Summary
यह प्रोटोकॉल पेरिकार्डियम और इसकी सामग्री को संरक्षित करते हुए चूहों में मायोकार्डियल रोधगलन को प्रेरित करने के चरणों को रेखांकित करता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल से पता चला है कि पेरिकार्डियम और इसकी सामग्री इस्केमिक कृंतक मॉडल (मायोकार्डियल चोट को प्रेरित करने के लिए कोरोनरी लिगेशन) में एक आवश्यक एंटी-फाइब्रोटिक भूमिका निभाती है। प्री-क्लिनिकल मायोकार्डियल रोधगलन मॉडल के बहुमत को होमियोस्टेटिक सेलुलर परिवेश के नुकसान के साथ पेरिकार्डियल अखंडता के विघटन की आवश्यकता होती है। हालांकि, हाल ही में मायोकार्डियल रोधगलन को प्रेरित करने के लिए हमारे द्वारा एक पद्धति विकसित की गई है, जो पेरिकार्डियल क्षति को कम करती है और हृदय की निवासी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को बरकरार रखती है। कोरोनरी लिगेशन के बाद एक बरकरार पेरिकार्डियल स्पेस के साथ चूहों में एक बेहतर कार्डियक फंक्शनल रिकवरी देखी गई है। यह विधि मायोकार्डियल रोधगलन के बाद पेरिकार्डियल स्पेस में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती है। फाइब्रोसिस सहित हृदय में रीमॉडेलिंग को चलाने वाले भड़काऊ तंत्र को विनियमित करने में पेरिकार्डियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भाग्य और कार्य को समझने के लिए लेबलिंग तकनीकों के आगे के विकास को इस मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
आज तक, कार्डियोवैस्कुलर बीमारी (सीवीडी) को विश्व स्तर पर मृत्यु के प्रमुख कारण के रूप में मान्यता प्राप्त है, जिसके परिणामस्वरूप एक महत्वपूर्ण वित्तीय बोझ और रोगी के जीवन की गुणवत्ता में कमीआई है। कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) सीवीडी का एक उप-प्रकार है और मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) के विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जो मृत्यु दर में एक प्रमुख योगदानकर्ता है। परिभाषा के अनुसार, एमआई इस्किमिया और हाइपोक्सिया की लंबी स्थितियों के कारण मायोकार्डियल ऊतक को अपरिवर्तनीय चोट से उत्पन्न होता है। मायोकार्डियल ऊतक में पुनर्जनन क्षमता की कमी होती है, इसलिए चोटें स्थायी होती हैं और इसके परिणामस्वरूप हृदय की मांसपेशियों को फाइब्रोटिक निशान के साथ बदल दिया जाता है जो शुरू में सुरक्षात्मक हो सकता है लेकिन अंततः प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग और अंततः दिल की विफलता में योगदान देताहै।
हालांकि पिछले कुछ दशकों में सीएडी वाले रोगियों के प्रबंधन में नाटकीय रूप से सुधार हुआ है, इस्किमिया के लिए द्वितीयक क्रोनिक हार्ट फेल्योर (सीएचएफ) दुनिया भर में कई रोगियों को प्रभावित करता है। इस महामारी को रोकने और प्रबंधित करने के लिए, अंतर्निहित तंत्र को अधिक व्यापक रूप से समझना और नए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करना आवश्यक है। इसके अलावा, पिछले निष्कर्ष प्रणालीगत चिकित्सा की सीमाओं और सटीक विकल्पों को विकसित करने की आवश्यकता को उजागर करते हैं। मनुष्यों में एमआई के आणविक अनुक्रम की जांच को देखते हुए, इन्फ्रैक्टेड ऊतक तक पहुंचने की क्षमता से प्रभावित होता है, पशु मॉडल जो सीवीडी से संबंधित मानव एमआई और सीएचएफ की विशेषताओं और विकास को पुन: परिभाषित करते हैं, अपरिहार्य हैं।
चूंकि आदर्श पशु मॉडल संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं के लिए एक मानव विकार से मिलते जुलते हैं, रोग एटियलजि को उनकी अवधारणा का मार्गदर्शन करना चाहिए। सीएडी में, यह कोरोनरी धमनियों या तीव्र थ्रोम्बोटिक रोड़ा का क्रोनिक एथेरोस्क्लेरोटिक स्टेनोसिस है। कोरोनरी धमनी संकीर्णता या रोड़ा को प्रेरित करने के लिए प्रयोगशाला जानवरों की विभिन्न प्रजातियों में विभिन्न तरीकों को विकसित और लागू किया गया है। इस तरह की रणनीतियों को मोटे तौर पर दो समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: (1) एमआई को प्रेरित करने के लिए कोरोनरी धमनी का यांत्रिक हेरफेर और (2) कोरोनरी संकुचन की सुविधा के लिए एथेरोस्क्लेरोसिस में तेजी लाना। पहली रणनीति में आमतौर पर कोरोनरी धमनी का बंधाव या धमनी के भीतर स्टेंट लगाना शामिल होता है। दूसरा दृष्टिकोण उच्च वसा / कोलेस्ट्रॉल भोजन को शामिल करने के लिए पशु के आहार को संशोधित करने पर भरोसा करता है। इस बाद के दृष्टिकोण की कुछ सीमाओं में कोरोनरी रोड़ा के समय और साइट पर नियंत्रण की कमी शामिल है।
इसके विपरीत, एक पशु मॉडल में एमआई या इस्किमिया के सर्जिकल प्रेरण के कई फायदे हैं, जैसे कि स्थान, सटीक समय और कोरोनरी घटना की सीमा, जिससे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम होते हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी (एलएडी) का सर्जिकल बंधाव है। इस तरह के मॉडल तीव्र इस्केमिक चोट के साथ-साथ सीएचएफ3 की प्रगति के लिए मानव प्रतिक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। प्रारंभ में बड़े जानवरों में विकसित, कृन्तकों जैसे छोटे जानवरों पर एलएडी सर्जरीप्रौद्योगिकी में प्रगति के साथ अधिक संभव हो गई है। इस तरह के मॉडल स्थापित करने में, चूहों को विभिन्न कारणों से पसंद किया गया है, जिसमें उनकी सापेक्ष उपलब्धता, आवास में कम खर्च और आनुवंशिक हेरफेर के लिए उनकी क्षमता शामिल है।
एलएडी रोड़ा का उपयोग करके इस्केमिक हृदय रोग के समकालीन सर्जिकल मॉडल में शोधकर्ता को धमनी5 को अस्थायी रूप से या स्थायी रूप से हटाने के लिए पेरिकार्डियम खोलने की आवश्यकता होती है। इस तरह की रणनीतियों के परिणामस्वरूप पेरिकार्डियल स्पेस का विघटन होता है, जो उचित हृदय समारोह सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य रूप से यांत्रिक और स्नेहन कार्य निभाता है। पेरिकार्डियम खोलने का एक और नुकसान अपने विभिन्न सेलुलर और प्रोटीन घटकों 6,7 के साथ जानवर के मूल पेरिकार्डियल द्रव को खो रहा है। जवाब में, पेरिकार्डियम को बरकरार रखते हुए एमआई को प्रेरित करने की एक विधि हमारे द्वारा विकसित की गई थी। इस होमोस्टैटिक वातावरण के गड़बड़ी को कम करने के अलावा, यह दृष्टिकोण एमआई पैदा करने के बाद विशिष्ट कोशिकाओं को टैग करने और ट्रेस करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण मानव सेटिंग में मायोकार्डियल इस्केमिक चोट का बेहतर प्रतिनिधित्व करता है।
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Protocol
