Summary
يحدد هذا البروتوكول خطوات إحداث احتشاء عضلة القلب في الفئران مع الحفاظ على التامور ومحتوياته.
Abstract
أظهر هذا البروتوكول أن التامور ومحتوياته يلعبان دورا أساسيا مضادا للتليف في نموذج القوارض الإقفارية (ربط الشريان التاجي للحث على إصابة عضلة القلب). تتطلب غالبية نماذج احتشاء عضلة القلب قبل السريرية تعطيل سلامة التامور مع فقدان البيئة الخلوية المتجانسة. ومع ذلك ، فقد تم تطوير منهجية مؤخرا من قبلنا للحث على احتشاء عضلة القلب ، مما يقلل من تلف التامور ويحتفظ بعدد الخلايا المناعية المقيمة في القلب. وقد لوحظ تحسن في الانتعاش الوظيفي للقلب في الفئران ذات مساحة التامور السليمة بعد ربط الشريان التاجي. توفر هذه الطريقة فرصة لدراسة الاستجابات الالتهابية في الفضاء التاموري بعد احتشاء عضلة القلب. يمكن الجمع بين التطوير الإضافي لتقنيات وضع العلامات مع هذا النموذج لفهم مصير ووظيفة الخلايا المناعية التامورية في تنظيم الآليات الالتهابية التي تدفع إعادة تشكيل القلب ، بما في ذلك التليف.
Introduction
حتى يومنا هذا ، يتم التعرف على أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) باعتبارها السبب الرئيسي للوفاة على مستوى العالم ، مما يؤدي إلى عبء مالي كبير وانخفاض في نوعية حياة المريض1. مرض الشريان التاجي (CAD) هو نوع فرعي من الأمراض القلبية الوعائية ويلعب دورا أساسيا في تطور احتشاء عضلة القلب (MI) ، وهو مساهم رئيسي في الوفيات. بحكم التعريف ، ينتج MI عن إصابة لا رجعة فيها لأنسجة عضلة القلب بسبب الظروف المطولة لنقص التروية ونقص الأكسجة. تفتقر أنسجة عضلة القلب إلى القدرة على التجديد ، لذا فإن الإصابات دائمة وتؤدي إلى استبدال عضلة القلب بندبة ليفية يمكن أن تكون وقائية في البداية ولكنها تساهم في النهاية في إعادة تشكيل القلب الضار وفشل القلب في نهاية المطاف2.
على الرغم من أن إدارة المرضى الذين يعانون من CAD قد تحسنت بشكل كبير خلال العقود القليلة الماضية ، إلا أن قصور القلب المزمن (CHF) الثانوي لنقص التروية يؤثر على العديد من المرضى في جميع أنحاء العالم. للوقاية من هذا الوباء وإدارته ، من الضروري فهم الآليات الأساسية على نطاق أوسع وتطوير مناهج علاجية جديدة. علاوة على ذلك ، تسلط النتائج السابقة الضوء على قيود العلاج الجهازي وضرورة تطوير بدائل دقيقة. بالنظر إلى أن التحقيق في العواقب الجزيئية ل MI في البشر يتأثر بالقدرة على الوصول إلى الأنسجة المحتشدة ، فإن النماذج الحيوانية التي تلخص خصائص وتطور MI البشري و CHF المتعلقة بالأمراض القلبية الوعائية لا غنى عنها.
نظرا لأن النماذج الحيوانية المثالية تشبه إلى حد كبير الاضطراب البشري للخصائص الهيكلية والوظيفية ، يجب أن توجه مسببات المرض تصورها. في CAD ، هو تضيق تصلب الشرايين المزمن للشرايين التاجية أو انسداد الخثار الحاد. تم تطوير طرق مختلفة وتطبيقها في أنواع مختلفة من المختبر للحث على تضييق الشريان التاجي أو انسداده. يمكن تصنيف هذه الاستراتيجيات على نطاق واسع إلى مجموعتين: (1) التلاعب الميكانيكي للشريان التاجي للحث على MI و (2) تسريع تصلب الشرايين لتسهيل تضييق الشريان التاجي مما يؤدي إلى MI. تتضمن الاستراتيجية الأولى عادة إما ربط الشريان التاجي أو وضع دعامة داخل الشريان. يميل النهج الثاني إلى الاعتماد على تعديل النظام الغذائي للحيوان ليشمل الأطعمة الغنية بالدهون / الكوليسترول. بعض القيود على هذا النهج الأخير تشمل عدم السيطرة على توقيت وموقع انسداد الشريان التاجي.
