Summary
Spyttkjertler har blitt foreslått som et vevsmålsted for genterapi, spesielt innen vaksinasjon ved genoverføring. Vi demonstrerer gentilførsel i en ikke-menneskelig primatmodell ved hjelp av retrograd parotidinfusjon.
Abstract
Spyttkjertler er et attraktivt vevsmål for genterapi med lovende resultater som allerede fører til menneskelige studier. De er iboende i stand til å utskille proteiner i blodet og er lett tilgjengelige, noe som gjør dem potensielt overlegne vevssteder for erstatningshormonproduksjon eller vaksinasjon ved genoverføring. Foreslåtte metoder for genlevering inkluderer transkutan injeksjon og retrograd infusjon gjennom spyttkanaler. Vi demonstrerer hvordan du utfører Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) hos ikke-menneskelige primater. Vi beskriver de viktige anatomiske landemerkene, inkludert identifisering av parotid papilla, en atraumatisk metode for kanylering og tetting av Stensens kanal ved hjelp av grunnleggende tannverktøy, polyetylenrør og cyanoakrylat, og riktig infusjonshastighet. Selv om dette er den minst traumatiske leveringsmåten, er metoden fortsatt begrenset av volumet som kan leveres (<0,5 ml) og potensialet for traumer til kanalen og kjertelen. Vi demonstrerer ved hjelp av fluoroskopi at et infusat kan leveres fullt ut i kjertelen, og videre demonstrere ved immunhiistokjemi transduksjonen av en typisk vektor og uttrykk for det leverte genet.
Introduction
Mens spyttkjertler er kjent for sin eksokrinproduksjon av spytt, har forskere lenge anerkjent sin evne til å skille ut proteiner direkte i blodet1, noe som gjør dem til et potensielt mål for genterapi for systemisk administrasjon, for eksempel erstatningshormoner eller antistoffproduksjon. Faktisk tilbyr spyttkjertler flere fordeler i forhold til andre vevsmål, for eksempel den iboende evnen til å produsere proteiner for sekresjon (en eiendomsmuskulatur mangler), tung innkapsling som kan begrense vektordiffusjon, og godt differensiert vev som gir stabilitet for ikke-integrerende vektorer. Videre, i tilfelle en alvorlig bivirkning, er spyttkjertler ikke kritiske for livet og kan fjernes kirurgisk. Selv om de ikke umiddelbart er intuitive, er parotidkjertler også lett tilgjengelige fra munnen gjennom hovedutskillelseskanalen, Stensens kanal2.
Gitt fordelene med spyttvev for genterapi, er det økende interesse for å utforske dette vevsmålet. Tallrike studier har allerede blitt utført i gnager-, hunde- og ikke-menneskelige primatmodeller, og minst en menneskelig klinisk studie er i gang3,4,5. For å utforske og utvikle nytten av dette vevsmålet for genterapiformål, må flere ikke-menneskelige primatstudier utføres. Dette dokumentet beskriver en metode for å få tilgang til parotidkjertlene gjennom Stensens kanal for å levere et vektorisert gen for transduksjon i den ikke-menneskelige primatmodellen. For å synlig demonstrere leveransen av infusatet og kanalens anatomi når den kommer inn i kjertelen, ble fluoroskopi ved hjelp av radiokontrast utført. For å demonstrere vellykket transduksjon av en vektor, ble en Adenovirus serotype 5 (Ad5) vektorisert egfp gen brukt. Ad5 er en godt beskrevet vektor som er i stand til å transdusere spyttvev. Selv om det er for immunogent for optimal klinisk bruk, ble en Ad5-vektor valgt for denne demonstrasjonsstudien for å sikre effektiv transduksjon. Evaluering av enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) produksjon er en godt beskrevet metode for å demonstrere vellykket transkripsjon og oversettelse av et vektorisert gen etter transduksjon og ble gjort her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene ble utført ved Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus for dyrestudier. Institusjonell dyrepleie- og brukskomité (IACUC) ble konsultert for etiske hensyn og detaljer om prosedyrene ble sendt inn til gjennomgang. Wake Forest IACUC godkjente vår studieprotokoll og alle prosedyrer ble gjort under IACUC-godkjent protokoll #A17-147.
1. Klargjøring av infusjonsenheten
- Klipp størrelse 10 Polyetylen Tube (PET10) i 25 cm lengder ved hjelp av en saks.
- Merk PET10 på 1 cm og 2 cm fra den ene enden ved hjelp av en svart markør.
- Forfyll 0,5 ml Ad5-EGFP-oppløsning (109 virale partikler/ml) i en 1 ml (tuberkulin)-sprøyte.
- Skyv den ikke-merkede enden av PET10-røret over 29-31 G kanyle festet til en sprøyte. Det er vanligvis enklere å utføre denne oppgaven under forstørrelse.
- Tilsett oppløsningen i PET10 til røret er helt fullt (synlig fall i fri ende).
- Bruk full standard personlig verneutstyr, inkludert kirurgiske skrubber, langermet kjole, ugjennomtrengelige hansker, kirurgisk maske, ansiktsskjerm, hårhette og skodeksler.
2. Forbereder dyret
MERK: Cynomolgus macaques ble brukt til videodemonstrasjonen. Anatomien til andre ikke-menneskelige og menneskelige primater er svært lik, og protokollen bør oversettes til andre arter.
- Injiser subkutant 0,05 mg/kg atropin 15 min før prosedyren for å minimere spyttsekretjoner og optimalisere distribusjon og oppbevaring av infusatet.
- Gi anestesi ved bruk av 5 ml sprøyter med intramuskulær ketamin/midazolam (10-15 mg/kg ketamin og 0,01-0,05 mg/kg midazolam). Bekreft riktig anestesi når det bedøvede dyret blir bevisstløs og ikke klarer å reagere på stimuli.
3. Utføre prosedyren
- Bruk orale retraktorer for å spenne åpen munn.
- Plasser gummiputen i den ene enden av retraktoren på den harde ganen bak de øvre tennene på siden av munnen motsatt av kjertelen som skal infunderes. Plasser gummiputen i den andre enden på den nedre hunden på samme side som øvre retraktor. La forsiktig fjærvirkningen til retraktoren utvide og åpne munnen.
- Identifiser parotid papilla, åpningen av Stensens kanal, på det bakre kinnet, ved siden av den øvre2. Dette er best visualisert ved hjelp av tannløkker for forstørrelse.
- Fortynn forsiktig parotid papilla med punktet på den koniske dilatatoren. Det er best å plassere punktet på dilatatoren i midten eller åpningen av papillaen og deretter rotere den forsiktig frem og tilbake. Punktet skal sakte komme inn i papillaen og utvide den over ca. 20 - 30 s mild rotering.
- Sett PET10-slangen inn i den utvidede parotid papillaen. Dette oppnås best ved å holde den markerte enden av PET10-røret med pinsett ca. 0,5 cm fra den distale enden og forsiktig sette tuppen av røret inn i den utvidede papillaen.
- Før forsiktig røret, som ofte forenkles av små roterende bevegelser for å hjelpe røret med å gli, etterfulgt av justering av pinsettene 0,5 cm proksimalt til forrige grep. Gjenta dette til 2 cm-merket når parotid papillaen.
- Påfør cyanoacrylat på kinnet rundt papillaen og det innsatte røret og vent til det tørker (ingen spesifikk mengde registrert, akkurat nok til å forsegle inngangen til Stensens kanal papilla). Dette tar vanligvis mindre enn et minutt og bidrar til å forsegle parotid papilla og redusere søl av infusate tilbake i munnhulen.
- Skyv sprøyteinnholdet langsomt over 5 minutter med en hastighet på 100 μL/min. Denne langsomme infusjonshastigheten minimerer risikoen for kanalskade på grunn av plutselig økning i intrakanaltrykket.
- La PET10 være på plass i minst 5 minutter etter at infusjonen er fullført. Hold kanalen forseglet og la infusatet forbli i parotidkjertelen.
- Fjern PET10 med skånsom trekkraft. Cyanoacrylaten vil trekke seg fri med røret.
- Gjenta trinn 3.2 til 3.8 på motsatt side.
- Slipp orale retraktorer langsomt etter at begge parotidene er infundert og begge PET10-rørene fjernet.
MERK: Hele prosedyren for begge sider bør ta mindre enn 30 minutter.
4. Post-prosedyre omsorg
- Etter at infusjonen er fullført og Stensens kanal dekanulert, observere dyr til anestesieffekten slites av (vanligvis mellom 20-30 min etter prosedyren).
- Tilby dyret drinker og deretter mat etter at de er helt våken og gjenoppta rutinemessig omsorg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket prosedyre, transduksjon og transkripsjon
Figur 1 viser parotid papillaen ved siden av denandre molaren på det bakre overlegne kinnet. Bildet viser også riktig plassering av munnstøtten, den ene gummienden på den harde ganen og den andre gummienden på den ipsilaterale hunden. Figur 2 viser et bilde tatt etter vellykket kanylering av parotid papilla ved 2 cm-merket på PET10. Figur 3 viser et fluoroskopibilde i øyeblikket av en radiokontrastinfusjon som demonstrerer forgrening av løsningen gjennom Stensens kanal og inn i parotidkjertelen. Dette fluoroskopiske bildet ble utført med den eneste intensjonen om å demonstrere anatomien og fordelingen av et infusat. Fluoroskopi er ikke nødvendig når du utfører denne prosedyren for vektorlevering. Figur 4 viser EGFP immunostert i rødt på histopatologi. Både kanal- og acinarceller har blitt farget i rødt, noe som indikerer vellykket transduksjon og transkripsjon i begge celletyper. Oppsummert viser disse fire figurene passende RSGI med visualisering av anatomien og transduksjonen av Ad5 vektorisert EGFP.
Figur 1: Parotid papilla. Legg merke til sirkelen på figuren som fremhever parotid papillaen ved siden avden andre molaren på det bakre kinnet. Legg også merke til plasseringen av munnstøtten, med den ene gummienden på den harde ganen og det andre gummibåndet på den nedre hunden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Parotid papilla kanylering ved PET10. Legg merke til 2 cm-merket på PET10-røret som er synlig ved parotid papilla (pilspiss), som ligger på det bakre kinnet, ved siden av denandre øvre molaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluoroskopibilde som viser diffusjon i parotidkjertelen. Legg merke til forgrening på enden av Stensens kanal (pilspiss) når den forgrener seg til mindre kanaler i parotidkjertelen (Circle). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Patologisk glidning av parotidkjertelen. Merk uttrykk for EGFP (farget i rødt) av kanal/acinar parotidvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for retrograd infusjon i parotidkjertelen gjennom Stensens kanal. Den beskrevne metodikken gir veiledning som potensielt kan brukes av forskere som utforsker nytten av spyttvev som et sted for genterapi og andre anvendelser.
Det er flere kritiske trinn for å sikre at prosedyren lykkes. Først og fremst bør alle prosedyretrinnene fullføres forsiktig. Kraftig avstivning av munnen kan føre til mandibulær subluxasjon. Kraftig kanylering av parotid papilla eller rask infusjon av oppløsningen i Stensens kanal kan føre til akutte duktale tårer eller kronisk duktale stenose.
For det andre, sørg for at anestesi har blitt administrert og er effektiv. Uten riktig anestesi kan ingen av trinnene lett oppnås, og risikoen for dyre- og menneskeskader økes betydelig. Vi valgte intramuskulær anestesi med ketamin og midazolam, som er et standardregime i ikke-menneskelige primatstudier6. Vi anser atropin som viktig for å redusere spyttsekretjoner under prosedyren, forbedre synligheten av anatomien og redusere utvaskingen av infusatet før transduksjon7,8.
Et skritt som ofte er utfordrende er den første kanylen og fremrykningen av PET10 inn i parotid papilla og Stensens kanal. Skånsom rotasjon av PET10 mens du setter inn, forenkler disse trinnene. Overdreven dytting kan føre til kanalskader.
Prosedyren er hovedsakelig begrenset av skjørheten og størrelsen på vevet. Dette krever svært skånsom teknikk og bruk av forstørrelsessløyfer og små verktøy for å sikre riktig kannasjon, fremrykning av rør og levering av infusatet. En annen potensiell begrensning er volumet av infusat at parotidkjertlene er i stand til å imøtekomme. Tidligere studier har infundert et maksimalt volum på 0,5 ml i hver parotidkjertel, totalt 1 ml per dyr6,9,10. Selv om dette ikke direkte påvirker selve prosedyren, avhengig av legemiddelkonsentrasjonen i det infusate, kan det vise seg å være begrensende for en ønsket fysiologisk effekt.
RSGI tilbyr det minst traumatiske alternativet hvis spyttkjertelinfusjon er ønsket. Alternativer som transkutane eller USA-styrte perkutane injeksjoner bærer risikoen for ansiktsnerveskade. Videre kan disse prosedyrene mislykkes i å oppnå tilstrekkelig distribusjon til hele kjertelen, mens RSGI bruker kanalsystemet for å sikre distribusjon. Fluoroskopi ble utført med standard radiokontrastløsning utelukkende med det formål å demonstrere at RSGI leverer et fullt infusat med god distribusjon gjennom hele kjertelen. Dette ble utført separat fra selve infusjonen av Ad5-vektoren. Fluoroskopi og/eller annen røntgenavbildning utført under RSGI for å levere genvektorer ville ikke være nyttig og anbefales ikke.
Etter hvert som terapeutiske feltet ved genoverføring fortsetter å utvikle seg, blir spyttkjertler som målvev allerede stadig mer populære2,5. Ponzio et al. tilbyr en flott gjennomgang om fordelene ved spyttkjertlene som mål for immunisering4. Som innkapslet, ikke-vitalt kjertelvev som vi har demonstrert er lett tilgjengelig, utgjør parotidkjertlene en ideell genterapiplattform. RSGI tilbyr den minst traumatiske teknikken for genoverføring til kjertlene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Mr. Cagney Gentry for hans audiovisuelle støtte til å filme prosedyren. Vi ønsker også å anerkjenne Hefner VA medisinske senter for faglig støtte i jakten på dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
