Summary
아폽토시스는 초기 및 후기 아폽토시스 바이오마커의 유세포 분석에 의해 특성화될 수 있다. 자궁경부암 세포주인 SiHa는 벤치탑 유세포 분석기를 사용하여 Actinomycin D로 처리한 후 세포자멸사 바이오마커를 분석했습니다.
Abstract
아폽토시스 바이오마커는 벤치탑 유세포 분석기를 사용하여 액티노마이신 D-처리된 SiHa 자궁경부암 세포에서 조사되었습니다. 세포 사멸의 초기 바이오마커(아넥신 V 및 미토콘드리아 막 전위)와 후기 바이오마커(카스파제 3 및 7, DNA 손상)를 실험 및 대조 배양에서 측정했습니다. 배양물은 5%CO2와 함께 37°C의 가습된 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션되었다. 그런 다음 트립신을 사용하여 세포를 분리하고 유세포 분석 세포 수 분석을 사용하여 열거했습니다. 세포는 아넥신 V 분석, 미토콘드리아 전기화학적 막횡단 전위 분석, 카스파제 3/7 분석, 및 DNA 손상 분석을 사용하여 세포자멸사에 대해 추가로 분석하였다. 이 기사에서는 세포자멸사 및 기존 유세포 분석에 대한 개요를 제공하고 SiHa 세포 처리 및 분석을 위한 유세포 분석 프로토콜을 자세히 설명합니다. 결과는 긍정, 부정 및 차선의 실험 데이터를 설명합니다. 또한 이 분석 플랫폼을 사용하여 세포자멸사에 대한 유세포 분석을 수행할 때의 해석 및 주의 사항에 대해서도 논의합니다. 유세포 분석은 세포자멸사에 대한 초기 및 후기 바이오마커의 정확한 측정을 제공합니다.
Introduction
아폽토시스(Apoptosis)는 제1형 프로그램된 세포사멸(type 1 programmed cell death)1로 분류되며, 세포증식과 세포사멸 사이의 평형을 보장한다2. 아폽토시스는 인간 발달 과정, 손상 후, 그리고 암과 같은 질병의 예방에 필수적이다3. 내인성 및 외인성 세포사멸 세포사멸 신호전달 경로4는 순차적인 생화학적 및 형태학적 세포내 변화를 일으킨다2,5,6. 형태학적 세포사멸 특징은 현미경으로 식별할 수 있으며, 생화학적 섭동은 유세포 분석(FC)7을 포함한 생화학적 분석으로 분석할 수 있습니다.
세포자멸사를 확인하고 관련 세포내 기전을 이해하기 위한 유세포 분석은 지난 20년 동안 급증했다8. FC는 단일 또는 다중 채널 레이저를 통과하는 유체의 세포를 분석하는 과학적 방법론입니다(그림 1)9,10,11. 유체의 세포는 유체역학적 포커싱을 사용하여 유세포 분석기의 유체 시스템에 의해 단일 파일로 포커싱됩니다. 세포가 레이저를 통과할 때 세포에서 빛이 산란되거나 방출됩니다. 산란광은 전방향(전방 산란) 또는 측면 방향(측면 산란)일 수 있으며 각각 셀 크기 및 셀 입도 또는 내부 구조에 대한 정보를 제공합니다.
또한, 형광 시약, 예컨대 형광 염료 또는 형광단으로 표지된 항체는 특정 표면 또는 세포내 구조 또는 분자를 검출한다. 레이저가 형광단을 여기시키면 특정 파장에서 빛이 방출됩니다. 검출기(일반적으로 광전자 증배관)는 세포 샘플에서 산란되고 방출되는 빛을 정량화합니다. 검출기는 광 산란 및 형광 방출에 비례하는 정량화 가능한 전류를 생성합니다. 전자 출력은 컴퓨팅 소프트웨어에 의해 디지털 신호로 변환되어 세포 크기, 세포 입도 및 형광단 표지 분자 9,12,13의 상대적 세포 형광을 기반으로 세포 집단을 식별합니다.
그림 1: 기존 유세포 분석의 기술적 작동 및 워크플로우를 설명하는 개략도. 세포는 형광 시약으로 염색되고 레이저로 조사됩니다. 생성된 형광 신호는 감지되어 전자 출력으로 변환되며, 이는 컴퓨터 소프트웨어 및 통계 프로그램에 의해 추가로 디지털화되고 분석됩니다. 약어: FSC = 전방 산란; SSC = 측면 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FC는 연구 및 건강 진단 모두에 사용됩니다. 괴사 생물학에서 FC의 두 가지 목표는 세포 사멸의 분자 및 기능적 특성의 해명과 다양한 세포 사멸 모드의 차별입니다 14,15,16,17,18. FC 응용 분야에는 세포 계수, 세포 집단 분류, 면역 표현형 분석, 바이오마커 검출(예: 세포자멸사 바이오마커), 독성 연구 및 단백질 공학이 포함됩니다12. 또한 FC는 일반적으로 혈액 악성 종양 환자의 진단 및 모니터링을 지원하기 위해 건강 진단에 적용됩니다. 계측, 형광단 검출 및 검출기 시스템의 발전으로 FC 응용 분야가 이미징 세포분석, 질량 세포 분석 및 스펙트럼 세포 분석을 포함하도록 확장되고 있으며 광범위한 연구 응용 분야가 있습니다12.
세포 사멸의 유세포 분석은 세포 건강을 평가하는 데 사용되는 기존 기술에 비해 이점을 제공합니다. FC는 이질적인 샘플에서 많은 단일 세포를 빠르고 재현 가능하게 분석하여 세포 사멸을 추정할 수 있습니다 3,5. 개별 세포 기준으로 세포 표현형에 대한 정량적 정보를 제공하고 벌크 분석을 피할 수 있는 FC의 능력은 세포 사멸 분석에 활용되는 웨스턴 블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 형광 측정 및 분광 광도법 기술에 대한 우수한 감도를 제공합니다 8,19. 또한, 웨스턴 블롯 및 ELISA의 번거롭고 재현성이 낮은 수동 단계와 대조적으로 FC 분석의 상대적 용이성이 유리합니다. 따라서 FC의 재현 가능하고 정확하며 처리량이 높은 분석은 암 연구에 도움이 된다20.
FC는 또한 건강한 세포사멸 세포군과 비정상적 세포사멸 세포집단에 대한 세포주기 파라미터의 동시 분석을 허용한다21. 아폽토시스(apoptosis)는 역동적인 과정이기 때문에, 상이한 방법들은 다양한 결과를 산출할 수 있으며, 세포가 수확되는 시점에 의존한다22. 세포 표현형의 여러 파라미터에 대한 동시 정량적 평가는 높은 정확도로 작은 하위 집단을 검출할 수 있게 해준다, 예를 들어, 0.01%의 낮은 빈도를 갖는 희귀 세포 서브세트가 검출될 수 있다23. 다중 모수 FC 분석은 세포사멸 연속체를 따라 다양한 지점에서 세포와 함께 초기 및 후기 생화학적 변화의 스펙트럼을 따라 세포사멸이 발생하기 때문에 특히 유용합니다. 예를 들어, 아폽토시스 세포의 FC 분석에서 아넥신 V와 프로피듐 요오드화물을 사용한 이중 염색을 사용하면 초기 아폽토시스 세포, 후기 아폽토시스 세포 및 죽은 세포의 분류가 가능합니다24. 여러 단계에서 세포자멸사를 정확하게 검출하면 오분류 및 위음성 결과를 피할 수 있습니다. 따라서 FC에 의한 다중모수 분석은 세포 표현형 검출의 전반적인 특이성을 개선하고 소집단의 오분류를 방지합니다. 또한, FC에 의한 세포 분류는 후속 분석을 위해 고순도의 세포 집단을 분리할 수 있게 한다7.
FC의 단점은 현탁액에 세포를 사용하는 것인데, 이는 조직이 세포로 분해되면 세포 기능이 변할 수 있기 때문에 조직 분석에서 어려울 수 있다19. 또한, FC 기기 설정, 데이터 분석 및 분석 보고서의 표준화가 부족하면 결과19에 변동이 발생할 수 있으며, 이는 FC 운영자가 데이터를 수행하고, 분석하고, 보고할 수 있도록 최적으로 교육할 필요성을 강조한다. 예를 들어, 세포사멸 핵에서 진정한 세포자멸사 파편을 구별하는 FC의 능력은 i) 적절한 획득 설정, ii) 이배체 DNA 피크를 식별하기 위한 보정 비드의 사용, iii) 세포 특이적 음성 및 양성 세포 대조군을 필요로 합니다3. 또한, 다중모수 분석은 검출기의 수에 의해 제한되며, 다중 형광 시약(25)을 사용할 때 비특이적 결과 및 형광 방출의 파급을 피하기 위해 최적의 보상이 수행될 필요가 있다. 기기 및 형광단 기술의 발전으로 파라미터 검출이 30개 파라미터로 향상되었습니다12.
세포사멸 세포사멸의 식별이 항상 간단한 것은 아니며7, 민감하고 특이적인 바이오마커를 고려해야 한다. 세포사멸 명명위원회(NCCD)는 세포자멸사 과정을 연구하고 정량화하기 위해 하나 이상의 분석법을 사용할 것을 권장한다26. 고전적 아폽토시스 특징에 대한 현미경 분석(microscopy analysis)26 은 또한 아폽토시스를 확인하고 위양성 결과를 피하기 위해 권장된다7. 초기 및 후기 세포자멸사 사건에 걸쳐 있는 4가지 주요 생화학적 특징은 (1) 세포막 비대칭의 손실; (2) 소산 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm); (3) 카스파아제 활성화; (4) DNA 손상26.
