Summary
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode van groei, zuivering en titratie van het oncolytische herpes simplex-virus voor preklinisch gebruik.
Abstract
Oncolytische virussen (OV's), zoals het oncolytische herpes simplex-virus (oHSV), zijn een snel groeiende behandelingsstrategie op het gebied van kankerimmunotherapie. OP's, waaronder oHSV, repliceren selectief in en doden kankercellen (sparen gezonde/normale cellen) terwijl ze antitumorimmuniteit induceren. Vanwege deze unieke eigenschappen worden oHSV-gebaseerde behandelingsstrategieën steeds vaker gebruikt voor de behandeling van kanker, preklinisch en klinisch, waaronder fda-goedgekeurde talimogene laherparevec (T-Vec). Groei, zuivering en titratie zijn drie essentiële laboratoriumtechnieken voor alle OVs, inclusief oHSV's, voordat ze kunnen worden gebruikt voor experimentele studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode om oHSV in Vero-cellen te versterken. Naarmate oHSV's zich vermenigvuldigen, produceren ze een cytopathisch effect (CPE) in Vero-cellen. Zodra 90-100% van de geïnfecteerde cellen een CPE vertonen, worden ze voorzichtig geoogst, behandeld met benzonase en magnesiumchloride (MgCl2),gefilterd en onderworpen aan zuivering met behulp van de sucrose-gradiëntmethode. Na zuivering wordt het aantal infectieuze oHSV (aangeduid als plaquevormende eenheden of PFUs) bepaald door een "plaquetest" in Vero-cellen. Het hierin beschreven protocol kan worden gebruikt om hoog-titer oHSV-voorraad voor te bereiden op in vitro studies in celkweek en in vivo dierproeven.
Introduction
Oncolytische virussen (OV's) zijn een opkomende en unieke vorm van kankerimmunotherapie. OP's repliceren selectief tumorcellen in en lyse (sparende normale/gezonde cellen)1 terwijl ze antitumorimmuniteit induceren2. Oncolytisch herpes simplex-virus (oHSV) is een van de meest uitgebreid bestudeerde virussen onder alle OV's. Het is het verst in de kliniek, met Talimogene laherparepvec (T-VEC) als eerste en enige OV die FDA-goedkeuring in de VS heeft ontvangen voor de behandeling van gevorderd melanoom3. Naast T-VEC worden veel andere genetisch gemanipuleerde oHSV's preklinisch en klinisch getest bij verschillende kankertypen3,4,5,6,7,8. De huidige geavanceerde recombinante DNA-biotechnologie heeft de haalbaarheid van de engineering van nieuwe oHSV's voor therapeutische transgene(n)3,5verder vergroot . Een efficiënt systeem van oHSV propagatie, zuivering en titer bepaling is van cruciaal belang voordat een (nieuw ontwikkelde) oHSV kan worden getest voor in vitro en in vivo studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode van oHSV-groei (in Vero-cellen), zuivering (volgens de sucrose-gradiëntmethode) en titratie (door een oHSV-plaquetest in Vero-cellen) (Figuur 1). Het kan gemakkelijk worden aangenomen in elke bioveiligheid niveau 2 (BSL2) laboratoriuminstelling om een hoogwaardige virale voorraad voor preklinische studies te bereiken.
Vero, een Afrikaanse groene apenniercellijn, is de meest gebruikte cellijn voor oHSV-propagatie9,10,11,12,13 omdat Vero-cellen een defecte antivirale interferonsignaleringsroute hebben14. Andere cellijnen met inactivated stimulator of interferon genes (STING) signalering kunnen ook worden gebruikt voor oHSV-groei12,13. Dit protocol maakt gebruik van Vero-cellen voor oHSV-groei en plaquetest. Na vermeerdering worden met oHSV geïnfecteerde cellen geoogst, gelyseerd en onderworpen aan zuivering, waarbij gelyseerde cellen eerst worden behandeld met benzonasenuclease om gastheercel-DNA af te doen, nucleïnezuur-eiwitaggregatie te voorkomen en de viscositeit van het cellysaat te verminderen. Aangezien een goede activering van benzonase vaak Mg2+vereist , wordt in dit protocol mgCl2 1-2 mM MgCl2gebruikt . Het gastheercelresten van het met benzonase behandelde cellysaat worden verder geëlimineerd door seriële filtratie vóór snelle sucrose-gradiëntcentrifugatie. Een stroperig 25% sucrose-oplossingskussen helpt om een langzamere virusmigratie door de sacharoselaag te garanderen, waardoor gastheercelgerelateerde componenten in het supernatant achterblijven, waardoor de zuivering wordt verbeterd en virusverlies in de pellet wordt beperkt16. De gezuiverde oHSV wordt vervolgens getitreerd op Vero-cellen en virale plaques worden gevisualiseerd door Giemsa-kleuring17 of X-gal-kleuring (voor LacZ-codering van oHSV's)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV groei
OPMERKING: Zorg voor goedkeuring door het instellingscomité voor bioveiligheid voordat u met oHSV werkt. Deze studie werd uitgevoerd onder goedgekeurd IBC Protocol nr. 18007. Houd BSL2-voorzorgsmaatregelen in stand: bleek alle pipetten, tips, buizen en andere materialen die in contact komen met het virus. Spuithandschoenen met 70% isopropylalcohol voordat de handen de BSL2 celkweekkap verlaten. Was altijd grondig de handen met zeepwater na het werken met een virus.
- Op dag -1, zaad low-passage Vero cellen in 20 T-150 cm2 kolven met een dichtheid van 7-8 × 106 cellen/kolf in gewone Vero cel medium.
OPMERKING: Vero medium wordt bereid door Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) aan te vullen met 10% warmte-inactief foetale kalfsserum (IFCS). - Voeg op dag 0 (cellen zijn 80-90% samenvloeiend) oHSV-entmateriaal toe aan de Vero-cellen.
- Bereiding van virus entmateriaal
- Gebruik een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 (MOI kan variëren van 0,01 tot 0,1, afhankelijk van de replicatiecapaciteit van het virus) voor virusversterking. Gebruik formule (1) om de hoeveelheid virus (ml) voor 20 kolven te berekenen.
Hoeveelheid virus (ml) voor 20 kolven = hoeveelheid virus die nodig is (pfu)/titer van het virusbestand (pfu/ml)(1) - Gebruik de fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco met hoge glucose, aangevuld met 1% IFCS om het virusentculum te bereiden (7 ml per T-150 cm2 kolf, d.w.z. ~ 140 ml voor 20 kolven). Voeg de vereiste hoeveelheid oHSV toe aan 140 ml dpbs/1% IFCS-oplossing met hoge glucose, vortex gedurende 1 min en houd het mengsel klaar voor toevoeging aan Vero-cellen.
- Gebruik een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 (MOI kan variëren van 0,01 tot 0,1, afhankelijk van de replicatiecapaciteit van het virus) voor virusversterking. Gebruik formule (1) om de hoeveelheid virus (ml) voor 20 kolven te berekenen.
- Was de T-150 cm2 kolven 2x met hoge glucose DPBS aangevuld met 1% IFCS (10 ml/was). Aspireer de DPBS/1% IFCS en voeg 7 ml virus inentculum/T-150 cm2 kolf toe.
- Schommel de kolven voorzichtig gedurende 5 minuten met behulp van een kolfrots voor een goede verdeling van het entmateriaal over de Vero monolayer en incubeer de kolven vervolgens gedurende 1,5-2 uur op 37 °C. Zorg ervoor dat de incubatorplank waterpas staat.
- Verwijder het entmateriaal en voeg DMEM toe aangevuld met 1% IFCS (25 ml/kolf). Incubeer de kolven gedurende 2-4 dagen.
- Bereiding van virus entmateriaal
- Controleer de kolven dagelijks op 90-100% CPE (zie figuur 2).
- Oogst de met oHSV geïnfecteerde Vero-cellen.
- Verzamel het kweeksupernatant (~20 ml) uit elke kolf (laat ~5 ml in elke kolf) in 50 ml conische centrifugebuizen of mediacontainers.
- Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig van de bodem van de kolven te schrapen.
