een stereoscoop (figuur 1E). - Maak de volgende dag coronale plakjes van de hersenen met een zalmmes en fixeer de plakjes 's nachts door weefselonderdompeling in 4% paraformaldehyde.
- Plaats ten slotte de plakjes in 0,01% azide in PBS voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zodra het varken bewusteloos is, wordt het gepalpeerd en wordt de oppervlakteanatomie gemarkeerd, beginnend bij de occipitale top (OC) en werkend naar de thoracale wervels (TV) en elke oorbasis (EB). Het is langs deze lijnen dat de dermale incisies worden gemaakt (figuur 1A). De drie spierlagen waaronder trapezius, semispinalis capitus biventer en semispinalis capitus complexus worden gereseceerd en opengehouden door twee sets zelfklevende retractors om de cisterna magna (CM) bloot te leggen (figuur 1B). Het hoofd wordt vervolgens gebogen om de ruimte tussen de achterkant van de schedel en de atlas te openen en de toegang tot de CM te vergemakkelijken (figuur 1C). Een 18 G canule wordt voorzichtig 3-5 mm in de CM ingebracht en op zijn plaats bevestigd door zowel superlijm als tandcement (DC). Tracer kan dan met een vaste snelheid worden geïnjecteerd. Zodra de tracer is geïnjecteerd, worden de infuuslijn en spuit vervangen door een canulekapje (figuur 1C-D). De spieren worden dan weer op de plaats gezet en het varken wordt bedekt en warm gehouden voor de tijd dat de tracer wordt gecirculeerd. Na de circulatie wordt het dier geëuthanaseerd en worden de hersenen snel verwijderd. Het is mogelijk om gestikte macroscopische beelden van het dorsale oppervlak van de hersenen te genereren, die het mogelijk maken om gedetailleerde inzichten te geven in de verdelingspatronen van tracer op het dorsale hersenoppervlak over de sulci en fissuren (figuur 1E). Vergelijkbare beelden kunnen worden gegenereerd van de ventrale en laterale oppervlakken van de hersenen waar de tracerverdeling kan worden onderzocht in de temporale kwab (TL) en laterale fissuur (LF) (figuur 1E). Een stereoscoop kan bovendien worden gebruikt om hogere vergrotingsbeelden van het hersenoppervlak te produceren, waarbij het mogelijk is om de tracer in de PVS langs slagaders te zien (figuur 1F-G). Macroscopische coronale hersensecties, ongeveer 8 mm dik, worden met een zalmmes gesneden en geven verder inzicht in de diepte van tracerpenetratie in de interhemisferische fissuur (IHS), evenals subcorticale tracerverdeling in structuren zoals de hippocampus (HPC) en het striatum (STR) (figuur 1H).
Immunohistochemische kleuring voor AQP4 uitgedrukt bij astrocytische endfeet, gliaal-fibrillair zuur eiwit (GFAP) uitgedrukt in astrocyten en gladde spier actine (SMA) rond arteriolen toonde aan dat de tracer zowel binnen de PVS lokaliseerde als zich verplaatste naar het hersenparenchym (figuur 1I-M). AQP4- en GFAP-kleuring worden gebruikt om astrocyten te identificeren en meer specifiek de astrocytenvoetprocessen die het buitenoppervlak van de PVS vormen, terwijl lectine en GLUT-1 de endotheelcellen kleuren die het binnenoppervlak van de PVS vormen (figuur 1I-L). Door deze vlekken uit te voeren om de PVS-grenzen te definiëren, is het mogelijk om vervolgens csf-geïnjecteerde tracer gelokaliseerd in de PVS-ruimte te identificeren. Dit ondersteunt het idee dat CSF toegang krijgt tot de gyrencephalische hersenen via uitgebreid PVS-transport dat vervolgens de glymfatische instroom in het hersenparenchym vergemakkelijkt. SMA-kleuring identificeert slagaders en arteriolen door zich te binden aan gladde spiercellen in arteriële wanden en kan worden gebruikt om aan te tonen dat PVS-instroom optreedt langs slagaders in tegenstelling tot aderen, die de basisfysiologie van de normale glymfatische functie vormen (figuur 1M).
