Summary
Doenças hepáticas são induzidas por muitas causas que promovem fibrose ou cirrose. O transplante é a única opção para recuperar a saúde. No entanto, dada a escassez de órgãos transplantáveis, alternativas devem ser exploradas. Nossa pesquisa propõe a implantação de andaimes de colágeno no tecido hepático a partir de um modelo animal.
Abstract
Doenças hepáticas são a principal causa de morte em todo o mundo. O consumo excessivo de álcool, uma dieta rica em gordura e a infecção pelo vírus da hepatite C promovem fibrose, cirrose e/ou carcinoma hepatocelular. O transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado para melhorar e prolongar a vida útil dos pacientes em estágios avançados da doença. No entanto, apenas 10% dos transplantes são bem-sucedidos, com disponibilidade de órgãos, procedimentos pré-cirúrgicos e pós-cirúrgicos, e custos elevados diretamente correlacionados com esse resultado. Andaimes de matriz extracelular (ECM) surgiram como uma alternativa para a restauração tecidual. A biocompatibilidade e a aceitação do enxerto são as principais características benéficas desses biomateriais. Embora a capacidade de restaurar o tamanho e a função correta do fígado tenha sido avaliada em modelos de hepatectomia hepática, o uso de andaimes ou algum tipo de suporte para substituir o volume da massa hepática extirpada não foi avaliado.
A hepatectomia parcial foi realizada em um fígado de rato com a xenoimplantação de um andaime de matriz de colágeno (CMS) de um condíle bovino. O tecido do lobo hepático esquerdo foi removido (aproximadamente 40%), e uma proporção igual de CMS foi implantada cirurgicamente. Os testes de função hepática foram avaliados antes e depois do procedimento cirúrgico. Após os dias 3, 14 e 21, os animais foram eutanizados, e foram realizadas avaliações macroscópicas e histópicas. Nos dias 3 e 14, observou-se tecido adiposo em torno do CMS, sem evidência clínica de rejeição ou infecção, assim como a neoformação do vaso e a reabsorção de CMS no dia 21. Havia evidências histológicas de um processo de inflamação insignificante e migração de células adjacentes para o CMS, observadas com a hematoxilina e eosina (H&E) e a coloração tricrômica de Masson. O CMS mostrou-se ter um bom desempenho no tecido hepático e pode ser uma alternativa útil para estudar a regeneração tecidual e a reparação em doenças hepáticas crônicas.
Introduction
O fígado é um dos órgãos mais importantes envolvidos na manutenção da homeostase e da produção deproteínas 1. Infelizmente, a doença hepática é a principal causa de morte em todo o mundo. Em estágios avançados de dano hepático, que incluem cirrose e carcinoma hepatocelular, o transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado. No entanto, devido à escassez de doadores e à baixa taxa de transplantes bem sucedidos, novas técnicas em engenharia de tecidos (TE) e medicina regenerativa (RM) foram desenvolvidas2,3.
O TE envolve o uso de células-tronco, andaimes e fatores de crescimento4 para promover a restauração de órgãos e tecidos inflamados, fibrosos e edematosos1,5,6. Os biomateriais utilizados em andaimes imitam o ECM nativo, fornecendo as pistas físicas, químicas e biológicas para remodelação celular guiada7. O colágeno é uma das proteínas mais abundantes obtidas a partir da dermis, tendão, intestino e pericárdio8,9. Além disso, o colágeno pode ser obtido como biopolímero para produzir andaimes bi e tridimensionais através de bioimpressão ou eletropinning10,11. Este grupo é o primeiro a relatar o uso de colágeno de uma fonte óssea para a regeneração do tecido hepático. Outro estudo relata o uso de andaimes sintetizados a partir de colágeno bovino, obtido a partir da pele, com poros homogêneos e situados de perto, sem qualquer comunicação entre eles12.
A descelularização preserva o ECM nativo, permitindo a posterior incorporação de células com potencial de células-tronco13,14. No entanto, este procedimento ainda está em fase experimental no fígado, coração, rim, intestino delgado e bexiga urinária de camundongos, ratos, coelhos, porcos, ovelhas, bovinos e cavalos3,14. Atualmente, o volume de massa hepática ressectado não é substituído em nenhum dos modelos de hepatectomia animal. No entanto, o uso de suporte adicional ou rede (biomateriais) que permita a proliferação celular e a angiogênese pode ser essencial para a pronta restauração das funções paramicírmicas hepáticas. Assim, os andaimes poderiam ser empregados como abordagens alternativas para regenerar ou reparar tecidos em doenças hepáticas crônicas, eliminando limitações devido à doação e às complicações clínicas do transplante hepático.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A presente pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina (DI/115/2015) da Universidade Nacional Autónoma de México (UNAM) e pelo comitê de ética do Hospital Geral do México (CI/314/15). A instituição cumpre todas as especificações técnicas para a produção, cuidado e uso de animais de laboratório e é legalmente certificada por lei nacional (NOM-062-ZOO-1999). Ratos Wistar machos pesando 150-250 g (6-8 semanas de idade) foram obtidos do Laboratório de Instalações Animais da Faculdade de Medicina da UNAM, para este estudo.
1. Obtenção de andaimes de matriz de colágeno a partir do fêmur bovino
- Obtenha o condíle do fêmur bovino de um matadouro certificado pelas autoridades sanitárias e agrícolas do México.
- Disseca cuidadosamente a gordura, músculo e cartilagem com um instrumento cirúrgico. Corte os fragmentos de condíle em fragmentos de 3 cm x3 cm usando um cortador de serra e limpe a gordura e o sangue com uma toalha. Lave os fragmentos de condíle com água.
- Ferva (92 °C) os fragmentos com 1 L de detergente aniônico (10 g/L) por 30 min. Lave os fragmentos de condíle duas vezes para remover quaisquer restos do detergente aniônico.
- Seque os fragmentos de condíle por 3 h usando papel filtro (0,5 mm).
- Prepare um triangular (1 cm x1 cm x1 cm) CMS de espessura 0,5 cm dos fragmentos mencionados na etapa 1.1 (Figura 1A).
- Desmineralize os fragmentos em 100 mL de 0,5 M HCl por 10 min com agitação constante. Remova o HCL.
NOTA: Neutralizar o HCl com hidróxido de sódio (10 M). - Enxágüe os fragmentos três vezes com 100 mL de água destilada, 15 min cada vez, com agitação constante. Seque o CMS com papel filtro (0,5 mm) por 1h.
- Use um microscópio estéreo15 para analisar as propriedades estruturais do CMS (tamanho dos poros, formação de poros e interconexão porosa)(Figura 1B).
- Use um microscópio eletrônico de varredura16 para analisar a superfície áspera da trabecula cms(Figura 1C).
- Utilize o instrumento de dissecção para mistura e alongamento para avaliar as alterações mecânicas (plasticidade e flexibilidade) do CMS(Figura 1D).
- Embale o CMS na bolsa de esterilização e esterilize-o com plasma de peróxido de hidrogênio por 38 minutos. Armazene o CMS estéril na embalagem original em uma área seca a 20-25 °C até usar.
- Desmineralize os fragmentos em 100 mL de 0,5 M HCl por 10 min com agitação constante. Remova o HCL.
2. Preparação da área cirúrgica e manuseio e preparação do modelo animal
- Higienize a área cirúrgica, mesa de trabalho, microscópio de microcirurgia e assento com solução de clorexidina de 2%. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, esponja cirúrgica, cotonetes e cortina cirúrgica descartável através da esterilização térmica (121 °C/30 min/100 kPa)
- Atribua os ratos (n=5) em três grupos de cinco ratos por grupo: 1. sham, 2. hepatectomia e 3. hepatectomia mais CMS, e siga todos os grupos nos dias 3, 14 e 21 dias.
- Administrar cetamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro.
NOTA: O período sedativo normalmente dura de 30-40 min. - Raspe a pele abdominal (5 cm x 2 cm) usando sabão cirúrgico e uma lâmina de dois gumes, e desinfete a pele usando solução tópica de 10% de povidona-iodo em três rodadas17.
- Coloque o animal em uma placa quente na posição decúbito dorsal, com o pescoço hiperextendido para manter uma via aérea permeável(Figura 2).
- Avalie a profundidade da anestesia através do padrão respiratório e perda do reflexo de abstinência nos membros.
- Coloque uma cortina cirúrgica descartável ao redor da pele raspada e faça uma incisão (2,5 cm) na linha albous com um bisturi, usando o processo xifoide como ponto de referência. Evite o vaso sanguíneo da parede abdominal para evitar sangramento.
- Coloque o retítil abdominal no lugar e observe a cavidade abdominal. Utilizando as fórceps de dissecção, extraia o lobo hepático esquerdo e coloque-o na placa metálica(Figura 3A).
NOTA: No grupo falso, apenas extraia o lobo hepático esquerdo e depois devolva o fígado para a cavidade abdominal. Sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0. - Nos grupos experimentais com e sem CMS, utilize uma lâmina de bisturi e lâmina de bisturi estéril (nº 15) para realizar hepatectomia (aproximadamente 40%) com dois cortes. Use um modelo metálico triangular (1 cm x 1 cm x 1 cm) para realizar a hepatectomia(Figura 3B).
- Para evitar sangramento no fígado, mantenha a compressão cirúrgica com um cotonete na borda do fígado por 5 minutos.
- Hidrate o CMS em solução salina estéril por 20 minutos antes do procedimento cirúrgico. Implante o CMS no sítio de hepatectomia com quatro suturas de pontos entre o tecido hepático e o CMS para evitar o deslocamento do bioma material. Use 7-0 suturas de polipropileno não absorvíveis(Figura 3C).
NOTA: Não remova as suturas em uma segunda cirurgia; as suturas podem ser usadas como referência para identificar o local de implantação de CMS. - Devolva o fígado à cavidade abdominal e sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0. Limpe a incisão cirúrgica com uma esponja cirúrgica encharcada de iodo em duas rodadas. Observe e monitore os sinais vitais dos animais.
- Administrar cetamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro.
3. Cuidados pós-operatórios
- Administre a flunixina de meglumina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro. Administrar analgésicos conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
- Para recuperação da anestesia, coloque os animais em caixas individuais de policarbonato com cama de animal de laboratório em uma área livre de ruídos com controle de temperatura (23 °C).
- Observe a recuperação dos animais e monitore seu consumo de água e alimentos por 2h. Monitorar animais postados operativamente conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
4. Avaliação da função hepática no soro
- Coletar amostras de sangue (500 μL) das veias traseiras laterais dos animais anestesiados antes do procedimento cirúrgico (valores de linha de base) e nos dias de avaliação 3, 14 e 21.
- Centrifugar as amostras de sangue a 850 × g/10 min em temperatura ambiente (23 °C); separe o soro e armazene-o a -80°C até usar.
- Realize um painel de testes de função hepática: albumina s sorocabana (ALB), fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), aminotransferase aspartate (AST), bilirrubina total (TB) e bilirrubina direta (DB)(Tabela 1).
5. Eutanásia e manejo de tecidos
- Anestesiar os animais para cada avaliação (dias 3, 14 e 21) seguindo o protocolo descrito acima.
- Eutanize através de métodos aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
- Realize uma incisão (5-6 cm) na linha albous com um bisturi para observar os órgãos da cavidade abdominal e tirar fotografias da área de hepatectomia da farsa e dos grupos experimentais, com e sem o CMS.
- Pegue amostras hepáticas (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) de todos os animais do grupo de estudo e coloque-as em uma solução de formaldeído de 4% para 24h para avaliação histológica subsequente.
6. Análise histológica
- Preservar os tecidos hepáticos em 4% de formaldeído e desidratar o tecido usando uma série de concentrações de álcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); colocá-los em xileno (1h) e incorporá-los na parafina16.
- Corte os blocos de parafina com um microtome em seções de 4 μm de espessura para a preparação de oito slides.
- Executar h&E e masson's tricromo mancha16.
- Observe as seções manchadas sob um microscópio leve para selecionar as áreas representativas do fígado, com e sem CMS. Obtenha fotomicrografias em 4x, 10x e 40x de ampliação e processe as imagens usando o software apropriado18 (ver a Tabela de Materiais).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A desmineralização óssea afeta as propriedades mecânicas do CMS sem alterar a forma original ou a interconexão de seusporos. O CMS pode ter qualquer forma e, portanto, pode ser ajustado ao tamanho e forma do órgão ou tecido selecionado19. No presente protocolo, utilizamos um CMS triangular (Figura 1A-D). Foi utilizado um modelo de rato para avaliar a capacidade regenerativa do xenoimplant CMS no fígado. Embora o fígado seja um órgão friável e macio, o procedimento cirúrgico realizado neste protocolo garantiu que o CMS permanecesse no lugar(Figura 2 e Figura 3A-C). A hepatectomia parcial de 40% do lobo esquerdo permitiu que uma porção do órgão fosse avaliada, mantendo o resto do fígado intacto, para que as alterações no implante e no parênquim nativo pudessem ser comparadas. Além disso, obtivemos amostras de sangue para avaliar a função hepática antes e depois da implantação do CMS.
Não houve diferenças nas concentrações de linha de base dos parâmetros bioquímicos entre o grupo falso e o grupo experimental com e sem implantação de CMS em 3 e 14 dias; permaneceram dentro dos valores de referência (ALB: 0,43-2,41 g/dL; ALP: 134-357.3 U/L; ALT: 41-83.1 UI/L; AST: 61.4-276.2 UI/L; TB: 0,01-0,43 mg/dL; DB: 0,1 mg/dL)20. Além disso, não houve diferenças nos níveis de albumina, ALP, ALT, AST, TB e DB entre o grupo sham e os grupos experimentais aos 21 dias, indicando que o CMS não interrompe a função hepática(Tabela 1).
Durante a eutanásia, a laparotomia exploratória revelou a cor típica e o tamanho e a forma corretas do fígado. Nenhuma inflamação ou infecção foi observada no local de implantação em nenhum dos casos. No dia 3, não houve alterações no órgão em relação à cavidade abdominal (Figura 4A). Em uma porção que continha tecido hepático e CMS, observou-se que o sangue se infiltrou no CMS, com gordura omental incipiente(Figura 4B). No dia 14, a quantidade de gordura aumentou; houve neoformação dos vasos sanguíneos e a integração do CMS no tecido hepático receptor, mas não houve alterações no intestino delgado ou órgãos da cavidade abdominal (Figura 5A). A gordura omental foi maior na zona anterior (Figura 5B) em comparação com a zona visceral (Figura 5C) no local de implantação do CMS. No dia 21 de avaliação, a incorporação do CMS no fígado ficou mais evidente (Figura 6A). O aumento da gordura omental poderia ser usado como um indicador do progresso da regeneração, pois é uma fonte de células-tronco mesenquimais21. Além disso, aos 21 dias, o fígado apresentava áreas densas que correspondiam à degradação e absorção, alterando o tamanho e a forma original(Figura 6B).
Para analisar a microestrutura do fígado com o implante cms, realizou-se análise histológica de um fragmento representativo do tecido do local de implantação, que foi comparado com tecido do lobo hepático direito (controle). As biópsias realizadas nos dias 3, 14 e 21 foram processadas e submetidas à coloração tricrômica de H&E e Masson. A estrutura normal do parênquimo hepático foi observada no grupo sham no dia 21 (Figura 7A e Figura 7E). No dia 3, a análise histológica mostrou que a presença do CMS no fígado não promoveu uma reação do corpo estranho, observando-se a presença visível de tecido conjuntivo frouxo(Figura 7B e Figura 7F). Nos dias 14 e 21, o tecido conjuntivo frouxo era mais abundante, com a trabecula cms cercada por hepatócitos, sugerindo que os hepatócitos haviam migrado para o CMS (Figura 7C e Figura 7G; Figura 7D e Figura 7H). Os resultados também mostraram áreas de hepatócitos que foram irrigadas por um navio (Figura 8A). Uma inspeção minuciosa revelou que os hepatócitos que aderiram à trabecula CMS às vezes eram cercados por tecido conjuntivo frouxo(Figura 8B-D). Dois patologistas independentes duplamente cegos realizaram a análise histopatológica. Ensaios baseados em reação em cadeia de imunohistoquímica e polimerase estão em andamento para avaliar as diferentes proteínas e genes relacionados ao processo de regeneração hepática.
Assim, as observações macroscópicas e microscópicas e os valores bioquímicos apoiam nossa proposta de que o CMS é um bioma material ideal para apoiar e promover a regeneração hepática. No entanto, a implantação do CMS deve ser avaliada por mais de 21 dias para determinar seu tempo de absorção e restauração completa do tecido hepático. Além disso, devem ser realizados estudos que avaliam as diferentes proteínas e genes relacionados à regeneração hepática na presença do CMS.
Figura 1: Amostra óssea e CMS. (A) Uma amostra triangular da amostra óssea foi utilizada para preparar o CMS. (B) Uma visão detalhada dos poros e interconexão ou conexão trabecular do CMS, como observado pela microscopia eletrônica. (C) O CMS, como visto em um microscópio estéreo. (D) Foi realizada manipulação de CMS com instrumento para verificar a modificação das propriedades mecânicas. Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparando o animal para cirurgia. O animal está na posição decúbito dorsal, mostrando a área abdominal raspada, preparada para hepatectomia e implantação de CMS. Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hepatectomia do lobo esquerdo do fígado. (A) O lobo esquerdo foi extraído e colocado na placa metálica para realizar a hepatectomia. (B) A hepatectomia de 40% do lobo esquerdo foi realizada em forma triangular, como o CMS. (C) A área da hepatectomia é substituída pelo CMS. Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dia 3 de avaliação. (A) Observação macroscópica do local de implantação no dia 3 de avaliação. O fígado implantado com (estrela preenchida) o CMS (linha pontilhada) não mudou de cor ou tamanho. O intestino delgado (estrela vazia) e o resto das estruturas abdominais não apresentaram alterações. (B) Amostra do fígado (estrela preenchida) e do CMS (seta branca) cobertos com gordura omental (seta vermelha). Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dia 14 de avaliação. (A) Observação macroscópica do local de implantação no dia 14 de avaliação. O tecido hepático (estrela preenchida) com o CMS não mudou de cor ou tamanho. O intestino delgado (estrela vazia) e o resto das estruturas e órgãos da cavidade abdominal não apresentaram alterações. Amostra do fígado com o CMS implantado: (B) visão anterior; (C) visão posterior/visceral. Gordura omental (seta vermelha) cobrindo a área. O CMS foi integrado ao tecido hepático. A gordura omental (seta vermelha) cobre principalmente a área na vista anterior. A linha pontilhada indica o local da implantação de CMS; suturas (fio azul). Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Dia 21 de avaliação. (A) Observação macroscópica do local de implantação no dia 21 de avaliação. O fígado receptor (estrela preenchida) implantado com o CMS (linha pontilhada) não mudou de cor ou tamanho. O intestino delgado (estrela vazia) e o resto das estruturas abdominais não apresentaram alterações. (B) Amostra do fígado com o CMS implantado (linha pontilhada) mostrando alterações de tamanho e forma. Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Histologia do fígado e fígado com CMS. (A) Fígado normal (SHAM) mostrando a arquitetura característica do tecido. (B) Dia 3 de implantação de CMS mostrando tecido conjuntivo frouxo na trabecula do CMS (ovais tracejados). (C) Zona de transição entre o fígado nativo (lado direito) e o CMS (lado esquerdo), com a trabecula do CMS (seta). (D) Fígado nativo em contato com o CMS (linhas pontilhadas) no dia 21. (E) Fígado normal com a mancha tricromática de Masson. (F) O CMS implantado no fígado; invasão de tecido conjuntivo frouxo no dia 3 (oval tracejado). (G) No dia 14, fígado nativo com trabecula de CMS, mostrando uma área de hepatócitos (estrela preenchida) fora do fígado nativo, indicando que os hepatócitos nativos haviam migrado através do CMS. Nodia 21, os hepatócitos nativos migraram em direção ao CMS (seta). A e E: Barras de escala = 200 μm: 4x, B-D e F-H: Barras de escala = 100 μm: 10x. A-D: Mancha H&E; E-H: A coloração tricrômica de Masson. Abreviaturas: CMS = andaime da matriz de colágeno; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Histologia do fígado e CMS. (A) Piscina de hepatócitos (seta branca) presente na trabecula do CMS (seta preta). Os hepatócitos são irrigados por um vaso (estrela preenchida). (B) Os hepatócitos (seta branca) migraram e aderiram à trabecula do CMS (seta preta). (C) Um grupo de hepatócitos (círculo tracejado) são observados entre duas trabeculas (setas pretas) do CMS. (D) Os hepatócitos aderiram à trabecula (setas pretas) de CMS na presença de tecido conjuntivo frouxo (oval tracejado). A e C: Barras de escala = 100 μm: 10x. B e D: Barras de escala = 20 μm: 40x. Abreviação: CMS = andaime de matriz de colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Dias | FARSA | Hepatectomia | CMS de implantação | |
| ALB (g/dL) | 3 | 1.4±00 | 1.25±0.07 | 1.4±00 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1,85±0,07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1,7± 0 | |
| ALT (IU/L) | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54,6±6.4 |
| 14 | 84±00. | 59,5±4,9 | 57±4.2 | |
| 21 | 57±00 | 73,5±14,8 | 73,5±14,8 | |
| AST (IU/L) | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5,5 | 94±21.2 | 83,5±17,6 | |
| 21 | 123,7±27,3 | 92,5±24,7 | 101±31.1 | |
| TB (mg/dL) | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0,3±00 |
| 14 | 0,5±00 | 0,2±00 | 0,15±000 | |
| 21 | 0,3±00 | 0,4±00 | 0.4±0.14 | |
| DB (mg/dL) | 3 | 0,1±00 | 0.05±0.07 | 0,1±00 |
| 14 | 0,1±00 | 0,1±00 | 0,1±00 | |
| 21 | 0,1±00 | 0,1±00 | 0,1±00 |
Tabela 1: Função hepática. Foram realizados testes de função hepática para os grupos falso e experimental com e sem CMS aos 3, 14 e 21 dias. Abreviaturas: CMS = andaime da matriz de colágeno; ALB = Albumina; ALP = Fosfattase alcalina; ALT= Alanine aminotransferase; AST = Aspartate aminotransferase; TB = Bilirrubina total; DB = Bilirrubina direta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O transplante de órgãos é o pilar do tratamento em pacientes com fibrose hepática ou cirrose. Alguns pacientes se beneficiam desse procedimento, tornando necessário fornecer alternativas terapêuticas para os pacientes na lista de espera. A engenharia de tecidos é uma estratégia promissora que emprega andaimes e células com potencial regenerativo2,4,13. A remoção de uma porção do fígado é um passo crítico neste procedimento devido ao sangramento profuso deste órgão vascularizado. Portanto, deve ser realizada hemostasia do leito cirúrgico para evitar essa complicação. Além disso, a ligação do tecido hepático ao CMS, essencial para garantir a interação tecido-biomagráfico, é facilitada através do uso de suturas. No entanto, deve ser feito com cuidado para evitar rasgar o fígado e causar sangramento posterior.
Embora o biomaterial aqui proposto seja de origem bovina (xenogênica), não há dados de reação biomaterial em ratos, tornando possível a hepatectomia seletiva. Em contrapartida, o modelo de hepatectomia 2/3 tem sido mostrado para causar a morte dos animais por causa da remoção de uma grande quantidade de tecido hepático14. Além disso, desenvolvemos um modelo metálico de aço inoxidável porque tivemos dificuldade em padronizar o tamanho da hepatectomia e do CMS. A esterilização do CMS foi desafiadora porque as técnicas existentes modificaram a estrutura do colágeno e suas propriedades bioquímicas. Assim, a esterilização por calor, radiação gama e óxido de etileno foi explorada como métodos de esterilização antes de determinar que o plasma de peróxido de hidrogênio era a técnica ideal13.
É essencial determinar o tamanho máximo do CMS que poderia ser implantado no fígado e avaliar a resposta biológica a um nível sistêmico. Além disso, é necessário otimizar e investigar a eficácia dessa técnica em uma espécie animal maior. Além disso, é importante investigar os efeitos da implantação de CMS no fígado por um período mais longo (>30 dias), o que permitirá a avaliação da extensão da biosorção do CMS e a regeneração do tecido hepático. Além disso, os efeitos da implantação do CMS devem ser examinados em modelos animais com danos hepáticos. Este método de implantação abriu as portas para estratégias que exploram a restauração da forma e volume do tecido ressecado, reduzindo assim anestesia, duração cirúrgica e tempo derecuperação 4,13.
O CMS foi obtido de fonte natural e preservou suas propriedades físicas e químicas em comparação com biomateriais sintéticos feitos por metodologias complexas, como bioimpressão ou eletrospinning, que não são biocompatíveis ou bioabsorvíveis2,3. O componente principal deste CMS é o colágeno tipo I, que é a principal proteína do ECM que permite a adesão e proliferaçãocelular 22. Além disso, a trabecula dos poros CMS permitem a migração celular e o fluxo contínuo de fatores de crescimento, sangue e outros mediadores do processo de regeneração. De acordo com o tecido a ser reparado, este grupo de pesquisa tem experiência em projetar o CMS em diferentes formas, preservando sua estrutura 3D. Por exemplo, cms cilíndricos foram implantados em uretra de cães e ducto biliar em suínos e produziram resultados promissores na regeneração tecidual23,24.
A implantação deste CMS pode ser um tratamento alternativo para estimular a regeneração tecidual e restaurar o equilíbrio fibrogênese-fibrolise na cirrose hepática devido a diferentes etiologias (por exemplo, vírus, álcool, fatores metabólicos). Ensaios de proliferação, migração e inflamação devem ser realizados para identificar os mecanismos moleculares e celulares desencadeados pelo CMS. Em conclusão, este artigo descreve um procedimento reprodutível para hepatectomia, bem como o exame do processo de regeneração através da xenoimplantação de biomateriais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Benjamín León-Mancilla é doutorando pelo Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa DGAPA-UNAM.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao pessoal do Laboratório de Instalação Animal da Unidade experimental de Medicina, enfermeira Carolina Baños G. pelo apoio técnico e cirúrgico, Marco E. Gudiño Z. pelo apoio em microfotografias, e Erick Apo pelo apoio na histologia hepática. O Conselho Nacional apoiou esta pesquisa de Ciência e Tecnologia (CONACyT),o número de subvenção SALUD-2016-272579 e o PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J.
- Langer, R., Vacanti, J.
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G.
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