OPMERKING: De cellen moeten snel uit de kolven komen. - Voeg ~15 ml van het kweeksupernatans (verzameld in stap 1.4.1) toe aan elke kolf (wat het volume van ~20 ml in elke kolf brengt, d.w.z. 400 ml voor 20 kolven) en was de bodem van de kolven een paar keer voorzichtig met een steriele serologische pipet van 10 ml.
OPMERKING: Niet krachtig pipetten. Probeer alle cellen intact te houden. - Verzamel de cellen (+ medium) in 50 ml conische centrifugebuizen op ijs (gebruik 8 buizen om 400 ml geoogste cellen uit 20 kolven te bevatten).
- Draai de cellen op 300 g gedurende 10 min bij 4 °C en aspireer het supernatant.
- Voeg 1,25 ml (50%) toe virusbuffer (VB) en 1,25 ml (50%) van kweeksupernatant (verzameld in stap 1.4.1) aan elke centrifugebuis en hang elke pellet grondig opnieuw op. Breng de resuspenseerde cellen over van acht centrifugebuizen van 50 ml naar één conische centrifugebuis van 50 ml.
OPMERKING: Raadpleeg de bereiding van de VB-oplossing in tabel 1. Filter-steriliseer de VB-oplossing met behulp van een mediasterilisatiefilter. Gebruik 0,5 ml VB + 0,5 ml supernatans per T-150 cm2 kolf voor hersuspensie, d.w.z. voor 20 kolven (20 ml), gebruik 10 ml VB en 10 ml kweeksupernatant. - Vries de opnieuw gesuspendeerde cellen in met droogijs/100% ethanol en bewaar bij -80 °C.
2) oHSV zuivering
- Snap-freeze (in droog ijs en 100% ethanol)/dooi (in een warmwaterbad van 37 °C) de cellen gevolgd door waterbad-sonicatie gedurende in totaal 3 cycli om een goede lysis van de cellen te garanderen om het virus in het supernatant vrij te geven.
OPMERKING: Voer sonicatie uit gedurende 1 min met 40 kHz, 120 V voeding. Als er geen afstembare sonicator beschikbaar is, gebruik dan een ultrasone waterbad sonicator. Neem een aliquot van 50 μL voor titratie in rubriek 3, die zal helpen om te bepalen welke van de volgende stappen verantwoordelijk is voor mogelijk virusverlies tijdens de zuiveringsprocedure. - Behandel het cellysaat met Benzonase Nuclease (175 eenheden/ml) + 2 mM MgCl2 (1 M bouillon = 2 μL/ml), vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Plaats de buis op ijs en voer de volgende stappen uit bij 4 °C.
- Pellet het celresten door centrifugeren met lage snelheid.
- Draai de cellysaat op 300 g gedurende 10 minuten.
- Verzamel het supernatant in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml (hang de celkorrel opnieuw op in 0,5 ml VB, wijs het aan als pellet-1 en bewaar het bij 4 °C voor gebruik in stap 2.3.5; zie figuur 1).
- Draai het supernatant (verkregen in stap 2.3.2) opnieuw op 500 g gedurende 10 min.
- Verzamel het supernatant in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml (hang de celkorrel opnieuw op in 0,5 ml VB, wijs het aan als pellet-2 en bewaar het bij 4 °C voor gebruik in stap 2.3.5; zie figuur 1).
- Combineer de opnieuw gesuspendeerde pellet-1 (vanaf 2.3.2) en pellet-2 (vanaf 2.3.4) tot een nieuwe 1,7 ml centrifugebuis, vortex/sonicaat (waterbad) 2x en draai gedurende 10 minuten op 400 g. Verzamel het supernatant en combineer het met het supernatant verkregen in stap 2.3.4; zie figuur 1).
OPMERKING: Voer sonicatie gedurende 1 min uit met 40 kHz, 120 V vermogen om virale aggregatie te voorkomen vóór de filtratieprocedure in stap 2.4. Neem een 50 μL aliquot van het gecombineerde supernatant voor titratie in rubriek 3.
- Filter het gecombineerde supernatant (~ 21 ml, d.w.z. 20 ml van 1.4.6, 0,5 ml van 2.3.2 en 0,5 ml van 2.3.4) met behulp van de volgende 3-staps filtratiemethode.
