Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen unter Beibehaltung des Perikards und seines Inhalts.
Abstract
Dieses Protokoll hat gezeigt, dass das Perikard und sein Inhalt eine wesentliche antifibrotische Rolle im ischämischen Nagetiermodell spielen (koronare Ligatur zur Induktion von Myokardverletzungen). Die Mehrzahl der präklinischen Myokardinfarktmodelle erfordert die Störung der Perikardintegrität mit Verlust des homöostatischen zellulären Milieus. In jüngster Zeit wurde jedoch von uns eine Methode entwickelt, um einen Myokardinfarkt zu induzieren, der den Perikardschaden minimiert und die im Herzen ansässige Immunzellpopulation erhält. Bei Mäusen mit intaktem Perikardraum nach koronarer Ligatur wurde eine verbesserte kardiale Funktionserholung beobachtet. Diese Methode bietet die Möglichkeit, Entzündungsreaktionen im Perikardraum nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Weiterentwicklung der Markierungstechniken kann mit diesem Modell kombiniert werden, um das Schicksal und die Funktion von perikardialen Immunzellen bei der Regulierung der Entzündungsmechanismen zu verstehen, die den Umbau im Herzen, einschließlich der Fibrose, vorantreiben.
Introduction
Bis heute gelten Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit als die häufigste Todesursache, was zu einer erheblichen finanziellen Belastung und einer Verringerungder Lebensqualität der Patienten führt1. Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist ein Subtyp der Herz-Kreislauf-Erkrankung und spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Myokardinfarkts (MI), der einen Hauptfaktor für die Mortalität darstellt. Definitionsgemäß resultiert MI aus einer irreversiblen Verletzung des Myokardgewebes aufgrund längerer Ischämie und Hypoxie. Dem Myokardgewebe fehlt die Regenerationsfähigkeit, so dass Verletzungen dauerhaft sind und zum Ersatz des Herzmuskels durch eine fibrotische Narbe führen, die zunächst schützend sein kann, aber letztendlich zu einem ungünstigen Herzumbau und schließlich zu einer Herzinsuffizienz beiträgt2.
Obwohl sich die Behandlung von Patienten mit KHK in den letzten Jahrzehnten dramatisch verbessert hat, sind viele Patienten weltweit von chronischer Herzinsuffizienz (CHF) infolge von Ischämie betroffen. Um dieser Epidemie vorzubeugen und sie zu bewältigen, ist es notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Darüber hinaus zeigen die bisherigen Befunde die Grenzen der systemischen Therapie und die Notwendigkeit, präzise Alternativen zu entwickeln. Angesichts der Tatsache, dass die Untersuchung der molekularen Folgen von MI beim Menschen von der Fähigkeit beeinflusst wird, Zugang zu infarktiertem Gewebe zu erhalten, sind Tiermodelle, die die Eigenschaften und die Entwicklung von humanem MI und CHF im Zusammenhang mit CVD rekapitulieren, unerlässlich.
Da ideale Tiermodelle in Bezug auf strukturelle und funktionelle Merkmale einer menschlichen Störung sehr ähnlich sind, sollte die Ätiologie der Krankheit ihre Konzeption leiten. Bei der KHK handelt es sich um die chronische atherosklerotische Stenose der Koronararterien oder einen akuten thrombotischen Verschluss. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und bei verschiedenen Arten von Labortieren angewendet, um eine Verengung oder Okklusion der Koronararterien zu induzieren. Solche Strategien können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: (1) mechanische Manipulation einer Koronararterie, um einen MI zu induzieren, und (2) Beschleunigung der Atherosklerose, um die Koronarverengung zu erleichtern, die zu einem MI führt. Die erste Strategie beinhaltet in der Regel entweder die Ligatur einer Koronararterie oder die Platzierung eines Stents innerhalb der Arterie. Der zweite Ansatz neigt dazu, die Ernährung des Tieres zu ändern, um fettreiche / cholesterinreiche Nahrung aufzunehmen. Zu den Einschränkungen dieses letzteren Ansatzes gehört die mangelnde Kontrolle über den Zeitpunkt und den Ort der Koronarverschlüsse.
