Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Total diz artroplastisinden sonra hastalardan elde edilen primer dokular, osteoartrit araştırmaları için maksimal klinik çevrililebilirlik ile deneysel bir model sağlar. Bu protokol, insan osteoartritinde mekanistik araştırmayı desteklemek için RNA'nın yedi benzersiz diz dokusundan nasıl tanımlanıp işlenerek izole edilip izole edilecek anlatmaktadır.

Abstract

Osteoartrit (OA) en sık dizi etkileyen kronik ve dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Şu anda tedavisi olmadığı için total diz artroplasti (TKA) yaygın bir cerrahi müdahaledir. TKA'dan elde edilen birincil insan OA dokularını kullanan deneyler, ex vivohastalık mekanizmalarını araştırma yeteneği sağlar. OA'nın daha önce esas olarak kıkırdağı etkilediği düşünülse de, şimdi eklemdeki birden fazla dokuyu etkilediği bilinmektedir. Bu protokol, diz ekleminde hastalık mekanizması araştırmasını desteklemek için yedi benzersiz dokunun her birinden hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolünü (RNA saflığına, bütünlüğüne ve verimine göre) açıklar. Bilgilendirilmiş onam ile OA için TKA uygulanan hastalardan örnekler alındı. Dokular, RNA için flaş dondurma veya histoloji için formalin fiksasyonu ile ameliyattan sonraki 4 saat içinde parçalandı, yıkandı ve depolandı. Toplanan dokular arasında eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas vardı. Her doku tipi için RNA ekstraksiyon protokolleri test edildi. En önemli değişiklik, düşük hücreli, yüksek matrisli, sert dokular (kıkırdak, kemik ve menisküs olarak kabul edilir) ile nispeten yüksek hücreli, düşük matrisli, yumuşak dokular (yağ pedi, bağ, sinovyum ve kas olarak kabul edilir) için kullanılan parçalanma yöntemini içeriyordu. Pulverizasyonun sert dokular için, homojenizasyonun ise yumuşak dokular için uygun olduğu bulunmuştur. Bazı deneklerin birden fazla dokuda sürekli olarak diğer deneklere göre daha yüksek RNA bütünlük sayısı (RIN) değerleri verme eğilimi gözlendi ve bu da hastalık şiddeti gibi altta kalan faktörlerin RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürdü. Birincil insan OA dokularından yüksek kaliteli RNA'yı izole etme yeteneği, sıralama da dahil olmak üzere sofistike gen ekspresyon deneyleri için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar ve bu da hastalara daha kolay çevrilen klinik içgörülere yol açabilir.

Introduction

Diz, kaval kemiği ve uyluk kemiği arasındaki tibiofemoral eklemi ve patella ile uyluk kemiği arasındaki patellofemoral eklemi içeren insan vücudundaki en büyük sinovyal eklemdir1. Dizdeki kemikler eklem kıkırdağı ile kaplıdır ve menisküs, yağ, bağlar ve kas dahil olmak üzere çeşitli bağ dokuları tarafından desteklenir ve sinovyal bir membran, sinovyal sıvı dolu bir boşluk oluşturmak için tüm eklemi kapsüller1,2,3 ( Şekil1). Sağlıklı bir diz, ön düzlemde sürtünmesiz harekete izin veren mobil menteşe eklemi olarak işlev alır1,3. Patolojik koşullar altında hareket kısıtlanabilir ve ağrılı hale gelebilir. En sık görülen dejeneratif diz eklemi hastalığı osteoartrittir (OA)4. İleri yaş, obezite, kadın cinsiyeti, eklem travması ve genetik dahil olmak üzere OA gelişimine yatkın olan çeşitli risk faktörleri bilinmektedir, diğerleriarasında 5,6. Şu anda ABD'de semptomatik diz OA'sı olan tahmini 14 milyon kişi vardır, artan nüfus yaşı ve obezite oranları nedeniyle prevalans artmaktadır7,8. Başlangıçta kıkırdak hastalığı olarak kabul edilen OA, şimdi tüm eklemin bir hastalığı olarak anlaşılmaktadır9. OA'da yaygın olarak gözlenen patolojik değişiklikler eklem kıkırdak erozyonu, osteofit oluşumu, subkondral kemik kalınlaşması ve sinovyum iltihabı9,10'dur. OA için bilinen bir tedavi olmadığından, tedaviler öncelikle semptom (örneğin, ağrı) yönetimi11,12'ye odaklanır ve OA son aşamaya ilerledikten sonra, eklem protezi ameliyatı genellikle13olarak belirtilir.

Eklem protezi ameliyatları, tüm tibiofemoral eklem ve patellofemoral eklemin değiştirilmesi de dahil olmak üzere total diz artroplasti (TKA) ile kısmi veya total diz protezleri olabilir. 2020 yılı itibariyle ABD'de her yıl yaklaşık 1 milyon TKA yapılmaktadır14. TKA sırasında, bir ortopedi cerrahı tibial platonun üst kısmını ve alt femoral kondilenleri (Şekil 2A, 2B) protez implantlarla donatılmak üzere resects. Bazen hastalar tarafından yanlış yorumlanır, bir TKA'da, her kemiğin ucundan sadece 8-10 mm resected, daha sonra kaplanır veya yeniden ortaya çıkar, metal ile. Birbirine ketilosen astar, iki metal implant arasındaki yatak yüzeyini (yani dolguyu) oluşturur. Ek olarak, eklemin birkaç yumuşak doku bileşeni, uygun eklem dengesini sağlamak için tamamen veya kısmen eksilir. Bu dokular arasında medial ve lateral menisküs (Şekil 2C), infrapateller yağ pedi (Şekil 2D), ön çapraz bağ (ACL; Şekil 2E), sinovyum (Şekil 2F) ve vastus medialis eğik kas (VMO; Şekil 2G) 15. TNA'lar genellikle OA tedavisi için başarılı olsa da, hastaların yaklaşık% 20'si ameliyat sonrası ağrının tekrarını bildirmektedir16. Prosedürün yüksek maliyeti ve göreceli istilacılığının yanı sıra, bu sınırlamalar OA'nın ilerlemesini azaltmak için alternatif tedavileri belirlemek için daha fazla araştırma ihtiyacına işaret etmektedir.

OA'da terapötik müdahale için yeni yollar sunabilecek hastalık mekanizmalarını araştırmak için hücreler, doku eksplantları ve hayvan modelleri de dahil olmak üzere deneysel sistemler kullanılabilir. Hücreler tipik olarak monolayer olarak kültürlenir ve birincil insan veya hayvan dokularından (örneğin, kıkırdaktan izole edilmiş kondrositler) veya ölümsüzleştirilmiş hücrelerden (örneğin, ATDC517 ve CHON-001 18)türetilir. Hücreler kontrollü bir kültür ortamında deneysel değişkenleri manipüle etmek için yararlı olsa da, hücre fenotiplerini etkilediği bilinen doğal eklem koşullarını yakalamaz19. OA'nın altında bulunan kimyasal, mekanik ve hücreden hücreye iletişimin karmaşık basamaklarını daha iyi özetlemek için, birincil insan veya hayvan doku örneklerinde, taze veya kültürlü eks vivo eksplant olarak kullanılsın, doku yapısını ve hücre mikroçevrimini korumak için bir alternatif bulunur20. Eklem in vivoincelemek için, küçük (örneğin, fare21)ve OA için büyük (örneğin, at22)hayvan modelleri (örneğin, cerrahi indüksiyon, genetik değişiklik veya yaşlanma yoluyla) da yararlıdır. Bununla birlikte, bu modellerden insan hastalığına çeviri anatomik, fizyolojik ve metabolik farklılıklarla sınırlanabilir, diğerleri arasında23. Deneysel sistemlerin avantajları ve dezavantajları göz önüne alındığında, türlere özgü olmanın ve birincil insan OA dokularının sunduğu hücre dışı nişi korumanın temel güçlü yanları, araştırma bulgularının çeviri potansiyelini en üst düzeye çıkarır.

Birincil insan OA dokuları TKA'yı takiben kolayca elde edilebilir ve bu da TKA'ların yüksek sıklığını araştırma için değerli bir kaynak haline getirir. Potansiyel deneysel uygulamalar arasında gen ekspresyolojisi ve histolojik analizler bulunmaktadır. Birincil insan OA dokularının bu araştırma yaklaşımları ve diğerleri için potansiyelini gerçekleştirmek için, özetlenen aşağıdaki temel hususlardır. İlk olarak, hasta örneklerinin kullanımı etik düzenlemeye tabidir ve protokollerin Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylarını karşılaması gerekir24. İkincisi, insan primer hastalıklı dokuların doğasında var olan heterojenlik ve yaş ve cinsiyet gibi değişkenlerin etkisi, diğerlerinin yanı sıra, dikkatli hasta seçimi (yani uygunluk kriterlerinin uygulanması) ve veri yorumlama ihtiyacını yaratır. Üçüncüsü, eklemdeki farklı dokuların benzersiz biyolojik özellikleri (örneğin, kıkırdak ve menisküs25'indüşük hücreselliği) deneyler sırasında zorluklara neden olabilir (örneğin, yüksek kalite ve RNA miktarını izole etmek). Bu rapor bu hususları ele alıyor ve hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrol (yani RNA saflığının ve bütünlüğünün değerlendirilmesi) için bir protokol sunuyor; Şekil 3) araştırma topluluğunda birincil insan OA dokularının kullanımını teşvik etmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma protokolü Henry Ford Sağlık Sistemi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #13995) tarafından onaylanmış ve kurumsal yönergelere uyulmuştır.

1. Hasta seçimi

  1. Ortopedi cerrahı ile TKA'ya girmesi planlananlar arasından hastaları tanımlayın.
  2. Hastaları çalışma protokolü tarafından tanımlanan uygunluk kriterlerine göre seçin. İnklüzyon kriterlerine örnek olarak 18 yaş ve üstü olmak ve diz osteoartritinin doğrulanmış tanısının olması verilebilir. Dışlama kriterlerine örnek olarak kısmi diz protezi yaptırmak veya romatoid artrit tanısı konmuş olmak verilebilir.
  3. Ameliyattan önce bilgilendirilmiş onay almak için hasta ile iletişime geçin.

2. Örnek işleme (RNA için)

NOT: Tüm doku işlemlerini sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin ve steril teknikleri izleyin. İnsan örneklerini işlerken her zaman uygun KKD (nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri) giyin. TKA sırasında çeşitli kemik parçaları üretilir, diseksiyon için potansiyel olarak çok miktarda kemik / kıkırdak kullanılabilir. Hastalığın ilerlemesi nedeniyle, eklem kıkırdak dejenerasyonu bazı kemik kısımlarında daha şiddetli olabilir ve bu da deneysel tasarıma dahil edilebilir. Sadece elektrokoterden rezeksiyon için zorunlu olan dokularda termal kenar hasarı vardır ve hasarı en aza indirmek için çoğu dokuyu neşterle temin etmek için eş zamanlı bir cerrahi çaba sarf edilir. Resected dokular steril PBS ile her zaman nemli tutulmalıdır.

  1. Tüm çalışma yüzeylerini ve ekipmanlarını% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve yine% 70 etanol ile dezenfekte edin. Kalan sıvıyı temiz, tüy bırakmayan dokularla silin. Forsepsler, kemik kesiciler ve neşterler, kullanımdan önce en az 10 dakika boyunca otomatik olarak kapatılır veya% 70 etanol içine batırılır. Ekipmanı hemen kullanılmadığında% 70 etanolde su altında tutun.
  2. Her doku için de-tanımlı örnek adı ve aliquot numarası ile en az üç cryovial ön etiket (örneğin, TKA-1 Kıkırdak 1).
    1. Şekil 2'degösterildiği ve açıklandığı gibi boyut, şekil, renk ve doku farklılıklarına göre numuneden her doku tipini tanımlayın. Kıkırdak (Şekil 2A oku), kemik (Şekil 2B ok), menisküs (Şekil 2C), infrapateller yağ pedi (Şekil 2D), ön çapraz bağ (Şekil 2E), sinovyum (Şekil 2F) ve vastus medialis eğik kas (Şekil 2G) tanımlayın.
  3. Eklem kıkırdaklarını izole edin.
    1. Minimum kıkırdak bozulması olan bir kemik kısmı seçin.
    2. 10 numaralı neşter kullanarak, kıkırdak tabakasının tam kalınlığını kesmek için kıkırdak derinliğini mümkün olduğunca kesin.
      NOT: 10 numara neşter sadece kıkırdaklara nüfuz eder, kemiğe değil.
    3. Kıkırdağın tam kalınlığını kullanarak, üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  4. Subkondral kemiği izole et.
    1. Kıkırdak toplanan kemik bölümünü kullanın.
    2. 10 numaralı neşter kullanarak, kalan kıkırdak ve artık dokuları kemik yüzeyinden kazıyın.
    3. Kemik kısmını tokalarla kesilecek şekilde tutun ve kemik kesicileri kullanarak üç 5 mm küp kesin.
  5. Menisküsleri izole et.
    1. Medial veya lateral menisküslerin nispeten hasarsız bir kısmını tanımlayın.
    2. 10 numaralı neşter ve önseçim kullanarak üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  6. Infrapateller yağ yastığını izole edin.
    1. No.10 neşter ve asalar kullanarak, dokunun sarı kısmını üç eşit büyüklükte ve homojen porsiyonda (her biri ~ 500 mg) kesin.
  7. Ön çapraz bağı (ACL) izole edin.
    1. 10 numaralı neşter ve önseçim kullanarak üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  8. Sinovumu izole et.
    1. 10 numara neşter ve toslar kullanarak, yağ dokusunu kazıyarak zarın pembe hücresel kısmını mümkün olduğunca izole edin.
    2. Üç eşit büyüklükte ve homojen porsiyon (her biri ~ 200 mg) diseksiyon.
  9. Vastus medialis eğik kasını (VMO) izole edin.
    1. 10 numaralı neşter ve tostips kullanarak, numuneden herhangi bir yağ dokusunu çıkarın ve sadece kırmızı kas dokusunu bırakın.
    2. Üç 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
      NOT: Dokunun başlangıç boyutu porsiyonların boyutunu sınırlar.
  10. Herhangi bir kalıntı veya döküntük gidermek için doku kısımlarını steril PBS ile durulayın.
  11. Histoloji yapmak için, Bölüm 3'teaçıklandığı gibi her doku kısmını sabitle.
  12. RNA ekstraksiyonu yapmak için, üç doku kısmının her birini daha küçük parçalara (~1-2 mm   küpler) kesin.
    1. Küçük parçaları 2 mL cryovial, güvenli kapaklara sıkıca aktarın, 30 s sıvı nitrojene batırarak flaş dondurma ve ardından uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucuya aktarın (mevcut protokolde test edilen 4 aya kadar). Tüm dokuların tüm aliquots için bunu tekrarlayın.
    2. Bölüm 4'teaçıklandığı gibi Doku homojenizasyonuna devam edin.

3. Örnek işleme (histoloji için)

DİkKAT: Formalin tehlikeli bir kimyasaldır, sadece kimyasal duman kaputunda kullanılır.

  1. Önceden etiketlenmiş 15 mL konik tüpleri % 10 formalin çözeltisi ile doldurun.
  2. Tokmak kullanarak doku bölümünü formalin dolu tüplere aktarın.
  3. Mümkünse sallarken / çalkalarken dokuları oda sıcaklığında 1 hafta formalin içinde sabitlayın.
  4. 1 hafta sonra, formalini uygun kimyasal atık bertarafına atın, dokuları PBS ile durulayın ve numuneler bölümleme için gömülene kadar 4 ° C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içeren taze bir 15 mL konik tüpe aktarın.
    NOT: Sadece kemik/kıkırdak için kireç çözme işlemi aşağıdaki gibi yapın.
  5. 1 hafta sonra, formalini uygun kimyasal atık bertarafına atın ve dokuları PBS ile durulayın.
  6. Dokuyu 45 mL%10 EDTA çözeltisi (pH 7.4) içeren 50 mL konik bir tüpe aktarın.
  7. Sallama/ ajitasyon mümkün değilse, tüpleri günde bir kez 10-15 kez ters çevirin.
  8. EDTA çözümünü haftada bir kez atın ve değiştirin.
    1. Haftada iki kez, basınç uygulandığında deformasyon gözlemleyerek kireçlenmeyi doğrulamak için dokuyu bir aletle (örneğin spatula) veya eldivenli parmakla test edin. Kemik dokusunu kireçten arındırmak için gereken süre 4-6 hafta arasında örnekler arasında değişecektir.
  9. Kireçten arındırdıktan sonra, dokuyu PBS ile durulayın ve numuneler bölümleme için gömülene kadar 4 °C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içeren taze bir 15 mL konik tüpe aktarın.

4. Doku homojenizasyonu

DİkKAT: Protokolde tehlikeli kimyasal fenol unun kullanımına dikkat edilir. Fenol ile çalışma kimyasal duman kaputunda yapılmalıdır.

NOT: % 70 etanol ile kullanılacak tüm ekipman ve yüzeyleri iyice temizleyin (en az 10 dakika ıslatın), ardından RNase dekontaminant (en az 10 dakika ıslatın), DEPC ile arıtılmış suyla durulayın, temiz, tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile silin ve ardından% 70 etanol ile respray veya ıslatın.

  1. Sert doku homojenizasyonu (eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs)
    1. Homojenizasyondan önce, sıvı nitrojen kullanarak harcı, pestleyi ve spatulayı soğutun. Numune erimesini önlemek için bunlar mümkün olduğunca soğuk tutulmalıdır.
    2. Numuneleri teker teker işleyin, diğer numuneleri kullanılana kadar -80 °C'de tutun.
    3. Doku örneğini soğutulmuş bir spatula kullanarak harçlara aktarın; dokunun üzerine ek sıvı azot dökün ve buharlaşmasını bırakın. Pestle kullanarak dokuyu ezin. Doku örneğine tekrar tekrar daha fazla sıvı azot ekleyin, buharlaşmasına izin verin ve ardından ince bir toz yapmak için pestle ile taşlamaya devam edin.
    4. Dokuyu mümkün olduğunca toz haline getirtikten sonra, önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      1. Doku transferden önce 30 sn sıvı nitrojene batırılarak ön soğutma tüpleri.
    5. Her tüpe 1 mL asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin ve buzda tutun.
    6. Her sert doku örneği için 4.1.3-4.1.5 adımlarını yineleyin.
    7. Her dokudan sonra, harç, pestle ve spatulayı% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve% 70 etanolde ilave bir ıslatma ile temizleyin. Kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir dokuyla silin.
    8. Örnekleri 20 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  2. Yumuşak doku homojenizasyonu (infrapateller yağ pedi, ACL, sinovyum, VMO)
    1. Homojenizatörü% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve her biri 30 s için ek% 70 etanol yıkama tüpleri çalıştırarak dezenfekte edin. Kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir dokuyla silin. Bunu her örnek arasında tekrarlayın.
    2. Her numune için 5 mL yuvarlak alt tüpler ön etiket. Her tüpe 1 mL asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin.
      1. Her seferinde bir örnek üzerinde çalışın, diğer numunelerin kullanıma kadar -80 °C'de işlenmesini sağlar.
    3. Dokuyu asit-guanidinium-fenol ile önceden etiketlenmiş 5 mL tüpe aktarın.
    4. Dokuları 30 s darbeyle homojenize edin, darbeler sırasında ve arasında buzda tutun. Doku görsel olarak çözülene kadar veya en fazla beş 30 s darbe için tekrarlayın.
      NOT: Bazı lifli dokular (yani kas) iyice homojenize olmayabilir.
    5. Çözünmüş dokuyu buzda kuluçkaya yatır ve bir sonraki örneğe geç.
      1. Homojenizatörleri adım 4.2.1'de açıklandığı gibi temizleyin. Doku parçalarının probun dişlerinde kalmadığından emin olun; gerekirse steril asalarla çıkarın.
    6. Tüm örneklerin homojenizasyonu yapıldıktan sonra, ek 20 dakika boyunca asit-guanidinium-fenolde buz üzerinde kuluçkaya yatın.
    7. Numuneleri yuvarlak alt tüplerden önceden etiketlenmiş ve önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.

5. Dokulardan RNA ekstraksiyonu

DİkKAT: Bu protokol fenol, kloroform ve izopropanol gibi tehlikeli kimyasallar kullanır. Tüm işi kimyasal duman kaputunda gerçekleştirin.

NOT: Ekipman ve reaktifler sadece RNA çalışmaları için ayrılmıştır ve moleküler uygulamalar için uygun kimyasal sınıfa sahip olmalıdır (yani steril, nükleaz içermemelidir). Bu protokol hem Parts 4.1 hem de 4.2 doku homojenizasyon protokollerinin başarılı olur. % 70 etanol (en az 10 dakika ıslatın) ve ardından RNase dekontaminant (en az 10 dakika ıslatın) ile kullanılacak tüm ekipman ve yüzeyleri iyice temizleyin. DEPC ile arıtılmış su ile durulayın, kalan sıvıyı temiz, tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile silin ve ardından% 70 etanol ile respray veya ıslatın.

  1. Enkazı peletmek için 10000 x g'daki mikrosantrifüj tüplerini 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
  2. Süpernatantı taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Yağ dokuları için bazen üstte bir lipit tabakası bulunur. Borunun yan tarafındaki tabakayı pipet ucuyla delerek bunu aktarmaktan kaçının.
  3. Her numuneye asit-guanidinium-fenol çözeltisinin 1 mL'si başına 200 μL kloroform ekleyin. 30 s karıştırmak için tüpleri kuvvetlice elle çalkalayın. Ardından, 2 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
  4. 4 °C'de 12 dakika boyunca 10000 x g'da santrifüj örnekleri.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra üç katman oluşmuş olacaktır: RNA içeren sulu bir faz, beyaz bir DNA ara fazı ve altta pembe bir protein fazı.
  5. Üst, sulu fazın ~500 μL'lik kısmını taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Ara fazı ve protein fraksiyonlarını bozmayın. Gelecekteki DNA veya protein izolasyonu için bu aşamaları -80 °C'de saklayın.
  6. Aktarılan sulu faza eşit miktarda asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin, tüpü 8-10 kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü 20 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır.
  7. Her numuneye asit-guanidinium-fenol çözeltisinin 1 mL'si başına 200 μL kloroform ekleyin. Karıştırmak için 30 sn boyunca elle kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
  8. 4 °C'de 12 dakika boyunca 10000 x g'da santrifüj örnekleri.
  9. Sulu fazın <500 μL'yi taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, numuneyi diğer aşamalarla kirletmemeye dikkat edin.
    DİkKAT: Kalan aşamaları uygun tehlikeli madde bertaraf yöntemleriyle atın.
  10. Her numuneye % 100 izopropanol eşit hacim (sulu faz olarak) ekleyin. Tüpü 8-10 kez ters çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    1. Santrifüj sonrası RNA peletinin bulunmasına yardımcı olmak için her numuneye 1 μL glikojen koprecipitant ekleyin.
  11. Numuneleri 12000 x g'da 4 °C'de 25 dakika santrifüj edin.
  12. Peleti tüpte bulun (coprecipitant kullanıyorsanız, mavi görünecektir). Süpernatant dikkatlice dökün.
  13. Her numuneye 1 mL buz gibi% 75 etanol ekleyerek peletin yıkanması, peletin tüpün dibinden yerinden sökülmek için girdap.
    NOT: Moleküler sınıf saf etanol ve nükleaz içermeyen su kullanarak % 75 etanol hazırlayın.
  14. 4 °C'de 5 dakika boyunca 7000 x g'da santrifüj. Süpernatant dikkatlice dökün.
  15. 5.13 ve 5.14 adımlarını iki kez daha yineleyin.
  16. Tüpün dibine herhangi bir artık sıvı getirmek için hızlı dönüş (5 s için <2000 x g). Tüplerin altındaki artık etanolleri çıkarmak için bir P20 pipet kullanın.
    1. RNA peletini pipet ucuyla dokunmaktan kaçının. Örnekler arasındaki ipuçlarını değiştirin.
  17. Tüp kapakları açıkken, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kuru örnekleri.
    NOT: Pelet kurudukça yarı saydam hale gelebilir. Tüm artık etanollerin buharlaşmasını sağlamak RNA saflığını artıracaktır.
  18. Peletin çözülmesi için her tüpe 25 μL çekirdeksiz su ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
  20. RNA'yı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet.
  21. Numunenin Aliquot 5 μL'si kalite kontrol analizi için taze bir tüpe (Bölüm 6). Gen ekspresyözü tahlilleri için kalan 20 μL'yi -80 °C'de saklayın.

6. Kalite kontrolü

  1. Üreticinin talimatlarına göre bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir elektroforezi cihazı kullanarak RNA bütünlüğünü belirleyin.
    NOT: RNA'yı talaş algılama sınırları aralığında olacak şekilde seyreltin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OA için TKA uygulanan hastalardan tahsil için yedi benzersiz insan diz eklem dokusu mevcuttur (Şekil 1). Bu protokolde, bu dokuların her biri cerrahi olarak çıkarılmasından 4 saat sonra tespit edilmiş ve işlenmiştir (Şekil 2). Şekil 3'tebelirtilen adımların ardından, her dokunun bazı kısımları histolojik değerlendirme için formalin-sabitlenmiştir (Şekil 4), diğer bölümleri ise RNA izolasyonu için flaş dondurulmuştu. Sert dokuların yumuşak dokulardan parçalanma yöntemiyle ayrılması (sırasıyla pulverizasyona karşı homojenizasyon), her doku tipinden yüksek bütünlük ve saflıkta RNA çıkarılır ve tablo 1'de (Yüksek kaliteli sütunlar) temsili sonuçlar gösterilmiştir. Özellikle, bazı denekler birden fazla dokuda daha düşük kaliteli RNA verdi(Tablo 1, Düşük kaliteli sütunlar), optimize edilmiş bir yönteme rağmen, dış faktörlerin (örneğin, hastalık şiddeti) doku tiplerinde RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Yanal kesit gösteren insan diz ekleminin şeması. Etiketli yedi dokunun her biri TKA sırasında toplanır ve bu protokolde açıklandığı gibi araştırma amaçlı kullanılır. VMO = vastus medialis eğik kas. OpenStax College'dan yaratıcı commons lisansı altında erişilen ve değiştirilen resim26. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: TKA uygulanan hastalardan elde edilen yedi dokunun her biri için temsili brüt görüntüler. (A) Toplanacak eklem kıkırdağına işaret eden ok ile ön femoral kemik kesimi. Kıkırdak, kemiğin yüzeyinde bulunan beyazımsı bir tabaka ile tanımlanır. (B) Ön femoral kemik toplanacak subkondral kemiğe işaret eden ok ile kesilir. (C) Menisküs. TKA sırasında elektrokoterizasyonun neden olduğu yanmış bölümleri toplamaktan kaçının. (D) Infrapateller yağ pedi (sarı renkli). (E) Ön çapraz bağ (beyaz, lifli, süngerimsi doku). (F) Sinovyum. Bir taraf açık renkli ve lifli görünecek, genellikle yağ dokusu içeren, karşı taraf pembemsi ve daha az lifli görünecektir. Zarın pembe tarafı sinovyal astarı içerir. (G) Vastus medialis eğik kas (kırmızı). Bu genellikle en küçük doku kısmı olabilir ve bazı yağ dokusu içerebilir. Ölçek çubuğu = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Histoloji ve RNA için birincil insan OA dokularını toplamak için atılan adımlara genel bakış. Bu protokolde hasta seçimi, histoloji ve RNA için numune işleme, sert dokular ve yumuşak dokular için doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve yedi primer insan diz OA dokusu için kalite kontrolü açıklanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: TKA uygulanan hastalardan elde edilen yedi dokunun her biri için histolojik bölümler. Hematoksilin ve eozin lekeli bölümler, A - F panellerinde 6x büyütmede gösterilir ve A'-F' ve A panellerinde40x'e kadar büyütülür. (A, A') Eklem kıkırdağı; (A, A") subkondral kemik; (B, B') menisküs; (C, C') infrapateller yağ pedi; (D, D') ön çapraz bağ; (E, E') sinovyum; (F, F') vastus medialis eğik kas. Ölçek çubukları = A-F için 400 μm ve A'-F' ve A için 50 μm". Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Doku N RİN [RNA] (ng/μL) 25 μL'de A260:A280 A260:A230
Yüksek kalite Düşük kalite Yüksek kalite Düşük kalite Yüksek kalite Düşük kalite Yüksek kalite Düşük kalite Yüksek kalite Düşük kalite
"Sert dokular"
Eklem Kıkırdağı 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1,47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Subkondral Kemik 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1,12 ± 0,62
Menisküs 10 4 7,5 ± 0,6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1,41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Yumuşak dokular"
Infrapateller Yağ Pedi 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2,02 ± 0,03 2,09 ± 0,17 1,47 ± 0,71
Ön Çapraz Bağ 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1,91 ± 0,18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Sinovyum 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2,00 ± 0,03 2,05 ± 0,11 1,91 ± 0,20
Vastus Medialis Eğik 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tablo 1. TKA hastalarından toplanan OA dokularından izole RNA'nın kalitesi ve miktarı. RIN = RNA Bütünlük Numarası. RIN için ortalama ± standart sapma, A 260 : A280ve A260 :A230 oranları ve RNA konsantrasyon değerleri için ortalama (aralık) olarak sunulan veriler. Yüksek kaliteli örnekler, tüm doku tiplerinin RIN > 6 (n = 8-10) ile RNA aldığı hastalardan oluşur. Düşük kaliteli örnekler, birden fazla doku tipinin 6 RIN < ile RNA aldığı hastalardan oluşur (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sunulan protokol RNA ekstraksiyonu (Tablo 1) ve histolojik işleme için yedi birincil insan OA dokusunun toplanmasında başarılı olmuştur (Şekil 4). Hasta örneklerini toplamadan önce, ideal olarak bir cerrah veya cerrahi ekiple işbirliği içinde IRB onaylı bir protokol oluşturmak gerekir. Numune toplama için standartlaştırılmış bir protokol uygulamak (örneğin, tutarlı yerinde konumlardan rezeksiyon) deneysel tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Doku örnekleri steril kaplarda laboratuvara taşınmalı ve bozulmayı önlemek için ameliyattan sonraki 4 saat içinde işlenmelidir. Doku diseksiyonu ve işlenmesi sırasında, tüm dokular steril PBS'de nemlendirilir ve RNA ekstraksiyonu için flaş dondurulması veya histoloji için formalin sabitlenmeden önce biyofluidler ve diğer istenmeyen döküntüler gibi potansiyel yüzey kirleticilerini gidermek için taze, steril PBS'de durulanır. Histolojik analizin yararlı bir uygulaması doku tiplerinin ve hastalık şiddetinin doğrulanmasıdır, çünkü bunlar hematoksilin ve eozin gibi standart lekeler tarafından gözlemlenebilen diğer faktörlerin yanı sıra hücre sayısı, dağılım ve morfoloji ile ayırt edilebilir (Şekil 4).

Birincil insan OA dokuları, saflık ve bütünlük ile tanımlandığı gibi, yeterli miktarda ve kalitede RNA çıkarmak için zorluklar ortaya çıkarabilir27. RNA miktarı, dokunun genel hücreselliğinin bir fonksiyonudur ve diz ekleminde kıkırdak, kemik ve menisküs gibi düşük hücreli, yüksek matrisli dokular ve yağ yastığı, ACL, sinovyum ve VMO gibi nispeten yüksek hücreli, düşük matrisli dokular vardır. Örneğin, hem eklem hyaline kıkırdak hem de meniskal fibrokartilaj28, çeşitli miktarlarda kollajen, proteoglikan ve diğer glikoproteinleri içeren hücre dışı matris ile düşük hücresellik ile karakterize edilir28,29. Daha az hücreye sahip olmak, doku hacmi başına daha az RNA (miktarı azaltma) ve daha fazla proteine sahip olmak RNA ile birlikte saflaştırma (saflığı azaltma)25,30ile sonuçlanır. RNA saflığı, A260 : A280ve A260 :A 230 değerlerinin 1,5 < organik kirleticilerin varlığını yansıttığı ve ~2,0 değerlerinin saf RNA31'iyansıttığı spektrofotometri ile belirlenebilir. RNA bütünlüğü, deneysel koşullardan (yani kesme kuvvetlerinden) veya enzimatik sindirimden (örneğin nükleazlar) kaynaklanıp kaynaklanmadığını ve genellikle elektroforetik analizle belirlendiği bozulma düzeyini yansıtır. 1 RNA Bütünlük Numarası (RIN) bozulmuş RNA'yı, 10 RIN ise bozulmamış RNA31,32'yiyansıtır. RNA dizilimi için, en az 7 RIN genellikle33 , 34,35önerilir. Tablo 1'de sunulan veriler, bu A260:A280, A260:A230 ve RIN eşiklerinin, bazı A260: A230hariç, Düşük kaliteli RNA grubundaki hasta örneklerine kıyasla Yüksek kaliteli RNA grubundaki hasta örneklerinden tüm dokularda karşılandığını ortaya koymaktadır. düşük hücreli, yüksek matrisli dokularda RNA'nın protein kontaminasyonini yansıtabilecek değerler. Belirli bir hasta örneğinden izole edilen RNA kalitesine katkıda bulunabilecek birçok faktör olsa da, bunların arasında hastalık şiddeti düzeyi olabilir. OA dokularının hastalıklı doğası, dokuları sindirebilen enzim seviyelerinin artmasıyla bozunma süreçlerinin meydana geldiğini, aynı zamanda RNA'nın da kaliteyi düşürdüğünü göstermektedir.

RNA ekstraksiyonu için bu protokol, birincil insan OA dokularından RNA miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. En kritik adım, dokuların toz haline getirilerek mi yoksa homojenleştirilerek mi parçalandığı ile ilgiliydi ve bunun doku hücreselliği ve matris bileşimi ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Başlangıçta, yedi doku da dokuların önce sıvı azot kullanılarak harç ve pestle ile toz haline getirildiği, daha sonra asit-guanidinium-fenol çözeltisine aktarıldığı ve elde tutulan bir doku homojenizatör kullanılarak daha da homojenize edildiği aynı protokole tabi tutuldu. Bu yöntem yağ pedi, ACL, sinovyum ve VMO (toplu olarak yumuşak dokular; ayrıca nispeten yüksek hücreli, düşük matris) için olumlu RNA verimi, saflığı ve bütünlüğü üretti, ancak kıkırdak, kemik ve menisküs (toplu sert dokular; ayrıca düşük hücreli, yüksek matris) için elverişsiz sonuçlar verdi. Bu gözlemlere dayanarak, yedi doku daha fazla protokol iyileştirmesi için iki gruba ayrıldı. Ek homojenizasyonun, ince bir toz haline getirildikten sonra sert dokuların daha fazla parçalanması üzerinde minimum etkiye sahip olduğu gözlenmiştir. Tersine, yumuşak dokuların ayrışması sadece homojenizasyon ile başarıyla sağlandı ve pulverizasyon gerektirmedi. Bu nedenle sert dokuların homojenizasyonu ve yumuşak dokuların pulverizasyonu ortadan kaldırıldı. Bu, kesme kuvvetlerini, işlem süresini ve sıcaklık dalgalanmasını en aza indirmek için faydalıydı, bunların hepsi RNA bütünlüğünü artırabilir. Yedi doku için de iki tur fenol/ kloroform faz ayrımı yapıldı, çünkü bunun verimi düşürmeden RNA saflığını artırdığı bildirildi31.

Bu protokolün potansiyel bir sınırlaması, deneysel tasarım tüm dokular arasında karşılaştırma gerektiriyorsa dokuların iki gruba ayrılmasından kaynaklanabilecek parti etkisidir. Pulverizasyon ve homojenizasyon yöntemlerinin kullanımı, değişkenlik getirebilecek teknik (örneğin, işlem süresi) ve çevresel (örneğin, sıcaklık dalgalanmaları) koşulları değiştirebilir36. İkinci bir sınırlama, denek içindeki ve genelindeki dokuların tanımlanması, parçalandırılması ve yönlendirilmesinde (histolojik bölümleme için) potansiyel tutarsızlıktır. Üçüncü bir sınırlama, mevcut raporda hasta hastalığı şiddeti ile RNA kalitesi arasındaki potansiyel korelasyonları doğrulayamamamızdır. Dördüncü bir sınırlama, karşılaştırma için sağlıklı kontrol dokularının bulunmamasıdır. Kontrol örnekleri kadavralardan temin edilemeyebilir, ancak bunlar TKA'dan OA dokularına göre daha az hazırdır. Bunu atlatmak için deneysel bir strateji, ister dokular arasında ister tedaviyi kontrolle karşılaştıran veya korunmuş alanlarla lezyon yapan dokular içinde karşılaştırmalar yapmak olsun, her konuyu kendi kontrolü olarak kullanmaktır. Son olarak, RNA ekstraksiyonu için doku eksplantlarının kullanılması, dokuları oluşturan bireysel hücre tiplerinin gen ekspresyon analizine izin vermez (örneğin, sinovyal fibroblastlara karşı sinovyal makrofajlar37).

Belirtilen sınırlamalara rağmen, birincil insan OA dokuları araştırma için değerli bir kaynaktır ve hücre nişini korumak da dahil olmak üzere OA için diğer deneysel sistemlere göre avantajlar sunar23. Bununla birlikte, birincil insan OA dokuları lojistik veya teknik zorluklar nedeniyle araştırmalarda az kullanılabilir. Bu protokol, TKA'dan elde edilen numunelerin kullanımını desteklemek için hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolünü açıklar. Örnek işlemeden sonra, diğerleri arasında gen ekspresyolojisi ve histoloji de dahil olmak üzere çeşitli deneysel yaklaşımlar izlenebilir. Hızla gelişen omik alanıyla en alakalı olanı, RNA dizilimi38,39gibi uygulamalar için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA'yı izole etme yeteneğidir. Moleküler profiller, belirli hastalık fenotipleri olan deneklerden (örneğin, yaş, cinsiyet ve diğer OA risk faktörlerine göre) dokular içinde ve dokular arasında karşılaştırılabilir. Elde edilen içgörüler, OA hasta popülasyonu için daha kolay çevrilebilecek yeni terapötik yolları bilgilendirebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Yazarlar, bu araştırmayı mümkün kılan çalışma katılımcılarına teşekkür ediyor ve bu raporu osteoartrit alanındaki yeni bilim insanlarına ithaf ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Biyoloji Sayı 173
İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter