Summary
Se describe un protocolo estándar para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad asociada de IL-1α en un modelo singénico de ratón de HNSCC.
Abstract
La terapia con citoquinas es una estrategia inmunoterapéutica prometedora que puede producir respuestas inmunitarias antitumorales robustas en pacientes con cáncer. La citoquina proinflamatoria interleucina-1 alfa (IL-1α) se ha evaluado como agente anticancerígeno en varios estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, las toxicidades limitantes de la dosis, incluidos los síntomas similares a la gripe y la hipotensión, han disminuido el entusiasmo por esta estrategia terapéutica. La administración de IL-1α basada en nanopartículas de polianhídrido (NP) representaría un enfoque efectivo en este contexto, ya que esto puede permitir una liberación lenta y controlada de IL-1α sistémicamente al tiempo que reduce los efectos secundarios tóxicos. Aquí se describe un análisis de la actividad antitumoral de NPs de polianhídrido cargados con IL-1α en un modelo de ratón singénico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Las células epiteliales orofaríngeas murinas que expresan de manera estable HPV16 E6 / E7 junto con células hRAS y luciferasa (mEERL) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL / 6J. Una vez que los tumores alcanzaron 3-4 mm en cualquier dirección, se administró una formulación de nanopartículas (IL-1α-NP) cargadas con 1,80% de IL-1a (p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano:1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano (CPTEG: CPH) cargadas con 1,5% de IL-1a (CPTEG: CPH) a ratones por vía intraperitoneal. El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron continuamente hasta que el tamaño del tumor o la pérdida de peso alcanzaron los criterios de eutanasia. Se tomaron muestras de sangre para evaluar las respuestas inmunes antitumorales mediante venopunción submandibular, y se midieron citocinas inflamatorias mediante ensayos multiplex de citoquinas. Los ganglios linfáticos tumorales e inguinales se resecaron y homogeneizaron en una suspensión unicelular para analizar varias células inmunes a través de citometría de flujo multicolor. Estos métodos estándar permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y el mecanismo potencial de las NP inmunoestimulantes y otros agentes de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer.
Introduction
Una de las áreas emergentes de la inmunoterapia contra el cáncer es el uso de citoquinas inflamatorias para activar el sistema inmunológico de los pacientes contra sus células tumorales. Varias citocinas proinflamatorias (es decir, interferón-alfa (IFNα), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 (IL-1)) pueden aumentar una inmunidad antitumoral significativa, lo que ha generado interés en explorar las propiedades antitumorales, así como la seguridad de los fármacos basados en citoquinas. La interleucina-1 alfa (IL-1α) en particular, es una citoquina proinflamatoria conocida como la citoquina maestra de la inflamación1. Desde el descubrimiento de esta citoquina a finales de la década de 1970, se ha investigado como un agente anticancerígeno, así como un fármaco hematopoyético para tratar los efectos negativos de la quimioterapia2. A finales de la década de 1980, se realizaron varios estudios preclínicos y clínicos para determinar los efectos anticancerígenos de IL-1α 3,4,5,6. Estos estudios encontraron una actividad antitumoral prometedora de IL-1α recombinante (rIL-1α) contra el melanoma, el carcinoma de células renales y el carcinoma de ovario. Sin embargo, se observaron con frecuencia toxicidades, como fiebre, náuseas, vómitos, síntomas similares a los de la gripe y, más gravemente, hipotensión limitante de la dosis. Desafortunadamente, estas toxicidades relacionadas con la dosis disminuyeron el entusiasmo por un mayor uso clínico de rIL-1α.
Para intentar abordar el problema crítico de las toxicidades mediadas por IL-1α, se investigarán formulaciones de nanopartículas de polianhídrido (NP) que permitan la liberación controlada de IL-1α por cinética de erosión superficial. Estas formulaciones NP están destinadas a cosechar los beneficios de las propiedades antitumorales de IL-1α al tiempo que reducen los efectos secundarios limitantes de la dosis7. Los polianhídridos son polímeros aprobados por la FDA que se degradan a través de la erosión superficial, lo que resulta en una liberación de orden casi cero de agentes encapsulados 8,9,10,11,12. Se ha informado que los copolímeros de polianhídrido anfifílico que contienen 1,8-bis-(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano (CPTEG) y 1,6-bis-(p-carboxifenoxi) hexano (CPH) son excelentes sistemas de administración para diversas cargas útiles en oncología e investigación basada en inmunología 8,12. En el siguiente protocolo 20:80 CPTEG:CPH NPs cargados con 1,5% en peso de rIL-1α (IL-1α-NPs) se utilizarán para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad de esta citoquina en un modelo de ratón de HNSCC.