Figuur 1. Cisterna magna cannulatie bij varkens. (A) Varken voorbereid vóór het begin van de operatie en gemarkeerd waar dermale incisies zullen worden uitgevoerd vanaf de occipitale kam (OC) vervolgens achterste tot thoracale wervels (TV) en lateraal naar elke oorbasis (EB). (B) Hoofd in de ontspannen positie met de trapezius, semispinalis capitus biventer en semispinalis capitus complexus spieren ingetrokken, waardoor cisterna magna (CM) wordt blootgesteld. (C) Hoofd handmatig gebogen om de toegang tot CM voor cannulatie en injectie te vergroten. (D) Close-up van een canule die na injectie in CM wordt ingebracht en op zijn plaats wordt bevestigd met het tandcement (DC). (E) Dorsale, ventrale en laterale hersenoppervlakken, respectievelijk, na fluorescerende beeldvorming met bijbehorende structurele witlichtbeelden. Interessegebieden die zichtbaar zijn aan deze oppervlakken zijn de interhemisferische fissuur (IHS), temporale kwab (TL) en laterale fissuur (LF). (F) Structureel wit licht beeld van de slagader en aderen op het hersenoppervlak. (G) Fluorescerend beeld van (F) met de verklikstofverdeling langs de oppervlakteslagader. (H) Macroscopische plakjes van de voorste en achterste cerebrale gebieden vertonen tweedimensionale tracerdispersie en -verdeling in fissuren (LF, IHS) en subcorticale structuren zoals het striatum (STR) en hippocampus (HPC). (I-J). Confocale beelden tonen de tracer in de PVS, begrensd door lectine-gekleurde endotheelcellen intern en AQP4 op astrocytenvoetprocessen extern. (K-L). Confocale beelden tonen de tracer in de PVS, intern begrensd door endotheelcellen met astrocytenvoetprocessen gekleurd voor gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) zichtbaar vormend een buitengrens. (M) Confocale afbeelding van de tracer in de PVS rond een arteriole gekleurd voor gladde spier actine (SMA) met tracer ook zichtbaar in en rond, rond het hersenparenchym. CM, cisterna magna; DC, tandcement; EB, oorbasis; GFAP, gliaal fibrillair zuur eiwit; HPC, hippocampus; IHS, interhemisferische fissuur; LF, laterale fissuur; OLB, olfactorische bol; OC, occipitale kam; STR, striatum; TL, temporale kwab; TV, thoracale wervels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: CSF-pulsatie na de tracerinjectie. Close-up video van de cisterna magna na de tracer injectie. Blauwe tracer is zichtbaar in de canulehals pulserend op het ritme van de liquor en is indicatief voor een succesvolle cannulatie en injectie. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin wordt een gedetailleerd protocol beschreven om de directe cannulatie van de cisterna magna bij varkens uit te voeren, inclusief de noodzakelijke voorbereiding, chirurgische procedure, tracerdifusie en extractie van de hersenen. Dit vereist iemand met ervaring en certificering voor het werken met grote dieren. Indien correct uitgevoerd, maakt dit de levering van gewenste moleculen met zekerheid rechtstreeks in de liquor mogelijk, waarna een reeks verschillende geavanceerde lichtbeeldvormingsmodaliteiten kan worden gebruikt om de csf-verdeling en glymfatische functie bij hoge resolutie bij een groot zoogdier te onderzoeken.
Het is belangrijk op te merken dat hoewel dit dezelfde procedure is als cisterna magna cannulatie bij knaagdieren, het iets uitdagender is en enkele uren training vereist. Een dergelijke training omvat de behandeling van grote zoogdieren onder laboratoriumomstandigheden, een goed begrip van de anatomie en het bewegingsapparaat, met name bij varkens, en een zekere mate van vaardigheid in het gebruik van chirurgische instrumenten. Zodra aan deze criteria is voldaan, is het mogelijk om deze techniek uit te voeren, die tot nu toe een slagingspercentage van 100% heeft in vergelijking met een slagingspercentage van 80-90% bij muizen. Het meest kritieke punt voor het correct uitvoeren van de procedure, is het opheffen van het hoofd en het buigen van de nek tijdens het inbrengen van de canule en het infunderen van de tracer. Hoewel hier met de hand tracer werd geïnjecteerd, gebeurde dit op een gecontroleerde manier van 100 μL per minuut. Bij muizen wordt meestal 10 μL tracer geïnjecteerd en bij het direct vergelijken van hersengroottes zou dit zich vertalen in ongeveer 2 ml in een varken van 50 kg6,11,18. Daarom was de injectie van 500 μL tracer in feite een conservatief volume en had het geen verlengde verstoringen in de intracraniale druk (ICP) mogen veroorzaken. Bovendien is onlangs aangetoond dat de perivasculaire glymfatische functie niet alleen een artefact is van voorbijgaande verhogingen van ICP, maar aanhoudt wanneer ICP bij de baseline wordt gehandhaafd met behulp van een dubbele spuitmethode, waardoor het idee dat deze bevindingen geen artefacten van veranderde ICP19 weerspiegelen, verder wordt versterkt.
Dit is niet de enige techniek die kan worden gebruikt om CMc bij varkens uit te voeren, en hoewel het aanzienlijk invasiever is, lijkt het een nauwkeuriger tracere infusie te geven. Een andere manier om CMc bij varkens uit te voeren, is door ze op hun zij te leggen in de laterale lighouding en blind te worden met een 150 mm spinale naald20. Hoewel dit een aantrekkelijke methode was vanwege de minimale invasiviteit, werd het potentiële slagingspercentage als lager ervaren. Omdat de achterkant van de varkenskop plat is en CM zeer diep (10-12 cm) van het oppervlak zit, heeft de spinale naald een lange afstand af te leggen voordat hij de CM binnendringt, waardoor de zekerheid van succesvolle cannulatie wordt beperkt. Afgezien van de grote afstand tot de CM is de diameter van de CM zelf slechts ongeveer 10 mm, waardoor de kans op een succesvolle cannulatie verder wordt verkleind. Daarentegen is het mogelijk om door gebruik te maken van de directe CMc-methode om de cannulatie direct te visualiseren en zo met zekerheid te weten dat deze succesvol is geweest en dat de middelen aan de liquor zijn afgeleverd en niet zijn uitgelekt in het omliggende zachte weefsel. Het waarborgen van succesvolle cannulatie is belangrijk voor dergelijke experimenten vanwege de hoge kosten van varkens, operatiefaciliteiten en fluorescerende tracers, evenals om het aantal gebruikte varkens te minimaliseren.
De beperkingen van deze methode, afgezien van de invasiviteit, is dat de kosten en tijd veel herhalingen ontmoedigen in vergelijking met knaagdieren. De eerste operatie duurde ongeveer 3 uur, maar wordt momenteel in ongeveer 45 minuten uitgevoerd. Dit vertegenwoordigt een aanzienlijke tijdsverbetering, maar om een cannulatie in een muis uit te voeren, duurt het minder dan 5 minuten voor een bekwame onderzoeker, wat betekent dat de werkelijke operatietijd bij het bereiken van vaardigheid nog steeds 9 keer langer is dan bij muizen. Bovendien betekent het grote brein dat de tracercirculatietijden in het varken uitgebreider zijn, bijvoorbeeld 2-6 uur, terwijl bij muizen een standaardcirculatietijd 30 minuten is. Afgezien van de hoge kosten van de tracer, die in grote volumes nodig is voor het varken, maken de werkelijke kosten van het varken zelf, evenals de huisvesting, anesthetica en kosten van het gebruik van een volledige operatiekamer de eindkosten van deze procedure voor één varken 15 keer duurder dan in een enkele muis. Een extra tijdsgerelateerde uitdaging is de tijd die nodig is voor de hersenextractie na de tracercirculatie. Uit eerdere rapporten is gebleken dat enige beweging van de tracer via PVS aanhoudt na euthanasie21. Dit maakt het belangrijk om hersenen zo snel mogelijk te extraheren om eventuele verstorende effecten van dit fenomeen te minimaliseren. Terwijl de hersenextractie van muizen slechts een paar minuten bedraagt, nemen varkenshersenextracties ongeveer 15-20 minuten in beslag. De hersenen moeten zo snel mogelijk worden verwijderd om dit effect te beperken, maar met de dikte en architectuur van de varkensschedel is het moeilijk om de huidige extractietijden te verkorten.
Hoewel directe cannulatie de procedure vrij invasief maakt, bedroeg het totale bloedverlies gemiddeld slechts 100 ml per operatie, wat een verlies van minder dan 3% van het totale bloedvolume vormt. Bovendien krijgt het dier een continue zoutinfuus met de anesthetica en een extra IV-lijn van Ringers'lactaat, waardoor het risico op hypovolemie wordt beperkt.
Toekomstige studies zijn nodig om de vertaling van de glymfatische fysiologische drivers geïdentificeerd bij muizen te onderzoeken, evenals de glymfatische functie bij wakkere of natuurlijk slapende varkens om de impact van anesthetica te verwijderen22,23. Om de natuurlijke slaap- of waaktoestand te onderzoeken, zal het nodig zijn om het huidige protocol zodanig aan te passen dat tracer via minder invasieve middelen kan worden toegediend met behoud van een hoog slagingspercentage. Dit kan mogelijk worden bereikt door CM-injecties uit te voeren onder computertomografiefluoroscopie, die eerder is gebruikt voor lumbaalpunctie bij varkens24. In de toekomst zou het van groot belang zijn om deze techniek te combineren met genetische manipulaties van het AQP4-waterkanaal om de rol ervan in de glymfatische functie bij een groot zoogdier te begrijpen. Bij het onderzoeken van de volledige omvang van het glymfatische systeem bij een groot zoogdier, komt het veld dichter bij het begrijpen van de glymfatische functie bij mensen en hoe het therapeutisch kan worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Knut and Alice Wallenberg Foundation, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations en de Crafoord foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
