Summary
في Drosophila، تخضع نواة البويضات لهجرة تعتمد على الميكروتبول أثناء تكوين الخلايا. هنا، ونحن نصف البروتوكول الذي تم تطويره لمتابعة الهجرة من خلال إجراء التصوير الحي على غرف البيض السابق فيفو. يحافظ إجراءنا على غرف البيض على قيد الحياة لمدة 12 ساعة للحصول على أفلام متعددة المواقع ثلاثية الأبعاد بفاصل زمني باستخدام المجهر confocal القرص الغزل.
Abstract
التصوير بالخلايا الحية ضروري بشكل خاص لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم حركات العضيات ، وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، أو نقش القطبية داخل الخلايا. عند دراسة تحديد مواقع نواة البويضات ، تعد تقنيات التصوير الحي ضرورية لالتقاط الأحداث الديناميكية لهذه العملية. غرفة البيض Drosophila هو هيكل متعدد الخلايا ونظام نموذج ممتاز لدراسة هذه الظاهرة بسبب حجمها الكبير وتوافر العديد من الأدوات الوراثية. خلال Drosophila منتصف oogenesis ، تهاجر النواة من موقع مركزي داخل البويضات لاعتماد موقف غير متماثل بوساطة القوى المولدة من microtubule. هذه الهجرة وتحديد المواقع من النواة ضرورية لتحديد محاور القطبية للجنين وذبابة الكبار اللاحقة. إحدى خصائص هذه الهجرة هي أنها تحدث في ثلاثة أبعاد (ثلاثية الأبعاد) ، مما يخلق ضرورة للتصوير الحي. وهكذا، لدراسة الآليات التي تنظم الهجرة النووية، قمنا بتطوير بروتوكول لتنمية غرف البيض تشريح وإجراء التصوير الحي لمدة 12 ساعة عن طريق الاستحواذ الفاصل الزمني باستخدام المجهر الكونفوجال الغزل القرص. وعموما، تسمح لنا ظروفنا بالحفاظ على غرف بيض دروسوفيلا حية لفترة طويلة من الزمن، مما يمكن من تصور إتمام الهجرة النووية في عدد كبير من العينات ثلاثية الأبعاد.
Introduction
لعدة سنوات، ظهرت البويضات دروسوفيلا كنظام نموذجي لدراسة الهجرة النووية. تتطور البويضات الدروسوفيليا في بنية متعددة الخلايا تسمى غرفة البيض. تشمل غرف البيض 16 خلية جرثومية (15 خلية ممرضة والبويضات) محاطة بطبقة ظهارية من الخلايا الجسدية الجريبية. تم تقسيم تطوير غرفة البيض إلى 14 مرحلة(الشكل 1A)، والتي خلالها تنمو البويضات وتتراكم الاحتياطيات اللازمة للتطور المبكر للجنين. أثناء التطوير ، عند إعادة تنظيم microtubule والنقل غير المتماثل للمحددات الأمومية ، تستقطب البويضات على طول المحاور الأمامية الظهرية والبطينية الظهرية. تحدد هذه المحاور محاور القطبية اللاحقة للجنين والبالغ الناشئة عن تخصيب هذه البويضة1. خلال تكوين الخلايا، تعتمد النواة وضعا غير متماثل في البويضات. في المرحلة 6، يتمركز النواة في الخلية. عند إشارة لم يتم تحديدها بعد المنبعثة من الخلايا الجريبية الخلفية التي تتلقاها البويضات ، تهاجر النواة نحو التقاطع بين أغشية البلازما الأمامية والظرية في المرحلة 7 (الشكل 1B)2،3. هذا الموقف غير المتماثل مطلوب للحث على تحديد المحور الظهري البطني.
الشكل 1: Drosophila melanogaster غرف البيض. (أ) ovariole الثابتة من الذباب المعدلة وراثيا التعبير عن FS(2) كيت-GFP أن التسميات المغلفات النووية وubi-PH-RFP التي تسمي أغشية البلازما. ويتكون ovariole من تطوير غرف البيض في مراحل مختلفة. يزداد النضج على طول المحور الأمامي الخلفي مع الجرثومة في الطرف الأمامي (يسار) حيث تتواجد الخلية الجذعية الجرثومية والمرحلة القديمة في الطرف الخلفي (يمين). (ب) Z-إسقاط غرفة البيض الحية عن طريق الغزل القرص المجهري confocal في المرحلة 6 من oogenesis (يسار)، والتي تركزت النواة في البويضات. سوف تهاجر النواة لاعتماد وضع غير متماثل في المرحلة 7 (يمين) ملامسة غشاء البلازما الأمامي (بين البويضات وخلية الممرضة) وغشاء البلازما الجانبي (بين البويضات والخلايا الجريبية). هذا الموقف سوف تحفز على تحديد الجانب الظهري، وبالتالي، محور الظهر البطني من غرفة البيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد درست هذه الهجرة النووية على مدى عقود عديدة على الأنسجة الثابتة عن طريق التثابت المناعي. وقد جعل هذا النهج بشكل ملحوظ من الممكن إثبات أن هذه العملية تعتمد على شبكة كثيفة من microtubules4،5. في الآونة الأخيرة ، وضعنا بروتوكولا يقدم شروطا متوافقة مع التصوير الحي للبويضات خلال عدة ساعات مما يجعل من الممكن دراسة هذه العملية ديناميكيا6.
ومن ثم، لأول مرة، تمكنا من وصف أن النواة لها مسارات تفضيلية ومميزة أثناء هجرتها، واحدة على طول غشاء البلازما الأمامي (APM) وأخرى على طول غشاء البلازما الجانبي (LPM) للبويضة (الشكل 2). وتؤكد هذه النتائج الأخيرة أهمية بروتوكولات التصوير الحي عند دراسة العمليات الدينامية مثل الهجرة النووية.
الشكل 2:تمثيل تخطيطي لمسارات الترحيل المختلفة للنواة. في المرحلة 6 من تكوين البويضات هي خلية كبيرة مع نواة مركزية. في هذه المرحلة ، يتم تعيين محور القطبية الأمامي الخلفي مع غشاء البلازما الخلفي / الجانبي للبويضة في اتصال مع الخلايا الجريبية وغشاء البلازما الأمامي (باللون الأصفر) على اتصال مع الخلايا الممرضة2. وقد سبق أن ذكرت أن النواة يمكن أن تهاجر إما على طول غشاء البلازما الأمامي (APM)، على طول غشاء البلازما الجانبي (LPM)، أو من خلال السيتوبلازم (STAD، مباشرة إلى القشرة الأمامية الظهرية)6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هجرة نواة البويضات هي ظاهرة تبلغ حوالي 3 ح6، وحتى الآن ، فإن الحدث الذي يؤدي إلى بدء الهجرة الفعلية غير معروف. كما يمكن تأخير بدء الهجرة بسبب طفرات البروتين المستخدمة لدراسة هذه الآلية. هذه المتغيرات غير معروفة حفزتنا على الحصول على الصور على مدى فترات زمنية طويلة (10-12 ساعة). لذلك ، من المهم ضمان بقاء البويضات على قيد الحياة. كما تتطور غرفة البيض، فإنه elongates على طول المحور الأمامي الخلفي من كروية إلى شكل بيضاوي الشكل. هذا الاستطالة مدفوع بتدوير الخلايا الجريبية ، والذي يحدث من المرحلة 1 إلى المرحلة 8 ، عموديا على المحور الأمامي الخلفي7. بالإضافة إلى ذلك ، يحيط غمد أنبوبي من العضلات مع خاصية pulsatile بغرف البيض. وظيفتها الفسيولوجية هي دفع بصيلات النامية نحو oviduct باستمرار8. من أجل الحد من الحركات التي تحفز التذبذبات من غرف البيض بعد تشريحها، قمنا بتصميم غرفة صغيرة مراقبة قياس 150 ميكرومتر في الارتفاع(الشكل 3A). هذا الارتفاع أعلى بشكل هامشي من حجم الجريب في المرحلتين 10 و 11. يحد بشكل كبير من الحركات الرأسية للعينة مع الحفاظ على دوران غرفة البيض ، مما يؤدي إلى عيوب محدودة في تطور الجريبات. ثم نقوم بإجراء التصوير الحي لمدة 12 ساعة على غرف البيض تشريحها عن طريق عمليات الاستحواذ متعددة المواقع الفاصل الزمني باستخدام المجهر confocal الغزل القرص. هنا نصف بروتوكولنا لدراسة الهجرة النووية البويضات بين المرحلتين 6 و 7.
الشكل 3:التمثيل التخطيطي لغرفة المراقبة. (A) (العرض العلوي) الأبعاد الدقيقة لشريحة الألومنيوم مع الارتفاعات (A') والمحيط (A') من البئر المحفور في منتصف الشريحة. (ب)(عرض أسفل) يتم إغلاق غطاء حجب البئر إلى الشريحة مع الشحوم السيليكون. (ج) (أعلى عرض) تشريح ovarioles تطوير في وسيلة التصوير التي تغطيها غشاء نفاذية الغاز. يستخدم زيت الهالوكربون لتثبيت الغشاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من أجل متابعة الهجرة النووية وتقييم المسارات بدقة في البويضات ، هناك حاجة إلى علامات لكل من المغلف النووي وغشاء البلازما. ولهذا الغرض، تم اختيار اثنين من المتحولين جنسيا التي لديها نسبة إشارة عالية / الضوضاء ولا تتلاشى على مدار التصوير الحي. لتسمية غشاء البلازما، ينصح باستخدام P [ubi-PH-RFP] الذي يشفر مجال Pleckstrin Homology (PH) من فوسفوليباز C الإنسان ∂1 (PLC∂1) تنصهر في RFP. هذا المجال PH يربط إلى PH الفوسفوينوسيتيد PI(4,5)P2 موزعة على طول غشاء البلازما من البويضات9. للمغلف النووي، P [PPT-un1]Fs(2) كيت-GFP البروتين فخ سلالة حيث يتم إدراج GFP داخل ترميز الجين وDrosophila ß-importin يعرض إشارة متجانسة ومكثفة10. يتم وضع الذباب الصغير (1-2 أيام من العمر) في قوارير طازجة تحتوي على الخميرة الجافة 24-48 ساعة قبل تشريح المبيض.
لهذا الفحص التصوير الحي، قطعة سميكة 1 ملم من الألومنيوم، وهو غير تفاعلي للعينة، وقد قطعت في أبعاد شريحة المجهر. لديها ثقب قطره 16 ملم في وسط الشريحة التي تم counterbored إلى 0.85 ملم. هذا كونتربور لديه ثقب قطره 6 مم إضافية مع عمق 150 ميكرومتر (الشكل 3A). يتم لصقها على غطاء مع الشحوم السيليكون (خامل للعينة) في الجزء السفلي من غرفة الألومنيوم (الشكل 3B). بعد وضع العينات في البئر المتوسطة الملء ، يتم وضع غشاء نفاذية إلى O2/ CO2 تبادل على المتوسط وتحيط بها زيت الهالوكربون(الشكل 3C).
لتشريح، فمن المستحسن استخدام ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ مع البعد تلميح من 0.05 × 0.02 ملم، والإبر قطرها 0.20 ملم لفصل ovarioles (الشكل 4B،C). يتم تصوير النوى المهاجرة على المجهر المقلوب الغزل القرص CSU-X1 مجهزة بكاميرا. تم الحصول على صور متعددة المواقع عن طريق الفاصل الزمني كل 15 دقيقة عند 24 درجة مئوية. يسمح الفاصل الزمني لمدة 15 دقيقة بإجراء عمليات الاستحواذ متعددة المواقع مع bleaching محدودة من البروتينات الفلورية والسمية الضوئية للعينات. وعلاوة على ذلك، فإن قصر الفترة لن يوفر بيانات أكثر إفادة بكثير لاتباع المسارات النووية. تتم معالجة الأفلام وتحليلها عبر برنامج فيجي11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التصوير إعداد المتوسطة
- إعداد وسائل الإعلام الطازجة في يوم الاستخدام. Pipette 200 ميكرولتر من شنايدر المتوسطة (تحتوي على L-الجلوتامين و 0.40 غرام / لتر من NaHCO3 تكملها 10٪ حرارة تعطيل مصل العجل الجنيني، 100 U/mL من البنسلين، و 100 ملغم / مل من الستريبتوميسين).
- تكملة مع 30 ميكرولتر من الأنسولين 10 ملغم / مل.
- أضف 4 ميكرولتر من مصل عجل الجنين المعطل حراريا.
2. إعداد غرفة المراقبة
- مع طرف ماصة، وتطبيق كمية صغيرة من الشحوم السيليكون في جميع أنحاء ثقب على الجانب السفلي من الشريحة ثقب(الشكل 4D).
- وضع 24 × 50 مم coverslip من 0.13-0.16 مم سمك.
- مع نهاية واسعة من طرف ماصة، وتطبيق الضغط على coverlip لتسطيح السيليكون من أجل ختم coverslip وخلق الداخلية حلقة السيليكون إلى الشريحة (الشكل 4F، G).
3. تشريح المبيض
- تخدير ذبابة أنثى من النمط الظاهري المطلوب على وسادة CO2.
- نقل الأنثى في 150 ميكرولتر من وسيلة التصوير في بئر تشريح(الشكل 4H).
- فتح أنثى واحدة عن طريق الاستيلاء على الصدر مع ملقط ومعسر كشل البطن الظهري مع زوج ثان من ملقط.
- عزل وفصل زوج من المبيضين، والتي ينبغي أن تكون مرئية بسهولة عند فتح لطيف.
- إزالة الرحم بعناية، oviduct، وغمد العضلات (الشكل 4I).
- ضع قطرة من 10-15 ميكرولتر من وسيط التصوير ونقل المبيض واحد في غرفة التصوير (الشكل 4J، K).
4. عزل غرفة البيض
- لفصل البويضة، أمسك الطرف الخلفي للمبيض (نحو المراحل القديمة) بالإبرة. ندف بصرف النظر عن ovarioles عن طريق سحب بعناية على الجرثومة مع إبرة أخرى.
- إزالة غمد العضلات المتبقية على غرف البيض; إبرة واحدة عقد غمد والآخر سحب على ovariole من خلال غرف أكبر (المرحلة 9 أو أكثر).
- السماح للovariole غير المورثة تغرق والاتصال coverlip.
- إزالة المراحل المتأخرة وبقية المبيضين من الغرفة الدقيقة بمساعدة ملقط. المسافة بعناية ovarioles من الآخرين مع الإبر لتسهيل اقتناء (الشكل 4L).
5. غرفة المراقبة تغلق
- قطع مربع صغير (10 × 10 ملم) من غشاء نفاذية (الشكل 4M، ن).
- تطبيق بعناية الغشاء على رأس وسيلة التصوير لطرد أي فقاعات الهواء (الشكل 4O).
- ختم Hermetically الغرفة مع طبقة رقيقة من زيت الهالوكربون حول البئر على كفاف الغشاء (الشكل 4P، س).
6. التصوير
- ضع إعداد التصوير على حامل الشريحة للمجهر المقلوب باستخدام هدف 40x (HCX PL Apo ، 1.25NA ، غمر الزيت).
- تحديد مواقع مختلفة من البويضات المرحلة 6 وحفظها في النواة التي على استعداد للهجرة.
- إعداد الليزر 488 و 561 نانومتر. باستخدام طاقة ليزر مقاسة تبلغ 150 ميجاوات، استخدم 30٪ من طاقة الليزر و300 مللي ثانية و500 مللي ثانية على التوالي.
- إعداد التجربة. تأخذ الفاصل الزمني من 12 ساعة مع الفاصل الزمني من 15 دقيقة-41 أقسام مع فاصل زمني من 1 ميكرومتر تركزت على النواة.
ملاحظة: وفقا لوقت التعرض المذكور أعلاه، يسمح هذا الإعداد بالحصول على مركز واحد في حوالي 45 s. نظرا لوجود تأخير بسبب تغيير المنصب ، يوصى بتحديد 12 وظيفة كحد أقصى في هذه الظروف.
7. تحليل الصور
- معالجة الأفلام على برنامج فيجي، وذلك باستخدام المكونات في عرض متعامد وتتبع يدويا النوى.
الشكل 4: خطوة بخطوة صغيرة غرفة تركيب الصور. (A, B, C) إعداد الأدوات اللازمة: تشريح لوحة البئر ، ملقط ، الإبر ، وسائط التصوير ، شحوم السيليكون ، الغشاء النفاذ ، وشريحة الألومنيوم. (د) تطبيق الشحوم السيليكون في الجزء الخلفي من الشريحة الألومنيوم مع طرف ماصة. (E) يتم لصقها على الزجاج coverlip الشحوم السيليكون لإنشاء الجزء السفلي من الغرفة. (F,G) تطبيق الضغط على coverlip مع أقصى أوسع من طرف ماصة لإنشاء مشترك داخل الغرفة. (H, I) تشريح المبيضين ذبابة في وسائل الإعلام التصوير. (J) بايبتينغ قطرة من وسائط التصوير في الغرفة الصغيرة. (K,L) فصل البويضة في الغرفة الصغيرة باستخدام الإبر. (M, N, O) قطع غشاء نفاذية إلى 10 × 10 ملم مربع ووضع أكثر من قطرة من المتوسط في الغرفة الصغيرة. (P, Q) ختم الغرفة الدقيقة بزيت الهالوكربون. العينات جاهزة للصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل الهجرة، تكون النواة ديناميكية وتتأرجح حول موقع مركزي خلال فترة تعرف بأنها ما قبل الهجرة. تعكس هذه الحركات الصغيرة توازنا بين قوى الدفع والسحب التي تحافظ على التوازن في منتصف البويضات. ومن خلال تحديد مسارات النوى، أظهرنا أن مساري APM وLPM كان لديهما نسب مماثلة. نحن نحدد طبيعة المسار من خلال أول اتصال بين النواة وغشاء البلازما6. وهكذا، فإن النواة تصل إما إلى APM أو LPM قبل الانزلاق على طولها، للوصول إلى موقفها النهائي عند تقاطع أغشية البلازما اثنين (الشكل 5،أفلام1-2). وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن الإشارات المتميزة تفضل كل مسار من المسارات. على سبيل المثال، ال سنتروسومات تتجمع بين النواة والغشاء الخلفي للبويضة تمكين مسار APM. وعلى العكس من ذلك، فإن عيب جسم الفطر المرتبط بالبروتين (MAP) (MAP) الذي يقع بشكل غير متماثل إلى المغلف النووي، يدعم مسارا على طول LPM6. وعلاوة على ذلك، فإن استنفاد إما سنتروسومات أو الطين يؤثر على سرعة هجرة النواة مقارنة بسياق النوع البري6.
الشكل 5: صور تمثيلية لهجرة نواة البويضات عن طريق التصوير الحي المجهري. (أ) إطارات مختارة مستخرجة من الفيلم الفاصل الزمني 1 تظهر الهجرة النووية لنواة البويضات لغرفة بيض من النوع البري تعبر عن علامة المغلف النووي(Fs(2)KetGFP)وعلامة غشاء البلازما(ubi-PH-RFP). (ب) إطارات مختارة من فيلم 2 (النسخة اقتصاص من الفيلم 1)مع التركيز على البويضات. الوقت (في h:min) بالنسبة إلى بداية الفاصل الزمني مبين في أعلى كل إطار محدد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نمو البويضات وغرفة البيض هي علامات على التطور الصحيح ، والتي يمكن رؤيتها بسهولة في التسجيلات الفاصلة زمنيا(الشكل 5). على العكس من ذلك ، تشوهات الأغشية غير منظم الخلايا الجريبية ، توقف الخلايا ، والنوى تقلصت هي العلامات الأولى من غرف البيض الموت(الشكل 6، فيلم 3-4). عند ملاحظة غرف البيض التنكسية هذه ، لم تعد حركات النوى قابلة للاستغلال للتحليل. عادة، ونحن لا نلاحظ أي البويضات المنحطة قبل 8 ساعة من التصوير(الشكل 6A)وحالات نادرة من الانحطاط المبكر هي بسبب مشاكل أثناء تشريح أو تصاعد الخطوات(الشكل 6B). نحن نعتبر أن 50٪ من البويضات لا تزال على قيد الحياة بعد 10 ساعة من التصوير.
الشكل 6: صور تمثيلية لانحطاط غرفة البيض أثناء التصوير الحي. (A) إطارات مختارة مستخرجة من فيلم الفاصل الزمني 3 تظهر انحطاط غرفة بيض من النوع البري بعد 8 ساعة ، مع التعبير عن علامة المغلف النووي(Fs(2)KetGFP)وعلامة غشاء البلازما(ubi-PH-RFP). (ب) إطارات مختارة مستخرجة من فيلم 4 تظهر الانحطاط السريع لغرفة بيض من النوع البري. مثل هذا الانحطاط المبكر هو سمة من سمات مشكلة أثناء تشريح أو تصاعد الخطوات. الوقت (في h:min) بالنسبة إلى بداية الفاصل الزمني مبين في أعلى كل إطار محدد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن أن تكون الحركات المفرطة مشكلة إضافية تؤدي إلى بيانات غير قابلة للاستخدام ومزيد من التحليل ، حيث لن تبقى غرف البيض في الإطار المصور. للتحايل على هذه المشكلة، نستخدم هدف 40x الذي يوفر إطارا كافيا للمراقبة ويسمح بحركات غرف البيض على طول الطائرة x-y مع توفير ما يكفي من الدقة لتقييم نوعي لمسار الهجرة الذي تتخذه نواة البويضات. بالإضافة إلى ذلك ، للحد من آثار الحركات المفرطة في المحور z ومن أجل الحفاظ على البويضات ضمن نطاق z-stack ، نقوم بإجراء مقاطع z أكثر من 40 ميكرومتر مكدس (41 قسما 1 ميكرومترا) ، في حين أن حجم البويضات المرحلة -6 يبلغ 20 ميكرومتر.
فيلم 1: فيلم تمثيلي من نوع البرية غرفة البيض التعبير عن كل من علامة المغلف النووي (FS(2) كيت-GFP) وعلامة غشاء البلازما (ubi-PH-RFP). في هذا المثال، تتصل نواة البويضات بالغشاء الأمامي أولا وتنزلق على طولها للوصول إلى الزاوية الأمامية الظهرية. يتم الإشارة إلى الوقت المنقضي من الفاصل الزمني في h:min في الزاوية العلوية اليسرى من الفيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 2 : اقتصاص نسخة من الفيلم 1 ، مع التركيز على البويضات. يتم الإشارة إلى الوقت المنقضي من الفاصل الزمني في h:min في الزاوية العلوية اليسرى من الفيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 3: فيلم تمثيلي من نوع البرية غرفة البيض التعبير عن كل من علامة المغلف النووي (FS(2) كيت-GFP) وعلامة غشاء البلازما (ubi-PH-RFP). في هذا المثال، تبدأ غرفة البيض في التدهور عند 8:45 ساعة قبل الانتهاء من هجرة النواة. يتم الإشارة إلى الوقت المنقضي من الفاصل الزمني في h:min في الزاوية العلوية اليسرى من الفيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 4: فيلم تمثيلي من الانحطاط المبكر لغرفة البيض البرية من نوع التعبير عن كل من علامة المغلف النووي(FS(2) كيت-GFP) وعلامة غشاء البلازما(ubi-PH-RFP). يتم الإشارة إلى الوقت المنقضي من الفاصل الزمني في h:min في الزاوية العلوية اليسرى من الفيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكولات أخرى تصف كيفية إعداد وثقافة Drosophila البيض غرف ex vivo لتصوير حية المقايسة12,13. حداثة هذا البروتوكول هو استخدام غرفة التصوير التي شيدت باستخدام شريحة الألومنيوم مجوفة، وأغطية، وغشاء نفاذية O2/ CO2. الميزة الرئيسية لهذا الإعداد هو الحد من الحركة في Z دون ممارسة الضغط على العينة. وهكذا، فإن البويضات لا تزال تتحرك بحرية، وهذا هو السبب الأول، يتم استخدام الهدف 40x والثانية، يتم الحصول على z-مداخن على طول 40 ميكرومتر، في حين أن البويضات حوالي 20 ميكرومتر ارتفاع في المرحلة 6.
على الرغم من أن هذا البروتوكول بسيط نسبيا، كل خطوة هامة للمقايسة. إعداد الغرفة الصغيرة ، والغشاء نفاذية ، وختم الغرفة ضرورية للسماح لتبادل الغاز ومنع تجفيف وسيلة التصوير ، وبالتالي ، العينات. الإضرار بغرفة البيض يعرض بقاءها للخطر ، لذلك تقنيات التشريح الدقيقة والدقيقة هي ذات أهمية قصوى. بالإضافة إلى ذلك، يجب إزالة غمد العضلات تماما كما القطع المتبقية من هذا الهيكل سيؤدي إلى حركة غرفة البيض غير المرغوب فيها.
الألومنيوم، بالإضافة إلى سلامتها للعينة، وقد تم اختيار لقوته، والمتانة، وسهولة التنظيف. ولم يتم التحقيق بعد في مواد أخرى في ظل هذه الظروف. استخدام البلاستيك مع تطوير طابعة 3D مغرية. ومع ذلك، يجب أن يكون المرء دقيقا جدا مع إنشاء حفرة بارتفاع 150 ميكرومتر.
في الآونة الأخيرة ، وقد وضعت Huynh وزملاؤه تقنية التصوير تكييفها مع الجرثومة Drosophila على أساس هيدروجيل14. أم لا يمكن تكييفها إلى المرحلة 6 في oogenesis يبقى أن تختبر. على وجه التحديد ، ليس من المعروف ما إذا كانت حركات مثل دوران الجريب يمكن أن تحدث في نظام الهيدروجيل. هذه الحركات التناوب ضرورية لاستطالة غرفة البيض، وبالتالي، والتنمية الطبيعية.
وقد استخدمت بروتوكولات أخرى زيت الهالوكربون لمتابعة هجرة نواة البويضات15،16. الخصائص البصرية للنفط و وسيلة التصوير المستخدمة في بروتوكولنا مختلفة جدا. خاصة، متوسط شنايدر لديه الحد الأقصى لامتصاص الضوء لأطوال موجية حول 450 نانومتر. لذلك، نلاحظ نسبة إشارة أعلى / ضوضاء مع النفط. ومع ذلك ، فإن زيت الهالوكربون يقلل بشكل كبير من بقاء البويضات إلى 1-2 ساعة ، مما يحد من القدرة على متابعة هجرة النواة بأكملها ، خاصة في السياقات الوراثية التي يتم فيها إزعاج هذه الهجرة. مع هذا البروتوكول الحالي، يسمح وسيط التصوير بالبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من غرفة البيض مما يسمح لنا بإجراء تسجيل الفاصل الزمني حتى 12 ساعة. وبالتالي، فإننا نزيد فرصتنا إلى أقصى حد لالتقاط عملية الهجرة برمتها.
باستخدام المعلمات الحالية لدينا، يمكننا فقط أداء الحد الأقصى من 12 وظيفة للمرور الزمني. في المتوسط، ثلث النوى المصورة قابلة للتطبيق ويمكن تحليلها. ولتحسين الكفاءة، يمكن استخدام مجهر قرص دوار مجهز بنظام كاميرا مزدوج، مما يسمح باقتناء كلا الطولين الموجيين في نفس الوقت، لتسريع وقت الاقتناء وبالتالي زيادة عدد المواقع.
وعلاوة على ذلك، بما أن هذه الغرفة الدقيقة تسمح باستزراع غرف البيض المفرغة لفترة طويلة نسبيا من الزمن، يمكن توسيع نطاق استخدامها ليشمل دراسة الآليات الديناميكية الأخرى لتولد الدروزوفيلا التي تحتاج إلى تقييم الجسم الحي الخارجي (على سبيل المثال، التدفق السيتوبلازمي في البويضات، دوران الجريبات، مورفوجينيسيس خلايا الجريبات، إلخ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للغاية لجان أنطوان Lepesant ونيكولاس تيسو الذي وضع أصلا البروتوكول وتقاسم بعض العناصر الرسومية من الشكل 3 معنا. نشكر فاني رولاند جوسلين التي التقطت صور الشكل 4. كما نشكر أعضاء المختبر الآخرين على المناقشات المفيدة التي ساهمت في تحسين هذه التقنية وناثانيل هينيمان على تعليقاته التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. نحن نعترف بالمنشأة الأساسية ImagoSeine التابعة لمعهد جاك مونود، عضو مؤسسة فرنسا للتصوير الحيوي (ANR-10-INBS-04). تدعم Maëlys Loh زمالة دكتوراه من وزارة البحوث الفرنسية (MESRI). تم دعم أنطوان غيشيه وفريد برنارد من قبل ARC (غرانت PJA20181208148) وجمعية Entreprises contre le Cancer (غرانت جيفلوك 2020 #221366) ومنحة ظهور من جامعة IdEx في باريس (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
