Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.

Abstract

المعززات هي منصات ملزمة لمجموعة متنوعة من عوامل النسخ التي تقود أنماط تعبير محددة للجينات الخاصة بالأنسجة والخلايا. أثبتت الوسائل المتعددة لتقييم الحمض النووي غير المشفر وحالات الكروماتين المختلفة فائدتها في التنبؤ بوجود تسلسلات معززة في الجينوم ، ولكن التحقق من صحة نشاط هذه التسلسلات وإيجاد الأعضاء ومراحل النمو التي تنشط فيها هي عملية كثيفة العمالة. مكنت التطورات الحديثة في ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) من توصيل جينات التحوير على نطاق واسع إلى أنسجة الفئران ، مما مكن من اختبار محسن في الجسم الحي دون الحاجة إلى معدل وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام بنية المراسل التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج ، والتي لا تقود تعبيرا مهما من تلقاء نفسها ، لدراسة أنماط نشاط تسلسل محسن المرشح في دماغ الفأر. يتم تسليم بناء مراسل معبأ AAV إلى دماغ الفأر وحضنه لمدة 1-4 أسابيع ، وبعد ذلك يتم التضحية بالحيوان ، ويتم ملاحظة أقسام الدماغ تحت المجهر. يظهر EGFP في الخلايا التي يكون فيها المحسن الذي تم اختباره كافيا لبدء التعبير الجيني ، مع تحديد الموقع ومرحلة النمو التي ينشط فيها المحسن في الدماغ. إن طرق الاستنساخ القياسية ، وتغليف AAV منخفض التكلفة ، وتوسيع الأنماط المصلية AAV وطرق التوصيل في الجسم الحي وقراءات التصوير القياسية تجعل هذا نهجا متاحا لدراسة كيفية تنظيم التعبير الجيني في الدماغ.

Introduction

المعززات هي عناصر تنظيمية جينومية لرابطة الدول المستقلة تعمل كمواقع ربط عامل النسخ ويمكنها دفع التعبير عن الجين المستهدف بطريقة محددة زمانيا مكانيا 1,2. وهي نشطة بشكل تفاضلي في أنواع الخلايا والأنسجة ومراحل التطور المختلفة ويمكن أن تكون ركائز للاختلاف الجينومي المرتبط بمخاطر المرض 3,4. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى فهم ديناميكيات وظيفة المحسن أمر بالغ الأهمية للتقدم في كل من التطبيقات العلمية الانتقالية والأساسية في علم الجينوم. في السيليكو ، يمكن أن تكون تنبؤات نشاط المحسن بمثابة موارد ممتازة لتوليد فرضيات حول قدرة المحسن 5,6. يمكن أن يتطلب نشاط المحسن المتوقع هذا التحقق والاستجواب الإضافي لفهم كامل للنشاط الوظيفي. أثبتت فحوصات مراسل Enhancer أنها ذات قيمة لهذا الغرض عبر مجموعة متنوعة من الأنظمة ، من الخلايا إلى الحيوانات7،8،9. من أجل توسيع هذه الدراسات في سياق عابر مرن وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الأساليب القائمة على AAV في الجسم الحي لاختبار تسلسلات المحسن المفترض لقدرتها على دفع التعبير عن جين مراسل خارج الرحم في دماغ الفأر بعد الولادة. هذه المجموعة من الأساليب لها فائدة لاستجواب تسلسل مرشح واحد أو فحص المكتبة المتوازي وهي ذات صلة بالبحوث الأساسية والانتقالية.

تجمع هذه الطريقة في بلازميد واحد تسلسل الحمض النووي المرشح المفترض مع جين مراسل (هنا EGFP) ، تحت سيطرة مروج الحد الأدنى الذي وحده لا يقود تعبيرا مهما. يتم تعبئة البلازميد في AAV المؤتلف (rAAV) وحقنه في نموذج حيواني. في حين أن التطبيق هنا هو الدماغ ، فإن الأنماط المصلية المختلفة rAAV تمكن العدوى عبر أنواع الأنسجة المختلفة بحيث يمكن توسيع هذا النهج ليشمل أنظمة أخرى10. بعد فترة من الزمن ، يمكن جمع الدماغ وفحصه للتعبير عن جين المراسل. يشير التعبير القوي ، مقارنة بالضوابط ، إلى أن تسلسل المرشح الذي تم اختباره كان قادرا على "تعزيز" التعبير عن الجين (الشكل 1). يوفر هذا التصميم البسيط نهجا سهلا وواضحا لاختبار تسلسل لنشاط المحسن في الجسم الحي في الدماغ.

بالإضافة إلى اختبار قدرة المحسن للتسلسل ، يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات لتحديد نشاط محسن نوع الخلية. في النهج القائمة على التسلسل لتحديد نشاط المحسن التفاضلي ، يمكن أن يسمح فرز الخلايا على علامات خاصة بنوع الخلية قبل تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي للباحثين بتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تظهر نشاط محسن تفاضلي ، كما هو موضح في Gisselbrecht et al.11. في النهج القائمة على التصوير ، يسمح وضع العلامات المشتركة للصور مع علامات خاصة بنوع الخلية بفحص ما إذا كانت الخلايا التي تظهر مضان مدفوع بالمحسن تعرض أيضا علامات من نوع الخلية ذات الأهمية12،13،14،15،16. تتيح مقايسات مراسل المحسن الاختبار المباشر للتباين الأليل المرتبط بالمخاطر في المعززات للتأثيرات على قدرة المحسن. تقع الغالبية العظمى من مواقع الخطر المحددة في دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) في مناطق غير مشفرة من الجينوم17. تشير دراسات التعليقات التوضيحية الوظيفية لمواقع المخاطر هذه إلى أن جزءا كبيرا من المحتمل أن يعمل كمحسنات18،19،20. يمكن أن يسمح نشر MPRA في الجسم الحي باختبار هذه المتغيرات المرتبطة بالمخاطر لنشاط المحسن في الدماغ12,21. أخيرا ، يمكن أن يقدم التسليم والتجميع في نقاط زمنية مختلفة نظرة ثاقبة لمراحل التطور التي يكون خلالها المحسن نشطا.

تصميمات البلازميد المحسنة-المراسل متنوعة ويمكن تخصيصها لتناسب الأهداف التجريبية. هناك العديد من الخيارات للحد الأدنى من المروجين التي تم استخدامها في أبحاث المحسن ، مثل المروج الأدنى β-globinالبشري 22 والماوس Hsp68 الحد الأدنى من المروج23. من المعروف أن هؤلاء المروجين يقودون مستويات منخفضة من التعبير ما لم يقترن بعنصر محسن لتنشيطهم. في المقابل ، تدفع عناصر المروج التأسيسية تعبيرا قويا عن جين التحوير ، وهو مفيد للتحكم الإيجابي أو لاختبار وظيفة المحسن على خلفية التعبير القوي. تشمل الخيارات الشائعة للمروجين التأسيسيين CAG ، وهو مروج هجين مشتق من مروج الدجاج β الأكتين ومحسن الفيروس المضخم للخلايا الفوريالمبكر 24 ، أو EF1α25 البشري. نظرا لأنه من المعروف أن المعززات تعمل ثنائي الاتجاه26 ، فإن اتجاه وموقع المحسن بالنسبة إلى الحد الأدنى من المروج مرن (الشكل 2 أ). تضع مقايسات المحسن والمراسل التقليدية المحسن في المنبع للمروج ، وفي عمليات تسليم المكتبة ، تتضمن تسلسل الباركود في اتجاه مجرى جين المراسل لربط قراءات التسلسل بالمحسنالمختبر 27. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع المعززات في إطار القراءة المفتوح لجين المراسل وتعمل كتسلسل باركود خاص بها ، كما هو الحال في STARR-seq28. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا تصميم مقايسة STARR-seq ، مما يضع تسلسل محسن المرشح في 3 'UTR لجين المراسل. في حين أن اتجاه STARR-seq يوفر ميزة الاستنساخ الأكثر انسيابية ، إلا أنه أقل فهما من النهج التقليدي وقد يؤدي إلى استقرار متغير للحمض النووي الريبي بين البنى. يمكن تكييف الطرق الموصوفة بسهولة إما مع STARR-seq أو الاتجاه التقليدي مع تعديلات طفيفة على عملية الاستنساخ التي تم وصفها في مكان آخر27,29.

يمكن استخدام طرق مختلفة لتسليم AAV لزيادة تخصيص هذه التقنية لتناسب الأهداف التجريبية (الشكل 2 ب). الحقن المباشر داخل الجمجمة ، الموصوف بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول ، يقدم تركيزا عاليا من الفيروس مباشرة إلى الدماغ30. وهذا يعطي كفاءة نقل عالية تتمركز في موقع الحقن ، مما يجعل هذه تقنية ممتازة للتجارب التي تتطلع إلى زيادة كثافة الخلايا المنقولة إلى أقصى حد على مساحة من الأنسجة. يمكن أن يساعد الحقن التجسيمي في توحيد موقع الحقن عبر الحيوانات من أجل النقل الموضعي القابل للتكرار. الحقن داخل الجمجمة هي الأكثر وضوحا في الحيوانات بعد الولادة المبكرة. كتقنية بديلة ، يمكن للحقن الجهازية توصيل جينات التحوير باستخدام AAVs مع الأنماط المصلية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي31. تسمح حقن الوريد الذيل للفيروس بالانتشار في جميع أنحاء الجسم ، مما يتيح التوصيل المعمم عبر العديد من الأنسجة10. الحقن المداري الخلفي هي تقنية حقن جهازية أخرى توصل الفيروس خلف العين إلى الجيب المداريالخلفي 32. يوفر هذا طريقا مباشرا أكثر ل AAV من الجهاز الوريدي إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى للخلايا المنقولة في الدماغ مقارنة بالحقن في المزيد من الأوعية الدموية المحيطية33.

جانب مرن آخر لهذه التقنية هو طريقة القراءة. بشكل عام ، يمكن وصف الخيارات بأنها قائمة على المراسل أو قائمة على التسلسل (الشكل 2 ج). يؤدي دمج مراسل فلوري مثل GFP في إطار القراءة المفتوح للبناء إلى التعبير عن البروتين الفلوري في أي خلايا محولة حيث قاد المحسن المرشح التعبير. تتيح تقنيات وضع العلامات والتصوير مثل الكيمياء المناعية تضخيم الإشارة. تتضمن تقنيات القراءة القائمة على التسلسل تحديد التسلسلات من البنية المسلمة في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من الأنسجة. من خلال تحديد كمية الحمض النووي الفيروسي التي تم تسليمها في البداية ، يمكن استخدام مقارنة الحمض النووي الريبي المعبر عنه مقابل الحمض النووي المنقول لتحديد الدرجة التي كان بها تسلسل محسن تم اختباره قادرا على زيادة التعبير عن جين التحوير ، على سبيل المثال ، في سياق مقايسة مراسل موازية على نطاق واسع (MPRA). تقدم MPRAs توسعا قويا لهذه التقنيات لاختبار ما يصل إلى الآلاف من المعززات المرشحة للنشاط في وقت واحد وقد تم وصفها على نطاق واسع في أبحاث الجينوم12،27،34،35،36. يتم تحقيق فحص إنتاجية أعلى من خلال تنفيذ خطوات الاستنساخ والتعبئة والتسليم والتسلسل للمحسنات المرشحة دفعة واحدة وليس بشكل فردي.

يوفر اختيار محسن المرشح فرصة أخرى للمرونة (الشكل 2D). على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد معززات جين معين ، للتأكد من وظيفة مناطق الحمض النووي غير المشفرة ذات الأهمية ، أو لتحديد أنواع معينة من الخلايا أو مراحل النمو التي يكون خلالها المحسن نشطا - وكلها تخدم أهدافا في كل من العلوم الأساسية وأبحاث الأمراض. بشكل عام ، يكون اختيار محسن المرشح مدفوعا بتنبؤات السيليكو لنشاط المحسن. بشكل عام ، في تنبؤات السيليكو تشمل ChIP-seq لتعديلات هيستون التي تشير إلى معززات محتملة ، مثل H3K27ac37 ورسم خرائط إمكانية الوصول إلى الكروماتين38. أخيرا ، هناك مجال متزايد للبحث هو الفحص القائم على الوظيفة لعناصر المحسن المصممة صناعيا ، مما يتيح إجراء دراسات حول كيفية توجيه تسلسل المحسن للوظيفة39 وتصميم المعززات ذات الخصائص المحددة40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (البروتوكول # 22339) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (BUA-R1903). تم اختبار هذا البروتوكول على الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين في يوم ما بعد الولادة 0-1.

1. استنساخ تسلسل مرشح محسن في البلازميد المتجه AAV.

ملاحظة: يتم إعطاء البروتوكولات التمثيلية ، ولكن استراتيجية الاستنساخ لديها درجة عالية من المرونة.

  1. حدد أو صمم بناء المراسل. هنا ، يتم إدخال مرشح المحسن في المنطقة غير المترجمة 3 '(UTR) لجين مراسل EGFP ، والذي يتم التعبير عنه تحت سيطرة المروج الأدنى Hsp68.
    ملاحظة: تم إيداع العديد من تركيبات بلازميد MPRA المناسبة لهذا الفحص في Addgene41 وهي متاحة للاستخدام البحثي.
  2. تصميم بادئات PCR لتضخيم سلسلة من الاهتمام. أضف إلى الطرف 5 'من البادئات ذراع التماثل المناسب لاستنساخ جيبسون (~ 35 نقطة أساس المقابلة للتسلسل 5' المنبع لموقع الإدراج ، والشريط العلوي للبرايمر الأمامي ، والشريط السفلي للبرايمر العكسي).
    ملاحظة: تأكد من أن تسلسل التمهيدي الأساسي يبلغ طوله ~ 18-24 نقطة أساس و ~ 50٪ -60٪ محتوى GC مع درجة حرارة انصهار تبلغ حوالي 57-59 درجة مئوية.
  3. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من عينة الحمض النووي باستخدام البادئات المصممة.
    1. قم بتجميع مزيج تفاعل PCR في أنابيب PCR سعة 0.2 مل كما هو موضح في الجدول 1.
    2. ضع مزيج (مزيجات) تفاعل PCR على دورة حرارية ودورة وفقا للبرنامج المذكور في الجدول 1.
    3. تأكد من نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تشغيل 5 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على 0.7٪ -1٪ هلام أغاروز عند 100 فولت لمدة 30-60 دقيقة. تحقق من وجود جزء من الطول المتوقع.
    4. قم بتنظيف منتج PCR باستخدام مجموعة عمود تنظيف التفاعل الأنزيمي التجاري. الشطف النهائي هو إدراج الاستنساخ.
  4. قم بإجراء عملية هضم التقييد لخطي متجه AAV في موقع الاستنساخ الفريد لإدخال المحسن في المتجه.
    1. يحد موقع الاستنساخ في 3 'UTR من بناء مراسل محسن المستخدمة هنا مواقع تقييد PacI و AscI الفريدة. قم بإجراء ملخص لخطي البلازميد في هذا الموقع وفقا للمعلمات التالية (الخطوات 1.4.2-1.4.4).
    2. هضم 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي المتجه باستخدام PacI و AscI ، اعتمادا على عدد تفاعلات الاستنساخ المطلوبة. قم بإعداد التفاعلات باستخدام المخزن المؤقت المرفق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة لهضم الحمض النووي المتجه. (إذا كان هضم أكثر من 5 ميكروغرام في تفاعل 50 ميكرولتر ، فقد يكون من الضروري حضانة أطول.)
    4. بعد 1-2 ساعة من الحضانة ، قم بإلغاء تنشيط الإنزيم عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. افصل شظايا هضم التقييد عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي باستخدام هلام أغاروز 0.7٪ -1٪ ، يعمل عند 100 فولت لمدة 30-60 دقيقة.
    6. قم باستئصال الشريط للناقل الخطي وتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية.
  5. إجراء تفاعلات استنساخ جيبسون وتحويلها
    1. تحديد تركيز المتجه المنقى وإدراج الاستنساخ باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: يمتص الحمض النووي الضوء عند 260 نانومتر ، بينما تمتص الملوثات الضوء عند 230 نانومتر و 280 نانومتر. تشير النسب العالية (>1.8) من 260/230 و 260/280 إلى حمض نووي عالي النقاء.
    2. قم بتجميع تفاعلات استنساخ جيبسون في أنابيب PCR سعة 0.2 مل: 5 ميكرولتر من مزيج جيبسون الرئيسي 2x ، شظايا الحمض النووي 0.02-0.5 pmol بنسبة 3: 1 إلى المتجه (يجب تحديد تركيز الحمض النووي الأمثل للتفاعل تجريبيا) والماء الخالي من النيوكلياز (ارفع الحجم إلى 10 ميكرولتر).
    3. احتضان تفاعلات جيبسون عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دورة حرارية.
  6. تحويل نقص إعادة التركيب (recA-) الإشريكية القولونية المختصة (E. coli).
    1. اضبط حماما مائيا على 42 درجة مئوية وقم بإذابة الخلايا المختصة المتاحة تجاريا على الجليد.
      ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة قبل الخطوة 1.4 ، ويمكن للخلايا أن تذوب أثناء تحضير واحتضان تفاعل جيبسون.
    2. القسمة 30-50 ميكرولتر من الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2.0 مل. أضف 2 μL من تفاعل جيبسون إلى القسمة وقم بتسمية الأنبوب بهوية جيبسون. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: استخدم 5-10 نانوغرام من المتجه الفارغ غير المهضوم كعنصر تحكم إيجابي والماء كعنصر تحكم سلبي.
    3. قم بصدمة حرارية للخلايا في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30-45 ثانية ، وأعد الأنابيب على الفور إلى الثلج ، واتركها تتعافى لمدة 5 دقائق.
    4. أثناء وجودك على الجليد ، أضف 400-950 ميكرولتر من وسائط الاسترداد المتاحة تجاريا.
      ملاحظة: تحتوي وسائط الاسترداد المستخدمة في هذه التجارب على 2٪ ببتون نباتي و 0.5٪ مستخلص خميرة و 10 mM كلوريد الصوديوم و 2.5 mM KCl و 10 mM MgCl2 و 10 mM MgSO4 و 20 mM جلوكوز.
    5. بعد التعافي على الجليد ، استعد الخلايا تماما عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية مع تقليب لطيف يبلغ 250 دورة في الدقيقة لمدة 30-60 دقيقة.
    6. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة 400 ميكرولتر من المادة الطافية ، تاركا ~ 50 ميكرولتر من البكتيريا إلى الطبق.
    7. يوضع على وسائط انتقائية ويحضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: تحتوي الوسائط الانتقائية المستخدمة في هذه التجارب على 1.0٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 1.0٪ كلوريد الصوديوم ، 1-2٪ أجار ، 96-97٪ ماء ، وكاربينيسيلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل. استخدم دائما سلالات البكتيريا الناقصة لإعادة التركيب لاستنساخ البلازميدات الفيروسية لأن التكرارات الطرفية المقلوبة الفيروسية (ITRs) لها تسلسلات متطابقة ويمكن أن تخضع لإعادة التركيب المتماثل. ومع ذلك ، لا تزال سلالات البكتيريا تخضع لمستويات منخفضة من إعادة التركيب. وبلازميد المراسل المستخدم هنا هو AAV مكمل ذاتيا، حيث تم تغيير تسلسل أحد لوائح الاتصالات الدولية ولم يعد يتطابق تماما مع لوائح الاتصالات الدولية الأخرى. يوصى أيضا بزراعة البكتيريا عند 30 درجة مئوية لزيادة إبطاء معدل إعادة التركيب المتماثل.
  7. تحقق من الحيوانات المستنسخة واستعادة البلازميدات.
    1. قم بإعداد مزيج PCR الرئيسي باستخدام مواد أولية أمامية وخلفية (جدول المواد) تلتصق بالمتجه ، وتحيط بموقع الإدراج. القسمة 10 ميكرولتر في أنابيب شريطية PCR 0.2 مل.
    2. في أنابيب مستديرة القاع سعة 14 مل ، قم بإعداد 5 مل من مرق LB الانتقائي للمضادات الحيوية ، واحد لكل مستعمرة يتم اختبارها عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحكم السلبي.
    3. استخدم عود أسنان معقم أو طرف ماصة لاختيار مستعمرة فردية وكشط المستعمرة تقريبا في قاع أنبوب PCR واحد.
    4. عندما تنفصل المستعمرة إلى مزيج PCR الرئيسي ، قم بإسقاط عود الأسنان أو الطرف في أحد حصص LB وقم بتسمية الأنبوب سعة 14 مل بتفاعل جيبسون ورقم أنبوب PCR.
    5. ضع تفاعلات PCR للمستعمرة على جهاز تدوير حراري وقم بالدورة مع البرنامج الموضح في الجدول 2.
    6. احتضان المزارع السائلة سعة 5 مل الملقحة بأعواد الأسنان أو أطراف الماصة في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
    7. قم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة على 0.7٪ -1٪ من هلام الأغاروز عند 100 فولت لمدة 30-60 دقيقة وتصور النطاقات في نظام تصوير هلام دوك.
    8. تجاهل مزارع 5 مل التي لا تعرض نطاق PCR المتوقع.
    9. لكل استنساخ مدمج بنجاح ، اسمح لمزارع 5 مل بالنمو بين عشية وضحاها ثم قم بإجراء تحضير صغير للبلازميد من 4.5 مل باستخدام مجموعة تجارية. احتفظ ب 0.5 مل من الثقافة السائلة ووفر عند -80 درجة مئوية كمخزون من الجلسرين.
    10. تأكد من أن جينات التحوير الموجودة داخل البلازميدات خالية من الطفرات غير المرغوب فيها باستخدام تسلسل سانجر42.
    11. بعد التأكد من استنساخ بنية المراسل بنجاح ، استخدم مخزون الجلسرين المحفوظ لتلقيح ثقافة بداية 5 مل وتنمو لمدة 8-16 ساعة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
    12. بمجرد أن يصبح المرق غائما ، قم بتخفيف ثقافة البداية 1000 مرة في 250-300 مل من مرق LB الانتقائي الطازج واحتضانه طوال الليل على الأقل في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. ثم قم بتنقية البلازميد باستخدام مجموعة ماكسي بلازميد تجارية.
      ملاحظة: ستنمو البكتيريا بشكل أبطأ عند 30 درجة مئوية مقارنة ب 37 درجة مئوية ، ولكن هذه هي أفضل درجة حرارة لإبطاء معدل إعادة التركيب التلقائي عند زراعة مزارع كبيرة.
    13. إجراء خلاصة XmaI لاختبار إعادة تركيب لوائح الاتصالات الدولية باستخدام الخطوات 1.4.2-1.4.5 ، مع استبدال XmaI بدلا من PacI و AscI. تصور العصابات على نظام تصوير هلام دوك.
      ملاحظة: سينتج عن بلازميد rAAV مع وجود كل من ITRs شريطين على هلام بعد هذا الملخص: أحدهما طول جينوم rAAV والآخر طول بقية العمود الفقري للبلازميد. وإذا كان هناك نطاق واحد فقط، فإن لوائح الاتصالات الدولية قد خضعت لإعادة تركيب متماثلة، ولن يكون بلازميد rAAV قادرا على تعبئة الجسيمات الفيروسية. وقد صمم العمود الفقري للبلازميد rAAV الموصوف هنا بحيث لا توجد مواقع XmaI إلا في لوائح الاتصالات الدولية. إذا كان إدراج مرشح المحسن يحتوي أيضا على أي مواقع XmaI، فقم بتحديث نتائج النطاق المتوقعة وتحليلها وفقا لذلك.

2. الحصول على rAAV المعبأة.

  1. استخدم rAAV المعبأ (بشكل احترافي أو داخلي) للتجارب في هذه الدراسة.
    ملاحظة: هناك العديد من الخيارات لتغليف rAAV. يمكن تعبئة rAAV بشكل احترافي في شركة أو منشأة جامعية أساسية. يمكن أيضا تعبئة rAAV داخليا باستخدام تقنيات مختلفة تتراوح في التعقيد والحاجة إلى معدات متخصصة43,44. الشاغل الرئيسي هو الحصول على ناقل عالي الجودة وأن عيار العدوى قد تم تحديده بدرجة عالية من اليقين. تم استخدام كل من rAAVs المعبأة بشكل احترافي ومعبأة داخليا في تجارب مختلفة موصوفة في هذه الدراسة.

3. حقن البلازميد المعبأ داخل الجمجمة rAAV في الفئران حديثي الولادة.

  1. تحضير خليط rAAV للتسليم.
    1. إذا كان القصد هو مقارنة أنماط التعبير بين فيروسات مراسل محسن مختلفة ، فقم بمعادلة عيار جميع الفيروسات المراد مقارنتها عن طريق تخفيف الكل لمطابقة الفيروس الأقل تركيزا.
    2. امزج معا نسبة 2: 1 أو 3: 1 من فيروس المراسل المحسن وفيروس المراسل الضابط المعبر عنه بشكل أساسي وأضف كمية صغيرة (تركيز نهائي 0.06٪) من صبغة Fast Green.
      ملاحظة: Fast Green هي صبغة تستخدم على نطاق واسع في حقن التجارب ، بما في ذلك AAV ، لتصور موقع الحقن أثناء الإجراءوبعده مباشرة 45،46،47،48. في حين أن هذه خطوة مهمة لضمان الجودة ، فمن الممكن أن تتداخل إضافة الصبغة مع النقل. قد تكون إعادة النظر في استخدام صبغة الحقن مهمة لتحسين البروتوكول في بعض الحالات. يعد فيروس التحكم المدفوع بشكل أساسي أمرا بالغ الأهمية لمقارنة الحقن المستقلة. ستختلف حقن الفيروس في موقع ومدى النقل من إلى آخر. ستمكن المكافحة التأسيسية من استبعاد الحقن الفاشلة من التحليل وتوفر معيارا لتطبيع التباين في توصيل الفيروس.
    3. اكسر طرف ماصة زجاجية معقمة مسحوبة مصنوعة من أنبوب شعري مدرج ميكرولتر عن طريق ثقبه برفق من خلال منديل دقيق معقم عن طريق نقعه في 70٪ من الإيثانول وتركه يجف تماما. ثم أدخل الماصة الزجاجية المسحوبة في مجموعة الشافطة التي تتكون من جهاز لتطبيق الضغط متصل بأنبوب مطاطي بطول 15 بوصة ينتهي بحشية مطاطية لحمل ماصة شعرية دقيقة.
      ملاحظة: قد يكون "جهاز الضغط" حقنة أو لسان حال. إذا كان سيتم استخدام حقنة ، فسيطلب من شخص ثان الضغط من خلال المحقنة بينما يتلاعب المجرب بالماصة في يد والحيوان في اليد الأخرى. في حالة استخدام لسان حال ، مما يتيح للمجرب التحكم الدقيق في كل من مواضع الحيوان والماصة والضغط المطبق على المحقنة ، يلزم توخي مزيد من الحذر لتجنب تلوث الفيروس.
    4. قم بتطبيق ضغط سلبي من خلال مجموعة الشافطة لسحب حجم صغير (~ 0.2-0.5 ميكرولتر) من الزيت المعدني في الماصة الزجاجية.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة جدا لتوفير حاجز لمنع الجسيمات الفيروسية المتطايرة من تلويث مجموعة الشفاط.
    5. ضع مجموعة الشافطة المعدة جانبا واحتفظ بالفيروس على الجليد حتى يصبح جاهزا للحقن.
  2. تخدير الفئران حديثي الولادة بالتبريد في طبق بلاستيكي جاف مغمور جزئيا في الثلج حتى توقف منعكس انسحاب الدواسة (~ 5 دقائق). تأكد من أن الفئران ليست على اتصال مباشر مع الجليد.
  3. استخدم الضغط السلبي من خلال مجموعة الشافطة لسحب خليط الفيروس إلى الماصة الزجاجية المسحوبة حتى يتجاوز الغضروف المفصلي علامة التجزئة 2 ميكرولتر.
  4. أخرج الماوس من الغرفة الباردة وضعه على سطح الطاولة. حدد موقع مواقع الحقن الثنائية في منتصف الطريق بين لامدا وبريجما وفي منتصف الطريق بين الخيط السهمي وكل عين. عقم كلتا المنطقتين بمناديل كحولية.
  5. استخدم الماصة الزجاجية المسحوبة لاختراق جمجمة الفئران حديثي الولادة وتطبيق الضغط الإيجابي برفق من خلال مجموعة الشافطة عندما تدخل الإبرة إلى الدماغ. مشاهدة الغضروف المفصلي لخليط الفيروس. ستنخفض مقاومة الضغط المطبق عندما يصل طرف الماصة إلى البطين الجانبي. استغني عن 1 ميكرولتر من الفيروس ، واسحب الماصة ، وكرر للبطين الجانبي الآخر.
  6. ضع الماوس على وسادة التدفئة أو غرفة التدفئة للتعافي. بمجرد أن تستيقظ وتنشط ، أعد الحيوان إلى قفص منزله.

4. جمع الأنسجة وإجراء الكيمياء المناعية.

  1. بعد مرور وقت كاف بعد نقل الفيروس ، تخدير الفئران والتضحية عن طريق التروية عبر القلب.
    ملاحظة: تسمح العديد من التجارب ، بما في ذلك النتائج التمثيلية الموضحة هنا ، بفترة 4 أسابيع أو أكثر لانتقال الفيروس. ومع ذلك ، يمكن أن تظهر AAVs التكميلية ذاتيا تعبيرا قويا في وقت مبكر من 7 أيام12. قد تحتاج فترة الحضانة المطلوبة إلى التحسين اعتمادا على تقنيات وأهداف تجريبية محددة.
    1. تحضير مضخة تمعجية مع أنابيب التسريب في الوريد وإبرة 25 غرام.
    2. تحضير 1x PBS و 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ووضعها على الجليد.
    3. ضع طرف السحب للأنبوب في برنامج تلفزيوني 1x بارد. اضبط معدل التدفق (2.5 مل / دقيقة لفئران P7 ، 3.5 مل / دقيقة لفئران P28) وقم بتشغيل المضخة حتى يتم سحب المخزن المؤقت بالكامل عبر الأنبوب ويتم تطهيره من الفقاعات. ضع الإبرة جانبا حتى تصبح جاهزة للتروية.
    4. داخل غطاء الدخان ، ماصة كمية صغيرة من isoflurane على منشفة ورقية في الجزء السفلي من غرفة جرة قطرة. ضع الماوس الذي تم حقنه مسبقا على شبكة فوق المنشفة الورقية ، مع التأكد من عدم ملامسته مباشرة للإيزوفلوران. أغلق الغرفة لتخدير الماوس. انتظر لمدة ~ 5 دقائق ثم افتح الغرفة وتحقق من منعكس سحب الدواسة. المضي قدما بمجرد أن يكون الحيوان فاقدا للوعي.
      ملاحظة: طوال فترة التروية ، يجب الحفاظ على الماوس على إيزوفلوران مع مخروط الأنف لمنع استعادة الوعي.
    5. استخدم المقص الجراحي لفتح بطن وصدر الفأر ، وإزالة القفص الصدري وفضح القلب.
    6. استخدم زوجا من مقص القزحية الصغير لعمل شق صغير في الأذين الأيمن للفأر ، وأدخل إبرة IV في البطين الأيسر ، وقم بتنشيط المضخة التمعجية.
    7. قم بتخلل الحيوان مع 1x PBS المثلج حتى يصبح الدم الذي يتدفق من الشق في الأذين الأيمن واضحا. يعد تطهير أنسجة الدم أمرا مهما للغاية لأن خلايا الدم الحمراء لها تألق ذاتي ، وقد تضعف الأوعية الدموية القدرة على تصوير الخلايا التي تعبر عن المراسل.
    8. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا وانقل أنبوب السحب من PBS إلى 4٪ PFA. أعد تنشيط المضخة واستخدم 1 مل / جم من وزن الجسم ، ~ 25 مل للفأر البالغ.
      ملاحظة: يجب أن تكون هزات التثبيت قابلة للملاحظة ، ويجب أن يتصلب جسم الماوس.
  2. تشريح وبعد إصلاح الدماغ.
    1. قم بإزالة رأس الماوس بمقص جراحي.
    2. باستخدام مقص جراحي صغير ، ابدأ من قاعدة الجمجمة وقم بعمل شق على طول خط الوسط من الرأس واسحب الجلد والأنسجة الكامنة لكشف الجمجمة.
    3. باستخدام مقص القزحية ، قم بقص الجزء الخلفي من الجمجمة بعناية ، بدءا من الثقبة العظمى واستمر صعودا نحو الخيط السهمي وعلى طوله حتى يتم تمرير المصابيح الشمية.
    4. أدخل المقص في الجمجمة فوق المصابيح الشمية وقم بعمل قطعتين أفقيتين في الجمجمة. اصنع زوجا مشابها من الجروح الأفقية في العظم القذالي. تخلق القطع الأفقية وخط الوسط زوجا من اللوحات الشبيهة بالباب في الجزء العلوي من الجمجمة.
    5. قشر اللوحات من الجمجمة لفضح الدماغ بالكامل. استخدم زوجا من الملقط لفصل المصابيح الشمية من الجمجمة وقطع الأعصاب القحفية ، وتحرير الدماغ من الجمجمة.
    6. قم بإسقاط الدماغ في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 3-5 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني. بعد الإصلاح 6 ساعات إلى بين عشية وضحاها. لا تفرط في إصلاح الأنسجة.
  3. تحضير العقول للتشريح بالتبريد.
    1. انقل الدماغ الثابت إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل مع 12-14 مل من السكروز بنسبة 30٪ في برنامج تلفزيوني للجفاف. احتضان عند 4 درجات مئوية حتى يغرق الدماغ في قاع الأنبوب (2-3 أيام).
    2. اغمر الدماغ الثابت والمجفف في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في قالب تبريد 15 مم × 15 مم × 5 مم. أضف OCT حتى يتم تغطية الدماغ بالكامل.
    3. ضع cryomold على كتلة من الثلج الجاف وقم بتجميد العينة في كتلة صلبة من OCT (~ 5 دقائق).
      ملاحظة: يمكن تخزين كتل OCT عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر إلى سنوات.
    4. قم بتسمية cryomold باسم العينة واتجاه الدماغ.
  4. الحصول على المقاطع الإكليلية باستخدام ميكروتوم cryostat.
    1. ضع علامة على اتجاه الدماغ على كتلة OCT بالقلم الرصاص وقم بإزالة الكتلة من cryomold داخل cryostat.
    2. ضع كتلة OCT بحيث يتم توجيه الدماغ مع المصابيح الشمية التي تواجه شفرة cryostat والتمسك الكتلة بحامل الكائن من cryostat مع بعض OCT الطازجة.
    3. بمجرد تجميدها في مكانها ، ابدأ في قطع أقسام 50 ميكرومتر من خلال الكتلة باتباع الخطوات 4.4.4-4.4.6.
    4. لا تستخدم اللوحة المضادة للانقلاب. سوف تتجعد الأقسام إلى لفات ضيقة عند قطعها وستتجمع إما أعلى الكتلة أو تسقط أسفلها في صينية التجميع.
    5. شاهد شكل الكتلة في التخفيضات القليلة الأولى التي يتم إجراؤها. قم بإجراء تخفيضات رأسية عبر الكتلة ، مما ينتج عنه وجه متساو عند البدء في القطع. اضبط الزاوية باستخدام أذرع ضبط العينة إذا لزم الأمر.
    6. عندما تكون المصابيح الشمية مرئية ، انتبه جيدا لشكل الأقسام. إذا ظهر أحدهما أكبر من الآخر ، تكون الجروح بزاوية بالنسبة للدماغ ، ومن الضروري تصويب اتجاه الدماغ ضد الشفرة باستخدام أذرع ضبط العينة.
      ملاحظة: في حالة القطع بشكل مستقيم ، يجب أن تبدأ القشرة في الظهور فوق كل بصلة شمية في نفس الوقت.
    7. بمجرد تقسيم البصلة الشمية وظهور أنسجة المخ المنضدية ، قلل سمك القطع إلى 30-35 ميكرومتر وابدأ في جمع الأقسام العائمة. اتبع الخطوات 4.4.8-4.4.13 لتقسيم الدماغ.
    8. قم بتنظيف جميع الأقسام السابقة من الكتلة وحامل الكائن بحيث تسقط في درج التجميع. قم بتنظيفها على جانب واحد من الدرج واحتفظ بها منفصلة. إذا كانت الكومة كبيرة جدا ، فقم بإفراغ الدرج.
    9. قم بتوزيع 1 مل من PBS في كل بئر من لوحة 24 بئر. تسمية 1 صف لكل دماغ.
    10. قطع 6 أقسام إكليلية. استرجع الأقسام باستخدام ملاقط باردة ورتبها على مرحلة cryostat. كرر هذه الخطوة 2 أو 3 مرات ، مع إبقاء المجموعات المكونة من 6 أقسام منفصلة.
    11. بلل فرشاة الرسم مقاس 000 باستخدام برنامج تلفزيوني وامسح السائل الزائد على منديل أو منشفة ورقية خالية من النسالة. استخدم فرشاة الرسم لالتقاط كل قسم برفق ، واحدا تلو الآخر ، ووضعه في الآبار المناسبة للوحة البئر 24.
    12. ضع أحد الأقسام الستة من مجموعة الشرائح في كل بئر من الآبار الستة في صف من لوحة البئر ال 24. هذا يضمن أن كل بئر يحتوي على أقسام تمثيلية تمتد على المنطقة المقسمة من الدماغ.
    13. استمر في التقسيم في مجموعات من 6 حتى يتم تقسيم النهاية الذيلية للقشرة الدماغية.
    14. للتخزين ، أغلق لوحة البئر 24 باستخدام البارافيلم وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: المقاطع مستقرة لمدة 1-2 أشهر عند 4 درجات مئوية. يمكن استخدام محلول PBS مع 0.1٪ أزيد الصوديوم لمنع نمو البكتيريا وإطالة العمر الافتراضي للأقسام. ومع ذلك ، إذا كان سيتم تخزين الأقسام لمدة تزيد عن شهرين ، فيجب وضعها في محلول واقي من البرودة وتجميدها عند -20 درجة مئوية للحصول على أفضل النتائج.
  5. إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتضخيم إشارة الجينات المراسل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات باستثناء استرجاع المستضد باستخدام التحريض اللطيف إلى المتوسط (~ 100 دورة في الدقيقة) على شاكر مدالي. للحفاظ على التألق الأصلي لمراسل التحكم (mRuby3) ، يجب حماية جميع الخطوات من الضوء قدر الإمكان.
    1. قم بإعداد المخازن المؤقتة اللازمة كما هو موضح في الجدول 3.
    2. قم بإعداد لوحة بئر جديدة مكونة من 24 صفا واحدا لكل دماغ ملطخ. في العمود الأول من الآبار ، أضف 1 مل من PBS إلى كل بئر.
    3. باستخدام فرشاة طلاء بحجم 000 ، انقل برفق 1 بئر من الأقسام من بئر المجموعة الأصلية إلى PBS الطازج في لوحة البئر 24 الجديدة لشطف سريع لإزالة مركب OCT المتبقي.
    4. أضف 1 مل من ARB إلى البئر التالي في لوحة البئر 24 وانقل الأقسام إلى هذا البئر. احتضان في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    5. اترك الطبق يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
    6. أضف 1 مل من PB إلى البئر التالي وانقل الأقسام إلى هذا البئر. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
    7. أضف 500 ميكرولتر من BB إلى البئر التالي وانقل الأقسام إلى هذا البئر. احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
    8. أضف 2 مل من WB إلى BB ثم ماصة ~ 2 مل من المحلول وتخلص منها ، تاركا محلول BB مخففا في البئر. كرر حتى تصبح الأقسام مرئية بوضوح.
    9. تمييع الجسم المضاد الأساسي (الدجاج IgY anti-GFP ، 1: 1000) في BB. أضف 350-500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى البئر التالي وانقل الأقسام إلى هذا البئر. أغلق الطبق بالبارافيلم واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    10. قم بتخفيف BB باستخدام WB كما تم سابقا حتى تصبح الأقسام مرئية بوضوح.
    11. أضف 1 مل من WB إلى البئر التالي وانقل الأقسام إلى هذا البئر. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
    12. قم بإزالة ~ 800-900 ميكرولتر من المخزن المؤقت وتجاهله. أضف 1 مل من WB الطازج واحتضان 20 دقيقة. استبدل 1 مل من WB 4 مرات أخرى ليصبح المجموع 5 غسلات ، 20 دقيقة لكل منهما.
    13. تمييع الجسم المضاد الثانوي (حمار مكافحة الدجاج اليكسا فلور 488 مترافق ، 1: 500) في BB. أضف 350-500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى بئر جديد. احتضان في RT لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
      ملاحظة: هذا هو البئر السابع ، لذلك إذا تلطيخ أقسام من أكثر من 2 أدمغة ، فستكون هناك حاجة إلى لوحة جديدة في هذه المرحلة.
    14. تمييع BB مع البنك الدولي كما في السابق ونقل الأقسام إلى بئر جديدة مليئة 1 مل من البنك الدولي. اغسل الأقسام كما تم سابقا لمدة 20 دقيقة 3 مرات.
    15. قم بإعداد حل عملي ل DAPI في PBS (التركيز النهائي 0.04-0.8 ميكروغرام / مل). حماية الحل من الضوء.
    16. أضف 1 مل من محلول DAPI إلى البئر التالي وانقل الأقسام إلى هذا البئر. احتضان في RT لمدة ~ 5 دقائق.
    17. انقل الأقسام مرة أخرى إلى WB وقم بتركيبها برفق على شرائح المجهر باستخدام فرشاة رسم مقاس 000. اترك الشرائح تجف في الهواء.
    18. ضع أغطية مع وسائط تركيب مناسبة. اسمح للشرائح بالعلاج في RT في الظلام طوال الليل.

5. تصوير وتحليل أقسام أنسجة المخ لنشاط محسن.

  1. استخدم عدسة موضوعية منخفضة التكبير (5x) لتسجيل صور مضان تمتد عبر قسم الدماغ.
  2. حدد موقع الحقن وقم بتقييم مدى انتقال الفيروس بناء على كثافة وشدة الخلايا الفلورية الحمراء. احرص على مقارنة الحيوانات التي تم تحويلها بالمثل.
  3. سجل صورا فلورية مفصلة باستخدام عدسة موضوعية تكبير أعلى (≥25x) إذا رغبت في ذلك.
    ملاحظة: تأكد دائما من استخدام نفس الإعدادات لمعلمات الاكتساب مثل شدة ضوء الإثارة والمرشحات ووقت التعرض بين العينات المراد مقارنتها.
  4. معالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور.
    ملاحظة: يمكن إجراء المعالجة في أي حزمة برامج لتحليل الصور. الخطوات التالية هي اقتراحات لتحديد ما إذا كان التسلسل يعمل كمحسن في سياق بناء المراسل (سؤال نعم أو لا) باستخدام توزيع فيجي مفتوح المصدر ل ImageJ. قد يكون القياس الضوئي الأكثر تعمقا مناسبا عند مقارنة درجات النشاط بين متغيرات المحسن. يجب دائما معالجة الصور من عينات مختلفة باستمرار حتى تتم مقارنتها.
    1. تطبيق المرشحات للحد من الضوضاء. في فيجي ، حدد خيار Despeckle ضمن قائمة Process > Noise .
      ملاحظة: هذا مرشح متوسط 3 × 3.
    2. اطرح مضان الخلفية باتباع الخطوات 5.4.3-5.4.6.
    3. افصل بين قنوات صورة متعددة القنوات. في فيجي ، حدد الخيار تقسيم القنوات ضمن قائمة > الصورة اللون .
    4. استخدم أداة تحديد المستطيل أو الدائرة لرسم شكل صغير في منطقة من الصورة لا تحتوي على أي خلايا فلورية وقياس متوسط كثافة البكسل للخلفية باستخدام Analyse > Measure. كرر لأخذ عينات من مناطق متعددة.
      ملاحظة: تأكد من تحديد متوسط القيمة الرمادية في القائمة تحليل > تعيين القياسات .
    5. متوسط القيمة الرمادية المتوسطة من 5-8 مناطق من الخلفية وإسقاط الفاصلة العشرية. اطرح هذه القيمة من كل بكسل في الصورة باستخدام العملية > الرياضيات > طرح.
      ملاحظة: قد يؤدي التقريب إلى أقرب عدد صحيح إلى المبالغة في تقدير الخلفية المراد طرحها. من الأكثر تحفظا إسقاط الفاصلة العشرية ببساطة. على سبيل المثال ، سيتم تقريب 6.4 إلى 6 ، ولكن يجب أيضا تقريب 6.5 إلى 6 لتجنب خطر طرح 0.5 وحدة من الإشارة الحقيقية من كل بكسل.
    6. إذا رغبت في ذلك ، ادمج القنوات مرة أخرى في صورة متعددة القنوات. في فيجي، استخدم > الصور الملونة > دمج القنوات.
    7. قم بتجميع أي صور متداخلة معا. في فيجي ، استخدم الإضافات > خياطة > خياطة الشبكة / المجموعة.
    8. اضبط السطوع والتباين. في فيجي، استخدم Image > ضبط > السطوع/التباين.
      ملاحظة: استخدم دائما نفس القيم الدنيا والقصوى لكل صورة لتتم مقارنتها.
    9. احسب عدد خلايا الفلورسنت الخضراء باتباع الخطوات 5.4.10-5.4.12. هذه هي الخلايا التي تمكن فيها تسلسل محسن المرشح من دفع تعبير المراسل.
    10. ابدأ بإخفاء القناة الخضراء واستخدم أداة التحديد الحر لرسم شكل حول منطقة الدماغ يعبر عن التألق الأحمر. باستخدام وظيفة القياس في فيجي ، قم بقياس المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية للقناة الحمراء في هذه المنطقة.
    11. باستخدام أداة التحديد متعدد النقاط ، احسب عدد الخلايا الخضراء في هذه المنطقة.
    12. تطبيع عدد الخلايا الخضراء من خلال الكثافة المتكاملة للقناة الحمراء. سطوع القناة الحمراء المحلية هو مقياس بديل لحجم التعرض للفيروس ، مما يتيح مقارنة نشاط المحسن بين الحيوانات المختلفة المحولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذه الطرق ، تم اختبار تسلسل 915 bp في الإنترون الثالث المرتبط بالمخاطر النفسية للجين CACNA1C19،49،50 لنشاط محسن في دماغ الفأر بعد الولادة. تم اكتشاف هذا التسلسل في MPRA من 345 تسلسلا محسنا مرشحا يركز على المخاطر النفسية والعصبية SNPs12 ويتم وصف تجارب التوصيف هنا كمثال عام. تم حقن الفئران C57BL / 6 في P0 مع بنية AAV9 معبأة كناقل مكمل ذاتيا51 يحتوي على EGFP تحت سيطرة المروج الأدنى Hsp68 وتسلسل محسن مرشح واحد (الشكل 3A). تم حقن فئران إضافية بتركيبات تحتوي على تسلسل تحكم سلبي كان من المتوقع ألا يكون له أي نشاط تنظيمي (الشكل 3 ب). تم تطبيع التتر الفيروسي لهذه التركيبات إلى 6.85 ×10 10 vg / mL. تم حقن جميع الفئران المحقونة بشكل مشترك مع بنية معبأة AAV9 تحتوي على mRuby3 تحت سيطرة مروج CAG التأسيسي لتصور المنطقة التي تم تحويلها بنجاح والتحكم في التباين المحتمل في الموقع وانتشار العدوى. تم جمع الأدمغة في يوم ما بعد الولادة (P) 28 للكيمياء المناعية والتصوير. أكدت هذه التجارب أن منطقة المحسن المرشحة هذه في CACNA1C قادت التعبير عن EGFP في دماغ الفأر P28 (الشكل 3A) ، في حين أن تسلسل التحكم السلبي لم يفعل ذلك (الشكل 3B). توضح هذه النتائج تطبيق مقايسات المحسن والمراسل في دماغ الفأر ، مما يتيح دراسة المعززات في الحياةأثناء الظروف التي لا يمكن تلخيصها باستخدام النماذج التقليدية في المختبر.