इन प्रयोगों के लिए 8-14 सप्ताह की उम्र के बीच नर और मादा C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल को कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति से नैतिक अनुमोदन प्राप्त हुआ है और सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।
1. माउस की तैयारी और सर्जरी
- सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें (मोती बाँझ या आटोक्लेव के माध्यम से)।
- प्रीसर्जिकल वजन और एनाल्जेसिक खुराक के लिए माउस का वजन करें।
- माउस को 4% आइसोफ्लुरेन और 800 एमएल / मिनट ऑक्सीजन के साथ एक प्रेरण बॉक्स में रखें। पैर की उंगलियों को चुटकी मारकर और रिफ्लेक्स की कमी के लिए जानवर को देखकर एनेस्थेटिक प्लेन की पुष्टि करें।
- एनाल्जेसिक को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें (0.1 मिलीग्राम / किग्रा बुप्रेनोर्फिन) ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सर्जरी के दौरान माउस को गर्म सर्जिकल पैड पर रखें और नाक शंकु के माध्यम से वितरित 3% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। प्रत्येक आंख पर सूखी आंखों से बचने के लिए नेत्र मलहम लागू करें।
- छाती और गर्दन के सर्जिकल क्षेत्रों से बालों को शेव करें।
- माउस के पंजे को रोकें और उन्हें सर्जिकल टेबल पर रखें।
- मुंह और ग्रसनी के माध्यम से श्वासनली में एक चिकनी 23 जी कैथेटर डालकर माउस को इंटुबेट करें।
- 110 सांस/मिनट की दर से सेट किए गए वाणिज्यिक वेंटिलेटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके वाहक गैस के रूप में 2% आइसोफ्लुरेन और 100% ऑक्सीजन के साथ इंटुबैशन के बाद माउस को हवादार करें, 250 μL की ज्वारीय मात्रा, और 4 mmHg का सकारात्मक अंत-समाप्ति दबाव (PEEP)।
- सर्जरी के लिए छाती के बाईं ओर की स्थिति के लिए माउस को इसके दाईं ओर 30% रोल करें।
- सर्जिकल क्षेत्र को 70% इथेनॉल और बीटाडीन के 3 वैकल्पिक स्क्रब के साथ एक गोलाकार गति में साफ करें (सामग्री की तालिका देखें)। सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर बाँझ सर्जिकल ड्रेप रखें।
- बाईं ओर की पेक्टोरलिस मांसपेशियों की कल्पना करने के लिए छाती की त्वचा में 2-3 सेमी पार्श्व चीरा लगाएं। तीसरी और चौथी पसलियों के बीच इंटरकोस्टल मांसपेशियों की कल्पना करने के लिए मध्य रेखा से 1 सेमी चीरा का उपयोग करके पेक्टोरलिस प्रमुख और मामूली काट लें।
नोट: रक्तस्राव वाहिकाओं के संयोजन के माध्यम से पेक्टोरलिस मांसपेशियों से अतिरिक्त रक्तस्राव से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। - छाती गुहा में हवा (निष्क्रिय वायु आंदोलन द्वारा) पेश करने के लिए बाएं इंटरकोस्टल मांसपेशी में 2 सेमी चीरा लगाएं ताकि हृदय और फेफड़े सर्जिकल चीरा से दूर गिर सकें। इसके अलावा, इंटरकोस्टल को संक्रमित करने और रक्तस्राव को रोकने के लिए एक कॉट्री डिवाइस ( सामग्री की तालिका देखें) की मदद से उद्घाटन का विस्तार करें
नोट: ऑक्सीजन के साथ विस्फोटक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए वेंटिलेटर को अस्थायी रूप से रोक दिया जाना चाहिए। इस बात का ध्यान रखा जाता है कि पेरिकार्डियल थैली को नुकसान न पहुंचे। - रिट्रैक्टर्स का उपयोग करके, दिल को उजागर करने के लिए पसलियों को वापस लें।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पेरिकार्डियम और अंतर्निहित हृदय का निरीक्षण करें।
नोट: माउस पेरिकार्डियम दिल के वाहिका की कल्पना करने के लिए काफी पतला है। - धीरे से पेरिकार्डियम की सतह पर बल रखें ताकि इसकी गति और अंतर्निहित हृदय को कम किया जा सके।
- बाएं उपांग के नीचे से इसके उद्भव का पता लगाकर बाएं पूर्ववर्ती अवरोही (एलएडी) कोरोनरी धमनी को नेत्रहीन रूप से लैंडमार्क करें।
- माइक्रो-नीडल ड्राइवर का उपयोग करके, एलएडी के नीचे पेरिकार्डियम के माध्यम से एक उपयुक्त सीवन ( सामग्री की तालिका देखें) का मार्गदर्शन करें, जिसमें एलएडी और पेरिकार्डियम के दूसरी तरफ सीवन उभर रहा है। कोरोनरी धमनी के माध्यम से रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करने के लिए सीवन को बांधें और कैंची की मदद से अतिरिक्त सीवन को ट्रिम करें (चित्रा 1 ए)।
नोट: कोरोनरी धमनी में रक्त के प्रवाह को प्रतिबंधित करने पर, बाएं वेंट्रिकल के पूर्ववर्ती हिस्से की ब्लैंचिंग दिखाई देनी चाहिए। यह प्रक्रिया एक स्थायी बंधाव मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, इस स्तर पर विभिन्न इस्किमिया अवधि के साथ एक क्षणिक बंधाव दृष्टिकोण भी लागू किया जा सकता है। - बाँझ क्षेत्र के भीतर चीरा साइट के नीचे, छाती में 24 ग्राम कैथेटर को परक्यूटेनियस रूप से पेश करें (छाती गुहा में प्रवेश करने के बाद गाइड सुई को हटा दें)। फिर, एक उपयुक्त सीवन (मांसपेशियों के लिए एक टेपर सुई, त्वचा के लिए पारंपरिक काटने की सुई) का उपयोग करके मांसपेशियों की परतों और त्वचा के बाद पसलियों को बंद करें।
- एक बार छाती बंद हो जाने के बाद, 3 एमएल सिरिंज और छाती संपीड़न के साथ कोमल सक्शन का उपयोग करके 24 जी कैथेटर के माध्यम से छाती गुहा से शेष हवा निकालें। एक बार हवा हटाने के बाद, 24 जी कैथेटर वापस ले लें।
- आइसोफ्लुरेन को 1% तक कम करें।
- माउस को संज्ञाहरण से ठीक करने की अनुमति देने के लिए ऑक्सीजन के साथ वेंटिलेशन बनाए रखते हुए आइसोफ्लुरेन को बंद करें। एक बार जब जानवर स्वतंत्र रूप से सांस लेने के संकेत दिखाता है, तो मुंह से 23 जी श्वासनली ट्यूब को हटा दें और माउस को सामान्य श्वास को फिर से शुरू करने के लिए निगरानी करने के लिए रिकवरी पिंजरे में रखें।
- बाहरी गर्मी स्रोत प्रदान करने के लिए वार्मिंग पैड पर रखे पिंजरे के एक हिस्से के साथ माउस को पिंजरे में ठीक होने दें।
- सर्जरी के बाद 72 घंटे के लिए हर 12 घंटे में एनाल्जेसिक (ब्यूप्रेनोर्फिन 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) के रखरखाव इंजेक्शन प्रदान करें।
- 7 दिनों के लिए रोजाना चूहों की स्वास्थ्य स्थिति की निगरानी करें, जिसमें चीरे और पशु असुविधा का मूल्यांकन शामिल है।
नोट: इस प्रक्रिया (थोराकोटॉमी) की आक्रामकता के कारण, एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन आवश्यक हो सकता है।
2. इकोकार्डियोग्राफी (ईसीजी) द्वारा कार्डियक फ़ंक्शन का कार्यात्मक मूल्यांकन
- 1.5-2% आइसोफ्लुरेन और 800 एमएल / मिनट ऑक्सीजन के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत माउस को प्रेरित और बनाए रखें।
- एक गर्म मंच मंच पर एक लापरवाह स्थिति में माउस रखें और पंजे को ईसीजी लीड से संलग्न करें।
- माउस की छाती को शेव करें।