초기 세포자멸사 동안, 포스파티딜세린은 세포외막 27에 외재화되고, 피코에리트린27,28,29로 형광 표지된 아넥신 V에 의해 검출될 수 있다. 또한 형광 DNA 결합 염료인 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 사용한 이중 염색을 통해 살아있는 세포, 후기 세포사멸 세포 및 죽은 세포를 구별할 수 있습니다. 그러므로, 초기 아폽토시스 세포는 Annexin V에 대해 양성이고 7-AAD에 대해 음성으로 염색되는 반면, 후기 아폽토시스 세포는 두 염료 모두에 대해 양성으로 염색된다24.
내재적 세포자멸사 신호는 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)의 소실을 유도합니다. 파괴된 ΔΨm은 미토콘드리아 막간 공간에서 세포질로 초기 pro-apoptotic 단백질의 방출을 유발합니다27,29,30. ΔΨm의 변화는 양전하를 띤 친유성 염료, 테트라메틸로다민 에틸 에스테르, TMRE 및 7-AAD를 사용한 이중 염색으로 평가할 수 있습니다. TMRE 염료는 막 전위가 높을 때 손상되지 않은 미토콘드리아의 내막 내에 축적됩니다. 탈분극된 미토콘드리아는 감소된 형광을 나타냅니다. 분극화된 미토콘드리아(온전한 미토콘드리아 막)가 있는 살아있는 세포는 TMRE에 대해 양성이고 7-AAD에 대해 음성으로 염색됩니다. 탈분극된 미토콘드리아가 있는 죽은 세포는 TMRE에 대해 음성이고 7-AAD31에 대해 양성입니다.
카스파제는 세포 내 프로테아제 계열로, 활성화되면 신호를 보내고 세포 사멸을 실행합니다26,27. 말단 사형 집행 인 카스파제 (3,6,7)는 후기 세포 사멸 29,32,33에 영향을 미친다. 카스파제-3 및 -7 활성은 형광 표지된 기질에 의해 측정될 수 있으며, 이 기질은 절단될 때 DNA에 결합하고 형광 신호를 방출합니다. 또한 세포막 무결성에 대한 손상은 7-AAD로 염색하여 평가할 수 있습니다. 아폽토시스 세포는 DNA 결합 염료에 대해 양성이지만 7-AAD에 대해서는 음성입니다. 후기 세포사멸 및 죽은 세포는 두 염료 모두에 대해 양성으로 염색됩니다34.
후기 세포자멸사는 DNA 손상27,29,35를 특징으로 하며, 이는 인산화된 ataxiatelangiectasia 돌연변이 키나아제(ATM) 및 히스톤 H2A.X에 의해 평가될 수 있습니다. 이중 가닥 DNA 절단(DSB)은 H2A.X의 인산화를 유발합니다. ATM 및 H2A에 대한 형광 표지 항체. X는 DNA 손상을 결정할 수 있습니다. ATM과 H2A의 음성 감지. X는 DNA 손상이 없음을 나타내는 반면, 두 염료의 검출은 DNA36에서 이중 가닥 절단의 존재를 나타냅니다.
액티노마이신 D는 세포자멸사의 강력한 유도제이며 DNA에 결합하여 전사 및 번역 사건을 차단하는 작용을 한다37. 이 연구는 세포자멸사의 초기 및 후기 단계 바이오마커를 분석하여 SiHa 세포주에서 액티노마이신 D에 의해 유도된 생화학적 세포자멸사를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 세포자멸사의 4가지 생화학적 바이오마커는 세포막 비대칭 손실, 미토콘드리아 막 전위의 변화, 말단 카스파제의 활성화 및 DNA 손상을 포함하는 세포자멸사 캐스케이드의 순차적 단계를 평가했습니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜은 벤치탑 유세포 분석기에서 측정 및 분석된 유세포 분석 상용 분석을 사용하여 액티노마이신 D-처리된 SiHa 세포의 세포 준비, 세포 계수, 세포 염색 및 분석의 단계를 설명합니다(그림 2).
그림 2: 유세포 분석에 의한 생화학적 아폽토시스 바이오마커 검출을 위한 워크플로우. 세포는 프로토콜 단계 1.1에 기재된 바와 같이 배양 및 처리된다. (1) 세포를 배양하고, (2) 열거하고, (3) 형광 시약으로 염색하고, (4) 벤치탑 유세포 분석기로 분석합니다. 데이터는 추가로 게이트되고 통계적으로 분석됩니다. 약어: 7-AAD = 7-아미노악티노마이신 D; PBS = 인산염 완충 식염수; PE = 피코에리트린; TMRE = 테트라메틸로다민 에틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 세포 배양 및 유세포 분석을 위한 치료제의 제조
알림: 세포 배양을 처리할 때 무균 기술을 따르는지 확인하십시오.
- 세포 배양물을 5%CO2로 37°C에서 가습된CO2 환경에서 성장시킨다. 실험을 위해 세포를 계대배양하기 전에 세포 배양이 부모 플라스크에서 약 70% 융합되는지 확인합니다.
- 플라스크에서 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 500μL의 트립신을 첨가하여 세포를 분리합니다. 세포가 둥글고 플라스크에서 분리되기 시작한 후 플라스크 바닥을 벤치에 날카롭게 두드려 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포를 계수하기 전에 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 약 5mL의 신선한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
- 6웰 세포 배양 플레이트에서 3mL의 세포 배양 배지에 15,000 cells/mL의 시드 세포. 배양 플레이트를 5%CO2 와 함께 37°C에서 밤새 인큐베이션하여 웰의 바닥에 세포의 부착을 허용한다.
- 실험 배양물을 100ng/mL 액티노마이신 D로 처리하고 배지 및 용매 대조군을 각각 신선한 배양 배지와 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 24시간 동안 처리합니다. 사용한 배지를 15mL 튜브에 모으고 1x PBS로 세포를 세척합니다. 그 후, 1x PBS 세척액을 튜브에 넣은 다음, 500 μL의 트립신을 웰에 첨가한다. 다음으로, 5 mL의 신선한 배양액을 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
참고: (1) 장기간의 트립신 배양 또는 불완전한 중화는 세포를 소화하고 세포막을 손상시켜 결과를 왜곡할 수 있습니다. 또한 세포막 비대칭을 변화시켜 포스파티딜 세린에 대한 접근성을 변화시킬 수 있습니다. (2) 떼어내어 표면에 떠 있는 세포는 제거된 배지를 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 신선한 배양액에 세포를 재현탁하여 후속 분석에 포함될 수 있습니다.
2. 생존도 분석을 이용한 세포 열거
- 미세 원심분리기 튜브에 450μL의 요오드화 프로피듐을 피펫팅합니다. 50 μL의 세포 현탁액을 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 유세포 분석으로 세포를 열거합니다(섹션 4 참조).
- 세포자멸사 분석을 진행하기 전에 모든 샘플을 세포 배양 배지를 사용하여 1 ×10 6 cells/mL의 농도로 희석합니다.
3. 유세포 분석을 위한 세포 염색
참고: 프로토콜의 이 부분에는 멸균 조건이 필요하지 않습니다.
- Annexin V를 이용한 포스파티딜세린 외부화 검출
- 100 μL의 세포 현탁액을 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 형광 결합 Annexin V와 7-AAD 시약의 1:1 혼합물 100μL를 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 빛으로부터 보호하십시오.
- 미토콘드리아 막 탈분극 분석
- 세포 현탁액 100 μL를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린다.
- 1x PBS 1mL에 세포를 재현탁하고 각 샘플에 TMRE 염색 용액 100μL를 추가한 다음 부드러운 백피펫팅으로 현탁액을 혼합합니다.
- 세포를 37°C의 가습된CO2 환경에서 20분 동안 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하기 위해 샘플을 깨끗한 알루미늄 호일로 감싸십시오.
참고: 미토콘드리아 막 전위는 세포 환경의 사소한 변화에 민감한 기능적 마커입니다. 따라서 재현성을 유지하기 위해 동일한 조건(온도, pH 및 배양 시작과 형광 측정 사이의 경과 시간)에서 샘플을 배양하고 측정해야 합니다. 또한 빛으로부터 샘플을 부적절하게 보호하면 형광단의 광표백이 발생하여 형광 방출이 잘못 낮아집니다. - 배양 후 7-AAD 염색 용액 5μL를 각 샘플에 넣고 혼합합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 카스파제 기질 DEVD를 이용한 활성화된 말단 카스파제-3 및 -7의 검출
참고: 이 분석을 수행하기 전에 다음 용액을 준비합니다.- DMSO의 DEVD 결합 DNA 결합 펩타이드를 멸균 1x PBS로 1:8의 비율로 희석하여 카스파제 검출 작업 용액을 만듭니다. 용액을 얼음 또는 2-8 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
참고: 각 샘플에는 이 용액 5μL가 필요합니다. - 148μL의 1x PBS에 2μL의 7-AAD 원액을 추가하여 7-AAD 작업 용액을 만듭니다. 용액을 얼음 또는 2-8 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
참고: 각 샘플에는 150μL의 이 용액이 필요합니다. - 세포 현탁액 50 μL를 300 × g에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리십시오. 50μL의 1x PBS에 세포를 재현탁한 다음 5μL의 카스파제 검출 작업 용액에 재현탁합니다. 철저히 섞는다.
- 튜브의 캡을 풀고 빛으로부터 보호되는 37°C의 가습된CO2 환경에서 30분 동안 배양합니다. 150μL의 7-AAD 작업 용액을 각 샘플에 추가하고 혼합합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- DMSO의 DEVD 결합 DNA 결합 펩타이드를 멸균 1x PBS로 1:8의 비율로 희석하여 카스파제 검출 작업 용액을 만듭니다. 용액을 얼음 또는 2-8 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
- 이중 가닥 DNA 절단 및 전체 DNA 손상 검출
- 세포 현탁액 50 μL를 300 × g에서 5 분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리십시오.
- 500μL의 1x PBS에 세포를 재현탁합니다. 500 μL의 포름알데히드 기반 고정 완충액을 첨가하고 혼합합니다. 샘플을 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
- 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 미세 원심분리기 튜브에서 90μL의 1x PBS에 세포를 재현탁합니다. 항체 용액 10μL를 미세원심분리기 튜브에 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS 100μL를 넣고 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 200μL의 1x PBS에 세포를 재현탁합니다.
4. 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다.
- 기기의 시스템 점검 키트를 실행하여 유세포 분석기의 분석 성능을 검증합니다. 모든 검사가 완료되고 통과될 때까지 샘플 실행을 진행하지 마세요.
- 기기에서 사전 프로그래밍된 분석 카탈로그를 검색하여 원하는 분석을 찾고 Run Assay를 선택합니다.
- 샘플을 유세포 분석기에 로드하기 전에 부드럽게 백피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
알림: 적절한 혼합은 세포가 현탁액에 남아 있도록 하고 낮은 세포 수를 방지합니다. - 먼저, 음성 대조군 시료를 유세포분석기에 로드하고 실행(설정 조정) 을 선택하여 기기가 시료 흡기를 시작하고 검출된 이벤트의 실시간 미리보기를 제공하도록 합니다. 기기 이름 및 세부 정보는 재료 표를 참조하십시오.
- 실시간 미리보기를 사용하여 형광 및 세포 크기에 대한 임계값을 조정하고 세포 집단 주위에 직사각형 게이트를 그립니다. 임계값 표시자를 드래그하여 세포 파편을 제외합니다. 다음(상태 프로필 설정) 을 선택하여 계속 진행합니다.
참고: 셀의 크기를 아는 것이 중요합니다. 슬라이더를 드래그하여 감지된 이벤트가 실시간 미리보기에 표시되는 방식의 변화를 관찰하면 임계값을 정확하게 선택할 수 있습니다. 이 단계에서 세포 파편을 배제하지 않으면 획득 후 분석에서 제거할 수 없습니다. - 사분면 마커를 탭하고 드래그하여 세포 집단을 분리하고 기기가 감지된 이벤트를 실시간으로 표시하도록 합니다. 이 플롯을 사용하여 최종 사용자에게 사분면 마커의 적절한 배치를 안내합니다. 다음(샘플 확인) 을 선택하여 계측기가 설정 요약을 표시하도록 진행합니다. 설정을 검토한 후 다음(설정 확인) 을 선택하여 실험 내의 모든 샘플에 이러한 설정을 적용합니다.
알림: 기기는 2분 라이브 사전을 제공합니다.view 기기의 설정을 조정하는 데 사용되는 셀. 이 시간 제한이 만료되면 기기에서 s를 방출합니다.ample, 4.2.2-4.2.4단계를 반복해야 합니다. 샘플을 제거하고 다시 로드하고 계속하기 전에 잘 혼합하십시오. - 세포 집단 주위에 영역을 그려 세포 집단을 게이트합니다. 실시간 미리 보기의 x축과 y축에 있는 슬라이더를 사용하여 형광 및 세포 크기에 대한 임계값을 조정합니다. 실험 내의 모든 샘플에 대해 이 설정을 적용합니다.
- 부드럽게 백피펫팅하여 첫 번째 샘플을 혼합하고 첫 번째 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 다음을 선택합니다. 샘플 이름을 지정하고 실행( Run )을 선택하여 시스템에서 샘플 실행을 시작하도록 합니다.
알림: 기기는 한 번에 하나의 샘플만 실행할 수 있습니다. - 모든 샘플이 실행되면 적절한 제목을 지정하여 실험을 저장합니다. 이후 실행에서 검색할 수 있도록 현재 실험의 설정을 저장합니다(선택 사항).
- 샘플을 유세포 분석기에 로드하기 전에 부드럽게 백피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
5. 인수 후 분석
- 필요한 경우 수집 후 게이트 또는 사분면 마커의 미세 조정을 수행합니다.
- 시스템의 파일 브라우저로 이동하여 조정이 필요한 실험을 찾고 실험을 엽니다.
- 플롯의 썸네일 미리보기를 탭하면 확대됩니다. 셀 게이트의 왼쪽 상단 또는 오른쪽 하단 모서리를 눌러 게이트의 치수를 조정합니다. 사분면 마커를 조정하려면 수직선과 수평선의 교차점을 눌러 마커를 그대로 이동합니다. 두 선의 각도를 조정하려면 선을 탭하고 핸들을 끕니다.
- 마커를 원하는 대로 조정하고(4.1.3-4.1.4단계에서 설명한 대로) 확인 표시 아이콘을 선택하고 모든 샘플을 표시 한 다음 수락을 선택하여 실험의 모든 샘플에 이러한 설정을 적용합니다.
6. 통계 분석
- 테스트를 세 번 실행하고 사후 Bonferroni 테스트로 분산 분석(ANOVA)을 실행하여 처리된 샘플과 대조군 간의 유의미한 차이를 평가합니다.
참고: 선택한 통계적 테스트는 조사자와 분석 중인 변수에 따라 다릅니다.
Representative Results
세포 수 및 생존율(그림 3) 결과는 샘플에서 세포의 95.2%가 살아 있고 4.8%가 죽은 것으로 나타났습니다. 원래 샘플의 총 세포 농도는 6.20 x 106 cells/mL였습니다.
Annexin V 및 세포 사멸 분석(그림 4)은 대조군과 비교하여 100ng/mL 액티노마이신 D로 처리된 SiHa 세포의 세포사멸 세포에서 유의한 증가(p < 0.0001)를 보여주었습니다. 아넥신 V 염색은 초기 단계의 세포자멸사 동안 세포에서 증가하기 때문에 이 발견은 100ng/mL 액티노마이신 D가 SiHa 세포에서 세포자멸사를 유도했음을 시사합니다.
미토콘드리아 전기화학적 막횡단 전위 분석(그림 5)은 액티노마이신 D, 배지 대조군 및 용매 대조군 사이의 세포 건강 프로파일(라이브, 탈분극 및 라이브, 탈분극 및 사멸, 사멸)에서 유의한 감소(p < 0.0001)를 입증했습니다. 이러한 데이터는 100ng/mL 액티노마이신 D가 SiHa 세포에서 미토콘드리아 탈분극을 유도했음을 시사합니다.
카스파제 3/7 분석(그림 6)은 대조군과 비교하여 100ng/mL 액티노마이신 D로 처리된 SiHa 세포에서 카스파제 3 및 7의 유의한(p < 0.0001) 활성화를 입증했습니다. 이러한 발견은 100ng/mL 액티노마이신 D가 SiHa 세포에서 세포자멸사를 유도했음을 보여줍니다.
DNA 손상 분석(그림 7)은 100ng/mL 액티노마이신 D가 DNA 손상 마커인 ATM 및 H2A를 유의하게(p < 0.0001) 유도하는 것으로 나타났습니다. X, SiHa 세포에서. 이 발견은 액티노마이신 D로 처리된 SiHa 세포에서 DNA 손상이 크게 증가했음을 시사합니다.
최적이 아닌 실험의 결과(그림 8)는 모든 분석에서 분석적 고려 사항을 보여줍니다. 세포 농도는 데이터의 정확도에 영향을 미칩니다. 도 8A에서, 세포 계수는 허용할 수 없을 정도로 낮다. 점도표의 4개 사분면 모두에 있는 게이트 세포 집단은 신호 강도가 낮습니다. 제조업체는 최종 시료 부피에서 300-700 cells/μL에 대한 분석을 최적화합니다. 이 예는 제조업체가 규정한 올바른 샘플 농도를 사용하는 것의 중요성을 보여줍니다.
또한 높은 세포 농도는 잘못된 결과를 초래했습니다(그림 8B). 배지 및 실험 배양은 각각 99.95% 및 100% 살아있는 세포를 나타냈습니다. 두 분석의 유속은 제조업체가 최적화한 농도인 100-500 cells/μL를 초과했으며 부정확한 분석을 피하기 위해 1x 분석 버퍼로 희석해야 했습니다.
세포 응집은 Annexin V 분석에 설명된 바와 같이 증가된 세포 크기 지수로 인해 잘못된 결과를 생성하므로 실험 배양을 준비하는 동안 피해야 합니다. 도 8C 는 SiHa 배지 대조군에서 세포 크기 지수가 4를 초과하는 것으로 입증되는 바와 같이, 제조사의 지시를 초과하는 높은 세포 농도 및 세포 응집의 이중 문제를 보여준다. 높은 세포 농도는 배지 배양에서 세포의 밝은 빨간색 평면을 형성하는 세포의 시트에 의해 설명되며, 이는 불일치할 정도로 높은 세포사멸 세포 집단을 보여줍니다.
배양물의 장기간 염색은 단백질의 비특이적 결합을 초래할 수 있으며 Annexin V 분석에 의해 입증된 바와 같이 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다. 도 8D 는 장기간의 염색으로 인한 배지 및 실험 배양에 대해 유사한 결과를 보여준다.
부실한 시료 취급, 부착 세포의 확장된 트립신 처리, 세척 단계 중 활발한 피펫팅, 고속 및 장기간의 원심분리 단계는 세포 용해 및 다량의 세포 파편을 유발합니다. 도 8E에서, 카스파아제 3/7 분석에 의해 분석된 배양물은 작은 세포 크기 지수(<2.2 세포 크기 지수)에 의해 입증되는 증가된 세포 파편을 입증한다. 따라서 데이터 수집을 위해 샘플을 준비할 때 주의해야 합니다.
그림 3: 세포 수 및 생존력 분석. 개체군 프로파일은 살아있는 세포와 죽은 세포에서 파편을 분리합니다. 2차원 점도표는 게이트가 있으며 살아있는 세포 집단과 죽은 세포 집단을 나눕니다. 정보 패널은 세포 수, 총 생존 세포의 백분율 및 샘플의 총 생존 세포 수에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 이러한 데이터는 후속 세포자멸사 분석을 위해 모든 샘플에서 세포 수를 표준화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Annexin V 분석. 모든 샘플은 동일한 게이팅 매개변수를 나타내며, 각 하위 집단의 통계 분석은 액티노마이신 D로 처리된 세포에서 세포자멸사가 유의하게 증가함을 보여줍니다. 모든 분석은 3개의 독립적인 실험으로 수행되었고, 각 실험은 3회 분석되었다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미토콘드리아 전기화학적 막횡단 전위 분석. 모든 샘플은 동일한 게이팅 매개변수를 나타내며 각 하위 집단의 통계 분석은 악티노마이신 D로 처리된 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 상당한 섭동을 보여줍니다. 모든 분석은 3개의 독립적인 실험으로 수행되었고, 각 실험은 3회 분석되었다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 카스파제 3/7 검출 분석. 모든 샘플은 동일한 게이팅 파라미터를 나타내며, 각 하위 집단의 통계 분석은 액티노마이신 D로 처리된 세포에서 카스파제 3/7 활성의 상당한 증가를 보여줍니다. 모든 분석은 3개의 독립적인 실험으로 수행되었고, 각 실험은 3회 분석되었다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: DNA 손상 분석. 모든 샘플은 동일한 게이팅 매개변수를 나타내며, 각 하위 집단의 통계 분석은 액티노마이신 D로 처리된 세포에서 이중 가닥 DNA 손상 및 총 DNA 손상의 상당한 증가를 보여줍니다. 모든 분석은 3개의 독립적인 실험에서 수행되었고, 각각의 실험은 삼중으로 분석되었다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. * p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 최적이 아닌 실험 조건에서는 결과가 좋지 않습니다 . (A) 낮은 농도의 세포, (B) 높은 농도의 세포, (C) 높은 세포 크기 지수에 의해 명백한 세포 응집 및 응집, (D) 두 샘플 모두에서 증가된 양성 염색에 의해 명백한 세포 샘플의 장기간 염색, 및 (E) 증가된 세포 파편에 의해 명백한 열악한 샘플 처리(세포 크기 지수 < 2.2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구에서 FC에 의해 분석된 액티노마이신 D-처리된 SiHa 세포는 세포자멸사에 대한 중요한 초기 및 후기 바이오마커를 밝혀냈습니다. 세포 준비, 계수 및 염색을 위한 최적이 아닌 조건에서 부정확한 결과가 확인되어 FC를 수행할 때 제조업체의 지침을 철저히 준수해야 할 필요성이 강조되었습니다.
초기 및 후기 바이오마커 식별에 의한 세포자멸사에 대한 이 연구는 세포자멸사를 조사하기 위한 NCCD 가이드라인1을 따른다. 액티노마이신 D-처리된 SiHa 배양은 초기 및 후기 세포자멸사 단계에 대한 양성 바이오마커를 입증했습니다. Annexin V/PI 분석과 미토콘드리아 투과성 분석은 액티노마이신 D가 각각 PS-플립 패턴과 미토콘드리아 막 전이의 소멸을 유도하는 것으로 나타났습니다. 일단 세포사멸 세포가 미토콘드리아 섭동에 의해 유도된 복귀 지점에 도달하면, 말단 카스파제는 활성화된다 3,7. 이 연구에서 관찰된 말단 카스파제 3과 7의 활성화는 말기 세포자멸사를 나타냅니다. 또한, 말단 카스파제 활성화는 뉴클레오솜 간 DNA 절단 및 광범위한 DNA 단편화를 유발하며, 이는 겔 전기영동28,38에 의해 관찰되는 계단 사다리 패턴으로 보고되었습니다.
ATM과 H2A로 인한 핵 피해. X FC DNA 손상 분석은 DNA의 이중 가닥 파손 및 전체 DNA 손상을 보여주었습니다. 이러한 결과는 실험 배양에서 고전적인 다운스트림 카스파제 유도 세포사멸 핵 손상(karyorrhexis 및 karyorrlysis)을 확인했습니다. 따라서 다중 유세포 분석 바이오마커를 사용하여 세포자멸사에서 순차적인 다단계 사건을 검출하고 초기 및 후기 세포자멸사 단계에서 정확하고 재현 가능하게 식별된 세포 집단을 검출했습니다. 이러한 발견은 인간 37,39,40,41의 암 치료에서 악티노마이신 D의 알려진 프로-아폽토시스 특징과 일치하며, 또한 세포자멸사를 조사하는 FC 세포 배양 실험에서 양성 대조군으로서 악티노마이신 D의 사용을 지지한다.
이 연구에서 세포 집단의 게이팅은 건강한 세포에서 세포자멸사를 분리하는 음성 배지 및 용매 대조군에 의해 알려졌습니다. 대안적으로, 양성 및 음성 대조군의 집단의 혼합물은 또한 세포 집단 게이트 7,9를 설정하기 위해 살아있는 세포 집단 및 세포사멸 세포 집단을 정의하기 위해 사용될 수 있다. 병에 걸린 세포와 건강한 세포 상태가 정의되고 게이트되면 템플릿 설정을 모든 후속 실험 및 대조 배양에 적용할 수 있습니다.
잘못된 결과를 방지하려면 FC 프로토콜을 엄격하게 준수하는 것이 중요합니다. 프로토콜을 최적화하는 동안 (1) 낮은 세포 농도, (2) 높은 세포 농도, (3) 세포 응집, (4) 장기간의 염색 및 (5) 열악한 샘플 취급과 같은 문제가 관찰되었습니다. 이러한 문제는 최적화된 프로토콜 요구 사항을 엄격하게 준수하여 방지할 수 있습니다. 이는 FC가 정확한 데이터를 얻기 위한 사전 분석 및 분석 단계의 중요한 특성을 강조합니다. 세포를 준비하는 동안 트립신 처리, 피펫팅, 원심분리 및 희석은 주의해서 수행해야 합니다. 과도한 트립신 처리 및 격렬한 피펫팅은 각각 세포의 화학적 및 기계적 전단을 초래할 수 있습니다. 장기간 고속 원심분리는 세포 파괴 및 높은 세포 파편 수를 초래할 수 있습니다. 세포 이벤트의 잘못된 획득을 최소화하기 위해 최적의 세포 농도가 필요합니다. 따라서 최적의 세포 농도를 얻기 위해 1차 세포 현탁액을 희석해야 합니다.
또한 샘플을 취급하는 동안 세포 응집 및 세포 단편화를 방지하고 분석 중에 세포가 현탁 상태로 유지되도록 주의해야 합니다. 세포 덩어리를 방지하기 위한 시료 처리는 단일 층류 세포 흐름을 허용하고, 기기의 모세관 튜브의 기계적 막힘을 방지하며, 스퓨리어스 큰 세포 크기 지수를 억제합니다. 또 다른 주의 사항은 광산화를 피하기 위해 빛으로부터 배양물을 보호하고 위음성 결과를 방지하기 위해 분석에서 형광단의 소멸을 방지하는 것입니다. 세포의 염색 단계 및 후속 처리 단계에서 최소한의 광 노출을 보장하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한, 면역염색 시간이 길어지면 단백질이 비특이적으로 염색되기 때문에 위양성 결과가 발생할 수 있습니다. 따라서 제조업체가 규정한 배양 염색 기간을 준수하는 것이 중요합니다.
요약하면, FC는 세포 사멸을 정확하게 검출하고 세포 배양에서 초기 및 후기 세포 사멸 바이오마커를 구별할 수 있습니다. 또한 기술의 발전으로 비전문 과학자가 세포 건강 및 복잡한 세포 내 신호 전달 경로를 연구할 수 있는 벤치탑 유세포 분석기가 제조되었습니다.
Disclosures
Luminex® Corporation은 물품 처리 비용을 친절하게 제공했습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NRF (National Research Foundation)와 SAMRC (South African Medical Research Council)의 재정 지원을 받았습니다. Guava Muse Cell Analyzer를 구매해 주신 NHLS(National Health Laboratory Service)에 감사드립니다. 이 간행물의 모든 그림은 Biorender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
| Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
| Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
| Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
| Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
| Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
| Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
| PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
| Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
| T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
| Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |
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