يمكن أيضا استخدام هذه الطرق لاختبار مكتبات تسلسلات محسن المرشح للنشاط باستخدام طرق التسليم المستندة إلى AAV ، كما هو الحال في MPRAs. توضح الصور التمثيلية لتعبير المراسل المستند إلى المكتبة في عيارات مختلفة مرونة هذا الفحص وتأثير العيار الفيروسي على كفاءة النقل. تؤدي المستحضرات الفيروسية عالية العيار (الشكل 4 أ) مقابل العيار المنخفض (الشكل 4 ب) إلى اختلافات في كمية الخلايا المحولة ، كما يتضح من كل من تعبير mRuby3 للتحكم الإيجابي المدفوع بمروج CAG وتعبير EGFP المنتج من مكتبات المحسن المرشح في دماغ الفأر بعد الولادة. هناك حالات قد يفضل فيها إما العيار العالي والتحويل الواسع أو العيار المنخفض والنقل المتناثر.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. تتضمن العناصر الرئيسية لهذا الفحص عنصر محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، واعتمادا على تصميم الفحص ، تسلسل الباركود لوضع العلامات الفريدة. يتم استنساخ هذه العناصر في العمود الفقري البلازميد AAV وتعبئتها في AAV. يتم تسليم الفيروس إلى الحيوان ويترك لاحتضانه لعدة أيام أو أسابيع. أخيرا ، يتم جمع الأنسجة ذات الاهتمام ويتم التحقق من نشاط المحسن عن طريق التصوير أو التسلسل. يمكن أن ينتج التعبير الجيني المحوري المدفوع بالمحسن تعبيرا ذا خصوصية من نوع الخلية والإقليمية والزمنية ، على عكس الدوافع التأسيسية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: المرونة في تصميم الفحص . (أ) يمكن أن يضع اتجاه البلازميد المحسن في المنبع للحد الأدنى من المروج أو المصب لجين المراسل ، كما هو الحال في STARR-seq28. بالنسبة للقراءات القائمة على التسلسل ، يتم تضمين رمز شريطي في اتجاه مجرى جين المراسل ، أو يمكن أن يكون المحسن بمثابة رمز شريطي خاص به في الاتجاه الثاني. (ب) تشمل تقنيات التوصيل الفيروسي الشائعة إلى الدماغ الحقن داخل الجمجمة أو الحقن خلف الحجاج أو حقن الوريد الذيلي ، والتي قد تؤدي إلى كثافات مختلفة للخلايا المنقولة في الأنسجة المختلفة. (ج) يمكن أن تكون القراءات قائمة على التسلسل أو التصوير. في القراءات القائمة على التسلسل ، يتم تعريف نشاط المحسن من خلال الزيادة النسبية لتسلسل الحمض النووي الريبي مقابل تسلسل الحمض النووي المدخل (التحكم في تسليم AAV). في قراءات التصوير ، يزداد التعبير عن جين المراسل حيث يكون المحسن نشطا. (د) تم تسليط الضوء على المعززات الداخلية المحتملة في الجين المرتبط بالمخاطر النفسية CACNA1C . في الصورة العلوية ، يتم اختيار منطقة واسعة تظهر ارتباطات قوية بالسمات والتفاعلات التي تم اختبارها بواسطة GWAS مع مروج CACNA1C عبر PLAC-seq20. في الجزء الداخلي ، يتم تحديد المناطق المرشحة الأصغر التي يتم حفظها تطوريا على مستوى التسلسل ، وهي في مناطق الكروماتين المفتوح ، وتظهر علامات جينية تدل على المعززات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: محسن في CACNA1C يقود تعبير EGFP في دماغ الفأر P28. (أ) يظهر الفأر الذي تم حقنه داخل الجمجمة عند P0 ببنية محسن - مراسل (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) والتحكم في الحقن المعبر عنه بشكل أساسي (AAV9-CAG-mRuby3) تعبير EGFP مدفوعا بالمحسن في الطبقات الوسطى السفلية من القشرة عند P28. (B) فأر تم حقنه عند P0 ببنية تحكم سلبية (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) ولا يظهر التحكم في الحقن تعبيرا عن EGFP عند P28. تم التقاط صور الدماغ بالكامل بتكبير 5x وتظهر الأجزاء الداخلية منظرا مكبرا للمنطقة المحاصرة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تظهر مكتبات المراسل المحسن التي يتم تسليمها بواسطة AAV من عيارات مختلفة نشاطا في دماغ الفأر. (أ) مكتبة AAV-PHP.eB المعبأة تجاريا وعالية العيار من المعززات المرشحة تقود تعبير EGFP الواسع في دماغ الفأر P7. (ب) مكتبة AAV9 ذات العيار المنخفض من المعززات المرشحة المترسبة من الوسائط المكيفة لخلايا التغليف تدفع تعبير EGFP المتناثر في دماغ الفأر P7. تم التقاط الصور بتكبير 5x. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مزيج تفاعل PCR
5x العازلة رد الفعل 10 ميكرولتر
dNTPs التركيز النهائي 200 ميكرومتر لكل منهما
استنساخ الاشعال التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر لكل منهما
قالب الحمض النووي 50 نانوغرام
بوليميراز عالي الدقة التركيز النهائي 0.02 وحدة / ميكرولتر
مياه خالية من النيوكلياز للوصول إلى حجم التفاعل النهائي 50 ميكرولتر
ظروف التدوير الحراري
30 دورة مما يلي: تلاحظ
درج درجة الحرارة الوقت
الانحراف 98 درجة مئوية 10 ثانية
صلب 60 درجة مئوية 20 ثانية قد تختلف درجة الحرارة المثلى بناء على الاشعال.
بسط 72 درجة مئوية 30 ثانية قد تختلف درجة الحرارة والمدة المثلى بناء على البلمرة.
التمديد النهائي 72 درجة مئوية 2 دقيقة قد تختلف درجة الحرارة والمدة المثلى بناء على البلمرة.
مسك 4 درجة مئوية

الجدول 1: مزيج تفاعل PCR وظروف ركوب الدراجات الحرارية.

ظروف التدوير الحراري
30 دورة مما يلي: تلاحظ
درج درجة الحرارة الوقت
تحلل الخلايا 98 درجة مئوية 5 دقائق
الانحراف 98 درجة مئوية 10 ثانية
صلب 55 درجة مئوية 15 ثانية قد تختلف درجة الحرارة المثلى اعتمادا على الاشعال.
بسط 72 درجة مئوية 30 ثانية قد تختلف درجة الحرارة والمدة المثلى اعتمادا على البلمرة.
مسك 4 درجة مئوية

الجدول 2: ظروف التدوير الحراري لمستعمرة PCR.

مخازن للكيمياء المناعية
مخزن مؤقت تكوين
1x برنامج تلفزيوني 137 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 2.7 مللي متر KCl ، 10 مللي متر Na2HPO4 ، 1.8 مللي متر KH2PO4
1x سيترات مستضد استرجاع العازلة (ARB) ، درجة الحموضة 6.0 الملكية ، انظر جدول المواد
المخزن المؤقت للنفاذية (PB) 1x PBS + 0.5٪ تريتون X100
العازلة للغسيل (WB) 1x PBS + 0.1٪ تريتون X100
حظر المخزن المؤقت (BB) WB + 5٪ حليب

الجدول 3: المخازن المؤقتة للكيمياء المناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على rAAV لنشر جينات التحوير التي يحركها المحسن في دماغ الفأر بعد الولادة. في هذا البروتوكول المعمم ، يتم استنساخ محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، وتسلسل باركود اختياري في العمود الفقري البلازميد AAV. يمكن إجراء هذه التجارب باستخدام تسلسل محسن مرشح واحد أو باستخدام العديد من التسلسلات بالتوازي. يتم تعبئة البلازميد في rAAV وتسليمه إلى دماغ الفأر بعد الولادة. بعد فترة من الوقت للسماح بنقل الفيروس ، يتم جمع الدماغ وتصويره للتعبير الجيني للمراسل. يتم تضمين فيروس المراسل المعبر عنه بشكل أساسي (CAG-mRuby3) كعنصر تحكم بالحقن. باستخدام هذا الفحص ، تظهر عناصر المحسن لدفع نسخ EGFP في دماغ الفأر ، مما يدل على نشاط المحسن في الجسم الحي.

تشمل الأهداف الأساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسين هذا الفحص العيار الفيروسي وتقنية الحقن والإطار الزمني للنقل. يمكن أن يكون للعيار الفيروسي المختلف تأثير قوي على كثافة الخلايا المحولة. في حين أن كفاءة النقل الأعلى من المحتمل أن تكون مفضلة لمعظم الأبحاث ، فإن المستوى الأمثل للتحويل يعتمد بشكل كبير على الأهداف التجريبية. توفر الحقن داخل الجمجمة كثافة عالية من الخلايا المحولة ، ولكن من المحتمل أن تكون أكثر تركيزا في موقع الحقن ، على الرغم من أن انتشار العدوى قد يعتمد على النمط المصلي الفيروسي وعمر الحيوان52. قد تظهر الحقن خلف الحجاج توزيعا أكثر توازنا للخلايا المنقولة في جميع أنحاء الدماغ ولكنها أقل عرضة لإعطاء أي منطقة عالية العدوى. يمكن لحقن الوريد الذيل أن تنقل الأنسجة الأخرى بشكل أكثر فعالية بالإضافة إلى الدماغ ولكن من المحتمل أن تعطي كثافة أقل من الخلايا المنقولة في الدماغ. وبالمثل ، يمكن لمجموعة متنوعة من الأطر الزمنية لنقل الفيروسات في الدماغ أن تخدم أغراضا مختلفة. يمكن أن يحدث تعبير scAAV القوي في الدماغ في وقت مبكر بعد سبعة أيام من الحقن داخل الجمجمة ، على الرغم من أن فترات 28 يوما أو أكثر تستخدم بشكل أكثر شيوعا وتنتج تعبيرا قويا. نظرا لأن المعززات يمكن أن تكون محددة زمنيا في نشاطها ، فمن المهم مراعاة النشاط المتوقع للمحسنات المختبرة عند تحديد تصميم الدراسة.

هناك بعض القيود المرتبطة بهذه الأساليب التي قد تجعل الخيارات الأخرى خيارا أكثر ملاءمة ، اعتمادا على الأهداف التجريبية. نظرا لأن AAVs تظهر اندماجا منخفضا في الجينوم ، يتم تحويل الأنسجة بشكل أكثر فاعلية عندما تكون ناضجة وهناك كثافة عالية من الخلايا بعد الانقسام ، حيث أن كمية كبيرة من انقسامات الخلايا المستمرة ستقلل من كثافة الخلايا المعبرة عن الجينات المحورة. بالنسبة للتوصيل الفيروسي لجين التحوير إلى نموذج أقل نضجا ، مثل الأنسجة التي لا تزال تنمو ، قد تكون الفيروسات العدسية خيارا أكثر ملاءمة ، لأنها تندمج في الجينوم وسترثها جميع الخلايا الوليدة للخلية المتكاثرة المتحولة. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن مقايسة المراسل الموصوفة هنا هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع للدراسة الوظيفية للنشاط التنظيمي لرابطة الدول المستقلة ، إلا أنها لا يمكن أن تقدم صورة كاملة عن كيفية عمل العنصر التنظيمي ضمن سياقه الأصلي. على سبيل المثال ، لا يوفر هذا الفحص معلومات حول الجينات التي قد يستهدفها العنصر التنظيمي في الجينوم. ومع ذلك ، إذا كانت الجينات المستهدفة للمحسن معروفة ، فيمكن الاستفادة من هذه المعلومات لتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا التي تظهر التعبير في هذا الفحص هي نفسها المعروفة للتعبير عن الجينات المستهدفة للمحسن ، والتي من شأنها أن تضفي صلاحية بيولوجية عالية لتفسير النتائج. قد لا يلخص الفحص أيضا التأثيرات التي قد يحدثها التسلسل الجيني المحيط أو النشاط البيولوجي والسلوكي الطبيعي للحيوان على نشاط العنصر التنظيمي المختبر. أخيرا ، يصف هذا البروتوكول تصميم مقايسة المراسل STARR-seq ، حيث يتم استنساخ عنصر المحسن المرشح في اتجاه مجرى جين المراسل في ORF ، على عكس المنبع للمروج ، كما هو الحال في اتجاه استنساخ مقايسة المراسل التقليدي. قد يؤدي تضمين تسلسلات متغيرة طويلة في ORF لجين المراسل إلى انخفاض استقرار الحمض النووي الريبي بسبب عوامل مثل زخارف بروتين ربط الحمض النووي الريبي أو مواقع لصق بديلة أو محتوى GC المتغير 36,53 ، وقد تم تطوير طرق إحصائية لحساب التحيزات القائمة على التسلسل عند تحليل بيانات STARR-seq54,55. على الرغم من هذه الاعتبارات ، تم استخدام STARR-seq MPRAs على نطاق واسع في السنوات الأخيرة لتحديد العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة بنجاح 56،57،58،59. يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا بسهولة للاستخدام مع اتجاه MPRA التقليدي.

إن خصوصية نوع الخلية للمحسنات تجعل هذا الفحص أداة قوية في قيادة التعبير الخاص بنوع الخلية للجينات ذات الأهمية في الجسم الحي. يمكن أن تكون التقنيات الحالية للتعبير عن نوع الخلية المحدد للجين المطلوب محدودة بسبب توفر تركيبات التعبير الشرطي أو تتطلب توليد خطوط فأرة جديدة معدلة وراثيا. باستخدام نظام يحركه محسن قائم على rAAV ، يمكن التعبير عن الجين محل الاهتمام بطريقة محددة زمانية مكانية باستخدام معززات أو مروجين محددين لنوع الخلية تم التحقق من صحتها لدفع التعبير13،14،15. أظهرت التطورات الأخيرة في هذه التكنولوجيا أن الجمع بين المعززات الخاصة بنوع الخلية والأنماط المصلية rAAV مع الانتحاءات للخلايا أو الأنسجة ذات الأهمية يمكن أن يظهر خصوصية مماثلة للتعبير الجيني المحورة كما هو الحال في النماذج الحيوانية المحورة وراثيا60. يوفر هذا طريقة رخيصة وسريعة ويحتمل أن تكون عالية الإنتاجية لفحص التسلسل والحث المحدد للتعبير الجيني المحورة في الجسم الحي في النماذج الحيوانية.

هذه التكنولوجيا لديها أيضا إمكانات علاجية. وجدت الدراسات السريرية أن توصيل جين التحوير القائم على rAAV في الجسم الحي يمكن أن يحفز التعبير عن نسخ صحية من الجين في الحالات التي توجد فيها نسخة معيبة فقط ، أو لا يتم نسخ الجين بمعدل كاف61،62،63. إن اختيار عنصر محسن القيادة لديه القدرة على تمكين التسليم المعمم ولكن تحريض التعبير بطريقة خاصة بنوع الخلية. أخيرا ، فإن توصيل جين التحوير عبر rAAV يمنح أيضا فوائد كبيرة. تتمتع AAVs بمناعة أقل من الفيروسات الأخرى المستخدمة غالبا في توصيل الجينات المحورة64 ، مما يجعلها ناقلا فيروسيا آمنا محتملا للاستخدام السريري.

النشر المحدد لمقايسات المحسن والمراسل المستندة إلى الجسم الحي rAAV قابل للتخصيص ويمكن تعديله ليناسب مجموعة من الأهداف التجريبية. يمكن استهداف الأنسجة والخلايا المختلفة عن طريق اختيار الأنماط المصلية أو معززات AAV التي لها نوع الخلية أو الخصوصية الزمانية المكانية. في أي مكان من واحد إلى آلاف من بنيات المحسن والمراسل يمكن تسليمها في الجسم الحي ، ويمكن فحص النشاط باستخدام عدد من القراءات القائمة على التصوير والتسلسل ، كما هو موضح في مجموعة ناشئة من الدراسات باستخدام هذا النهج15،16،65،66،67،68 . تتيح مجموعة خيارات تصميم البناء والتسليم تعديل هذه التقنية لمجموعة متنوعة من الاستخدامات في كل من العلوم الانتقالية والأساسية ، مما يجعلها أداة جديدة قوية لأبحاث علم الجينوم وعلم الأعصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم إجراء التسلسل في مركز تقنيات الحمض النووي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. نشكر مختبر لين تيان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس على التدريب على تغليف rAAV وإهدائنا بسخاء مساعد AAV وبلازميدات مندوب / غطاء. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

علم الأعصاب، العدد 181،
نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في <em>الجسم الحي في</em> دماغ الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter