Summary
בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
Abstract
הדמיית תאים חיים נחוצה במיוחד כדי להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את תנועות האברונים, סידורים מחדש של ציטוסקלטון או דפוסי קוטביות בתוך התאים. בעת לימוד מיקום גרעין oocyte, טכניקות הדמיה חיה חיוניות כדי ללכוד את האירועים הדינמיים של תהליך זה. תא הביצים Drosophila הוא מבנה רב תאי ומערכת מודל מעולה ללמוד תופעה זו בשל גודלה הגדול וזמינות של כלים גנטיים רבים. במהלך Drosophila באמצע oogenesis, הגרעין נודד מעמדה מרכזית בתוך oocyte לאמץ עמדה אסימטרית בתיווך כוחות שנוצרו microtubule. נדידה זו ומיצוב הגרעין נחוצים כדי לקבוע את צירי הקוטביות של העובר ואת הזבוב הבוגר הבא. מאפיין אחד של הגירה זו הוא שהיא מתרחשת בשלושה ממדים (3D), יצירת צורך בהדמיה חיה. לכן, כדי לחקור את המנגנונים המסדירים הגירה גרעינית, פיתחנו פרוטוקול כדי לתרבות את תאי הביצים נותחו ולבצע הדמיה חיה במשך 12 שעות על ידי רכישות בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. בסך הכל, התנאים שלנו מאפשרים לנו לשמר את תאי הביצים של Drosophila בחיים במשך תקופה ארוכה של זמן, ובכך לאפשר את השלמת ההגירה הגרעינית להיות לדמיין במספר רב של דגימות בתלת-ממד.
Introduction
במשך מספר שנים, ביצינה Drosophila התפתח כמערכת מודל לחקר הגירה גרעינית. הביצית הדרוזופילה מתפתחת במבנה רב תאי הנקרא תא הביצים. תאי הביצה מקיפים 16 תאי נבט (15 תאי אחות וביציות) מוקפים בשכבה אפיתל של תאים סומטיים זקיקים. פיתוח תאי הביצים מחולק ל-14 שלבים (איור 1A),שבמהלכם הביצית תגדל ותצבר עתודות הדרושות להתפתחות מוקדמת של העובר. במהלך ההתפתחות, עם ארגון מחדש של מיקרוטובולות והובלה אסימטרית של דטרמיננטים אימהיים, הביציות מקוטבות לאורך הצירים האנטרו-דורסלים והדורסו-גחון. צירים אלה קובעים את צירי הקוטביות הבאים של העובר ואת המבוגר הנובע מהפריה של הביצית1. במהלך אוגנזה, הגרעין מאמץ עמדה אסימטרית בביציות. בשלב 6, הגרעין מרוכז בתא. לאחר אות שטרם זוהה הנפלט מתאי הזקיקים האחוריים המתקבל על ידי הביציות, הגרעין נודד לכיוון הצומת בין קרום הפלזמה הקדמי והלבטי בשלב 7 (איור 1B)2,3. עמדה אסימטרית זו נדרשת כדי לגרום לקביעת ציר דורסו-גחון.
איור 1: תאי הביצים של Drosophila melanogaster. (A)ביציות קבועות מזבובים מהונדסים המבטאים Fs(2)Ket-GFP המתייגת את המעטפות הגרעיניות ואת ubi-PH-RFP המתייג את קרום הפלזמה. השחלות מורכבות ממפתחת תאי ביצים בשלבים שונים. ההתבגרות גדלה לאורך הציר האחורי-הקדמי עם הנבט בקצה הקדמי (משמאל) שבו שוכן תא הגזע של החיידק והשלב הישן בקצה האחורי (מימין). (B)Z-הקרנה של תא ביצה חיה על ידי ספינינג דיסק קונפוקלי מיקרוסקופיה בשלב 6 של oogenesis (משמאל), שבו הגרעין מרוכז בביצית. הגרעין יעבור לאמץ תנוחה א-סימטרית בשלב 7 (מימין) במגע עם קרום הפלזמה הימני (בין הביציות לתא האחות) וקרום הפלזמה לרוחב (בין הביציות לתאי הזקיקים). עמדה זו תעורר את קביעת הצד הדו-צדדי, וכך גם את הציר הגחון-דורסו של תא הביצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
במשך עשורים רבים, הגירה גרעינית זו נחקרה על רקמות קבועות על ידי חיסון. גישה זו אפשרה במיוחד להוכיח כי תהליך זה תלוי ברשת צפופה של microtubules4,5. לאחרונה, פיתחנו פרוטוקול המציע תנאים התואמים הדמיה חיה של oocyte במהלך מספר שעות, מה שמאפשר ללמוד את התהליך הזה באופן דינמי6.
לפיכך, בפעם הראשונה, הצלחנו לתאר כי הגרעין יש מסלולים מועדפים ומאופיינים במהלך נדידתו, אחד לאורך קרום הפלזמה הנעים (APM) והשני לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM) של oocyte (איור 2). תוצאות עדכניות אלה מדגישות את החשיבות של פרוטוקולי הדמיה חיה בעת לימוד תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית.
איור 2: ייצוג סכמטי של נתיבי ההעברה השונים של הגרעין. בשלב 6 של oogenesis, ביוציט הוא תא גדול עם גרעין מרכזי. בשלב זה, ציר הקוטביות הקדמית-אחורית מוגדר עם קרום פלזמה אחורי / לרוחב של הביצית במגע עם תאי הזקיקים וקרום הפלזמה הקדמי (בצהוב) נמצא במגע עם תאי האחות2. דיווחנו בעבר כי הגרעין יכול לנדוד לאורך קרום הפלזמה הקדמי (APM), לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM), או דרך הציטופלסמה (STAD, היישר לקליפת המוח הקדמית-דורסל)6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
נדידת גרעין הביצית היא תופעה של כ 3 שעות6, ועד כה, האירוע המפעיל את תחילת ההגירה בפועל אינו ידוע. תחילת הנדידה יכולה להתעכב גם על ידי מוטציות חלבון המשמשות לחקר מנגנון זה. משתנים לא ידועים אלה הניעו אותנו לרכוש תמונות על פני תקופות זמן ארוכות (10-12 שעות). לכן חשוב לוודא שהאוציטים יישארו בחיים. ככל שחדר הביצים מתפתח, הוא מתרבה לאורך הציר האנטרו-אחורי מצורה כדורית לצורה אליפטית. התארכות זו מונעת על ידי סיבוב של תאים זקיקים, המתרחש משלב 1 לשלב 8, בניצב לציר האנטרו-אחורי7. בנוסף, נדן צינורי של שריר עם רכוש פועם מקיף את תאי הביצים. תפקידו הפיזיולוגי הוא לדחוף את הזקיקים המתפתחים לכיוון oviduct ברציפות8. כדי להגביל את התנועות הגורמות לתנודות של תאי הביצים לאחר ניתוחם, עיצבנו מיקרו-תא תצפית בגובה 150 מיקרומטר(איור 3A). גובה זה גבוה באופן שולי מגודלו של זקיק בשלבים 10 ו -11. זה מגביל במידה ניכרת את התנועות האנכיות של המדגם תוך שמירה על הסיבוב של תא הביצה, ובכך וכתוצאה מכך פגמים מוגבלים בהתפתחות הזקיק. לאחר מכן אנו מבצעים הדמיה חיה במשך 12 שעות על תאי ביצים ניתחו על ידי רכישות זמן-לשגות מרובות מיקום באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לחקר ההגירה הגרעינית של ביצית בין שלבים 6 עד 7.
איור 3: ייצוג סכמטי של תא התצפית. (A) (תצוגה עליונה) ממדים מדויקים של שקופית האלומיניום עם הגבהים (A') וההיקפים (A') של הבאר שנקדחה באמצע השקופית. (B)(תצוגה תחתונה) כיסוי החוסם את הבאר אטום לשקופית עם שומן סיליקון. (C)(מבט עליון) השחלות נותחו מתפתחות במדיום הדמיה המכוסה על ידי קרום חדיר לגז. שמן Halocarbon משמש לייצוב הממברנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
על מנת לעקוב אחר הנדידה הגרעינית ולהעריך במדויק את המסלולים בביציות, יש צורך בסמנים הן לעוטף הגרעיני והן לממברנת הפלזמה. במטרה זו נבחרו שני טרנסג'נים בעלי יחס אות/רעש גבוה ואינם דוהים במהלך ההדמיה החיה. כדי לתייג את קרום הפלזמה, מומלץ להשתמש P[ubi-PH-RFP] המקודד את תחום ההומולוגיה של פלקסטרין (PH) של הפוספוליפאז האנושי C ∂1 (PLC∂1) התמזג ל- RFP. דומיין PH זה נקשר ל- PI phosphoinositide(4,5)P2 המופץ לאורך קרום הפלזמה של הביציות9. עבור המעטפה הגרעינית, P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP זן מלכודת חלבון שבו GFP מוכנס בתוך הגן קידוד Drosophila ß-importin מציג הומוגני אות אינטנסיבי10. זבובים צעירים (בני 1-2 ימים) ממוקמים בבקבוקונים טריים המכילים שמרים יבשים 24-48 שעות לפני ניתוח השחלות.
עבור זה הדמיה חיה assay, חתיכה בעובי 1 מ"מ של אלומיניום, אשר אינו פעיל עבור המדגם, נחתך לתוך הממדים של שקופית מיקרוסקופיה. יש לו חור בקוטר 16 מ"מ במרכז השקופית כי כבר counterbored ל 0.85 מ"מ. ל-counterbore זה יש חור נוסף בקוטר 6 מ"מ עם עומק של 150 מיקרומטר(איור 3A). כיסוי מודבק עם שומן סיליקון (אינרטי לדגימה) בתחתית תא האלומיניום(איור 3B). לאחר הנחת הדגימות בבאר הבינונית, קרום חדיר לחילופי O2/CO2 ממוקם מעל המדיום ומוקף בשמן הילוקרבון(איור 3C).
עבור הניתוח, מומלץ להשתמש במלקחיים מפלדת אל-חלד עם ממד קצה של 0.05 x 0.02 מ"מ, ומחטים בקוטר 0.20 מ"מ להפרדת השחלות(איור 4B,C). הגרעינים הנודדים מצולמים על מיקרוסקופ הפוך של דיסק מסתובב CSU-X1 המצויד במצלמה. תמונות מרובות מיקום נרכשו על ידי זמן לשגות כל 15 דקות ב 24 °C (50 °F). מרווח של 15 דקות מאפשר ביצוע רכישות מרובות עמדות עם צילומים מוגבלים של חלבוני הפלואורסצנט והפוטו-טוקסיקיות עבור הדגימות. יתר על כן, מרווח זמן קצר יותר לא יספק נתונים אינפורמטיביים הרבה יותר כדי לעקוב אחר המסלולים הגרעיניים. הסרטים מעובדים ומנותחים באמצעות תוכנת פיג'י11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדמיה הכנה בינונית
- הכן מדיה טרייה ביום השימוש. פיפט 200 μL של בינוני שניידר (המכיל L-גלוטמין ו 0.40 גרם / ליטר של NaHCO3 בתוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U / mL של פניצילין, ו 100 מ"ג / מ"ל של סטרפטומיצין).
- תוספת עם 30 μL של אינסולין 10 מ"ג/מ"ל.
- יש להוסיף 4 מיקרו-אל של סרום עגל עוברי מומת בחום.
2. הכנת תא תצפית
- בעזרת קצה פיפטה, יש למרוח כמות קטנה של שומן סיליקון מסביב לחור בצד התחתון של השקופית המנוקבת (איור 4D).
- מקם כיסוי של 24 x 50 מ"מ בעובי 0.13-0.16 מ"מ.