في المقابل ، فإن الحث الجراحي ل MI أو نقص التروية في نموذج حيواني له العديد من المزايا ، مثل الموقع والتوقيت الدقيق ومدى الحدث التاجي ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر قابلية للتكرار. الطريقة الأكثر استخداما هي الربط الجراحي للشريان التاجي النازل الأمامي الأيسر (LAD). تلخص هذه النماذج الاستجابات البشرية للإصابة الإقفارية الحادة ، بالإضافة إلى التقدم إلىCHF 3. تم تطوير جراحة LAD على الحيوانات الصغيرة مثل القوارض في البداية في الحيوانات الكبيرة ، وأصبحت أكثر جدوى مع التقدم التكنولوجي4. في إنشاء مثل هذه النماذج ، تم تفضيل الفئران لأسباب مختلفة ، بما في ذلك توافرها النسبي ، وانخفاض النفقات في السكن ، وقدرتها على التلاعب الجيني.
تتطلب النماذج الجراحية المعاصرة لأمراض القلب الإقفارية باستخدام انسداد LAD من الباحث فتح التامور لربط الشريان بشكل مؤقت أو دائم5. تؤدي هذه الاستراتيجيات إلى تعطيل مساحة التامور ، والتي تلعب وظيفة ميكانيكية وتزليق بشكل أساسي لضمان وظيفة القلب المناسبة. عيب آخر لفتح التامور هو فقدان سائل التامور الأصلي للحيوان بمكوناته الخلوية والبروتينية المختلفة 6,7. ردا على ذلك ، تم تطوير طريقة للحث على MI مع الحفاظ على التامور سليمة من قبلنا. بالإضافة إلى تقليل اضطراب هذه البيئة المتجانسة ، يسمح هذا النهج بوضع علامات على خلايا معينة وتتبعها بعد التسبب في MI. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل هذا النهج بشكل أفضل إصابة نقص تروية عضلة القلب في البيئة البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام ذكور وإناث الفئران C57BL / 6J بين 8-14 أسبوعا من العمر لهذه التجارب. حصل هذا البروتوكول على موافقة أخلاقية من لجنة رعاية الحيوان في جامعة كالجاري ويتبع جميع إرشادات رعاية الحيوان.
1. إعداد الماوس والجراحة
- تعقيم الأدوات الجراحية (عن طريق معقم الخرز أو الأوتوكلاف).
- وزن الماوس للوزن قبل الجراحة والجرعة المسكنة.
- ضع الماوس في صندوق تحريضي يحتوي على 4٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين. تأكيد الطائرة المخدرة عن طريق معسر أصابع القدم ومراقبة الحيوان لعدم وجود رد فعل.
- حقن مسكن تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ من البوبرينورفين) (انظر جدول المواد).
- ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة أثناء الجراحة وحافظ على التخدير مع 3٪ إيزوفلوران يتم توصيله عبر مخروط الأنف. ضع مرهم العيون لتجنب جفاف العين على كل عين.
- حلق الشعر من مناطق جراحة الصدر والرقبة.
- كبح الكفوف من الماوس ووضعها على طاولة الجراحة.
- قم بتنبيب الماوس عن طريق إدخال قسطرة ناعمة 23 G في القصبة الهوائية عبر الفم والبلعوم.
- قم بتهوية الفأر بعد التنبيب بنسبة 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين كغاز حامل باستخدام جهاز تهوية تجاري (انظر جدول المواد) مضبوط بمعدل 110 نفسا / دقيقة ، وحجم مد وجزر يبلغ 250 ميكرولتر ، وضغط زفير نهائي إيجابي (PEEP) يبلغ 4 مم زئبق.
- لف الماوس بنسبة 30٪ على جانبه الأيمن لوضع الجانب الأيسر من الصدر لإجراء الجراحة.
- نظف المنطقة الجراحية ب 3 مقشرات متناوبة من 70٪ إيثانول وبيتادين بحركة دائرية (انظرجدول المواد). ضع ستائر جراحية معقمة حول منطقة الجراحة.
- قم بعمل شق جانبي 2-3 سم في جلد الصدر لتصور عضلات الصدر على الجانب الأيسر. قطع الصدرية الكبرى والصغرى باستخدام شق 1 سم من خط الوسط إلى الخارج لتصور العضلات الوربية بين الضلعين الثالث والرابع.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب النزيف الزائد من العضلة الصدرية من خلال الكي من الأوعية النزيفية. - قم بعمل شق 2 سم في العضلة الوربية اليسرى لإدخال الهواء (عن طريق حركة الهواء السلبي) في تجويف الصدر للسماح للقلب والرئتين بالسقوط بعيدا عن الشق الجراحي. علاوة على ذلك ، قم بتوسيع الفتحة بمساعدة جهاز الكي (انظر جدول المواد) لشق الوربي ومنع النزيف
ملاحظة: يجب إيقاف جهاز التنفس الصناعي مؤقتا خلال فترة الكي لتجنب التفاعلات المتفجرة مع الأكسجين. يتم الحرص على عدم إتلاف كيس التامور. - باستخدام المبعدات ، اسحب الأضلاع لفضح القلب.
- مراقبة التامور والقلب الكامن تحت المجهر المجسم.
ملاحظة: تأمور الفأر رقيق بما يكفي لتصور الأوعية الدموية للقلب. - ضع الملقط برفق على سطح التأمور لتقليل حركته وحركة القلب الأساسي.
- معلم بصريا الشريان التاجي الأمامي الأيسر النازل (LAD) من خلال تتبع ظهوره من تحت الزائدة اليسرى.
- باستخدام محرك الإبرة الدقيقة ، قم بتوجيه خياطة مناسبة (انظر جدول المواد) من خلال التامور ، تحت LAD ، مع ظهور الخيط على الجانب الآخر من LAD والتامور. اربط الخيط لتقييد تدفق الدم عبر الشريان التاجي وتقليم الخيط الزائد بمساعدة المقص (الشكل 1 أ).
ملاحظة: عند تقييد تدفق الدم إلى الشريان التاجي ، يجب أن يكون ابيضاض الجزء الأمامي من البطين الأيسر مرئيا. يمثل هذا الإجراء نموذج ربط دائم. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق نهج ربط عابر مع فترات نقص تروية مختلفة في هذه المرحلة. - أسفل موقع الشق داخل المنطقة المعقمة ، أدخل قسطرة 24 G عن طريق الجلد في الصدر (قم بإزالة إبرة التوجيه بعد دخول تجويف الصدر). ثم أغلق الأضلاع متبوعة بطبقات العضلات والجلد باستخدام خياطة مناسبة (إبرة مستدقة للعضلات ، إبرة قطع تقليدية للجلد).
- بمجرد إغلاق الصدر ، قم بإخلاء الهواء المتبقي من تجويف الصدر عبر قسطرة 24 G باستخدام شفط لطيف مع حقنة 3 مل وضغطات على الصدر. بمجرد إزالة الهواء ، اسحب قسطرة 24 G.
- تقليل إيزوفلوران إلى 1 ٪.
- قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران مع الحفاظ على التهوية بالأكسجين للسماح للفأر بالتعافي من التخدير. بمجرد أن يظهر الحيوان علامات التنفس بشكل مستقل ، قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية 23 G من الفم وضع الفأر في قفص الاسترداد ليتم مراقبته لاستئناف التنفس الطبيعي.
- اسمح للماوس بالتعافي في القفص مع وضع جزء من القفص على وسادة تدفئة لتوفير مصدر حرارة خارجي.
- توفير حقن الصيانة من مسكن (البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ، تحت الجلد) كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد الجراحة.
- مراقبة الحالة الصحية للفئران يوميا لمدة 7 أيام ، والتي تشمل تقييم الشقوق وعدم الراحة الحيوانية.
ملاحظة: بسبب غزو هذا الإجراء (بضع الصدر) ، قد يكون من الضروري إعطاء المضادات الحيوية.
2. التقييم الوظيفي لوظيفة القلب عن طريق تخطيط صدى القلب (ECG)
- حث الماوس والحفاظ عليه تحت التخدير العام مع 1.5-2٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين.
- ضع الماوس في وضع ضعيف على منصة مرحلة ساخنة وقم بتوصيل الكفوف بأسلاك تخطيط القلب.
- حلق صدر الماوس.
- الحصول على صور تخطيط صدى القلب باستخدام مسبار محول طاقة خطي 40 ميجاهرتز وهلام الاتصال وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب (انظر جدول المواد).
- قم بإيقاف تشغيل isoflurane واترك الماوس يتعافى على منصة التسخين قبل إعادة القفص إلى حالة نشطة.
ملاحظة: تقييم تخطيط صدى القلب غير جراحي وبالتالي يمكن إجراؤه طوليا طوال التجربة لتحديد التغييرات قبل وبعد ربط الشريان التاجي.
3. جمع أنسجة القلب لتلطيخ التليف
- التضحية الفئران مع استنشاق 100 ٪ CO2 وتشريح القلب بعناية.
ملاحظة: باستخدام المقص والملقط ، يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع الأوعية الكبيرة التي تدخل (الوريد الأجوف ، الوريد الرئوي) والخروج (الشريان الرئوي ، الشريان الأورطي) القلب لتحريره من الدورة الدموية في التجويف الصدري. - إصلاح القلب في 10 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
- قطع العينات باستخدام شفرة حلاقة مستقيمة من خلال البطين الأيمن والحاجز بين البطينين والبطين الأيسر ، مما يضمن مرور الشق عبر مركز منطقة الاحتشاء. ثم يتم إرسال العينات إلى المرفق الأساسي لتضمين البارافين.
- قطع أقسام الأنسجة بسمك 5 ميكرومتر مع ميكروتوم ووضعها على شرائح زجاجية للتلطيخ.
- قم بإزالة البارافين باستخدام الزيلين التجاري وغسول الكحول المتدرج (2x 99٪ ، 1x 95٪ ، 1x 70٪) بالماء منزوع الأيونات ، ثم أعد الترطيب.
- وصمة عار مع 0.1 ٪ سيريوس الأحمر في حمض البكريك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل المقاطع بحمض الخليك 0.5٪ لمدة 3 دقائق واشطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- قم بتجفيف الأقسام باستخدام الترتيب العكسي للغسيل الموضح في 3.4 ، مع زيادة تركيزات الإيثانول المتدرجة ثم الزيلين.
- قم بتركيب أقسام الأنسجة بمحلول تركيب (انظر جدول المواد) للتقييم المجهري.
4. التدفق الخلوي للقلب وغسل تجويف التامور
- التضحية الفئران مع استنشاق 100 ٪ CO2 للتأثير.
- ضع الماوس على ظهره وثبت الذراعين والساقين على لوحة جراحية باستخدام شريط لاصق.
- افتح بعناية الجانب الأيسر (الجانب الأيمن من وجهة نظر المجرب) من التجويف الصدري ، بدءا من قطع الحجاب الحاجز إلى نقطة المنتصف تقريبا ثم قطع الأضلاع الخارجية باتجاه القص.
ملاحظة: تجنب وخز الأوعية الدموية الكبيرة، وخاصة تلك التي تعمل بالتوازي مع القص. - سحب الأضلاع باستخدام مرقئ لفضح القلب الأساسي والتأمور.
ملاحظة: التامور هش للغاية ، لذا تأكد من عدم التقاطه بالمقص أثناء القطع. - باستخدام أنبوب PE-10 (انظر جدول المواد) يتم إدخال قسطرة في الفضاء التاموري بالقرب من تقاطع الأذين الأيسر والبطين الأيسر ، قم بحقن 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في تجويف التامور.
- اسمح لمحلول ملحي بالتجمع والتجمع من الجانب الخلفي للقلب ، مع الحرص على عدم ثقب أو تمزق التامور في هذه العملية. كرر هذه الخطوة مرتين وضع سائل الغسيل على الثلج أثناء معالجة القلب.
- استئصال القلب عن طريق قطع الأوعية الرئيسية (الشريان الأورطي والشريان الرئوي والوريد والوريد الأجوف) التي تدخل القلب وتخرج منه. أزل الأذينين الأيمن والأيسر ووزن أنسجة القلب البطينية.
- فرم الأنسجة في قطعة صغيرة 1 مم2 باستخدام مقص وضعها في 10 مل من مخزن الهضم الذي يحتوي على 450 وحدة / مل من كولاجيناز I ، و 125 وحدة / مل من كولاجيناز الحادي عشر ، و 60 وحدة / مل من DNase I ، و 60 وحدة / مل من الهيالورونيداز في PBS لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري.
- مرر أنسجة القلب المتجانسة من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد) وقم بتدويرها لأسفل عند 60 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا المتنية القلبية.
- اجمع المادة الطافية ، وقم بتمريرها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر (انظر جدول المواد) للحصول على تعليق خلية واحدة ، وقم بتدويرها لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
- إجراء حجب مستقبلات الشظايا القابلة للتبلور (Fc) وتلطيخ العلامات الخلوية على خلايا التامور والقلب كما هو موضح سابقا8.
- قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي.
5. وضع العلامات على البلاعم التامورية باستخدام طريقة النهج الوربي للفضاء الجنبي (ICAPS)9
- تعقيم الأدوات الجراحية (عن طريق معقم الخرز أو الأوتوكلاف) ورش 70٪ من الإيثانول قبل البدء.
- حث الماوس والحفاظ عليه تحت التخدير العام مع 1.5-2٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين. تأكيد الطائرة المخدرة عن طريق معسر أصابع القدم ومراقبة الحيوان لعدم وجود رد فعل.
- حقن مسكن تحت الجلد (البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ).
- ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة أثناء الجراحة.
- حلق المنطقة الصدرية الأمامية الجانبية اليمنى.
- تنظيف المنطقة الجراحية مع الإيثانول والبيتادين.
- قم بعمل شق بطول 3 سم في الجلد ، ومع ملقط فضح القفص الصدري.
- قم بتحميل 5 ميكرولتر من حبات الفلورسنت (الكريات المجهرية الفلورية المتاحة تجاريا ، 1 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) و 45 ميكرولتر من المحلول الملحي في قسطرة حقنة أنابيب PE-10 بطرف مشطوف.
- قم بتوجيه القسطرة إلى الفضاء الوربي كما هو موضح سابقا9 ، وقم بحقن محلول الخرزة ببطء وإزالة القسطرة بحركة واحدة.
- أغلق الجلد باستخدام الدبابيس.
ملاحظة: يتم استخدام الدبابيس بدلا من الغرز لتقليل احتمال إعادة فتح الشق. - قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، ضع الماوس في قفص الاسترداد وراقب المضاعفات خلال أول 24 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحسين نموذج ربط الشريان التاجي المعدل هذا لتحقيق قابلية التكاثر وبقاء الحيوان. ومع ذلك ، نظرا للإصابة الكبيرة التي تحدث في القلب ، ترتبط بعض الوفيات المتوقعة أثناء الجراحة وبعدها بالإجراء. عادة ما يكون معدل الوفيات القياسي أعلى في الذكور (~ 25-35٪) منه في الإناث (~ 10-15٪).
يجب أن يكون الحث الناجح ل MI مع ربط الشريان التاجي المعدل واضحا من خلال التغييرات في المعلمات الوظيفية للقلب والسمات الهيكلية. بالنسبة للوظيفة ، سيكون الانخفاض في المعلمات مثل الكسر القذفي للبطين الأيسر (LV) كما تم تقييمه بواسطة تخطيط صدى القلب ملحوظا في غضون 3-4 أسابيع بعد MI (الشكل 1 أ). يجب أن تكون هذه التغييرات الوظيفية مصحوبة بتليف كبير في الجدار الحر لل LV كما تم تقييمه بواسطة تلطيخ نسيجي مثل أحمر بيكروسيريوس (PR) (الشكل 1 ب). بالنسبة لهذا التحليل ، يجب أن يسمح استخدام المقاطع العرضية الطولية من خلال الاحتشاء بتمثيل المنطقة المحتشدة والمناطق المحيطة بالاحتشاء والمناطق النائية من القلب.