Im Gegensatz dazu hat die chirurgische Induktion von MI oder Ischämie in einem Tiermodell mehrere Vorteile, wie z. B. Ort, präzises Timing und Ausmaß des koronaren Ereignisses, was zu reproduzierbaren Ergebnissen führt. Die am weitesten verbreitete Methode ist die chirurgische Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD). Solche Modelle rekapitulieren die menschlichen Reaktionen auf akute ischämische Verletzungen sowie die Progression aufCHF 3. Ursprünglich bei größeren Tieren entwickelt, ist die LAD-Chirurgie an Kleintieren wie Nagetieren mit Fortschritten in der Technologie praktikabler geworden4. Bei der Etablierung solcher Modelle wurden Mäuse aus verschiedenen Gründen bevorzugt, darunter ihre relative Verfügbarkeit, geringe Kosten für die Unterbringung und ihre Fähigkeit zur genetischen Manipulation.
Zeitgenössische chirurgische Modelle der ischämischen Herzkrankheit mit LAD-Verschluss erfordern, dass der Forscher das Perikard öffnet, um die Arterie5 vorübergehend oder dauerhaft zu ligieren. Solche Strategien führen zu einer Störung des Perikardraums, der im Wesentlichen eine mechanische und schmierende Funktion hat, um eine ordnungsgemäße Herzfunktion zu gewährleisten. Ein weiterer Nachteil der Öffnung des Herzbeutels ist der Verlust der nativen Herzbeutelflüssigkeit des Tieres mit seinen verschiedenen Zell- und Proteinbestandteilen 6,7. Als Reaktion darauf wurde von uns eine Methode entwickelt, um MI zu induzieren und gleichzeitig das Perikard intakt zu halten. Neben der Minimierung der Störung dieser homöostatischen Umgebung ermöglicht dieser Ansatz das Markieren und Verfolgen bestimmter Zellen nach dem Verursachen eines MI. Darüber hinaus stellt dieser Ansatz die myokardiale ischämische Schädigung im menschlichen Umfeld besser dar.
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Protocol
Für diese Experimente wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 14 Wochen verwendet. Dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary ethisch genehmigt und entspricht allen Tierpflegerichtlinien.
1. Vorbereitung und Operation der Maus
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über Perlensterilisator oder Autoklav).
- Wiegen Sie die Maus für das präoperative Gewicht und die analgetische Dosis.
- Legen Sie die Maus in eine Induktionsbox mit 4% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.
- Injizieren Sie das Analgetikum subkutan (0,1 mg/kg Buprenorphin) (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad und halten Sie die Anästhesie mit 3% Isofluran aufrecht, das über den Nasenkonus verabreicht wird. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um trockene Augen für jedes Auge zu vermeiden.
- Rasieren Sie die Haare aus den Brust- und Nackenbereichen.
- Halten Sie die Pfoten der Maus fest und positionieren Sie sie auf dem OP-Tisch.
- Intubieren Sie die Maus, indem Sie einen 23-G-Katheter mit glatter Spitze durch den Mund und den Rachen in die Luftröhre einführen.
- Belüften Sie die Maus nach der Intubation mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff als Trägergas mit einem handelsüblichen Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) mit einer Geschwindigkeit von 110 Atemzügen/min, einem Atemzugvolumen von 250 μl und einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 4 mmHg.
- Rollen Sie die Maus 30% auf der rechten Seite, um die linke Seite der Brust für die Operation zu positionieren.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit 3 abwechselnden Peelings aus 70% Ethanol und Betadin in kreisförmigen Bewegungen (sieheMaterialtabelle). Legen Sie sterile OP-Abdecktücher um den Operationsbereich herum.
- Machen Sie einen 2-3 cm langen seitlichen Schnitt in die Haut der Brust, um die Brustmuskeln auf der linken Seite sichtbar zu machen. Schneiden Sie den Pectoralis major und minor mit einem 1 cm langen Schnitt von der Mittellinie nach außen, um die Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe sichtbar zu machen.
HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass übermäßige Blutungen aus dem Musculus pectoralis durch Kauterisation blutender Gefäße vermieden werden. - Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in den linken Interkostalmuskel, um Luft (durch passive Luftbewegung) in die Brusthöhle einzuführen, damit Herz und Lunge vom chirurgischen Schnitt abfallen können. Erweitern Sie die Öffnung mit Hilfe eines Kauterisationsgeräts (siehe Materialtabelle), um die Interkostale zu schneiden und Blutungen zu verhindern
HINWEIS: Das Beatmungsgerät sollte während der Kauterisation vorübergehend gestoppt werden, um explosive Reaktionen mit Sauerstoff zu vermeiden. Es wird darauf geachtet, den Perikardsack nicht zu beschädigen. - Ziehen Sie die Rippen mit Retraktoren zurück, um das Herz freizulegen.
- Beobachten Sie den Perikard und das darunter liegende Herz unter einem Stereomikroskop.
HINWEIS: Das Perikard der Maus ist dünn genug, um das Gefäßsystem des Herzens sichtbar zu machen. - Legen Sie eine Pinzette vorsichtig auf die Oberfläche des Perikards, um seine Bewegung und die des darunter liegenden Herzens zu reduzieren.
- Visuelle Markierung der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD), indem sie ihren Austritt unter dem linken Anhängsel verfolgt.
- Führen Sie mit dem Mikronadeltreiber eine geeignete Naht (siehe Materialtabelle) durch das Perikard unter dem LAD, wobei die Naht auf der anderen Seite des LAD und des Perikards hervortritt. Binden Sie die Naht zusammen, um den Blutfluss durch die Koronararterie einzuschränken, und schneiden Sie die überschüssige Naht mit Hilfe einer Schere ab (Abbildung 1A).
HINWEIS: Bei Einschränkung des Blutflusses zur Koronararterie sollte eine Blanchierung des vorderen Teils des linken Ventrikels sichtbar sein. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein permanentes Ligaturmodell. In diesem Stadium könnte jedoch auch ein transienter Ligationsansatz mit unterschiedlichen Ischämieperioden angewendet werden. - Führen Sie unterhalb der Inzisionsstelle im sterilen Bereich einen 24-G-Katheter perkutan in den Brustkorb ein (entfernen Sie die Führungsnadel nach dem Eintritt in die Brusthöhle). Schließen Sie dann die Rippen, gefolgt von den Muskelschichten und der Haut mit einer geeigneten Naht (eine konische Nadel für den Muskel, eine herkömmliche Schneidnadel für die Haut).
- Sobald der Brustkorb geschlossen ist, entleeren Sie die verbleibende Luft aus der Brusthöhle über den 24-G-Katheter mit einer sanften Absaugung mit einer 3-ml-Spritze und Thoraxkompressionen. Sobald die Luft entfernt ist, ziehen Sie den 24-G-Katheter zurück.
- Reduzieren Sie das Isofluran auf 1%.
- Schalten Sie das Isofluran aus, während Sie die Beatmung mit Sauerstoff aufrechterhalten, damit sich die Maus von der Anästhesie erholen kann. Sobald das Tier Anzeichen einer selbstständigen Atmung zeigt, entfernen Sie den 23 G Trachealschlauch aus dem Maul und legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig, um die Wiederaufnahme der normalen Atmung zu überwachen.
- Warten Sie, bis sich die Maus im Käfig erholt hat, wobei ein Teil des Käfigs auf ein Wärmekissen gelegt wird, um eine externe Wärmequelle bereitzustellen.
- Erhaltungsinjektionen des Analgetikums (Buprenorphin 0,1 mg/kg, subkutan) alle 12 h für 72 h nach der Operation verabreichen.
- Überwachen Sie den Gesundheitszustand von Mäusen täglich für 7 Tage, einschließlich der Bewertung von Einschnitten und Beschwerden der Tiere.
HINWEIS: Aufgrund der Invasivität dieses Verfahrens (Thorakotomie) kann die Verabreichung von Antibiotika erforderlich sein.
2. Funktionelle Beurteilung der Herzfunktion mittels Echokardiographie (EKG)
- Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Bühnenplattform und befestigen Sie die Pfoten an den EKG-Elektroden.
- Rasieren Sie die Brust der Maus.
- Nehmen Sie Echokardiographie-Bilder mit einer 40-MHz-Linearwandlersonde und Kontaktgel auf und analysieren Sie sie mit der entsprechenden Software (siehe Materialtabelle).
- Schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie die Maus auf der Heizplattform regenerieren, bevor Sie den Käfig wieder in einen aktiven Zustand versetzen.
HINWEIS: Die Echokardiographie-Beurteilung ist nicht-invasiv und kann daher während des gesamten Experiments longitudinal durchgeführt werden, um Veränderungen vor und nach der Koronarligatur zu bestimmen.
3. Entnahme von Herzgewebe zur Fibrose-Färbung
- Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100% CO2 und sezieren Sie das Herz vorsichtig.
HINWEIS: Mit Schere und Pinzette wird dies erreicht, indem die großen Gefäße durchtrennt werden, die in das Herz eintreten (Vena cava, Lungenvene) und es verlassen (Lungenarterie, Aorta), um es aus dem Kreislaufsystem in der Brusthöhle zu lösen. - Fixieren Sie das Herz in 10% Formalin für mindestens 24 Stunden.
- Schneiden Sie Proben mit einer geraden Rasierklinge durch den rechten Ventrikel, das interventrikuläre Septum und den linken Ventrikel, um sicherzustellen, dass der Schnitt durch das Zentrum der Infarktzone ging. Die Proben werden dann zur Einbettung von Paraffin an die Core Facility geschickt.
- Schneiden Sie Gewebeschnitte von 5 μm Dicke mit einem Mikrotom aus und legen Sie sie zum Färben auf Glasobjektträger.
- Entparaffinieren Sie mit handelsüblichem Xylol und abgestuftem Alkohol (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) mit deionisiertem Wasser, dann rehydrieren.
- Mit 0,1% Siriusrot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur färben.
- Abschnitte mit 0,5% Essigsäure für 3 min waschen und mit 70% Ethanol für 1 min spülen.
- Die Abschnitte werden in umgekehrter Reihenfolge der Wäschen wie in 3.4 beschrieben mit steigender und abgestufter Ethanolkonzentration und dann mit Xylol dehydriert.
- Montieren Sie Gewebeschnitte mit einer Befestigungslösung (siehe Materialtabelle) zur mikroskopischen Auswertung.
4. Durchflusszytometrie der Herz- und Perikardhöhlenspülung
- Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100%CO2 zur Wirkung.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Arme und Beine mit Klebeband an einem OP-Brett.
- Öffnen Sie vorsichtig die linke Seite (rechte Seite aus der Sicht des Experimentators) der Brusthöhle, beginnen Sie mit dem Schneiden des Zwerchfells bis etwa zum Mittelpunkt und schneiden Sie anschließend durch die äußeren Rippen in Richtung Brustbein.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, große Blutgefäße einzuklemmen, insbesondere solche, die parallel zum Brustbein verlaufen. - Ziehen Sie die Rippen mit einem Hämostat zurück, um das darunter liegende Herz und Perikard freizulegen.
HINWEIS: Der Herzbeutel ist sehr zerbrechlich, achten Sie also darauf, ihn während des Schneidens nicht mit einer Schere zu fangen. - Injizieren Sie 100 μl sterile Kochsalzlösung mit einem PE-10-Schlauch (siehe Materialtabelle), der in den Perikardraum in der Nähe der Verbindung von linkem Vorhof und linkem Ventrikel eingeführt wird.
- Lassen Sie Kochsalzlösung von der hinteren Seite des Herzens sammeln und sammeln, wobei Sie darauf achten, den Perikard dabei nicht zu durchstechen oder zu zerreißen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und geben Sie Lavageflüssigkeit auf Eis, während Sie das Herz bearbeiten.
- Schneiden Sie das Herz aus, indem Sie die Hauptgefäße (Aorta, Lungenarterie, Vene und Vena cava) schneiden, die in das Herz ein- und austreten. Entfernen Sie den rechten und linken Vorhof und wiegen Sie das ventrikuläre Herzgewebe.
- Zerkleinern Sie das Gewebe in kleinen 1 mm2 Stücken mit einer Schere und geben Sie 10 ml Verdauungspuffer mit 450 E / ml Kollagenase I, 125 E / ml Kollagenase XI, 60 E / ml DNase I und 60 E / ml Hyaluronidase in PBS für 1 h bei 37 ° C auf einen Orbitalschüttler.
- Herzgewebe homogenisiert durch ein 70 μm großes Zellsieb (siehe Materialtabelle) und schleudert bei 60 x g für 5 min bei 4 °C, um Herzparenchymzellen zu entfernen.
- Der Überstand wird gesammelt, durch ein 40-μm-Zellsieb (siehe Materialtabelle) für eine Einzelzellsuspension geleitet und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C nach unten geschleudert, um die Zellen zu pelletieren.
- Fragmentkristallisierbare (Fc) Rezeptorblockierung und Färbung von zellulären Markern auf Perikard- und Herzzellen, wie zuvor beschrieben8.
- Lassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer laufen.
5. Markierung von Perikardmakrophagen mit der Methode des Interkostalansatzes für den Pleuraraum (ICAPS)9
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über einen Perlensterilisator oder Autoklaven) und sprühen Sie 70% Ethanol ein, bevor Sie beginnen.
- Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.
- Analgetikum subkutan injizieren (Buprenorphin 0,1 mg/kg).
- Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad.
- Rasieren Sie den rechten anterolateralen Brustbereich.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit Ethanol und Betadin.
- Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette frei.
- Laden Sie 5 μL fluoreszierende Kügelchen (handelsübliche fluoreszierende Mikrokugeln, 1 μm, siehe Materialtabelle) und 45 μL Kochsalzlösung in einen PE-10-Schlauchspritzenkatheter mit abgeschrägter Spitze.
- Führen Sie den Katheter wie zuvor beschrieben9 in den Interkostalraum, injizieren Sie langsam die Perlenlösung und entfernen Sie den Katheter in einer Bewegung.
- Verschließen Sie die Haut mit Klammern.
HINWEIS: Klammern werden anstelle von Nähten verwendet, um ein mögliches Wiederöffnen des Einschnitts zu minimieren. - Schalten Sie das Isofluran aus, legen Sie die Maus in den Aufwachkäfig und überwachen Sie die ersten 24 Stunden auf Komplikationen.
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Representative Results
Dieses modifizierte Koronarligaturmodell wurde optimiert, um Reproduzierbarkeit und Überleben der Tiere zu erreichen. Aufgrund der erheblichen Verletzung, die im Herzen induziert wird, sind jedoch einige erwartete intraoperative und postoperative Mortalitäten mit dem Eingriff verbunden. Die Standardsterblichkeit ist typischerweise bei Männern höher (~ 25-35%) als bei Frauen (~ 10-15%).
Die erfolgreiche Induktion eines MI mit der modifizierten koronaren Ligatur sollte durch Veränderungen der funktionellen Parameter und strukturellen Merkmale des Herzens sichtbar sein. In Bezug auf die Funktion wird eine Abnahme von Parametern wie der Ejektionsfraktion des linken Ventrikels (LV), die durch Echokardiographie beurteilt wird, innerhalb von 3-4 Wochen nach dem MI bemerkbar sein (Abbildung 1A). Diese funktionellen Veränderungen sollten mit einer signifikanten Fibrose der freien Wand des LV einhergehen, die durch histologische Färbung wie Picrosiriusrot (PR) beurteilt wird (Abbildung 1B). Für diese Analyse sollte die Verwendung von Längsschnitten durch den Infarkt die Darstellung des Infarktbereichs, des Periinfarkts und der entfernten Zonen des Herzens ermöglichen.
Die Aufrechterhaltung eines intakten Perikards während des gesamten Eingriffs bietet die Möglichkeit, die gleichzeitige Entzündungsreaktion in der Perikardhöhle zu untersuchen. Es ermöglicht auch zu bestimmen, wie Immunzellen in diesem Kompartiment zu laufenden Umbauprozessen beitragen können. Die Kombination der Fluoreszenzperlenmarkierungsmethode mit der Durchflusszytometrie-Analyse bietet einen Ansatz zur Verfolgung von hochselektiven residenten Gata6+ Perikardmakrophagen (GPCMs). Bei diesem Verfahren werden Perlen direkt in den Pleuraraum injiziert. Diese werden von residenten Gata6-Makrophagen sowohl in der Pleura- als auch in der Perikardhöhle (Abbildung 2A) aufgrund der Kommunikation zwischen diesen beiden Hohlräumen gleichermaßen aufgenommen10. Wichtig ist, dass wenig bis gar keine Markierung im Herzen oder Blut nachgewiesen werden sollte (Abbildung 2A). Nach der Markierung kann die Verlagerung der Zellen nach entzündlichen Herausforderungen wie MI durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2B) und/oder Bildgebung verfolgt werden. Um mögliche entzündliche Wirkungen des ICAPS-Verfahrens zu vermeiden, sollte diese Markierung eine Woche vor nachfolgenden Eingriffen durchgeführt werden.
Abbildung 1: Das intakte perikardiale Koronarligaturmodell induziert funktionelle und strukturelle Veränderungen im Herzen. (A) Schematische Zeitachse und Quantifizierung der LV-Ejektionsfraktion zu Studienbeginn oder 4 Wochen nach koronarer Ligatur bei Tieren mit gestörtem oder intaktem Perikard. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ***= p < 0,001, *= p < 0,05 vs. Ausgangswert, unidirektionale ANOVA. Adaptiert von Deniset JF, et al., mit Genehmigung von Elsevier8. (B) Repräsentative Bilder und Quantifizierung der Picrosirius-Rotfibrose-Färbung in Mausherzquerschnitten 4 Wochen nach dem Infarkt mit den gestörten oder intakten perikardialen Koronarligaturmodellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Markierung und Nachverfolgung von Perikardhöhlenmakrophagen nach MI . (A) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von fluoreszierenden Kügelchen, die myeloische Zellen aus der Pleurahöhle, der Perikardhöhle, dem Herzgewebe und dem Blut zu Beginn der Studie oder 7 Tage nach lokaler Injektion von fluoreszierenden Kügelchen unter Verwendung der ICAPS-Methode enthalten. Unterseite - Charakterisierung von Kügelchen und Zellen in der Perikardhöhle als überwiegend Gata6+ Perikardmakrophagen (GPCMs). (B) Durchflusszytometrische Analyse und Quantifizierung von fluoreszierenden myeloischen Perikardzellen in Perikardhöhle und Herz mit oder ohne MI. *= p < 0,05, ** = p < 0,01. Adaptiert von Deniset JF, et al., mit Genehmigung von Elsevier8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Induktion eines MI in einem geschlossenen Perikard bei Nagetieren ist einzigartig und kann potenziell bedeutende Anwendungen haben. Das Verfahren hängt stark von der Vertrautheit des Chirurgen mit dem Nagetiermodell und der Herzanatomie der Nagetiere ab. Der Erfolg hängt auch von der Pflege ab, die in drei kritischen Schritten angewendet wird: Interkostalmuskelschnitt und Rippenretraktion (Schritte 1.11-1.13), Entstehung des Infarkts (Schritt 1.17) und Genesung des Tieres (Schritte 1.22-1.24).
Die Thorakotomie muss sorgfältig durchgeführt werden, um eine Punktion oder Zerrissenheit des Perikards zu vermeiden. Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist das Nähen des LAD, um einen Infarkt zu induzieren. Wie bei allen LAD-Ligaturmodellen ist die geeignete Platzierung der Ligaturnaht auf dem LAD von entscheidender Bedeutung: Die proximale Ligatur kann zu einem tödlichen MI führen, während die distale Ligatur möglicherweise keine funktionell relevante MI verursacht. Da die LAD-Ligatur mit schlagendem Herzen durchgeführt wird, kann die sanfte Stabilisierung des Herzens mit einer Pinzette dazu beitragen, die Bewegung zu minimieren, so dass das LAD vernäht werden kann, ohne es zu beschädigen. Während dieses Verfahrens kann es zu kleinen Gefäßrissen am Epikard kommen. Kleinere Blutungen lösen sich innerhalb von 2-3 Tagen auf und kontaminieren die Perikardflüssigkeit nicht. Das Perikard der Nagetiere, insbesondere bei Mäusen, ist sehr dünn und kann leicht gerissen werden, wenn der Chirurg nicht vorsichtig ist. Schließlich muss der Bediener dem Tier in der Phase nach dem Eingriff (d. h. in der Genesungsphase) besondere Aufmerksamkeit schenken. Der Zeitpunkt des Absetzens von Isofluran und der Entfernung des Endotrachealtubus muss methodisch erfolgen, um sicherzustellen, dass sich das Nagetier selbst belüften kann. Die Maus sollte auch nach der Genesung überwacht werden, um sicherzustellen, dass keine postoperativen Komplikationen ein sofortiges Eingreifen erfordern, bevor sie in Tierhaltungseinrichtungen gebracht werden. Beispiele für diese Komplikationen sind Hämatothorax, Pneumothorax und die Unfähigkeit, nach der Anästhesie das Bewusstsein wiederzuerlangen.
Die meisten aktuellen Mausmodelle von MI erfordern das Öffnen des Perikards, um das LAD zu ligieren, was zu einem nicht intakten Perikard führt. Das vorliegende Modell ist einzigartig, da es den homöostatischen Aspekt des Perikardraums während des Infarkts bewahrt und somit eine klinisch relevantere Darstellung eines Herzinfarkts bietet. Die Aufrechterhaltung des Perikardraums führt zu verbesserten funktionellen Eigenschaften des Mausherzens im Vergleich zu Verfahren, die das Perikard teilen. Die Konservierung der nativen Perikardflüssigkeit bietet auch erhebliche Vorteile für die Forschungsmöglichkeiten sowie für die Infarktheilung. Der intraperikardiale Druck ist signifikant 11,12, während die Perikardflüssigkeit Proteine enthält, die nicht-fibrotische Heilungswege fördern13. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Makrophagen, die sich in der Perikardflüssigkeit befinden, auch eine wesentliche Rolle bei der Reparatur und Heilung von Herzgewebe spielen8. Das aktuelle Protokoll bietet eine spezifische Markierungsmethode, um das Schicksal dieser Makrophagen nach MI zu verfolgen. Andere Zellen innerhalb des Perikardraums können auf ähnliche Weise markiert werden, um ihre Rolle beim kardialen Umbau zu beurteilen. Tiermodelle, die das Perikard erhalten, können diese wichtigen Signalwege besser erhalten, was sie zu einer genaueren Darstellung der Pathophysiologie der Patienten und der Heilungsprozesse macht.
Dieses Modell ermöglicht es dem Benutzer, den gesamten Perikardraum zu untersuchen und zu manipulieren und die Forschung zu potenzieren, die die komplexen Heilungs- und Entzündungswege erforscht, die durch Perikardzellen vermittelt werden. Dieses Modell bietet auch ein verbessertes Nagetierinfarktmodell für die Forschung, die sich nicht auf den Perikardraum konzentriert. Die erhaltenen Perikard-Verletzungswege ermöglichen es Infarkten, mehr menschliche Relevanz zu haben. Die wesentlichen Einschränkungen dieses Modells lagen aufgrund seiner technischen Natur in der Benutzerfähigkeit. Wenn der Chirurg die Handhabung von Gewebe und die Operationstechniken nicht beherrscht, können Fehler zu einem gerissenen Perikard oder zum Tod führen. Um die Vorteile dieses Protokolls nutzen zu können, sollten die Benutzer in der Lage sein, etablierte und fortschrittliche Bildgebungsmodalitäten wie Echokardiographie und Mikroskopie zu verwenden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
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