Summary
Dendritische Stacheln sind wichtige zelluläre Merkmale des Nervensystems. Hier werden bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Struktur und Funktion von dendritischen Dornen in C. elegans beschrieben. Diese Ansätze unterstützen die Entwicklung von mutierten Screens für Gene, die die Form oder Funktion der dendritischen Wirbelsäule definieren.
Abstract
Dendritische Dornen sind spezialisierte Orte der synaptischen Innervation, die durch Aktivität moduliert werden und als Substrate für Lernen und Gedächtnis dienen. Kürzlich wurden dendritische Dornen für DD GABAerge Neuronen als Eingangsstellen von präsynaptischen cholinergen Neuronen im motorischen Kreislauf von Caenorhabditis elegans beschrieben. Dieser synaptische Schaltkreis kann nun als leistungsfähiges neues In-vivo-Modell der Wirbelsäulenmorphogenese und -funktion dienen, das die einfache Genetik und leichte Zugänglichkeit von C nutzt. Elegans zur Bildgebung lebender Zellen.
Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Strategien zur Beurteilung der Struktur und Funktion der DD-Wirbelsäule. Bei diesem Ansatz wird eine hochauflösende Bildgebungsstrategie verwendet, um die komplizierten Formen aktinreicher dendritischer Dornen zu visualisieren. Um die DD-Wirbelsäulenfunktion zu bewerten, stimuliert das lichtaktivierte Opsin Chrimson die präsynaptischen cholinergen Neuronen, und der Kalziumindikator GCaMP berichtet über die evozierten Kalziumtransienten in postsynaptischen DD-Stacheln. Zusammen umfassen diese Methoden leistungsfähige Ansätze zur Identifizierung genetischer Determinanten von dendritischen Dornen in C. elegans , die auch die Morphogenese und Funktion der Wirbelsäule im Gehirn steuern könnten.
Introduction
Dendritische Dornen sind spezialisierte Zellstrukturen, die von benachbarten Neuronen für die synaptische Übertragung Input erhalten. Die Aktivierung von Neurotransmitterrezeptoren erhöht intrazelluläres Kalzium und nachgeschaltete Signalwege in diesen charakteristischen neuronalen Vorsprüngen1. Aufgrund der fundamentalen Bedeutung der dendritischen Dornen für die Neurotransmission und ihrer Fehlregulation bei neurologischen Entwicklungserkrankungen1 ist die Entdeckung von Faktoren, die die Morphogenese und Funktion der dendritischen Wirbelsäule modulieren, für die Neurowissenschaften von großem Interesse.
Kürzlich wurden dendritische Stacheln im Nervensystem von C. elegans identifiziert, basierend auf Schlüsselmerkmalen, die mit Säugetierstacheln geteiltwerden 2. Diese Bestimmung ist entscheidend, weil sie die Möglichkeit eröffnet, die Vorteile von C. elegans für die Erforschung der Wirbelsäulenbiologie zu nutzen. Dendritische Stacheln auf dorsalen D (DD) Motoneuronen erhalten Input von cholinergen Neuronen (VA und VB) im ventralen Nervenstrang (Abbildung 1A)2,3,4. Hier werden bildgebende Verfahren vorgestellt, um die Struktur von DD-dendritischen Dornen und ihre Funktion in vivo in einem intakten Nervensystem zu erforschen, das für Live-Bildgebung und genetische Analyse leicht zugänglich ist. Zur Überwachung der Form von dendritischen Dornen, (1) zytosolisch fluoreszierende Proteine, die den dendritischen Prozess und die Dornen füllen; (2) membrangebundene fluoreszierende Proteine, die den Rand von dendritischen Dornen und Dendriten schmücken; oder (3) die Aktinmarker LifeAct5 oder Utrophin6 verwendet werden, die mit dendritischen Stacheln angereichert sind und so ihre Form offenbaren. Um die Funktionalität von DD-Dornen zu überwachen, wird GCaMP-Fluoreszenz verwendet, um Ca++-Transienten zu detektieren, die durch Aktivierung des rotverschobenen Opsins Chrimson in präsynaptischen cholinergen Neuronen hervorgerufenwerden 7. Es wird erwartet, dass beide Strategien die Untersuchung von DD-dendritischen Stacheln bei Wildtyp- und mutierten Tieren erleichtern.