يوفر الحفاظ على التامور سليما طوال الإجراء فرصة لدراسة الاستجابة الالتهابية المتزامنة في تجويف التامور. كما يسمح بتحديد كيف يمكن للخلايا المناعية داخل هذه الحجرة أن تساهم في عمليات إعادة البناء المستمرة. يوفر الجمع بين طريقة وضع العلامات على حبة الفلورسنت وتحليل قياس التدفق الخلوي نهجا واحدا للتتبع باستخدام البلاعم التامورية Gata6 + المقيمة عالية الانتقائية (GPCMs). يتضمن هذا الإجراء حقن الخرز مباشرة في الفضاء الجنبي. يتم تناولها بالتساوي بواسطة بلاعم Gata6 المقيمة في كل من التجاويف الجنبية والتامور (الشكل 2 أ) بسبب الاتصال بين هذين التجويفين10. الأهم من ذلك ، يجب اكتشاف القليل من الملصقات أو عدم وجود علامات في القلب أو الدم (الشكل 2 أ). بمجرد وضع العلامات ، يمكن تتبع نقل الخلايا بعد التحديات الالتهابية مثل MI عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2B) و / أو التصوير. لتجنب أي آثار التهابية محتملة من إجراء ICAPS ، يجب إجراء هذا التصنيف قبل أسبوع واحد من التدخلات اللاحقة.
الشكل 1: يؤدي نموذج ربط التامور التاجي السليم إلى حدوث تغييرات وظيفية وهيكلية في القلب. (أ) الجدول الزمني التخطيطي والقياس الكمي لكسر طرد الجهد المنخفض عند خط الأساس أو 4 أسابيع بعد ربط الشريان التاجي للحيوانات ذات التامور المضطرب أو السليم. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. ***= p < 0.001 ، * = p < 0.05 مقابل خط الأساس ، ANOVA أحادي الاتجاه. مقتبس من Deniset JF وآخرون ، بإذن من Elsevier8. (ب) صور تمثيلية وتحديد كمي لتلطيخ التليف الأحمر بيكروسيروس في المقاطع العرضية لقلب الفأر في 4 أسابيع بعد الاحتشاء مع نماذج ربط التامور التاجية المضطربة أو السليمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: وضع العلامات على بلاعم تجويف التامور وتتبعها بعد MI . (أ) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للخرزة الفلورية التي تحتوي على خلايا نخاعية من التجويف الجنبي وتجويف التامور وأنسجة القلب والدم عند خط الأساس أو بعد 7 أيام من الحقن الموضعي للخرز الفلوري باستخدام طريقة ICAPS. الألواح السفلية- توصيف الخرزة والخلايا في تجويف التامور على أنها في الغالب البلاعم التامورية Gata6 + (GPCMs). (ب) تحليل التدفق الخلوي والقياس الكمي للخلايا النخاعية التامورية المسماة بحبة الفلورسنت في تجويف التامور والقلب مع أو بدون MI. *= p < 0.05, ** = p < 0.01. مقتبس من Deniset JF وآخرون ، بإذن من Elsevier8. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تحريض MI في التامور المغلق في القوارض فريدا ويمكن أن يكون له تطبيقات مهمة محتملة. يعتمد الإجراء بشكل كبير على معرفة الجراح بنموذج القوارض وتشريح قلب القوارض. يعتمد النجاح أيضا على الرعاية المقدمة خلال ثلاث خطوات حاسمة: شق العضلات الوربية وتراجع الضلع (الخطوات 1.11-1.13) ، وإنشاء الاحتشاء (الخطوة 1.17) ، واستعادة الحيوانات (الخطوات 1.22-1.24).
يجب إجراء بضع الصدر بجد لتجنب ثقب أو تمزق التامور. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي خياطة LAD للحث على احتشاء. كما هو الحال مع جميع نماذج ربط LAD ، فإن الموضع المناسب لخياطة الربط على LAD أمر بالغ الأهمية: قد يؤدي الربط القريب إلى MI مميت ، في حين أن الربط البعيد قد لا يسبب MI ذي صلة وظيفية. وضع علامة على LAD في المركز التقريبي للقلب يتجنب هذه المشكلات. نظرا لأنه يتم إجراء ربط LAD مع ضربات القلب ، فإن تثبيت القلب بلطف بالملقط يمكن أن يساعد في تقليل الحركة ، مما يسمح بخياطة LAD دون إتلافه. يمكن أن يحدث تمزق صغير في النخاع أثناء هذا الإجراء. سيتم حل النزيف الطفيف على مدار 2-3 أيام ولن يلوث سائل التامور. تأمور القوارض ، خاصة في الفئران ، رقيقة جدا ويمكن أن تتمزق بسهولة إذا لم يتوخي الجراح الحذر. أخيرا ، يجب على المشغل إيلاء اهتمام وثيق للحيوان في مرحلة ما بعد الإجراء (أي التعافي). يجب أن يتم توقيت إيقاف الأيزوفلوران وإزالة الأنبوب الرغامي بشكل منهجي لضمان قدرة القوارض على التهوية الذاتية. يجب أيضا مراقبة الفأر بعد الشفاء لضمان عدم حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة تتطلب تدخلا فوريا قبل وضعه في مرافق إيواء الحيوانات. تتضمن أمثلة هذه المضاعفات تدمي الصدر واسترواح الصدر وعدم القدرة على استعادة الوعي بعد التخدير.
تتطلب معظم طرازات الماوس الحالية من MI فتح التامور لربط LAD ، مما يؤدي إلى تأمور غير سليم. النموذج الحالي فريد من نوعه لأنه يحافظ على الجانب الاستتبابي لمساحة التامور أثناء الاحتشاء ، وبالتالي يوفر تمثيلا أكثر صلة سريريا ل MI. يؤدي الحفاظ على مساحة التامور إلى تحسين الخصائص الوظيفية لقلب الفأر مقارنة بالإجراءات التي تقسم التامور. يوفر الحفاظ على سائل التامور الأصلي أيضا فوائد كبيرة لإمكانيات البحث بالإضافة إلى شفاء الاحتشاء. الضغط داخل التامور كبير 11,12 ، بينما يحتوي سائل التامور على بروتينات تعزز مسارات الشفاء غير الليفية13. كشفت الأبحاث الحديثة أن البلاعم الموجودة في سائل التامور تلعب أيضا دورا أساسيا في إصلاح أنسجة القلب والشفاء8. يوفر البروتوكول الحالي طريقة محددة لوضع العلامات لتتبع مصير هذه الضامة بعد MI. يمكن تسمية الخلايا الأخرى داخل الحيز التأموري بالمثل لتقييم دورها في إعادة تشكيل القلب. قد تحافظ النماذج الحيوانية التي تحافظ على التامور على هذه المسارات الحاسمة بشكل أفضل ، مما يجعلها تمثيلا أكثر دقة للفيزيولوجيا المرضية للمرضى وعمليات الشفاء.
يسمح هذا النموذج للمستخدم بدراسة ومعالجة مساحة التامور بأكملها ، مما يحفز البحث الذي يستكشف مسارات الشفاء والالتهابات المعقدة بوساطة خلايا التامور. يوفر هذا النموذج أيضا نموذجا محسنا لاحتشاء القوارض للأبحاث التي لا تركز على مساحة التامور. تسمح مسارات إصابة التامور المحفوظة للاحتشاء بأن يكون له صلة بشرية أكبر. تكمن القيود الكبيرة لهذا النموذج في مهارة المستخدم بسبب طبيعته التقنية. إذا لم يكن الجراح بارعا في التعامل مع الأنسجة والتقنيات الجراحية ، فقد تؤدي الأخطاء إلى تمزق التامور أو الوفاة. أخيرا ، للاستفادة من مزايا هذا البروتوكول ، يجب أن يكون المستخدمون قادرين على استخدام طرق التصوير الراسخة والمتقدمة ، مثل تخطيط صدى القلب والفحص المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
- Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
- Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
- Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
- Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
- Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
- Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
- Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).