- Trek 21 ml van het supernatant met behulp van een spuit van 10 ml (telkens 5-7 ml voor een gemakkelijke doorgang door het filter) en voer het door een steriel 5 μm polyvinylideendifluoride (PVDF) membraanfilter dat op een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml is geplaatst (gelabeld als TUBE 1).
- Voeg 1 ml VB toe aan een conische centrifugebuis van 50 ml die in 2.4.1 is geleegd (om de resterende hoeveelheid virussupernatant), vortex te verzamelen en door hetzelfde 5 μm PVDF-filter te gaan dat op BUIS 1 is geplaatst (waardoor het totaal op 22 ml filtraat komt). Ga verder met stap 2.4.2.
- Trek 22 ml filtraat uit BUIS 1 (zoals in 2.4.1) en passeer het door een steriel 0,8 μm gemengd celluloseester (MCE) membraanfilter dat op een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml (aangeduid als TUBE 2) is geplaatst.
- Voeg 1 ml VB toe aan TUBE 1 geleegd in stap 2.4.2, vortex, en passeer het door hetzelfde 0,8 μm MCE-filter dat op TUBE 2 is geplaatst (waardoor het totaal op 23 ml filtraat komt). Ga verder met stap 2.4.3.
- Trek 23 ml filtraat uit TUBE 2 (zoals in 2.4.1) en passeer het door een steriel 0,45 μm PVDF-filter dat op een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml is geplaatst (gelabeld als TUBE 3).
- Voeg 1 ml VB toe aan TUBE 2 geleegd in stap 2.4.3, vortex, en passeer het door hetzelfde 0,45 μm PVDF-filter dat op TUBE 3 is geplaatst (waardoor het totaal op 24 ml filtraat komt).
OPMERKING: Neem een aliquot van 50 μL van het filtraat voor titratie in rubriek 3.
- Voeg 1 ml VB toe aan TUBE 2 geleegd in stap 2.4.3, vortex, en passeer het door hetzelfde 0,45 μm PVDF-filter dat op TUBE 3 is geplaatst (waardoor het totaal op 24 ml filtraat komt).
- Trek 21 ml van het supernatant met behulp van een spuit van 10 ml (telkens 5-7 ml voor een gemakkelijke doorgang door het filter) en voer het door een steriel 5 μm polyvinylideendifluoride (PVDF) membraanfilter dat op een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml is geplaatst (gelabeld als TUBE 1).
- Centrifugeren met hoge snelheid met behulp van de sucrose-gradiëntmethode
OPMERKING: In dit protocol werd een rotor met vaste hoek F13-14x50cy gebruikt. Zowel de rotor als de centrifuge moeten op 4 °C staan voordat de volgende stappen worden uitgevoerd.- Voeg 10 ml van een ijskoude, steriel gefilterde 25% sacharoseoplossing (bereid door 25 g sacharosepoeder op te lossen in 100 ml Hank's Balanced Salt Solution) toe in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 ml.
- Voeg langzaam (3 ml/min) 24 ml van het virus filtraat (verkregen uit stap 2.4.3.1) toe bovenop de sacharoselaag. Zorg ervoor dat u afzonderlijke lagen van het virus filtraat en de sacharose-oplossing onderhoudt.
OPMERKING: Tot 30 ml van de viruslaag kan worden toegevoegd over 10 ml van de sacharose-oplossing. - Centrifugeer de buis gedurende 90 min bij 22.620 g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en de sacharoselaag uit de 50 ml conische centrifugebuis.
OPMERKING: De viruskorrel moet witachtig zijn. Neem een 50 μL aliquot van het supernatant en een 50 μL aliquot van de sacharoselaag voor titratie in rubriek 3.
- Schors de pellet opnieuw in 10% glycerol/PBS-oplossing.
- Voeg 1 ml steriele 10% glycerol (verdund in PBS) toe aan de conische centrifugebuis van 50 ml om de pellet te bedekken.
OPMERKING: De hoeveelheid van het opnieuw gesuspendeerde mengsel kan variëren (zoals 0,8-1,2 ml) afhankelijk van de korrelgrootte. Een kleiner volume zou een hogere concentratie van het virus geven. - Plaats de conische centrifugebuis van 50 ml 2-4 uur op ijs. Tijdens deze periode soniceert/vortex de pellet elke 15 minuten gedurende 30 s om de pellet te helpen losmaken / opnieuw op te schorten.
- Verzamel de opnieuw gesuspendeerde pellet (1 ml 10% glycerol/PBS + de pelletgrootte brengt het totale volume op ~ 1,3 ml) in een microcentrifugebuis van 2 ml. [Optioneel: Voeg nog eens 0,3 ml glycerol/PBS toe aan dezelfde 50 ml conische centrifugebuis om de resterende sporenhoeveelheid van de pellet te verzamelen, op en neer te gaan en combineer met de opnieuw gesuspendeerde pellet in stap 2.6.3 om het totale volume op ~ 1,6 ml te brengen.]
- Als de suspensie in stap 2.6.3 troebel of troebel is (als gevolg van celresten), centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 500 g, breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml en ga verder met stap 2.6.4.
- Neem een 50 μL aliquot voor oHSV titratie in rubriek 3. Aliquot de rest van de oplossing (250 μL/aliquot) in steriele microcentrifugebuizen met schroefdoppen (goed afgedicht voor langdurige opslag), snap-freeze, en bewaar bij -80 °C tot gebruik (klaar voor experimentele studies zodra de oHSV-titer is bepaald).
OPMERKING: Alle materialen die in contact komen met het virus moeten worden gebleekt of behandeld met ultraviolette straling voordat ze uit de kap worden verwijderd of worden verwijderd.
- Voeg 1 ml steriele 10% glycerol (verdund in PBS) toe aan de conische centrifugebuis van 50 ml om de pellet te bedekken.
3. oHSV titratie en plaque assay
- Zaad 1,7-1,8 x 105 Vero cellen/put in een 6-put celkweekplaat in Vero celmedium (DMEM met 10% IFCS; zie stap 1.1).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen homogeen over de put zijn verdeeld; draai de plaat niet, wat ophoping van cellen in het midden van de putten kan veroorzaken. Om werveling te voorkomen, schommelt u de plaat langzaam met de hand verticaal, vervolgens horizontaal en plaatst u de plaat vervolgens voorzichtig in de incubator. - De volgende dag (wanneer de cellen 70-80% samenvloeiing bereiken), aspireren het kweekmedium en voegen 1 ml / put hoge glucose PBS toe aangevuld met 1% IFCS. Laat de plaat in de celkweekkap staan totdat stap 3.3 is voltooid.
- Verdun het virus serieel in polypropyleen buizen van 5 ml met PBS/1% IFCS (figuur 3).
OPMERKING: Gebruik de 50 μL aliquot die in stap 2.6.4 is verzameld voor seriële verdunning. Voeg in de1e buis (10-3 verdunning) 2 μL van het virus toe in 1998 μL PBS/1%IFCS, vortex. In de2e buis (10-5 verdunning) 10 μL uit de1e buis nemen in 990 μL PBS/1% IFCS, vortex. Neem in de3e buis (10-6 verdunning) 100 μL uit de 2e buis in 900 μL PBS/1% IFCS, vortex; ga door met deze 10-voudige seriële verdunning tot 10-9 verdunning. Zie de details in figuur 3. - Aspireer PBS/1% IFCS en voeg 0,7 ml/put van het serieel verdunde virus (vanaf 10-5 tot 10-9) toe aan Vero-cellen.
OPMERKING: Laat de cellen niet drogen. - Schommel de plaat voorzichtig 5 minuten op een schommel bij kamertemperatuur (om een homogene verdeling van het virusenoculum te garanderen).
- Incubeer de plaat gedurende 1,5 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Bereid tijdens deze incubatieperiode 1:1000 verdunning van humaan immunoglobuline G (IgG) in DMEM, aangevuld met 1% IFCS. Voor een 6-put plaat, bereid 12,5 ml zodat 2 ml / put kan worden gebruikt in stap 3.7. Pas de verdunning aan om rekening te houden met partijvariaties in de menselijke IgG. - Verwijder het virusinoculum uit de putten en voeg 2 ml/put van 0,1% menselijke IgG toe (om de oHSV in het cultuurmedium te neutraliseren en de vorming van secundaire plaques te voorkomen) in DMEM aangevuld met 1% IFCS. Incubeer de plaat gedurende 3-4 dagen bij 37 °C.
OPMERKING: Duidelijke plaques vormen zich meestal binnen 3 dagen. - Bevestigings- en kleurplaten
- Verwijder het supernatant en fixeer de cellen gedurende 5 minuten in pure methanol (1 ml/put). Verwijder de methanol en laat de platen aan de lucht drogen.
- Verdun Giemsa-vlek (1:5) met gedeioneerd water en voeg 1 ml van de verdunde Giemsa-vlek per put toe. Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
- Verwijder de vlek, spoel af met kraanwater en laat de platen aan de lucht drogen.
- Tel de plaquettes met behulp van een ontleedmicroscoop.
- Optioneel voor oHSV's met lacZ-expressie:
- Verwijder het supernatant en fixeer de cellen met koud 0,2% glutaraldehyde/2% paraformaldehyde gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de fixatieve oplossing en was de cellen 3x met PBS.
- Voeg X-gal-oplossing toe aan de cellen (1 ml/put) en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C.
OPMERKING: De X-gal-vlek moet vers worden bereid op de dag van de kleuring; langdurige opslag kan leiden tot vervaging van de kleur. Zie de bereiding van X-gal-oplossing in tabel 1. - Verwijder de X-gal vlek en was de plaat 1 minuut met kraanwater.
- Tegenvlek met Neutral Red oplossing (1 ml/put) gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zie de bereiding van neutral red-oplossing in tabel 1. - Was de plaat 1 minuut met kraanwater; laat de platen aan de lucht drogen.
- Tel blauwe plaques met behulp van een ontleedmicroscoop (Figuur 4).
- Bereken de titer met behulp van formule (2)
Titer in pfu/ml (plaquevormende eenheden) = Aantal plaques/0,7 ml × verdunningsfactor (2)
OPMERKING: Als er bijvoorbeeld 25 plaques worden gevonden in de verdunningsput van 10-9, is de titer 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Dit is de laatste oHSV-titer van aliquots bereid in stap 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een kort overzicht van het hele protocol is weergegeven in figuur 1, die de kritieke stappen vertegenwoordigt die betrokken zijn bij de groei, zuivering en titratie van oHSV. CPE in Vero-cellen kan al na 4 uur post-HSV-infectie worden gedetecteerd19. Figuur 2 toont CPE in Vero-cellen op drie verschillende tijdstippen na oHSV-infectie. Het niveau van de CPE wordt in de loop van de tijd verhoogd. In dit protocol wordt 90-100% CPE meestal waargenomen binnen 48 uur na inenting van laag-MOI oHSV (wat het beste moment is om cellen te oogsten voor zuivering). Het kan echter tot 4 dagen duren, afhankelijk van de oHSV MOI die is ingeënt in stap 1.2 en/of het replicatiepotentieel van de oHSV. Na deze periode kunnen cellen met CPE worden gelyseerd, wat leidt tot de afgifte van het virus in het supernatant. Dus om een hoge virale titer te verkrijgen, is het van cruciaal belang om cpe-aangetaste cellen te oogsten wanneer ze intact zijn. Een andere belangrijke factor die bijdraagt aan de uiteindelijke virustiter is het aantal of de grootte van de weefselkweekkolven die worden gebruikt voor oHSV-versterking. Figuur 3 toont het proces van seriële verdunning (10-3 tot 10-9) van een bepaald virusbestand (verkregen in stap 2.6.4) dat nodig is voor de bepaling van de plaquetest. Voor oHSV's met lacZ-expressie kunnen virale plaques worden gevisualiseerd door X-gal-kleuring (Figuur 4). In dit protocol werden 20 T-150 cm2 weefselkweekkolven gebruikt, waarvoor 1,3-1,6 ml oHSV-voorraad met een titer van 1 × 1010 pfu/ml kan worden verwacht.
Figuur 1: Een schematische weergave van belangrijke stappen die betrokken zijn bij oHSV-groei, zuivering en de plaquetest. Afkortingen: oHSV = oncolytisch herpes simplex virus; CPE = cytopathisch effect; VB = Virusbuffer; HBSS = Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Cytopathisch effect in Vero cellen na oHSV infectie. Vero-cellen werden ingeënt met oHSV-codering voor mCherry (weergegeven in rode fluorescentie) bij een MOI van 0,01 en afgebeeld (10x vergroting) bij 36, 48 en 72 uur post-virusinfectie. CPE wordt geïdentificeerd door afronding van de met oHSV geïnfecteerde cellen (aangegeven met zwarte pijlen). Schaalbalken = 200 μm. Afkorting: oHSV = oncolytisch herpes simplex virus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Een seriële verdunning van een oHSV-bestand voor plaquetesten. Zie ook stap 3.3 van het protocol. Afkorting: oHSV = oncolytisch herpes simplex virus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Een representatief beeld van X-gal-bevlekte plaques bij 72 uur post-oHSV infectie. Onverdunde (bovenste put) en verdund (1:10; onderste put) oHSV-geïnfecteerde celkweeksupernatanten toegevoegd aan Vero-cellen (70-80% samenvloeiing), gevolgd door X-gal-kleuringsprotocol beschreven in rubriek 3.8.5 (met uitzondering van tegenkleuring met Neutraal Rood). Representatieve afbeeldingen van een X-gal-bevlekte virusplaque (van het linkerpaneel) worden gepresenteerd in het midden (4x; schaalbalken = 1000 μm) en rechts (10x; schaalbalken = 200 μm) panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Oplossingssamenstelling | |
| Voorbereiding van virusbuffer | hoeveelheid |
| 1 M Natriumchloride | 15 ml |
| 1 M Tris-hydrochloride | 3 ml |
| Gezuiverd water | 132 ml |
| pH aanpassen tot 6,8 | |
| Bereiding van X-gal oplossing (~6,5 ml voor een 6-put plaat) | |
| 250 mM kalium ferricyanide | 130 μL |
| 250 mM kaliumferrocyanide | 130 μL |
| 1 M Magnesiumchloride | 13 μL |
| X-gal voorgeoplossingd (20 mg/ml) in dimethylsulfoxide (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Bereiding van Neutral Red oplossing voor één 6-put plaat | |
| Neutrale rode oplossing | 100 μL |
| methanol | 1 ml |
| Gezuiverd water | 7 ml |
Tabel 1: Samenstelling van de oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol begint met de groei van oHSV in low-passage Vero cellen. De samenvloeiing van de Vero-celmonolaag moet ~ 80% zijn op het moment van virusinenting, omdat overwoekerde cellen strakke vezelige structuren kunnen ontwikkelen die de oHSV-invoer in Vero-cellen kunnen verminderen20. Zodra 90-100% CPE is waargenomen, wordt het kweeksupernatant verwijderd, cellen geoogst, geresuspendeerd in VB/supernatant (zie stap 1.4.6), snap-frozen en opgeslagen bij -80 °C voor latere zuivering. Blaho en collega's gebruikten een iets andere methode voor het oogsten en opslaan van geïnfecteerde Vero-cellen. Zo worden de kolven met de cellen en kweekmedia (aangevuld met 1% runderserumalbumine en PBS met kalium) in eerste instantie gedurende ten minste 15 minuten bij -80 °C bewaard, gevolgd door een langzame opwarming van de kolven bij kamertemperatuur. De cellen worden vervolgens geoogst, gemengd met steriele melk en opgeslagen bij -80 °C tot zuivering20. In dit geval fungeert steriele melk als een stabilisator en is aangetoond dat de titer van een virusbestand dramatisch hoger is wanneer het wordt opgeslagen in steriele melk/medium dan in medium alleen20. In een andere studie toonde een directe vergelijking tussen verschillende stabilisatoren (inclusief steriele melk) die werden gebruikt voor de opslag van verschillende herpesvirussen bij -80 °C echter geen significante impact op de uiteindelijke virustiters21. Hier werd de celkorrel opnieuw gesuspendeerd in VB, gevormd met Tris-buffer zoutoplossing (pH 6,8) en 10% glycerol als opslagstabilisator, wat meestal een hoog virus titer geeft (zoals beschreven in stap 3.10) voor experimentele studies.
Het is van cruciaal belang om alle cellulaire en mediagerelateerde componenten uit de opnieuw gesuspendeerde pellet te verwijderen om een hoogwaardige virusvoorraad te verkrijgen. De verwijdering van niet-virale deeltjes is cruciaal om potentiële immuunreacties tijdens in vivo experimenten te voorkomen. Verschillende methoden voor viruszuivering zijn beschreven, waaronder centrifugeren22, verschillende gradiëntmethoden23,filtratie 24en affiniteitschromatografie25. Hoewel dit protocol is gebaseerd op centrifugeren met hoge snelheid met behulp van een sucrose-gradiëntmethode, zijn door anderen verschillende andere gradiëntmethoden gebruikt, zoals jodxanol11,26, Percoll27en Ficoll-Nycodenz23. Deze gradiëntmethoden scheiden het virus door dichtheid en vereisen isolatie van de band van de gradiënt, in plaats van het sacharosekussen waar het virus wordt geplet. De sucrose-gradiëntmethode biedt een zachte benadering om virale deeltjes te scheiden, omdat het het risico minimaliseert om virale envelopeiwitten te verstoren met behoud van virale infectiviteit. Ondanks deze voordelen kan de hoge osmolariteit van de geconcentreerde sacharoseoplossing de virale deeltjes uitdrogen; daarom werd de iodixanol gradiëntmethode ontwikkeld om dit nadeel te overwinnen. De iodixanol gradiëntmethode vereist echter ultracentrifuge en verzameling van de virionband. Andere factoren waarmee rekening moet worden gehouden tijdens oHSV-zuivering zijn snelheid en tijd van centrifugeren en de keuze van de virusbuffer die wordt gebruikt voor langdurige opslag. Dit protocol heeft de beperking dat de zuiverheid van oHSV niet wordt bevestigd; een groot aantal functionele virusdeeltjes werd echter gevonden in een bepaald gezuiverd oHSV-bestand door titratie op Vero-cellen (zie rubriek 3).
oHSV vormt plaques op Vero-cellen (figuur 4). De virale plaques kunnen worden geïdentificeerd door Giemsa-kleuring, wat een gemakkelijke en handige methode is. Giemsa vlekken Vero cellen, waardoor de virale plaques transparant of leeg die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd (blote oog) en geteld met behulp van een ontleden microscoop. Terwijl het bedekken van de media met agarose of methylcellulose vaak wordt gebruikt tijdens plaquevorming (in stap 3.7) om de verspreiding van het virus en secundaire infecties en plaquestaarten28te voorkomen, is het gebruik van menselijke IgG om oHSV in de cultuursupernatant te neutraliseren gemakkelijker en handiger. Voor oHSV's die lacZuitdrukken , kunnen plaques worden gevisualiseerd door X-gal-kleuring(figuur 4),terwijl fluorescerende microscopie wordt gebruikt voor fluorescerend eiwit (d.w.z. groen fluorescerend eiwit) dat oHSV's uitdrukt18. Aanvullende testen om met oHSV geïnfecteerde cellen te detecteren zijn immuno-histochemische of -fluorescentie met oHSV-specifieke antilichamen29 of lasergebaseerde scanning van near-infrared fluorofoor-geconjugeerde oHSV-specifieke antilichamen30.
Er zijn kritische maatregelen die moeten worden genomen om een goede virusvoorraad te bereiken, zoals het handhaven van steriliteit om microbiële (bacteriën, gist of schimmel) besmetting en gezonde Vero-cellen te voorkomen. Aangezien de envelop van oHSV uiterst thermogevoelig is20,moet de oHSV-voorraad worden behandeld in een cryoprotectant zoals 10% glycerol. Over het algemeen kan dit protocol gemakkelijk worden gebruikt en geoefend in een laboratoriumomgeving, maar is het mogelijk niet nuttig voor grootschalige virusproductie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR is een mede-uitvinder van octrooien met betrekking tot oncolytische herpes simplex-virussen, eigendom van en beheerd door Georgetown University en Massachusetts General Hospital, die royalty's hebben ontvangen van Amgen en ActiVec Inc. en deel uitmaakt van de Wetenschappelijke Adviesraad van EG 427. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek in het Saha lab werd mede ondersteund door fondsen van de DOD (W81XWH-20-1-0702) en Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin en Melissa R.M. Humphrey werden gedeeltelijk ondersteund door NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J.
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