Protocol
1. Bestimmung der Struktur der dendritischen DD-Dornen
- Transgene Würmer erstellen, um DD-Stacheln zu kennzeichnen
- Verwenden Sie den flp-13-Promotor , um einen Expressionsvektor für die gewünschte Markierung zu erstellen (z. B. zytoplasmatische mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (Abbildung 1). Siehe die vollständige Liste der Plasmide in der Zusatzakte 1.
- Verwenden Sie etablierte Methoden, um eine transgene Linie zu erzeugen, die DD-Stacheln 8,9 markiert.
- Bereiten Sie das Dichtmittel vor
- Machen Sie eine 1:1-Mischung aus paraffinbasiertem Einbettungsmedium10 (siehe Materialtabelle).
- Erhitzen Sie das Medium bei 60 °C bis zum Schmelzen, aliquot dann in 1,5 ml verschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie einen Heizblock bei 60-70 °C.
HINWEIS: Dichtmittel kann 4 Wochen im Heizblock halten.
- Bereiten Sie ein Anästhetikum vor.
- Stammlösungen aus destilliertemH2Oaus 1% Tricain und 1 M Levamisol herstellen (siehe Materialtabelle). Bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus 0,05% Tricain und 15 mM Levamisolanästhetikum vor, wie in den Schritten 1.3.3-1.3.511 beschrieben.
- Mischen Sie 75 μL 1% Tricain-Brühe und 22,5 μL 1 M Levamisol.
- Fügen Sie M9-Puffer zu einem endgültigen Volumen von 1,5 ml hinzu.
- Aliquot 10 μL 0,05% Tricain, 15 mM Levamisol in 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Die Anästhesiemischung ist temperaturempfindlich, und einzelne Aliquots der Arbeitslösung sollten nach dem Auftauen für jeden Versuch nicht wieder eingefroren werden. Siehe Zusatzdatei 2 für ein Rezept für M9-Puffer.
- Erfassen Sie hochauflösende Bilder
- 10%ige Agarose zubereiten und im Wasserbad bei 60 °C aufbewahren.
HINWEIS: Siehe den Bericht von Monica Driscoll in WormBook12. - Montieren Sie 15-20 junge Erwachsene auf 10% Agarosepads und fügen Sie 3 μL Anästhetikum hinzu (siehe Schritt 3).
- Deckglas auftragen (Würmer werden innerhalb von 5 Minuten immobilisiert).
- Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit geschmolzener Dichtstoff-Klebstoffmischung (siehe Materialtabelle).
- Bilder erfassen
- Super-Resolution-Erfassung
- Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, das für hochauflösende Mikroskopie mit einem 63x/1,40 Plan-Apochromat-Ölobjektiv ausgestattet ist, um eine kleine Pixelgröße (z. B. < 50 nm) zu erreichen. Erwerben Sie Z-Stacks mit der von der Software des Herstellers empfohlenen Schrittweite (siehe Materialtabelle).
- Sammeln Sie eine Reihe optischer Abschnitte, die das Gesamtvolumen des ventralen DD-Prozesses umfassen (z. B. 15-20 Scheiben bei einer Schrittweite von 0,19 μm oder einer Dicke von 2 bis 3 μm). Senden Sie Z-Stacks zur Bildverarbeitung mit der Software des Herstellers und analysieren Sie Bilder mit einer Punktzahl von mehr als 7 (Abbildung 1B, Abbildung 2 und Abbildung 3).
- Übernahme von Nyquist
- Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um die optimale Pixelgröße für die Wellenlänge des Lichts und die numerische Apertur der verwendeten Objektivlinse auszuwählen (z. B. 40x/1,4 Plan Fluor-Ölobjektiv).
HINWEIS: Die kleinere Pixelgröße zeigt die feine Struktur von DD-Stacheln. - Senden Sie den Stack für die 3D-Dekonvolution mit dem automatischen Algorithmus (siehe Materialtabelle) (Abbildung 3).
- Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um die optimale Pixelgröße für die Wellenlänge des Lichts und die numerische Apertur der verwendeten Objektivlinse auszuwählen (z. B. 40x/1,4 Plan Fluor-Ölobjektiv).
- Verwenden Sie den kleinstmöglichen Z-Schritt (z. B. bestimmt durch Piezo-Stufe), da Oversampling in Z nach der 3D-Dekonvolution13 schärfere Bilder liefern kann.
- Super-Resolution-Erfassung
- 10%ige Agarose zubereiten und im Wasserbad bei 60 °C aufbewahren.
- Bildanalyse
- Verwenden Sie geeignete Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle), um Projektionen mit maximaler Intensität der Z-Stacks14 zu erstellen.
- Zählen Sie die Vorsprünge auf dem DD-Dendriten manuell.
HINWEIS: Vorsprünge sind senkrechte Verlängerungen vom Hauptschaft (Abbildung 1B, Pfeilspitzen). - Bestimmen Sie die Länge des DD-Dendriten, um die Dichte der Dornen pro 10 μm DD-Dendrit zu berechnen (Abbildung 1C).
- Klassifizieren Sie Stacheln als dünn/pilzig, filopodial, stumpf oder verzweigt (Abbildung 2A).
HINWEIS: Dünne / Pilzstacheln weisen eine schmale Basis (Hals) und eine breitere Spitze (Kopf) auf. Filopodische Stacheln weisen keine verengte Basis (kein Hals) auf, sondern haben eine konstante Breite. Stummelstacheln haben eine breite Basis und Spitze. Verzweigte Stacheln sind Vorsprünge mit mehr als einer Spitze.
2. Bewertung der Aktivierung von DD-dendritischen Dornen durch präsynaptische cholinerge Signalübertragung
- Transgene Würmer erzeugen mit herkömmlichen Techniken (z.B. Mikroinjektion)8,9
- Verwenden Sie den flp-13-Promotor , um die Expression des Ca++ -Sensors GCaMP6s in DD-Neuronen zu steuern, und den unc-4-Promotor , um die Expression von Chrimson, einem rotverschobenen Kanalrhodopsin, in präsynaptischen VA-Neuronen zu steuern (Abbildung 4A). Siehe die Liste der Plasmide in der Zusatzakte 1.
- Bereiten Sie All-trans Retinal (ATR) und Kontrollplatten vor.
HINWEIS: ATR ist ein erforderlicher Cofaktor, damit Chrimson als optogenetisch aktivierter Ionenkanal fungieren kann.- 100 mM ATR-Stammlösung in Ethanol (100%) herstellen. Bei -20 °C in 1 ml Aliquots lagern.
- Unter einer Laminar-Flow-Haube 300 μL OP50-Bakterienkultur über Nacht und 0,25 μL ATR zu jeder 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) Nährstoff-Agarplatte zugeben und mit einem sterilen Glasstab verteilen.
- Für Kontrollen fügen Sie 300 μL OP50-Bakterien und 0,25 μL Ethanol (100%) zu einer separaten Gruppe von NGM-Platten hinzu.
- Lassen Sie die Teller 24 h bei Raumtemperatur (geschützt vor Umgebungslicht) in der Haube sitzen, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.
HINWEIS: Die Platten können nach der anfänglichen 24-stündigen Inkubation verwendet oder bei 4 °C gehalten werden, um sie innerhalb von 5 Tagen zu verwenden.
- Aufbau des Experiments
- Platzieren Sie fünf NC3569 L4-Larven auf OP50-gesäten ATR- oder Kontrollplatten, denen ATR fehlt und die bei Dunkelheit bei 23 °C wachsen.
- Verwenden Sie drei Tage später ein Stereo-Seziermikroskop, um die Vulvaentwicklung zu bestätigen, um L4-Nachkommen aus ATR und Kontrollplatten für die Bildgebung auszuwählen, wie in den Schritten 2.4.1-2.4.3 beschrieben.
- Auf einen Objektträger 2 μL 0,05 μm Polyperlen (2,5 % Feststoffe w/v) geben (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie einen Platindraht ("Wurmpickel"), um der Lösung eine kleine Kugel Sekundenkleber hinzuzufügen und schwenken Sie sanft, um filamentöse "Klebstoffstränge" zu erzeugen. Fügen Sie dann 3 μL M9-Puffer hinzu (Abbildung 4B).
- Legen Sie etwa zehn L4-Larven in die Lösung und tragen Sie einen Deckglas auf.
HINWEIS: Leimfasern berühren zufällig Würmer und immobilisieren sie, nachdem das Deckglas aufgetragen wurde. Würmer, die in große Klebstoffkügelchen eingebettet sind, erscheinen ausgetrocknet und sollten nicht abgebildet werden. - Die Kanten des Deckglases gemäß Schritt 1.4.4 versiegeln.
- Aufnahme von evozierten Ca++ Transienten in dendritischen Dornen.
- Verwenden Sie ein konfokales Drehscheibenmikroskop, das mit einer empfindlichen CCD-Kamera, einem 100-fachen TIRF-Ölobjektiv und 488 nm und 561 nm Laserlinien ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie den Mikroskoptisch so ein, dass DD-Stacheln in der Brennebene positioniert werden.
- Setup-Zeitraffererfassung zur Beleuchtung der Probe mit 488 nm Laserlinie in jedem Bild (zur Detektion der GCaMP6s-Fluoreszenz) und der 561-nm-Laserlinie in periodischen Intervallen (für Chrimson-Anregung).
HINWEIS: Verwenden Sie beispielsweise 488 nm Licht, um aufeinanderfolgende Schnappschüsse (200 ms) des GCaMP6s-Signals in Verbindung mit einem 200-ms-Impuls von 561 nm Licht in jedem 5. Bild zu erfassen (Abbildung 4C-E). Mit dieser Konfiguration werden GCaMP-Werte vor und nach jedem 561-nm-Puls im Abstand von ~1 s detektiert (200 ms 488-nm-Laser zur Detektion von GCaMP vor der VA-Aktivierung, 200 ms 561-nm-Puls zur Aktivierung von VA und ~600 ms zum Umschalten zwischen Laserlinien und Emissionsfiltern). Mit diesem Aufbau werden VA-Neuronen alle 2,5 s aktiviert.
- Analyse der in vivo Ca++ Bildgebung
- Verwenden Sie 2D-Dekonvolution und Bildausrichtung, um geringfügige Abweichungen zu korrigieren, die durch die Schneckenbewegung während der Aufnahme entstehen (siehe Materialtabelle).
- Definieren Sie die dendritische DD-Wirbelsäule als die Region von Interesse (ROI in den Abbildungen 4C-D).
- Duplizieren Sie den ROI und verschieben Sie ihn in eine benachbarte Region innerhalb des Wurms, um das Hintergrundsignal (z. B. Rauschen) zu erfassen.
- Verwenden Sie geeignete Software (siehe Materialtabelle), um GCaMP6s-Intensitäten für jeden Zeitpunkt zu exportieren. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz von der ROI-Fluoreszenz der Wirbelsäule.
- Bestimmen Sie die Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die GCaMP6s-Fluoreszenz im Rahmen unmittelbar vor der 561 nm Anregung (F0) von jedem Zeitpunkt nach der Anregung (ΔF) subtrahieren und dann durch F0 dividieren, um ΔF / F0 zu bestimmen (Abbildung 4E).
- Zeichnen Sie die normalisierten Leiterbahnen grafisch an (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie einen gepaarten statistischen Test für jede Messung der GCaMP6s-Fluoreszenz vor und nach jedem Puls von 561 nm Licht durch.
HINWEIS: Dieser Ansatz schließt effektiv zufällige Fluktuationen in der GCaMP6s-Fluoreszenz aus, die ansonsten die statistische Aussagekraft des Vergleichs des mittleren GCaMP6s-Signals aus allen Messungen vor und nach 561 nm Anregung verringern (Abbildung 4F). - Für Messungen, die eine Normal- oder Gaußverteilung zeigen, verwenden Sie einen gepaarten parametrischen ANOVA-Test und korrigieren Sie mehrere Vergleiche für jede der beiden Gruppen (ATR vorher vs. nachher, keine ATR vorher vs. nachher). Alternativ können Sie für Daten, die nicht normalverteilt sind, eine nicht-parametrische ANOVA mit Post-hoc-Korrektur für mehrere Tests verwenden.
HINWEIS: Würmer, die auf Platten ohne ATR ("kein ATR") gezüchtet werden, sind notwendige Kontrollen und sollten keine 561 nm-aktivierten Ca++ -Transienten aufweisen, da ATR für die Chrimson-Funktion erforderlich ist.
Representative Results
Messungen mit drei unabhängigen Markern (zytosolische mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) ergaben eine durchschnittliche Dichte von 3,4 ± 1,03 DD dendritischen Dornen pro 10 μm DD-Dendrit bei jungen Wildtyp-Erwachsenen (Abbildung 1B,C). Für diese Analyse wurden die mit dem GFP::Utrophin-Marker erzielten Messungen, die eine signifikant geringere Wirbelsäulendichte ergaben, aufgrund von Wechselwirkungen von Utrophin mit dem Aktin-Zytoskelett6, die möglicherweise die Wirbelsäulenmorphogenese15 antreiben, ausgeschlossen (2,4 ± 0,74, Abbildung 1). Die Messungen der Wirbelsäulendichte im Lichtmikroskop sind vergleichbar mit dem Wert von 4,2 Dornen/10 μm Dendrit, der aus der Rekonstruktion von 12 Dornen aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen des DD1-Neurons2 gewonnen wurde. Der Lebendzell-Bildgebungsansatz bestätigte, dass die dünne/pilzförmige Morphologie der DD-Stacheln in den adulten vs. alternativen Wirbelsäulenformen (z. B. filopodisch, stumpf, verzweigt) vorherrscht (Abbildung 2B), was auch für Stacheln im reifen Säugetiernervensystem typisch ist16.
Eine optogenetische Strategie wurde verwendet, um zu fragen, ob die mutmaßlichen dendritischen Dornen, die durch hochauflösende Lichtmikroskopie detektiert wurden (Abbildung 1 und Abbildung 2), auf die Freisetzung von Neurotransmittern aus präsynaptischen Stellen ansprechen, ein charakteristisches Kennzeichen dendritischer Dornen in Säugetierneuronen. Grünes Licht (561 nm) wurde verwendet, um eine Kanalrhodopsin-Variante, Chrimson, in präsynaptischen cholinergen Neuronen und blaues Licht (488 nm) zu aktivieren, um Ca++-abhängige Fluoreszenz zu detektieren, die von einer zytoplasmatischen GCaMP-Sonde in postsynaptischen DD-dendritischen Dornen emittiert wurde. Dieses Experiment detektierte vorübergehende Ausbrüche des GCaMP-Signals in DD-Stacheln unmittelbar nach der optogenetischen Aktivierung von Chrimson in präsynaptischen VA-Neuronen (Abbildung 3). Der Erfolg dieses Experiments hängt von der zuverlässigen Expression von Chrimson in allen präsynaptischen VA-Neuronen ab. In diesem Fall wurde ein chromosomaler Integrant17 des Punc-4::Chrimson-Markers verwendet, um eine konsistente VA-Expression sicherzustellen. Dieses Experiment könnte auch mit einem extrachromosomalen Array durchgeführt werden. Die Chrimson-Expression in einem spezifischen VA-Neuron kann unabhängig voneinander bestätigt werden, indem beispielsweise das Chrimson-Transgen an eine SL2-transplicierte Leadersequenz mit einem nachgeschalteten nuklear-lokalisierten GFP als Co-Expressionsmarker2 gekoppelt wird. Es ist wichtig, ein Kontrollexperiment in Abwesenheit von ATR durchzuführen, um zu bestätigen, dass das gemessene GCaMP-Signal von der optogenetischen Aktivierung von Chrimson abhängt, die streng ATR-abhängig ist (Abbildung 4D). Da evozierte Ca++ -Signale transient sind, ist es schließlich wichtig, ein Bildgebungsprotokoll zu verwenden, das ein schnelles Umschalten (<1 s) zwischen 561-nm-Anregung und GCaMP-Signalerfassung mit dem 488-nm-Laser ermöglicht (Abbildung 4).
Abbildung 1: Markierung von DD-dendritischen Stacheln . (A) (Oben) Sechs dorsale D (DD1-DD6) Neuronen im ventralen Nervenstrang von C. elegans. (Unten) Bei Erwachsenen berühren ventral gerichtete DD-Stacheln (Pfeilspitze) präsynaptische Terminals von Ventral A (VA) und Ventral B (VB) Motoneuronen (Magenta), und DD-Kommissuren erstrecken sich bis zum dorsalen Nervenstrang, um den Körpermuskeln (Pfeil) GABAergen Output zu liefern18. Diese Abbildung wurde gegenüber Referenz2 geändert. (B) Fluoreszierende Mikroaufnahmen (Airyscan) von DD-Stacheln, markiert mit zytosolischer mCherry, myristoyliertem mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP und GFP::Utrophin bei jungen erwachsenen Würmern. Graue Pfeilspitzen zeigen auf Stacheln. Maßstabsbalken = 2 μm. (C) Dichte (Stacheln/10 μm) von dendritischen DD-Neuronen, markiert mit zytosolischer mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) oder GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Alle Proben sind normalverteilt. One-Way ANOVA zeigt, dass die Wirbelsäulendichte für zytosolische mCherry, MYR::mRuby und LifeAct::GFP nicht signifikant (NS) unterschiedlich ist, während die Wirbelsäulendichte für GFP::Utrophin vs. zytosolisch markierte mCherry (p = 0,0016) und LifeAct::GFP (p = 0,0082). Die gestrichelte rote Linie stellt die Wirbelsäulendichte von DD-Neuronen dar, die aus der 3D-EM-Rekonstruktion bewertet wurden (4,2 Stacheln/10 μm). Diese Abbildung wurde gegenüber Referenz2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bildgebung von DD-dendritischen Stacheln. (A) (Oben) Schematische Darstellung der Wirbelsäulenformen. (Unten) Airyscan-Bilder jeder Art von Wirbelsäule (Maßstabsbalken = 500 nm) markiert mit LifeAct::GFP (grün) und 3D-Rekonstruktionen durch serielle elektronenmikroskopische Aufnahmen eines hochdruckgefrorenen Erwachsenen (blau). (B) Wirbelsäulenfrequenz nach Typ, visualisiert mit LifeAct::GFP: Dünn/Pilz (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Verzweigt (15,42 ± 6,01%). Stachelhäufigkeit nach Typ visualisiert mit MYR::mRuby: Thin/Mushroom (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Branched (9,02 ± 9,6%). Ungepaarter T-Test, Filopodial (p = 0,0339); Stubby- (p = 0,0009) und verzweigte (p = 0,011) Stacheln, die mit dem MYR::mRuby-Marker gekennzeichnet sind, unterscheiden sich signifikant von LifeAct::GFP. Diese Abbildung wurde gegenüber Referenz2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Strategien zur Aufnahme hochauflösender Bilder von DD-Stacheln. (A-B) (Oben) Fluoreszierende Bilder von DD1-Dendriten, markiert mit einem zytosolischen Marker (mCherry) durch (A) Airyscan-Detektor und (B) Nyquist-Akquisition. (Unten) DD-Dendrit (rot) wird mit einer Bildanalysesoftware dargestellt (Auto-Path-Option des Filament-Tracers), und DD-Dornen (blau) werden mit dem halbautomatischen Stachelerkennungsmodul grafisch dargestellt. Der Pfeil zeigt auf einen verzweigten Stachel, der in C und D vergrößert ist. Pfeilspitzen bezeichnen benachbarte dünne / Pilzstacheln, die in C und D vergrößert sind. Maßstabsbalken = 2 μm. (C-D) Vergrößerte Beispiele für (oben) verzweigte Stacheln (Pfeil) und (unten) zwei benachbarte dünne / Pilzstacheln (Pfeilspitzen), die mit (C) Airyscan-Detektor oder durch (D) Nyquist-Erwerb erhalten wurden. Maßstabsbalken = 500 nm. Daten reproduziert aus2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beurteilung der Funktion von DD-Stacheln. (A) DD-Motoneuronen exprimieren den Ca++ -Indikator GCaMP6s (grün) und VA-Motoneuronen die Kanalrhodopsin-Variante Chrimson (Magenta)7. (B) Schematische Darstellung des Verfahrens zur Montage von Würmern für Ca++ -Messungen. (1) Auf einen sauberen Objektträger geben, (2) 2 μL 0,05 μm Polyperlen geben, (3) einen Platindraht ("Wurmpickel") verwenden, um eine kleine Kugel Sekundenkleber hinzuzufügen und (4) in die Lösung wirbeln, um filamentöse Klebstoffstränge zu erzeugen. (5) Fügen Sie 3μL M9-Puffer hinzu. (6) Etwa zehn L4-Larven in die Lösung geben, (7) Deckglas auftragen und Ränder mit Vaseline/Wachs versiegeln. (C-D) Die Aktivierung von VA-Neuronen korreliert mit Ca++ -Transienten in DD1-Stacheln. GCaMP6s-Fluoreszenz, abgebildet (in 0,5 s-Intervallen) mit periodischer Lichtaktivierung von Chrimson (2,5 s-Intervalle), evoziert Ca++ -Transienten mit (C) +ATR (n = 12), aber nicht in (D) Kontrollen (-ATR, n = 12). Panels sind Momentaufnahmen über die Zeit(en), vor und nach dem Puls von 561 nm Licht (vertikale rosa Linie). Maßstabsbalken = 2 μm. Das GCaMP6s-Signal wird von einem ROI (Region of Interest) an der Spitze jeder Wirbelsäule erfasst. (E) GCaMP6s-Fluoreszenz während der 10 s Aufnahmeperiode, die für +ATR (grün) vs -ATR (Kontrolle, grau) (n = 12 Videos) dargestellt wurde. Vertikale rosa Balken bezeichnen 561 nm Beleuchtung (z. B. Chrimson-Aktivierung). Jedes Tier wurde 4 mal mit 561 nm Licht stimuliert. Die Messungen wurden vor und nach jedem Puls von 561 nm Licht gesammelt. (F) Darstellung der GCaMP6s-Fluoreszenz vor und nach jedem Puls von 561 nm Licht. Die GCaMP6s-Fluoreszenz wurde 1 s nach jedem Puls von 561 nm Licht gemessen. Da die Proben nicht normalverteilt sind, wurde ein gepaarter nichtparametrischer Friedman-Test angewendet, um mehrere Vergleiche der GCaMP6s-Fluoreszenz vor vs. nach 561 nm Lichtstimulation für Würmer, die entweder mit ATR (+ATR, grün) (*** p = 0,0004, n = 48 Messungen) oder in Abwesenheit von ATR (-ATR, grau) (NS, nicht signifikant, p = 0,0962, n = 48 Messungen) gewachsen sind. Diese Abbildung wurde gegenüber Referenz2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzdossier 1: Liste der in der Studie verwendeten Plasmide. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Dossier 2: Zusammensetzung und Vorbereitung des M9-Puffers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Der Airyscan-Detektor wurde ausgewählt, um Schnappschüsse von DD-Dornen zu erfassen, da er ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Auflösung als herkömmliche konfokale Mikroskope bietet19,20. Die AiryScan-Bildgebung ermöglicht auch die Verwendung herkömmlicher fluoreszierender Proteine (z. B. GFP, mCherry usw.), die jetzt für C. elegans weit verbreitet sind. Obwohl Bilder mit höherer Auflösung mit anderen Super-Resolution-Methoden (z. B. STORM, STED, PALM) erhalten werden können, erfordern diese Methoden photoaktivierbare oder photoschaltbare fluoreszierende Proteine21. Als Alternative zu Airyscan empfehlen sich herkömmliche konfokale Mikroskope. Zum Beispiel erreicht die Bildgebung mit Nyquist-Akquisition (Abbildung 3) die Pixelgröße mit einem 40x/1,3-Objektiv von 123,9 nm, was ausreicht, um die morphologischen Typen der Wirbelsäule zu unterscheiden (Abbildung 2).
Zur Bestimmung der Wirbelsäulendichte wird die Verwendung eines zytosolisch fluoreszierenden Proteins wie (1) mCherry oder GFP, (2) LifeAct zur Markierung des Aktinzytoskeletts oder (3) eines myristoylierten fluoreszierenden Proteins (z. B. MYR::mRuby) zur Markierung der Plasmamembran empfohlen (Abbildung 1B). Im Vergleich dazu reduziert das F-Aktin-bindende Protein Utrophin die Wirbelsäulendichte (Abbildung 1C), was auf einen negativen Effekt auf die Morphogenese der Wirbelsäule hinweist, wenn Utrophin überexprimiert wird.
Die derzeitigen bildgebenden Verfahren sollen helfen, genetische Varianten zu identifizieren, die die Wirbelsäulenmorphologie steuern 1,16. Die DD-Wirbelsäulenmorphologie (d.h. dünn/pilzig, filopodial, stumpf, verzweigt, siehe Abbildung 2) kann aus einzelnen 2D-Projektionen der lateralen Bilder des ventralen Nervenstrangs beurteilt werden, da die meisten DD-Stacheln eine charakteristisch ventral gerichtete Orientierung annehmen. In diesen Vergleichen ist es wichtig, für jede Erkrankung den gleichen fluoreszierenden Marker zu verwenden, da scheinbare morphologische Typen der Wirbelsäule durch die Markierungsmethode beeinflusst zu werden scheinen (z. B. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Wirbelsäulenformen dynamisch sind und wahrscheinlich ihre Form als Reaktion auf die externen Signale ändern 2,16. Daher ist es auch wichtig, die Wirbelsäulenformen zwischen Genotypen in ähnlichen Entwicklungsstadien und unter ähnlichen Bedingungen zu vergleichen.
Die Ausrichtung des C. elegans-Bauchschnürs ist für eine genaue Bildaufnahme von entscheidender Bedeutung . Sowohl die ventralen als auch die dorsalen Schnüre auf gegenüberliegenden Seiten des Tieres sollten in derselben Z-Ebene sichtbar sein, was darauf hinweist, dass der Wurm auf seiner Seite ausgerichtet ist (Abbildung 1B). Es ist am besten, keine Bilder von Würmern zu sammeln, die sich bewegen oder mit anderen Würmern oder Blasen in der Nähe der Bauchschnur in Kontakt kommen, da dies Bilder von Stacheln verschlechtern kann.
Für die In-vivo-Calcium-Bildgebung müssen unmittelbar vor jeder Aufnahme frische Objektträger vorbereitet werden. Es ist am besten, Würmer in Kontakt mit nur dünnen Klebefasern vs. "Klumpen" von Klebstoff, die dazu neigen, Würmer auszutrocknen und das Bild zu verschlechtern (Abbildung 4B). In dem in Abbildung 4 gezeigten Experiment aktiviert der Puls von 561 nm Licht das gesamte Sichtfeld. Zur Erhöhung der zeitlichen und räumlichen Auflösung zur Detektion lokaler Ca++ -Transienten, beispielsweise innerhalb einzelner DD-Dornen, kann ein Galvo-Mini-Scanner verwendet werden, der für die 561-nm-Laserlinie eingerichtet ist, um einen kleineren Bereich von Interessezu stimulieren 17.
Disclosures
Wir erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Bildgebung und Analyse auf Imaris wurden in der Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) durchgeführt, die von NIH unterstützt wird (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 und EY08126). Der LSM 880 wird durch den Zuschuss 1S10OD201630 unterstützt. Die Bildgebung auf einer sich drehenden Nikon-Scheibe wurde im Nikon Center of Excellence durchgeführt. Wir danken Jenny Schafer, CISR-Direktorin, und Bryan Millis für Schulungen und aufschlussreiche Diskussionen und Mitgliedern des Burnette-Labors: Dylan Burnette, Aidan Fenix und Nilay Taneja für den Rat. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health an DMM (R01NS081259 und R01NS106951) und einen Zuschuss der American Heart Association an ACC (18PRE33960581) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
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