El objetivo general de los siguientes procedimientos es evaluar la actividad antitumoral de IL-1α-NP en los HNSCC. Los procedimientos descritos, incluida la evaluación del crecimiento y la supervivencia del tumor, se pueden aplicar a cualquier agente inmunomodulador de interés. Estos procedimientos deben realizarse en un modelo de ratón singénico con un sistema inmuneintacto 13 para maximizar la relevancia clínica. La toxicidad de IL-1α-NP también se evaluará midiendo los cambios en los niveles circulantes de citoquinas proinflamatorias y el peso animal. Existen muchos métodos para determinar la toxicidad in vivo de los fármacos; Sin embargo, los métodos más utilizados implican la medición de las enzimas séricas para la toxicidad de los órganos y los cambios histológicos en esos órganos. Sin embargo, para realizar análisis histológicos, el animal necesita ser sacrificado, lo que afectará las curvas de supervivencia del experimento. Por lo tanto, este protocolo incluirá un protocolo para la recolección de sangre de ratones vivos para la medición de citoquinas en muestras de suero. El suero recolectado se puede utilizar para la medición de cualquier analito sérico deseado para la toxicidad de los órganos. La citometría de flujo multicolor se utilizará para comprender los cambios en la población de células inmunitarias en el microambiente tumoral y la migración de células inmunitarias al ganglio linfático. Se pueden utilizar otros métodos para identificar células inmunes, incluyendo inmunohistoquímica y/o inmunofluorescencia de secciones preservadas14. Sin embargo, estas técnicas pueden llevar mucho tiempo y ser tediosas de realizar en un gran número de animales. En general, los siguientes métodos permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y los posibles mecanismos de los agentes inmunoestimulantes para el tratamiento del cáncer.
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Protocol
Todos los procedimientos in vivo utilizados en este estudio fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Universidad de Iowa.
1. Preparación y mantenimiento de la línea celular HNSCC
NOTA: En este estudio, se utilizará la línea celular epitelial orofaríngea murina transformada de manera estable con VPH E6 y E7 junto con hRas y luciferasa (mEERL). Esta línea celular se desarrolló a partir de la cepa de ratón C57BL / 6J y fue un regalo de la Dra. Paola D. Vermeer (Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina Sanford de la Universidad de Dakota del Sur, Dakota del Sur, EE.
- Descongele un vial congelado de células mEERL en un baño de agua precalentado (37 °C) y luego transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml que contenga medios de cultivo calientes (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] suplementado con 40.5% 1: 1 DMEM / Hams F12, 10% de suero fetal bovino [FBS], 0.1% de gentamicina, 0.005% de hidrocortisona, 0.05% de transferrina, 0.05% de insulina, 0.0014% de triyodotironina y 0.005% de factor de crecimiento epidérmico).
- Centrifugar el tubo cónico a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio. A continuación, resuspender el pellet celular en medios frescos de 3-5 ml y transferirlo a un matraz de cultivo celular T-25. Para una recuperación óptima del almacenamiento congelado, células en placa a alta densidad.
NOTA: Los matraces T-25 se utilizaron debido a su tamaño más pequeño, lo que resulta en tiempos de recuperación más rápidos del almacenamiento congelado cuando las celdas están muy cerca en comparación con los matraces T-75. - Deje que las células crezcan en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2, expanda a matraces más grandes (es decir, T-75 o T-150) y pase cada 3 días. Cuando haya suficientes células para la implantación deseada en todos los ratones, retire los frascos, deseche el medio y enjuague suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, añadir 4 ml (si se utilizan matraces T150) de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar a 37 °C durante 2 min. Aumente o disminuya la cantidad de tripsina según el tamaño del plato/matraz que se utilice.
NOTA: El tipo de línea celular y el grado de confluencia pueden afectar los tiempos de tripsinización. Los largos períodos de tripsinización pueden dañar las células, lo que resulta en una baja viabilidad. Utilice la cantidad mínima de tiempo necesaria para la tripsinización. - Bajo el microscopio, las células separadas en la tripsinización se mueven libremente. Si algunas células todavía están unidas, golpee muy suavemente el matraz para movilizar las células adherentes restantes. Agregue medios nuevos (escala la cantidad de medios según lo desee) para detener la reacción de tripsina y recoja la suspensión celular en tubos cónicos de 50 ml. Centrifugar a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio.
- Resuspenda las células en medios frescos y cuente las células. Centrifugar una vez más (como se describió anteriormente), y luego agregar PBS frío a las células para obtener una concentración final de 10 × 106 células / ml. Mantenga la(s) suspensión(es) celular(es) en hielo antes de inyectarla en ratones.
2. Implantación del tumor, tratamiento farmacológico y medición
NOTA: Los animales experimentales se mantuvieron en el Centro de Cuidado de Animales de la Universidad de Iowa y siguieron los procedimientos asépticos apropiados para manejarlos.
- Anestesiar ratones C57Bl/6J con ketamina (80 mg/kg) y xylazina (10 mg/kg) mezcla. Afeite cuidadosamente el área del flanco o el sitio de inyección deseado con una máquina de afeitar eléctrica.
NOTA: Recuerde documentar el uso de sustancias controladas según lo requerido por las reglas y regulaciones institucionales (u otras). - Desinfecte el área del flanco con una almohadilla de etanol e inyecte lentamente 100 μL (que contiene 1 x 106 células) de la suspensión celular por vía subcutánea utilizando una jeringa de 25-28 G. Anestesiar a los ratones antes de la inyección para evitar movimientos bruscos y pérdida de células. Antes de cada inyección, mezcle suavemente la suspensión celular para evitar que las células se depositen en el fondo del vial o tubo cónico.
- Después de tomar la suspensión celular en la jeringa, retire todas las burbujas y el espacio muerto de la parte superior. Inyecte la suspensión celular de manera lenta y constante. No use la misma aguja en varios ratones. Siempre haga suspensiones celulares adicionales para tener en cuenta la pérdida accidental.
- Coloque al animal en sus respectivas jaulas y monitoréelo hasta que se recupere de la anestesia. Durante la anestesia, los animales están en riesgo de hipotermia; Por lo tanto, proporcione calor suplementario o coloque a los ratones cerca uno del otro para mantenerse calientes (si están alojados en la misma jaula).
- Cuando los tumores alcancen los 3 mm en cualquier dirección, aleatorice a los ratones (por tamaño y/o peso del tumor) en los grupos de tratamiento y luego comience el tratamiento farmacológico. Inyectar los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) con NPs15 que contienen 3,75 μg de rIL-1α/ratón en los días 4 y 9. Mida y registre el volumen del tumor ((largo x ancho 2) /2) y el peso del ratón diariamente o cada dos días hasta que el tamaño del tumor o los ratones alcancen los criterios de eutanasia.
NOTA: Incluso con un investigador experimentado, es difícil implantar el tumor del mismo tamaño en todos los ratones. Aleatorizar a los animales en grupos experimentales según el tamaño del tumor y el peso del ratón.
3. Extracción de sangre y separación del suero
NOTA: La recolección de sangre de una vena submandibular es una técnica fácil y efectiva que permite la recolección de sangre de animales conscientes o bajo anestesia. Para este estudio, se recolectó sangre de los animales cuando estaban bajo anestesia.
- Anestesiar a los ratones con una inyección de mezcla de ketamina / xilazina como se mencionó anteriormente.
- Agarre la piel suelta sobre el hombro con la mano no dominante y perfore la vena submandibular con una aguja o lanceta de 18 G, ligeramente detrás de la mandíbula (una mancha blanca en esa área).
- Perfore la vena para asegurar el flujo sanguíneo inmediatamente. Recoja 200-300 μL de sangre (dependiendo del peso del ratón) en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml o en un tubo separador de suero. Después de la recolección de sangre, aplique una presión suave en el sitio de punción hasta que el sangrado se haya detenido. Devuelva a los ratones a sus respectivas jaulas y observe hasta que se recuperen de la anestesia.
NOTA: No recoja más del 1% del peso corporal del ratón en una colección o durante un período de 24 horas. - Deje que la sangre recolectada coagule a temperatura ambiente durante 20-30 min. Coloque los tubos sobre hielo hasta que estén listos para centrifugarse.
- Centrifugar la sangre coagulada a 1540 x g durante 15 min a 4 °C.
- Recoja la capa superior (suero) sin alterar los glóbulos rojos. Conservar a -80 °C hasta su uso.
4. Multiplexación del suero recogido
- Descongele las muestras de suero o plasma mientras las mantiene en hielo.
- Centrifugar las muestras a 1540 x g durante 5 min a 4 °C para sedimentar cualquier residuo celular y recoger cuidadosamente la capa de suero de la parte superior.
- Saca el kit multiplex a temperatura ambiente.
NOTA: Hay varios kits multiplex disponibles comercialmente que están diseñados para citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento específicos. Además, es posible personalizar el kit en función de la proteína de interés. - Realice el ensayo según el protocolo del fabricante para detectar citoquinas.
NOTA: La mayoría de los kits multiplex utilizan perlas magnéticas para unir el anticuerpo capturado. Por lo tanto, es esencial utilizar una lavadora magnética automatizada o de mano durante el lavado. De lo contrario, las cuentas magnéticas se lavarán de la placa y uno no tendrá suficientes eventos para tomar la lectura.
5. Recolección del tumor y ganglio linfático inguinal y preparación de la suspensión unicelular
- Anestesiar a los ratones con una mezcla de ketamina/xilazina. Para asegurar una sedación completa, use reflejo del pedal (pellizco firme del dedo del pie). Si los ratones no responden, eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
- Coloque cada ratón sobre su espalda y rocíe etanol al 70% sobre la piel del área abdominal. Use fórceps y tijeras para cortar el tumor del lado izquierdo de los ratones y el ganglio linfático del lado derecho. Si el tumor es grande, córtelo en trozos pequeños y tome 500-600 mg del tejido. Para el ganglio linfático, recoja todo el órgano.
NOTA: Hay dos ganglios linfáticos a ambos lados de la región inguinal. Dependiendo de los objetivos experimentales, el ganglio linfático y el tumor se pueden aislar del mismo lado. Sin embargo, si el tumor se vuelve muy grande, no será fácil recolectar el ganglio linfático del mismo lado. - Coloque los tejidos en los tubos disociadores respectivos que contienen 3-5 ml de medios RPMI. Homogeneizar el tejido utilizando un disociador automatizado.
NOTA: Se pueden utilizar otros homogeneizadores automáticos o portátiles. - Después de la homogeneización, transfiera la suspensión celular a través de un filtro de 70 μm a un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio. Lave y resuspenda las células en 1-2 ml de PBS frío.
6. Tinción FACS de suspensión unicelular
- Use tinción de azul de tripano al 0.4% para contar las células viables en un hemocitómetro. Calcule el volumen requerido para obtener 2-3 millones de células y transfiéralas al tubo FACS respectivo.
- Use un tinte de viabilidad para bloquear las células vivas; De lo contrario, puede ocurrir una unión inespecífica del anticuerpo con células muertas que puede producir un resultado falso positivo.
NOTA: El tinte zombie se utilizó para la tinción de células vivas y muertas en este experimento. Varios colorantes reparables y no reparables (por ejemplo, yoduro de propidio) están disponibles comercialmente. - Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) las celdas contadas. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 300 μL de PBS. Agregue 0.5-1 μL de tinte / tubo zombie. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
- Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las células con 1-2 ml de tampón FACS y resuspenderlas en 200 μL de tampón FACS.
- Agregue un bloqueador del receptor Fc (2 μL por 200 μL o según el protocolo del fabricante) e incube las células durante 10 min.
- Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las celdas con 1-2 ml de tampón FACS. Añadir el cóctel de anticuerpos e incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
- Después de la incubación, centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las células con 1-2 ml de tampón FACS. Añadir 300-400 μL de solución de paraformaldehído al 2% y resuspender para fijación. Almacenar las células en este paso durante un par de días a 4 °C o analizar inmediatamente con citómetro de flujo multicolor.