- עם הקצה הרחב של קצה פיפטה, להפעיל לחץ על כיסוי כדי לשטח את הסיליקון כדי לאטום את כיסוי וליצור פנים טבעת סיליקון לשקופית(איור 4F,G).
3. ניתוח השחלות
- להרדים זבוב נקבה של פנוטיפ הרצוי על כרית CO2.
- העבר את הנקבה ב 150 μL של מדיום ההדמיה בבאר ניתוח(איור 4H).
- פתח נקבה אחת על ידי תפיסת בית החזה שלה עם מלקחיים וצביטת בטן הגב עם זוג שני של מלקחיים.
- לבודד ולנתק את זוג השחלות, אשר צריך להיות גלוי בקלות על פתיחת חתך.
- הסר בזהירות את הרחם, האובידוקט ונדן השרירים(איור 4I).
- מניחים טיפה של 10-15 μL של מדיום ההדמיה ומעבירים שחלה אחת בתא ההדמיה(איור 4J,K).
4. בידוד תאי הביצים
- כדי להפריד את השחלות, להחזיק את הקצה האחורי של השחלה (לקראת השלבים הישנים) עם המחט. להקניט את השחלות על ידי משיכה בזהירות על נבט עם מחט אחרת.
- הסר את נדן השריר הנותר על תאי הביצים; מחט אחת מחזיקה את הנדן והשנייה מושכת את השחלה דרך התאים הגדולים יותר (שלב 9 ומעלה).
- אפשרו לחלותות שלא נושלו לשקוע ולצור קשר עם כיסוי.
- הסר שלבים מאוחרים ושאר השחלות מתא המיקרו בעזרת מלקחיים. הרחיקו בזהירות את השחלות מהאחרים עם מחטים כדי להקל על הרכישה(איור 4L).
5. סגירת תא תצפית
- חותכים ריבוע קטן (10 x 10 מ"מ) של ממברנה חדירה(איור 4M,N).
- יש למרוח בזהירות את הממברנה על גבי מדיום ההדמיה כדי לגרש את כל בועות האוויר(איור 4O).
- אטמו הרמטית את התא בשכבה דקה של שמן הילוקרבון סביב הבאר על קווי המתאר של הממברנה(איור 4P,Q).
6. הדמיה
- מקם את הגדרת ההדמיה על מחזיק השקופית של המיקרוסקופ ההפוך באמצעות מטרה 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, טבילת שמן).
- אתר ושמור עמדות של ביציות שלב 6 שונות שבהן הגרעין מוכן לנדוד.
- תגדיר את הלייזרים 488 ו-561 ננומטר. עם כוח לייזר פלט מדוד של 150 mW, להשתמש 30% של כוח הלייזר ו 300 אלפיות שני ו 500 ms חשיפה, בהתאמה.
- תארגן את הניסוי. קח זמן לשגות של 12 שעות עם מרווח של 15 דקות-41 קטעים עם מרווח של 1 מיקרומטר במרכז הגרעין.
הערה: על פי זמן החשיפה המתואר לעיל, הגדרה זו מאפשרת רכישה של פוזיציה אחת בסביבות 45 s. מכיוון שיש עיכוב עקב שינוי מיקום, מומלץ לקבוע מקסימום של 12 עמדות בתנאים אלה.
7. ניתוח תמונה
- לעבד את הסרטים על התוכנה פיג'י, באמצעות תוסף תצוגת Orthogonal ולעקוב באופן ידני אחר הגרעינים.
איור 4: תמונות הרכבה מיקרו-תא צעד אחר צעד. (A,B,C) הכנת הכלים הדרושים: כריתת צלחת באר, מלקחיים, מחטים, מדיית הדמיה, שומן סיליקון, ממברנה חדירה ומגלשת האלומיניום. (D)יישום של שומן הסיליקון בחלק האחורי של שקופית האלומיניום עם קצה פיפטה. (E)כיסוי זכוכית מודבק על שומן הסיליקון כדי ליצור את החלק התחתון של התא. (F,G) יישום לחץ על כיסוי עם הגפיים הרחבות יותר של קצה פיפטה כדי ליצור מפרק בתוך התא. (ח,אני) ניתוח השחלות הזבובות בתקשורת ההדמיה. (J)צנרת של טיפה של מדיה הדמיה בתא מיקרו. (K,L) הפרדת השחלות בתא המיקרו באמצעות מחטים. (M,N,O) קרום חדיר לחתוך לתוך 10 x 10 מ"מ מרובע ומניח מעל טיפת המדיום בתא מיקרו. (P,Q) איטום של תא המיקרו עם שמן הילוקרבון. הדגימות מוכנות להתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני ההעברה, הגרעין דינמי ומתנדנד סביב מיקום מרכזי בתקופה המוגדרת כקדם-העברה. תנועות קטנות אלה משקפות איזון של דחיפה ומשיכת כוחות השומרים על שיווי משקל באמצע ביציות. על ידי כימות המסלולים של הגרעינים, הראינו כי מסלולי APM ו- LPM היו פרופורציות דומות. אנו מגדירים את אופי המסלול על ידי המגע הראשון בין הגרעין לבין קרום הפלזמה6. לפיכך, הגרעין מגיע ל-APM או ל-LPM לפני שהוא מחליק לאורכו, כדי להגיע למקומו הסופי בצומת של שתי קרום הפלזמה (איור 5,סרטים 1-2). יתר על כן, הראינו כי רמזים ברורים לטובת כל אחד מהמסלולים. לדוגמה, המרכז מקובצים בין הגרעין לבין הממברנה האחורית של ביציות לאפשר את מסלול APM. לעומת זאת, פגם גוף פטריות (MAP) הקשור למיקרוטובול (MAP), הממוקם באופן לא סימטרי לעוטף הגרעיני, תומך במסלול לאורך LPM6. יתר על כן, דלדול של צנטרוזומים או בוץ משפיע על מהירות הנדידה של הגרעין בהשוואה לסוג הבר הקשר6.
איור 5: תמונות מייצגות של נדידת גרעין הביצית על ידי מיקרוסקופיה הדמיה חיה. (A)מסגרות נבחרות שחולצו מזמן לשגות סרט 1 המציגות את הנדידה הגרעינית של גרעין הביצית של תא ביצים מסוג בר המבטא את סמן המעטפה הגרעינית (Fs(2)KetGFP) ואת סמן קרום הפלזמה (ubi-PH-RFP). (B)מסגרות נבחרות מסרט 2 (הגרסה החתוכים של סרט 1) תוך התמקדות ביציקה. השעה (ב- h:min) ביחס לתחילת הזמן מצוין בחלק העליון של כל מסגרת שנבחרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
גידולי הביצית ותא הביצים הם סימנים להתפתחות נכונה, שניתן לראות בקלות בהקלטות של זמן לשגות(איור 5). להיפך, עיוותי ממברנה לא מאורגנים בתאי זקיקים, תאים מעוכבים ונגרעינים מכווצים הם הסימנים הראשונים לתאי ביצים גוססים(איור 6, סרט 3-4). עם התצפית על תאי הביצים הניווניים האלה, תנועות הגרעינים אינן ניתנות עוד לניצול לניתוח. בדרך כלל, איננו מבחינים ביציות מנוונות לפני 8 שעות של הדמיה (איור 6A) והמקרים הנדירים של ניוון מוקדם נובעים מבעיות במהלך שלבי הניתוח או ההרכבה(איור 6B). אנו סבורים כי 50% מהביציטים עדיין חיים לאחר 10 שעות של הדמיה.
איור 6: תמונות מייצגות של ניוון של תא ביצים במהלך הדמיה חיה. (A)מסגרות נבחרות שחולצו מזמן לשגות סרט 3 המציגות את ניוון תא הביצים מסוג בר לאחר 8 שעות, המבטאות את סמן המעטפה הגרעינית (Fs(2)KetGFP) ואת סמן קרום הפלזמה (ubi-PH-RFP). (B)מסגרות נבחרות שחולצו מסרט 4 המציגות את הניוון המהיר של תא ביצים מסוג בר. ניוון מוקדם כזה מאפיין בעיה במהלך השלבים ההפעלה או הרכבה. השעה (ב- h:min) ביחס לתחילת הזמן מצוין בחלק העליון של כל מסגרת שנבחרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
תנועות מוגזמות יכולות להיות בעיה נוספת וכתוצאה מכך נתונים שאינם שמיש וניתוח נוסף, כמו תאי הביצים לא יישארו במסגרת הדמויה. כדי לעקוף בעיה זו, אנו משתמשים במטרה 40x המספקת מסגרת נאותה של תצפית ומאפשרת תנועות של תאי הביצה לאורך מישור x-y תוך מתן רזולוציה מספקת להערכה איכותית של נתיב הנדידה שנלקח על ידי גרעין הביצית. בנוסף, כדי להגביל את ההשפעות של תנועות מוגזמות בציר z ועל מנת לשמור על oocyte בטווח של z-stack, אנו מבצעים z-קטעים מעל 40 מחסנית מיקרומטר (41 חלקים 1 מיקרומטר זה מזה), בעוד שלב-6 ביציות יש גודל של 20 מיקרומטר.
סרט 1: סרט מייצג של תא ביצים מסוג בר המבטא הן את סמן המעטפה הגרעינית(Fs(2)Ket-GFP) והן את סמן קרום הפלזמה(ubi-PH-RFP). בדוגמה זו, גרעין ביציות יוצר קשר עם הממברנה הימנית תחילה ומגלש לאורכו כדי להגיע לפינה האנטרו-דורית. הזמן שחלף של זמן-לשגות מצוין ב h:min בפינה הימנית העליונה של הווידאו. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 2: גרסה חתוכה של סרט 1, תוך התמקדות ביוט. הזמן שחלף של זמן-לשגות מצוין ב h:min בפינה הימנית העליונה של הווידאו. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 3: סרט מייצג של תא ביצים מסוג בר המבטא הן את סמן המעטפה הגרעינית(Fs(2)Ket-GFP) והן את סמן קרום הפלזמה(ubi-PH-RFP). בדוגמה זו, תא הביצים מתחיל להתנוון בשעה 8:45 שעות לפני השלמת נדידת הגרעין. הזמן שחלף של זמן-לשגות מצוין ב h:min בפינה הימנית העליונה של הווידאו. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 4: סרט מייצג של ניוון מוקדם של תא ביצים מסוג בר המבטא הן את סמן המעטפה הגרעינית (Fs(2)Ket-GFP) והן את סמן קרום הפלזמה (ubi-PH-RFP). הזמן שחלף של זמן-לשגות מצוין ב h:min בפינה הימנית העליונה של הווידאו. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולים אחרים מתארים כיצד להכין ולתרבות תאי הביצה Drosophila ex vivo לבדיקת הדמיה חיה12,13. החידוש של פרוטוקול זה הוא השימוש בתא הדמיה שנבנה באמצעות מגלשת אלומיניום חלולה, כיסוי, וקרום חדיר O2/ CO2. היתרון העיקרי של מערך זה הוא להגביל את התנועה ב- Z מבלי להפעיל לחץ על המדגם. לכן, oocyte עדיין יכול לנוע בחופשיות, וזו הסיבה הראשונה, המטרה 40x משמש ושני, z-ערימות נרכשים לאורך 40 מיקרומטר, בעוד oocyte הוא סביב 20 מיקרומטר גובה בשלב 6.
למרות שפרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, כל צעד הוא קריטי לבדיקה. הכנת המיקרו-תא, הממברנה החדירות ואיטום התא חיוניים כדי לאפשר החלפת גזים ולמנוע ייבוש של מדיום ההדמיה, ולכן את הדגימות. פגיעה בתא הביצים מסכנת את הישרדותו, ולכן טכניקות ניתוח עדינות ומדויקות הן בעלות חשיבות עליונה. בנוסף, נדן השרירים חייב להיות מוסר לחלוטין כמו חתיכות הנותרות של מבנה זה יגרום תנועה תאי ביצה לא רצויה.
אלומיניום, בנוסף לבטיחותו עבור המדגם, נבחר על כוחו, עמידותו וקלות הניקוי. חומרים אחרים טרם נחקרו בתנאים אלה. השימוש בפלסטיק עם פיתוח מדפסת תלת-ממד מפתה; עם זאת, אחד חייב להיות מאוד מדויק עם יצירת חור עם גובה של 150 מיקרומטר.
לאחרונה, Huynh ועמיתיו פיתחו טכניקת הדמיה המותאמת Drosophila germarium המבוסס על הידרוג'ל14. אם זה יכול להיות מותאם לשלב 6 ב oogenesis נשאר להיבדק. באופן ספציפי, לא ידוע אם תנועות כגון סיבוב של הזקיק יכול להתרחש במערכת הידרוג'ל. תנועות סיבוב אלה חיוניות להארכת תא הביצים ומכאן, להתפתחות תקינה.
פרוטוקולים אחרים השתמשו בשמן הילוקרבון כדי לעקוב אחר נדידת גרעין ביציות15,16. המאפיינים האופטיים של שמן ומדיום ההדמיה המשמש בפרוטוקול שלנו שונים מאוד. במיוחד, מדיום שניידר יש מקסימום של ספיגת אור עבור אורכי גל סביב 450 ננומטר. לכן, אנו מבחינים ביחס אות / רעש גבוה יותר עם שמן. עם זאת, שמן ההילוקרבון מפחית מאוד את הישרדות ביציות ל 1-2 שעות, מה שמגביל את היכולת לעקוב אחר כל ההגירה של הגרעין, במיוחד בהקשרים גנטיים שבהם הגירה זו מופרעת. עם פרוטוקול זה הנוכחי, מדיום ההדמיה מאפשר הישרדות ארוכה של תא הביצים המאפשר לנו לבצע הקלטה בזמן לשגות עד 12 שעות. לכן, אנו ממקסמים את ההזדמנות שלנו ללכוד את כל תהליך ההגירה.
באמצעות הפרמטרים הנוכחיים שלנו, אנו יכולים לבצע רק מקסימום של 12 עמדות עבור זמן לשגות. בממוצע, שליש מהגרעין התדמיתי הם בני קיימא וניתן לנתחם. כדי לשפר את היעילות, מיקרוסקופ ספינינג-דיסק המצויד במערכת מצלמה כפולה, אשר יאפשר רכישות של שני אורכי הגל בו זמנית, יכול לשמש כדי להאיץ את זמן הרכישה ובכך, להגדיל את מספר העמדות.
יתר על כן, כמו תא מיקרו זה מאפשר לתרבות תאי הביצה ניתחו במשך תקופה ארוכה יחסית של זמן, השימוש בו יכול להיות מורחב לחקר מנגנונים דינמיים אחרים של drosophila oogenesis כי צריך להיות מוערך ex vivo (למשל, הזרמה ציטופלסמית בביצית, סיבוב זקיק, תאים זקיק morphogenesis, וכו ').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים מאוד לז'אן אנטואן לפסאנט וניקולס טיסוט שפיתחו את הפרוטוקול במקור ושיתפו איתנו כמה אלמנטים גרפיים של איור 3. אנו מודים לפאני רולנד-גוסלין שצילמה את התמונות של איור 4. אנו מודים גם לחברי מעבדה אחרים על דיונים מועילים שתרמו להחמצת טכניקה זו ונתנאל הנמן על הערותיו שעזרו לשפר את כתב היד הזה. אנו מכירים במתקן הליבה של ImagoSeine של המכון ז'אק מונוד, חבר בצרפת-BioImaging (ANR-10-INBS-04). מאליס לו נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המחקר הצרפתי (MESRI). אנטואן Guichet ופרד ברנרד נתמכו על ידי ARC (גרנט PJA20181208148), האגודה des Entreprises contre le Cancer (גרנט Gefluc 2020 #221366) ועל ידי מענק הופעתה מאוניברסיטת IdEx דה פריז (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
