Summary
Apoptose kan karakteriseres ved flowcytometrisk analyse af tidlige og sene apoptotiske biomarkører. Cellelinjen for livmoderhalskræft, SiHa, blev analyseret for apoptosebiomarkører efter behandling med Actinomycin D ved hjælp af et benchtop flowcytometer.
Abstract
Apoptose biomarkører blev undersøgt i actinomycin D-behandlede SiHa livmoderhalskræftceller ved hjælp af et benchtop flow cytometer. Tidlige biomarkører (Annexin V og mitokondriemembranpotentiale) og sene biomarkører (caspase 3 og 7 og DNA-skader) af apoptose blev målt i eksperimentelle og kontrolkulturer. Kulturer blev inkuberet i 24 timer i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2. Cellerne blev derefter løsrevet ved hjælp af trypsin og opregnet ved hjælp af et flowcytometrisk celletællingsassay. Celler blev yderligere analyseret for apoptose ved anvendelse af et Annexin V-assay, et mitokondrielt elektrokemisk transmembranpotentialeassay, et caspase 3/7-assay og et DNA-skadeassay. Denne artikel giver et overblik over apoptose og traditionel flowcytometri og uddyber flowcytometriske protokoller til behandling og analyse af SiHa-celler. Resultaterne beskriver positive, negative og suboptimale eksperimentelle data. Også diskuteret er fortolkning og forbehold ved udførelse af flowcytometrisk analyse af apoptose ved hjælp af denne analytiske platform. Flowcytometrisk analyse giver en nøjagtig måling af tidlige og sene biomarkører for apoptose.
Introduction
Apoptose, klassificeret som type 1 programmeret celledød1, sikrer en ligevægt mellem celleproliferation og celledød2. Apoptose er afgørende under menneskelig udvikling, efter skade og til forebyggelse af sygdomme som kræft3. Indre og ydre apoptotiske celledødssignalveje4 forårsager sekventielle biokemiske og morfologiske intracellulære ændringer 2,5,6. Morfologiske apoptotiske egenskaber kan identificeres ved mikroskopi, og den biokemiske forstyrrelse kan analyseres ved biokemiske assays, herunder flowcytometri (FC)7.
Flowcytometrisk analyse for at identificere apoptose og forstå de tilknyttede intracellulære mekanismer er vokset i løbet af de sidste to årtier8. FC er en videnskabelig metode, der analyserer celler i en væske, der passerer gennem enkelt- eller flerkanalslasere (figur 1) 9,10,11. Cellerne i væsken fokuseres i en enkelt fil af flowcytometerets fluidiksystem ved hjælp af hydrodynamisk fokusering. Når celler passerer gennem laseren, spredes eller udsendes lys fra cellerne. Det spredte lys kan være i fremadgående retning (fremadrettet spredning) eller mod siden (sidespredning) og giver information om henholdsvis cellestørrelse og cellegranularitet eller interne strukturer.
Derudover detekterer fluorescerende reagenser, såsom fluorescerende farvestoffer eller antistoffer mærket med fluoroforer, specifikke overflade- eller intracellulære strukturer eller molekyler. Når laseren ophidser fluoroforerne, udsendes lys ved en bestemt bølgelængde. Detektorer - almindeligvis fotomultiplikatorrør - kvantificerer det spredte og udsendte lys fra celleprøver. Detektorerne producerer en kvantificerbar strøm, der er proportional med lysspredningen og fluorescensemissionen. Det elektroniske output konverteres til digitale signaler ved hjælp af computersoftware til at identificere cellepopulationer baseret på cellestørrelse, cellegranularitet og den relative cellefluorescens af fluoroformærkede molekyler 9,12,13.
Figur 1: Skematisk beskrivelse af den tekniske drift og arbejdsgang for traditionel flowcytometri. Celler farves med fluorescerende reagenser og undersøges af en laser. De genererede fluorescenssignaler detekteres og konverteres til en elektronisk udgang, som yderligere digitaliseres og analyseres af computersoftware og statistiske programmer. Forkortelser: FSC = fremadrettet spredning; SSC = sidespredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
FC bruges i både forskning og sundhedsdiagnostik. De to mål for FC i nekrobiologi er belysning af molekylære og funktionelle egenskaber ved celledød og diskrimination af forskellige former for celledød 14,15,16,17,18. FC-applikationer inkluderer celletælling, sortering af cellepopulationer, immunofænotypning, biomarkørdetektion (f.eks. Apoptosebiomarkører), toksicitetsundersøgelser og proteinteknik12. Derudover anvendes FC almindeligvis til sundhedsdiagnostik for at hjælpe med diagnosticering og overvågning af patienter med hæmatologiske maligniteter. Fremskridt inden for instrumentering, fluoroforetektion og detektorsystemer udvider FC-applikationer til at omfatte billeddannelsescytometri, massecytometri og spektral cytometri med bredere forskningsapplikationer12.
Den flowcytometriske analyse af apoptose giver fordele i forhold til traditionelle teknikker, der anvendes til vurdering af cellesundhed. FC kan analysere mange enkeltceller i en heterogen prøve hurtigt og reproducerbart for at estimere apoptose 3,5. FC's evne til at give kvantitativ information om cellefænotyper på individuel cellebasis og undgå bulkanalyse giver overlegen følsomhed over for Western blotting, enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er), fluorometri og spektrofotometriteknikker, der anvendes til analyse af apoptose 8,19. Desuden er den relative lethed ved FC-analyse i modsætning til de besværlige og dårligt reproducerbare manuelle trin i Western blots og ELISA'er fordelagtig. Den reproducerbare, nøjagtige og high-throughput analyse af FC er derfor gavnlig i kræftforskning20.
FC tillader også samtidig analyse af cellecyklusparametre for sunde og unormale apoptotiske cellepopulationer21. Da apoptose er en dynamisk proces, kan forskellige metoder producere variable resultater og er afhængige af det tidspunkt, hvor cellerne høstes22. Den samtidige kvantitative vurdering af flere parametre for cellefænotype gør det muligt at påvise mindre subpopulationer med høj nøjagtighed, f.eks. kan sjældne celleundergrupper med en lav frekvens på 0,01% detekteres23. Multiparametrisk FC-analyse er især nyttig, da apoptotisk død forekommer langs et spektrum af tidlige og sene biokemiske ændringer med celler på forskellige punkter langs det apoptotiske kontinuum. For eksempel muliggør brugen af dobbeltfarvning ved hjælp af Annexin V og propidiumiodid i FC-analyse af apoptotiske celler kategorisering af tidlige apoptotiske celler, sene apoptotiske celler og døde celler24. Den nøjagtige påvisning af apoptose i flere faser undgår fejlklassificering og falsk-negative resultater. Således forbedrer multiparametrisk analyse af FC den overordnede specificitet ved påvisning af cellefænotyper og undgår fejlklassificering af mindre populationer. Desuden tillader cellesortering ved FC isolering af cellepopulationer med høj renhed til efterfølgende analyse7.
Ulempen ved FC omfatter brugen af celler i suspension, hvilket kan være udfordrende i vævsanalyse, da disaggregering af væv i celler kan ændre cellulær funktion19. Desuden kan manglen på standardisering af FC-instrumentopsætning, dataanalyse og analyserapporter forårsage variation i resultater19, hvilket understreger behovet for optimalt at træne FC-operatører til at udføre og analysere og rapportere data. For eksempel kræver FC's evne til at skelne ægte apoptotisk affald fra apoptotiske kerner i) korrekte erhvervelsesindstillinger, ii) brugen af kalibreringsperler til at identificere en diploide DNA-top og iii) negative og positive cellekontroller, der er cellespecifikke3. Desuden er multiparametrisk analyse begrænset af antallet af detektorer, og der skal udføres optimal kompensation for at undgå uspecifikke resultater og afsmittende virkninger af fluorescerende emission ved anvendelse af flere fluorescerende reagenser25. Fremskridt inden for instrument- og fluoroforteknologi har forbedret parameterdetektering til 30 parametre12.
Identifikationen af apoptotisk celledød er ikke altid enkel7, og følsomme og specifikke biomarkører bør overvejes. Nomenklaturudvalget for celledød (NCCD) anbefaler, at der anvendes mere end et assay til at undersøge og kvantificere processen med apoptose26. Mikroskopianalyse for klassiske apoptotiske træk26 anbefales også for at bekræfte apoptose og undgå falsk-positive resultater7. Fire kardinale biokemiske egenskaber, der spænder over tidlige og sene apoptotiske hændelser, er (1) tab af cellemembranasymmetri; (2) spredning mitokondrie membranpotentiale (ΔΨm); (3) caspase aktivering; og (4) DNA-skade26.
Under tidlig apoptose eksternaliseres phosphatidylserin til den ydre cellemembran 27 og kan detekteres ved Annexin V fluorescerende mærket med phycoerythrin27,28,29. Desuden skelner dobbeltfarvning med det fluorescerende DNA-bindende farvestof, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), levende, sen-apoptotiske og døde celler. Derfor pletter tidlige apoptotiske celler positivt for Annexin V og negativt for 7-AAD, i modsætning til sen-apoptotiske celler, der pletter positivt for begge farvestoffer24.
Intrinsiske apoptotiske signaler inducerer spredning af mitokondriemembranpotentialet (ΔΨm). Den forstyrrede ΔΨm forårsager frigivelse af tidlige pro-apoptotiske proteiner fra mitokondrieintermembranrummet ind i cytosolen27,29,30. Ændring i ΔΨm kan vurderes ved dobbeltfarvning med det positivt ladede, lipofile farvestof, tetramethylrhodamin ethylester, TMRE og 7-AAD. TMRE-farvestoffet akkumuleres i den indre membran af intakte mitokondrier, når membranpotentialet er højt. Depolariserede mitokondrier viser nedsat fluorescens. Levende celler med polariserede mitokondrier (intakt mitokondriemembran) pletter positive for TMRE og negative for 7-AAD. Døde celler med depolariserede mitokondrier pletter negative for TMRE og positive for 7-AAD31.
Caspaserne er en familie af intracellulære proteaser, der, når de aktiveres, signalerer og udfører apoptose26,27. De terminale bøddelkaspaser (3,6,7) effekt sen apoptose 29,32,33. Caspase-3 og -7 aktiviteter kan måles af et fluorescerende mærket substrat, som, når det spaltes, binder til DNA og udsender et fluorescerende signal. Desuden kan ethvert kompromis med cellemembranintegritet vurderes ved farvning med 7-AAD. Apoptotiske celler pletter positivt for det DNA-bindende farvestof, men negativt for 7-AAD. Senapoptotiske og døde celler pletter positivt for begge farvestoffer34.
Sen apoptose er karakteriseret ved DNA-skade27,29,35, som kan evalueres ved phosphoryleret ataxiatelangiectasia muteret kinase (ATM) og histon H2A.X. Dobbeltstrengede DNA-brud (DSB'er) forårsager phosphorylering af H2A.X. Fluorescerende mærkede antistoffer mod ATM og H2A. X kan bestemme DNA-skader. Negativ detektion af både ATM og H2A. X indikerer ingen DNA-skade, mens påvisning af begge farvestoffer indikerer tilstedeværelsen af dobbeltstrengsbrud i DNA36.
Actinomycin D er en potent inducer af apoptose og virker ved at binde til DNA for at blokere transkriptions- og translationshændelser37. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere biokemisk apoptose induceret af actinomycin D i SiHa-cellelinjen ved at analysere tidlige og sene biomarkører for apoptose. Fire biokemiske biomarkører for apoptose vurderede de sekventielle trin i den apoptotiske kaskade, der omfattede tab af cellemembranasymmetri, ændring i mitokondriemembranpotentiale, aktivering af terminale caspaser og DNA-skade.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol beskriver trin i celleforberedelsen, celletælling, cellefarvning og analyse af actinomycin D-behandlede SiHa-celler ved hjælp af flowcytometriske kommercielle assays målt og analyseret på et benchtop flowcytometer (figur 2).
Figur 2: Arbejdsproces til påvisning af biokemiske apoptotiske biomarkører ved flowcytometri. Celler dyrkes og behandles som beskrevet i protokoltrin 1.1. (1) Celler dyrkes, (2) opregnes og (3) farves med fluorescerende reagenser og (4) analyseres af et stationært flowcytometer. Data er yderligere gated og statistisk analyseret. Forkortelser: 7-AAD = 7-aminoactinomycin D; PBS = fosfatbufret saltvand PE = Phycoerythrin; TMRE = tetramethylrhodamin ethylester. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Forberedelse af cellekultur og behandlinger for flowcytometri
BEMÆRK: Sørg for, at aseptisk teknik følges ved håndtering af cellekulturer.
- Cellekulturer dyrkes i et befugtet CO 2 -miljø ved 37 ° C med 5% CO2. Sørg for, at cellekulturen er ca. 70% sammenflydende i moderkolben, før cellerne passerer til forsøg.
- Substratet fjernes fra kolben, cellerne vaskes med 1x fosfatbufret saltvand (PBS), og der tilsættes 500 μL trypsin for at løsne cellerne. Når cellerne begynder at runde og løsne sig fra kolben, skal du banke kolbens bund skarpt på bænken for at løsne cellerne. Derefter neutraliseres trypsinet ved at tilsætte ca. 5 ml frisk dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt kalveserum, før cellerne tælles.
- Frøceller ved 15.000 celler / ml i 3 ml cellekulturmedium i en 6-brønds cellekulturplade. Kulturpladerne inkuberes natten over ved 37 °C med 5% CO2 for at tillade fastgørelse af cellerne til bunden af brønden.
- De eksperimentelle kulturer behandles med 100 ng/ml actinomycin D og substrat- og opløsningsmiddelkontrollerne med henholdsvis frisk dyrkningsmedium og dimethylsulfoxid (DMSO) i 24 timer. Opsaml det brugte medium i et 15 ml rør og vask celler med 1x PBS. Derefter tilsættes 1x PBS-vasken til røret, og tilsæt derefter 500 μL trypsin til brønden. Neutraliser derefter trypsinet ved at tilsætte 5 ml frisk kulturmedium.
BEMÆRK: (1) Langvarig trypsininkubation eller ufuldstændig neutralisering kan fordøje cellerne og kompromittere deres cellemembran, hvilket kan skæve resultaterne. Derudover kan det også ændre cellemembranasymmetri og dermed tilgængeligheden til phosphatidylserin. (2) Celler, der har løsnet sig og flød til overfladen, kan medtages i den efterfølgende analyse ved centrifugering af det fjernede substrat ved 300 × g i 5 minutter og resuspendering af cellerne i frisk dyrkningsmedium.
2. Optælling af celler ved hjælp af levedygtighedsanalysen
- Pipette 450 μL propidiumiodid i et mikrocentrifugeglas. Der tilsættes 50 μL af cellesuspensionen til mikrocentrifugeglasset. Inkuber røret ved stuetemperatur i 5 min. Optælling af cellerne efter flowcytometri (se punkt 4).
- Fortynd alle prøver til en koncentration på 1 × 106 celler / ml med cellekulturmedium, før du fortsætter til apoptoseanalyserne.
3. Farvning af celler til flowcytometri
BEMÆRK: Sterile forhold er ikke påkrævet for denne del af protokollen.
- Påvisning af eksternalisering af phosphatidylserin ved anvendelse af Annexin V
- Der tilsættes 100 μL cellesuspension i et mikrocentrifugeglas. Der tilsættes 100 μL af en 1:1 blanding af fluorescerende konjugeret Annexin V og 7-AAD reagens. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min, beskyttet mod lys.
- Analyse af mitokondriel membran depolarisering
- Der centrifugeres 100 μl af cellesuspensionen ved 300 × g i 5 min., og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellerne i 1 ml 1x PBS, tilsæt 100 μL TMRE-farvningsopløsning til hver prøve, og bland suspensionen ved forsigtig backpipettering.
- Cellerne inkuberes i 20 minutter i et befugtet CO2 -miljø ved 37 °C. Pak prøverne ind i ren aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
BEMÆRK: Mitokondriemembranpotentiale er en funktionel markør, der er følsom over for mindre ændringer i cellemiljøet. Derfor bør prøverne inkuberes og måles under identiske betingelser (temperatur, pH og den tid, der er gået mellem inkubationens begyndelse og fluorescerende måling) for at opretholde reproducerbarheden). Bemærk også, at utilstrækkelig beskyttelse af prøver mod lys forårsager fotoblegning af fluoroforer, hvilket resulterer i falsk lavt udsendt fluorescens. - Efter inkubation tilsættes 5 μL af 7-AAD-farvningsopløsningen til hver prøve og blandes. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Påvisning af aktiveret terminal caspase-3 og -7 ved anvendelse af caspasesubstrat DEVD
BEMÆRK: Følgende opløsninger fremstilles, før der udføres denne analyse.- Fortynd det DEVD-bundne DNA-bindende peptid i DMSO til et forhold på 1:8 med steril 1x PBS for at få caspase-detektionen til at fungere. Opbevar opløsningen på is eller ved 2-8 °C, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Hver prøve kræver 5 μL af denne opløsning. - Tilsæt 2 μL af en 7-AAD-stamopløsning til 148 μL 1x PBS for at få 7-AAD til at fungere. Opbevar opløsningen på is eller ved 2-8 °C, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Hver prøve kræver 150 μL af denne opløsning. - 50 μL af cellesuspensionen centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten kasseres. Resuspender cellerne i 50 μL 1x PBS efterfulgt af 5 μL af caspase-detektionsarbejdsløsningen. Bland grundigt.
- Hætten på glassene løsnes og inkuberes i 30 minutter i et befugtet CO2 -miljø ved 37 °C, beskyttet mod lys. Der tilsættes 150 μL af 7-AAD-arbejdsløsningen til hver prøve og blandes. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Fortynd det DEVD-bundne DNA-bindende peptid i DMSO til et forhold på 1:8 med steril 1x PBS for at få caspase-detektionen til at fungere. Opbevar opløsningen på is eller ved 2-8 °C, beskyttet mod lys.
- Påvisning af dobbeltstrengede DNA-brud og total DNA-skade
- 50 μL af cellesuspensionen centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten kasseres.
- Resuspender cellerne i 500 μL 1x PBS. Der tilsættes 500 μL af en formaldehydbaseret fikseringsbuffer og blandes. Inkuber prøverne på is i 10 min.
- Der centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g , og supernatanten kasseres. Resuspender cellerne i 90 μL 1x PBS i et mikrocentrifugeglas. Der tilsættes 10 μL af antistofopløsningen til mikrocentrifugeglasset. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
- Der tilsættes 100 μL 1x PBS og centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten kasseres. Resuspender cellerne i 200 μL 1x PBS.
4. Kør prøver på flowcytometeret.
- Kontroller flowcytometerets analytiske ydeevne ved at køre instrumentets systemkontrolsæt. Fortsæt ikke med at køre prøver, før alle kontroller er afsluttet og bestået.
- Find det ønskede assay ved at gennemse kataloget over forprogrammerede assays på instrumentet, og vælg Kør assay.
- Prøven blandes forsigtigt med tilbagepipettering, inden prøven lægges på flowcytometeret.
BEMÆRK: Tilstrækkelig blanding sikrer, at cellerne forbliver i suspension og forhindrer lave celletal. - Først skal du indlæse en negativ kontrolprøve på flowcytometeret og vælge Kør (Juster indstillinger), så instrumentet begynder at aspirere prøven og giver en forhåndsvisning i realtid af detekterede hændelser. Se materialetabellen for instrumentnavn og detaljer.
- Brug live preview til at justere tærsklerne for fluorescens og cellestørrelse og tegne en rektangulær port omkring cellepopulationen. Træk tærskelmarkøren for at udelukke mobilaffald. Vælg Næste (Indstil sundhedsprofil) for at fortsætte.
BEMÆRK: Det er vigtigt at kende størrelsen på cellerne. Træk skyderne og observer ændringer i, hvordan registrerede hændelser plottes på forhåndsvisningen i realtid, da dette vil informere et nøjagtigt valg af tærsklerne. Hvis celleaffald ikke udelukkes på dette stadium, kan det ikke fjernes i analyser efter erhvervelse. - Tryk og træk kvadrantmarkørerne for at adskille cellepopulationerne, så instrumentplottene registrerede hændelser i realtid. Brug disse afbildninger til at vejlede slutbrugeren om den korrekte placering af kvadrantmarkørerne. Vælg Næste (Bekræft prøver) for at fortsætte, så instrumentet viser en oversigt over indstillingerne. Når du har gennemgået indstillingerne, skal du vælge Næste (Bekræft indstillinger) for at anvende disse indstillinger på alle eksempler i eksperimentet.
BEMÆRK: Instrumentet giver en 2-minutters live preview af celler, der bruges til at justere instrumentets indstillinger. Hvis denne frist udløber, frigiver instrumentet prøven, og trin 4.2.2-4.2.4 gentages. Prøven fjernes og blandes grundigt, inden den genindlæses og fortsættes. - Gate en population af celler ved at tegne et område omkring cellepopulationen. Juster tærskler for fluorescens og cellestørrelse ved hjælp af skyderne på x- og y-aksen i live preview. Anvend disse indstillinger for alle prøver i eksperimentet.
- Bland den første prøve ved forsigtigt at pipettere tilbage, og læg den første prøve på flowcytometeret, og vælg Næste. Navngiv eksemplet, og vælg Kør , så systemet begynder at køre eksemplet.
BEMÆRK: Instrumentet kan kun køre én prøve ad gangen. - Når alle prøver er kørt, skal du gemme eksperimentet ved at give det en passende titel. Gem indstillingerne for det aktuelle eksperiment til hentning i fremtidige kørsler (valgfrit).
- Prøven blandes forsigtigt med tilbagepipettering, inden prøven lægges på flowcytometeret.
5. Analyse efter overtagelsen
- Udfør om nødvendigt finjustering af porte eller kvadrantmarkører efter erhvervelse.
- Find det eksperiment, der skal justeres, ved at navigere i systemets filbrowser, og åbn eksperimentet.
- Tryk på miniatureeksemplet på plottet for at forstørre det. Tryk på øverste venstre eller nederste højre hjørne af celleporten for at justere portens dimensioner. For at justere kvadrantmarkørerne skal du trykke på skæringspunktet mellem de lodrette og vandrette linjer for at flytte markørerne, som de er. For at justere vinklen på en af linjerne skal du trykke på linjen og trække i håndtaget.
- Juster markørerne (som tidligere beskrevet i trin 4.1.3-4.1.4) efter behov, og anvend disse indstillinger på alle prøver i eksperimentet ved at vælge fluebenet , markere alle prøverne og vælge Acceptér.
6. Statistisk analyse
- Kør test i tre eksemplarer og kør en variansanalyse (ANOVA) med en post-hoc Bonferroni-test for at vurdere signifikante forskelle mellem de behandlede prøver og kontroller.
BEMÆRK: Den valgte statistiske test afhænger af efterforskeren og de variabler, der analyseres.
Representative Results
Resultaterne af celletal og levedygtighed (figur 3) viste, at 95,2% af cellerne i prøven var levende, og 4,8% var døde. Den totale cellekoncentration i den oprindelige prøve var 6,20 x 106 celler/ml.
Annexin V og celledødsanalysen (figur 4) viste en signifikant stigning (p < 0,0001) i apoptotiske celler i SiHa-celler behandlet med 100 ng/ml actinomycin D sammenlignet med kontrollerne. Fordi Annexin V-farvning øges i celler under apoptose i det tidlige stadium, antyder dette fund, at 100 ng / ml actinomycin D inducerede apoptose i SiHa-celler.
Mitokondriets elektrokemiske transmembranpotentialeanalyse (figur 5) viste et signifikant fald (p < 0,0001) i cellesundhedsprofiler (levende, depolariseret og levende, depolariseret og død, død) mellem actinomycin D, medium kontrol og opløsningsmiddelkontrol. Disse data tyder på, at 100 ng / ml actinomycin D induceret mitokondriel depolarisering i SiHa-celler.
Caspase 3/7-analysen (figur 6) viste signifikant (p < 0,0001) aktivering af caspase 3 og 7 i SiHa-celler behandlet med 100 ng/ml actinomycin D sammenlignet med kontrollerne. Disse fund viser, at 100 ng / ml actinomycin D induceret apoptose i SiHa-celler.
DNA-skadeanalysen (figur 7) viste, at 100 ng / ml actinomycin D signifikant (p < 0,0001) inducerede DNA-skademarkører, ATM og H2A. X, i SiHa-celler. Dette fund tyder på signifikant stigning i DNA-skader i SiHa-celler behandlet med actinomycin D.
Resultaterne af suboptimale eksperimenter (figur 8) viser analytiske overvejelser på tværs af alle assays. Cellekoncentration påvirker nøjagtigheden af data. I figur 8A er celletallet uacceptabelt lavt. Gated cellepopulationerne i alle 4 kvadranter i prikplottet har lav signalintensitet. Producenten optimerer analysen til 300-700 celler / μL i slutprøvevolumenet. Dette eksempel illustrerer vigtigheden af at bruge den korrekte prøvekoncentration, der er foreskrevet af producenten.
Derudover forårsagede høje cellekoncentrationer også fejlagtige resultater (figur 8B). Mellemstore og eksperimentelle kulturer viste henholdsvis 99,95% og 100% levende celler. Strømningshastigheden for begge assays oversteg producentens optimerede koncentration på 100-500 celler / μL og krævede fortynding med 1x Assay Buffer for at undgå unøjagtig analyse.
Celleklumpning bør undgås under fremstillingen af eksperimentelle kulturer, da det giver falske resultater på grund af øgede cellestørrelsesindekser, som illustreret i bilag V-assayet. Figur 8C viser et dobbelt problem med høj cellekoncentration, der overstiger producentens instruktion og celleklumpning, som det fremgår af cellestørrelsesindekser, der overstiger 4 i SiHa-mediumkontrollen. Den høje cellekoncentration illustreres ved arkering af celler, der danner et klart rødt plan af celler i mellemstore kulturer, hvilket viser uoverensstemmende høje apoptotiske cellepopulationer.
Langvarig farvning af kulturer kan resultere i ikke-specifik binding af proteiner og resultere i falske resultater, som påvist ved Annexin V-assayet. Figur 8D viser lignende resultater for mellemstore og eksperimentelle kulturer på grund af langvarig farvning.
Dårlig prøvehåndtering, udvidet trypsinisering af klæbende celler, kraftig pipettering under vasketrin og højhastigheds- og langvarige centrifugeringstrin forårsager cellelyse og store mængder celleaffald. I figur 8E viser kulturer analyseret af caspase 3/7-analysen øget celleaffald, der fremgår af et lille cellestørrelsesindeks (<2,2 cellestørrelsesindeks). Der bør derfor udvises forsigtighed, når der udarbejdes prøver til dataindsamling.
Figur 3: Celletal og levedygtighedsanalyse. Befolkningsprofilen adskiller affald fra levende og døde celler. Det todimensionelle prikplot er lukket og deler levende og døde cellepopulationer. Informationspanelet giver kvantitative data om celletal, procentdel af samlede levedygtige celler og det samlede antal levedygtige celler i prøven. Disse data kan bruges til at standardisere celletallet i alle prøver til efterfølgende apoptoseanalyser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bilag V-analyse. Alle prøver viser identiske gatingparametre, og statistisk analyse af hver subpopulation afslører en signifikant stigning i apoptose i celler behandlet med actinomycin D. Alle analyser blev udført som tre uafhængige eksperimenter, og hvert eksperiment blev analyseret i tre eksemplarer. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD, og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Mitokondriel elektrokemisk transmembranpotentialeanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametre, og statistisk analyse af hver subpopulation afslører signifikant forstyrrelse i mitokondriemembranpotentiale i celler behandlet med actinomycin D. Alle analyser blev udført som tre uafhængige eksperimenter, og hvert eksperiment blev analyseret i tre eksemplarer. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD, og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Caspase 3/7 detektionsanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametre, og statistisk analyse af hver subpopulation afslører en signifikant stigning i caspase 3/7 aktivitet i celler behandlet med actinomycin D. Alle analyser blev udført som tre uafhængige eksperimenter, og hvert eksperiment blev analyseret i tre eksemplarer. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD, og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: DNA-skadeanalyse. Alle prøver viser identiske gatingparametre, og statistisk analyse af hver underpopulation afslører en signifikant stigning i dobbeltstrenget DNA-skade og total DNA-skade i celler behandlet med actinomycin D. Alle analyser blev udført på tre uafhængige eksperimenter, og hvert eksperiment blev analyseret i tre eksemplarer. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD, og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Suboptimale eksperimentelle betingelser giver dårlige resultater. (A) Lav koncentration af celler, (B) høj koncentration af celler, (C) celleklumpning og aggregering tydelig ved højt cellestørrelsesindeks, (D) langvarig farvning af celleprøver, der fremgår af øget positiv farvning i begge prøver, og (E) dårlig prøvehåndtering tydelig ved øget cellulært affald (cellestørrelsesindeks < 2,2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
I denne undersøgelse afslørede actinomycin D-behandlede SiHa-celler analyseret af FC signifikante tidlige og sene biomarkører for apoptose. Suboptimale betingelser for celleforberedelse, optælling og farvning identificerede unøjagtige resultater, hvilket understreger behovet for nøje overholdelse af producentens anvisninger, når FC udføres.
Denne undersøgelse af apoptose ved tidlig og sen biomarkøridentifikation er i overensstemmelse med NCCD-retningslinjerne1 til undersøgelse af apoptose. Actinomycin D-behandlede SiHa-kulturer viste positive biomarkører for tidlige og sene apoptotiske stadier. Annexin V/PI-analysen og mitokondriepermeabilitetsanalysen viste, at actinomycin D inducerede henholdsvis et PS-flip-mønster og spredning af mitokondriemembranovergangen. Når apoptotiske celler når point of no return induceret af mitokondriel forstyrrelse, aktiveres de terminale caspaser 3,7. Aktiveringen af de terminale caspaser 3 og 7 observeret i denne undersøgelse indikerer apoptose i sen fase. Desuden forårsager terminal caspaseaktivering internukleosomal DNA-spaltning og omfattende DNA-fragmentering, som klassisk er blevet rapporteret som et trinstigemønster observeret ved gelelektroforese28,38.
Den nukleare skade med ATM og H2A. X FC DNA-skadeanalyse viste dobbeltstrengsbrud i DNA og total DNA-skade. Disse resultater bekræftede klassisk nedstrøms caspase-induceret apoptotisk nuklear skade (karyorrhexis og karyorrlysis) i eksperimentelle kulturer. Anvendelsen af multipel flow cytometriske biomarkører detekterede således de sekventielle flertrinshændelser i apoptose og nøjagtigt og reproducerbart identificerede cellepopulationer i tidlige og sene apoptotiske stadier. Disse resultater er i overensstemmelse med de kendte pro-apoptotiske træk ved actinomycin D i kræftbehandling hos mennesker37,39,40,41 og understøtter yderligere brugen af actinomycin D som en positiv kontrol i FC-cellekultureksperimenter, der undersøger apoptose.
Gating af cellepopulationer i denne undersøgelse blev informeret af negative medium og opløsningsmiddelkontroller, som adskilte apoptotiske fra raske celler. Alternativt kan en blanding af populationer af positive og negative kontroller også anvendes til at definere levende og apoptotiske cellepopulationer for at fastsætte cellepopulationsportene 7,9. Når syge og sunde cellulære tilstande er defineret og gated, kan skabelonindstillingerne anvendes på alle efterfølgende eksperimentelle og kontrolkulturer.
Streng overholdelse af FC-protokollen er afgørende for at undgå falske resultater. Under optimeringen af protokollen blev følgende problemer observeret: (1) lav cellekoncentration, (2) høj cellekoncentration, (3) celleklumpning, (4) langvarig farvning og (5) dårlig prøvehåndtering. Disse problemer kan forhindres ved nøje overholdelse af optimerede protokolkrav. Dette understreger den afgørende karakter af præanalytiske og analytiske trin for FC for at opnå nøjagtige data. Under celleforberedelse skal trypsinisering, pipettering, centrifugering og fortyndinger udføres med omhu. Over-trypsinisering og kraftig pipettering kan resultere i henholdsvis kemisk og mekanisk klipning af celler. Langvarig centrifugering med høj hastighed kan resultere i cellenedbrydning og høje cellulære affaldstal. Optimal cellekoncentration er nødvendig for at minimere forkert erhvervelse af cellehændelser. Derfor bør primære cellesuspensioner fortyndes for at opnå optimal cellekoncentration.
Ved håndtering af prøver skal man desuden sørge for at forhindre celleklumpning og cellefragmentering og sikre, at cellerne forbliver suspenderet under analysen. Prøvehåndtering for at forhindre celleklumpning tillader enkelt laminær cellestrøm, forhindrer mekanisk blokering af instrumentets kapillærrør og bremser falske store cellestørrelsesindekser. En anden advarsel er at beskytte kulturer mod lys for at undgå fotooxidation og slukning af fluoroforerne i analyserne for at forhindre falsk-negative resultater. Der skal udvises omhu for at sikre minimal lyseksponering ved cellernes farvningstrin og efterfølgende behandlingstrin. Desuden kan forlængede immunfarvningstider resultere i falsk-positive resultater, da proteiner er ikke-specifikt farvede. Derfor er overholdelse af fabrikantens foreskrevne inkubationsfarvningsperioder vigtig.
Sammenfattende kan FC nøjagtigt detektere apoptose og skelne mellem tidlige og sene apoptosebiomarkører i cellekultur. Derudover har teknologiske fremskridt ført til fremstilling af stationære flowcytometre til ikke-ekspertforskere til at studere cellesundhed og komplekse intracellulære signalveje.
Disclosures
Luminex® Corporation har venligst stillet gebyrer for varebehandling til rådighed.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet økonomisk af National Research Foundation (NRF) og South African Medical Research Council (SAMRC). Vi vil gerne takke National Health Laboratory Service (NHLS) for købet af Guava Muse Cell Analyzer. Alle figurer i denne publikation blev oprettet med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
| Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
| Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
| Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
| Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
| Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
| Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
| PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
| Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
| T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
| Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |
References
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).
- Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H.
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F. Apoptosis. Al-Rubeai, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 33-73 (1998).
- Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z.
- Bio-Rad Laboratories. Introduction to Flow Cytometry Basics. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html (2021).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Detection of localized caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry. Cytometry. 47 (2), 81-88 (2002).
- Castedo, M., et al. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis. J Immunol Methods. 265 (1-2), 39-47 (2002).
- McKinnon, K. M.
- Macey, M. G. Flow cytometry: principles and clinical applications. Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).
- Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
- Darzynkiewicz, Z., et al. Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).
- Ormerod, M. G. The study of apoptotic cells by flow cytometry. Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).
- van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. P. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry. 31 (1), 1-9 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods. 243 (1), 167-190 (2000).
- Jahan-Tigh, R. R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K.
- Lövborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. Screening for apoptosis-classical and emerging techniques. Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).
- Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis. Methods. 112, 105-123 (2017).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods in molecular biology. 263, Clifton, N.J. 141-160 (2004).
- Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis. J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).
- Luminex Corporation. Muse® Annexin V & Dead Cell Kit. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/ (2019).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).
- Apoptosis assays and markers guide. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays (2021).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Saelens, X., et al. Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).
- Muse™ MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit (2013).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).
- Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling. Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).
- Muse® Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview (2019).
- Häcker, G.
- Muse® Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview (2020).
- Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells. International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).
- Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances. Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).
- Szeberenyi, J. The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells. Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).
- Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties. Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).
- Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases. Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).