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Representative Results
En este estudio, se investigó la actividad antitumoral del polianhídrido IL-1α en un modelo singénico de ratón de HNSCC. La IL-1α recombinante (rIL-1α) ralentizó significativamente el crecimiento tumoral de mEERL (Figura 1A), aunque se observó pérdida de peso en los ratones tratados, que se restableció después de la retirada del tratamiento (Figura 1B). Las IL-1α-NP no indujeron un efecto antitumoral significativo en comparación con las NP salinas o en blanco (Figura 1A) y se acompañaron de cierta pérdida de peso, aunque no tan prominente como la rIL-1α (Figura 1B). Los ratones tratados con rIL-1α sobrevivieron significativamente más tiempo que los otros grupos de tratamiento (Figura 1C). Además, los niveles circulantes de IL-1α, IL-1β e IFN-γ fueron más altos en ratones tratados con rIL-1α en comparación con los otros grupos de tratamiento (Figura 2A-C). Estos resultados sugieren que se justifican mejoras en la IL-1α-NP con respecto a la eficacia antitumoral.
Figura 1: Efecto de rIL-1α sobre el crecimiento, la supervivencia y el peso corporal del tumor. Los ratones machos C57BL/6J (n = 10-11 ratones/grupo de tratamiento) portadores de tumores mEERL HNSCC fueron tratados i.p. el día 1 y el día 5 con rIL-1α (3,75 μg de rIL-1α), IL-1α-NP (0,25 mg de NP que contienen 3,75 μg de rIL-1α), Blank-NP (0,25 mg de NP) y 100 μL de solución salina (CON). Se muestran cambios en el volumen tumoral promedio (A), pesos corporales normalizados (B) y curvas de supervivencia (C). Las barras de error representan el error estándar de la media. *p < 0,05 vs. otros grupos de tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto de rIL-1α sobre citoquinas circulantes. Se recolectaron muestras de sangre de un subconjunto de ratones (n = 4 ratones/grupo de tratamiento) después de la segunda administración del fármaco y se analizaron los niveles de citoquinas circulantes mediante un ensayo múltiple. Se muestran los niveles circulantes de IL-1α (A), IL-1β (B) e IFN-γ (C). Las barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo permitirá a cualquier investigador estudiar la actividad antitumoral y algunos de los mecanismos subyacentes de los fármacos inmunomoduladores en un sistema modelo de ratón tumoral in vivo . Aquí, se utilizó un modelo de tumor subcutáneo singénico, que tiene varias ventajas sobre los modelos ortotópicos, incluido su protocolo técnicamente sencillo, fácil monitoreo del crecimiento tumoral, menos morbilidad animal y mayor producibilidad. Los modelos de tumores subcutáneos también se pueden modificar a un modelo de tumor bilateral inyectando células tumorales tanto en el flanco izquierdo como en el derecho. En este modelo de tumor bilateral, se puede administrar radioterapia o fármacos a un tumor intratumoralmente, y se pueden monitorear las respuestas abscopales. Los modelos ortotópicos de ratón HNSCC, aunque son más relevantes clínicamente, son técnicamente difíciles de generar, difíciles de monitorear el crecimiento tumoral, y la carga tumoral en la cavidad oral a menudo resulta en eutanasia prematura debido a la incapacidad de los ratones para comer y beber.
La preparación de células es un paso importante para la formación de tumores simétricos y de tamaño similar en todos los ratones. La mala preparación de las células reduce la viabilidad celular y afecta en gran medida la generación de tumores en ratones. Se recomienda que las células tumorales estén en un número de paso temprano y dentro de la confluencia del 80% al 90%. El mayor número de pasajes y la confluencia afectan la viabilidad celular y, por lo tanto, la generación de tumores. Las células también deben inyectarse tan pronto como sea posible después de la preparación, ya que la viabilidad se reduce si se mantiene en PBS más allá de 20-30 min. Si un gran número de ratones necesitan ser implantados con tumores, se recomienda hacer una solución madre de células mantenidas en medios y preparar suspensiones celulares inyectables en PBS para un grupo más pequeño de animales.
Hay varios pasos críticos en el protocolo que deben mantenerse cuidadosamente después de preparar las células tumorales para la inyección. La inyección de células tumorales en el espacio subdérmico podría producir diferentes patrones y tamaños de crecimiento tumoral en comparación con el espacio subcutáneo. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la colocación de la aguja para una formación tumoral consistente. La selección de la aguja también es importante. Si la aguja es más pequeña que la célula cancerosa, las agujas más pequeñas podrían estresar las células, lo que resultaría en una menor viabilidad. Si la aguja es muy grande, podría lastimar al animal y provocar fugas de células del sitio inyectado. Incluso para investigadores experimentados con el tamaño correcto de la aguja, puede haber fuga de células en el sitio inyectado que resulta en un tumor pequeño o nulo. Es importante que los investigadores utilicen la técnica correcta para la inyección del tumor y el tamaño óptimo de la aguja con el fin de reducir la pérdida de células tumorales y aumentar la exactitud y precisión durante la implantación de células tumorales. Las mediciones del tumor deben realizarse cuidadosamente utilizando calibradores Vernier (manuales o electrónicos). La mejor práctica es ser consistente con la dirección de la medición de la longitud y el ancho del tumor para reducir la variabilidad. La medición del tumor realizada por el mismo investigador a lo largo del estudio puede reducir la variabilidad.
Como era de esperar, los ratones que recibieron rIL-1α perdieron peso durante el tratamiento, lo que apoya los hallazgos previos15,16. Aunque la pérdida de peso es una forma simple y directa de evaluar la toxicidad, hay otros criterios de valoración toxicológicos que se pueden utilizar. La evaluación de los recuentos de células sanguíneas (glóbulos blancos, glóbulos rojos y recuentos de plaquetas) y los niveles de enzimas hepáticas (aspartato transaminasa, alanina aminotransferasa y fosfatasa alcalina) proporcionan información valiosa sobre la toxicidad del fármaco. Además, se puede sacrificar un subconjunto de ratones y realizar análisis histopatológicos de órganos (hígado, riñones, páncreas, pulmón, etc.). La inflamación sistémica se utiliza a menudo como un indicador de toxicidad. Aquí, se analizaron varias citoquinas proinflamatorias circulantes en los ratones después del tratamiento farmacológico con venopunción submandibular utilizando una aguja de 18 G. La venopunción submandibular en ratones requiere una habilidad que proviene de muchas repeticiones del procedimiento. Si la punción es demasiado profunda, puede causar sangrado del oído y daño al tejido interno. Mientras que, si la aguja no se penetra lo suficiente, se puede recolectar una cantidad insuficiente de sangre. Las alternativas a las agujas son el uso de lancetas sangrantes desechables. Hay diferentes tipos de lancetas sangrantes que están disponibles comercialmente que difieren en su longitud. Los investigadores deben utilizar un tamaño de lanceta adecuado para garantizar una recolección óptima de sangre y un trato humano de los animales. Para este procedimiento, se muestran los resultados de tres citoquinas (Figura 2A-C). Es probable que un aumento en las citoquinas proinflamatorias circulantes incluyendo IL-1α, IL-1β e IFN-γ observado en ratones tratados con rIL-1α pueda estar asociado con la pérdida de peso aguda (Figura 1B) observada en este grupo de tratamiento.
Por último, se describe un protocolo para el aislamiento y preparación de suspensiones unicelulares de tumores de ratones y ganglios linfáticos. Este método es útil para aquellos que buscan detectar cambios en la activación y el reclutamiento de células inmunes debido al tratamiento farmacológico. Durante la disección de tumores, el tejido adiposo, la piel, el cabello y otros desechos deben eliminarse tanto como sea posible. Por lo general, el volumen del tumor debe ser mayor de 30 mm3 para tener suficientes células para la citometría de flujo. Sin embargo, si el tumor es muy grande, puede ser difícil preparar suspensiones unicelulares. Los tumores grandes deben cortarse en trozos pequeños antes de colocarlos en el tubo disociador. El proceso debe hacerse rápidamente para obtener células viables óptimas. Además, los tumores grandes dificultan la búsqueda del ganglio linfático inguinal en el lado del tumor. En este caso, el ganglio linfático inguinal se puede recolectar del sitio opuesto. Una vez obtenidas las suspensiones unicelulares, se pueden teñir con diferentes anticuerpos y analizar mediante citometría de flujo multicolor.
En general, estos protocolos proporcionan una forma efectiva de estudiar la actividad antitumoral de los fármacos inmunomoduladores y los cambios asociados en las citoquinas circulantes y las poblaciones de células inmunes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el Premio de Revisión al Mérito #I01BX004829 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos y apoyado por el Programa de Premios Mezhir a través del Centro Integral de Cáncer Holden de la Universidad de Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
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