- 40 मेगाहर्ट्ज रैखिक ट्रांसड्यूसर जांच और संपर्क जेल का उपयोग करके इकोकार्डियोग्राफी छवियां प्राप्त करें और उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- आइसोफ्लुरेन को बंद करें और पिंजरे को सक्रिय स्थिति में लौटने से पहले माउस को हीटिंग प्लेटफॉर्म पर ठीक होने दें।
नोट: इकोकार्डियोग्राफी मूल्यांकन गैर-इनवेसिव है और इस प्रकार कोरोनरी लिगेशन से पहले और बाद में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए प्रयोग के दौरान अनुदैर्ध्य रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है।
3. फाइब्रोसिस धुंधला होने के लिए हृदय ऊतक संग्रह
- चूहों को 100% सीओ2 के साँस के साथ बलिदान करें और दिल को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें।
नोट: कैंची और बल का उपयोग करके, यह वक्ष गुहा में संचार प्रणाली से इसे छोड़ने के लिए हृदय में प्रवेश करने वाली बड़ी वाहिकाओं (वेना कावा, फुफ्फुसीय नस) और बाहर निकलने (फुफ्फुसीय धमनी, महाधमनी) के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। - कम से कम 24 घंटे के लिए दिल को 10% फॉर्मलिन में ठीक करें।
- दाहिने वेंट्रिकल, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से एक सीधे रेजर ब्लेड का उपयोग करके नमूने काटें, यह सुनिश्चित करते हुए कि चीरा इन्फ्रैक्ट ज़ोन के केंद्र से होकर जाता है। फिर पैराफिन एम्बेडिंग के लिए नमूने कोर सुविधा में भेजे जाते हैं।
- माइक्रोटोम के साथ 5 μm मोटाई के ऊतक वर्गों को काटें और उन्हें धुंधला करने के लिए ग्लास स्लाइड पर रखें।
- वाणिज्यिक जाइलीन और वर्गीकृत अल्कोहल वॉश (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) का उपयोग करके डिपारफिनाइज करें, फिर पुनर्जलीकरण करें।
- कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पिक्रिक एसिड में 0.1% सिरियस लाल रंग के साथ दाग।
- 3 मिनट के लिए 0.5% एसिटिक एसिड के साथ अनुभागों को धोएं और 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ कुल्ला करें।
- 3.4 में उल्लिखित वॉश के रिवर्स ऑर्डर का उपयोग करके खंडों को निर्जलित करें, जिसमें जाइलीन की तुलना में इथेनॉल सांद्रता बढ़ रही है और वर्गीकृत है।
- सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक माउंटिंग समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ऊतक वर्गों को माउंट करें।
4. हृदय और पेरिकार्डियल कैविटी लैवेज का फ्लो साइटोमेट्री
- प्रभाव के लिए 100% सीओ2 के साँस के साथ चूहों का बलिदान करें।
- माउस को अपनी पीठ पर रखें और टेप का उपयोग करके हाथों और पैरों को सर्जिकल बोर्ड पर ठीक करें।
- थोरैसिक गुहा के बाईं ओर (प्रयोगकर्ता दृश्य से दाईं ओर) को सावधानीपूर्वक खोलें, डायाफ्राम को मध्य बिंदु तक काटने से शुरू करें और बाद में बाहरी पसलियों को उरोस्थि की ओर काटें।
नोट: बड़ी रक्त वाहिकाओं को बाहर निकालने से बचें, विशेष रूप से वे जो उरोस्थि के समानांतर चलते हैं। - अंतर्निहित हृदय और पेरिकार्डियम को उजागर करने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करके पसलियों को वापस लें।
नोट: पेरिकार्डियम बहुत नाजुक है, इसलिए सुनिश्चित करें कि काटने के दौरान कैंची से इसे न पकड़ें। - पीई -10 ट्यूबिंग ( सामग्री की तालिका देखें) कैथेटर का उपयोग करके बाएं आलिंद और बाएं वेंट्रिकल के जंक्शन के पास पेरिकार्डियल स्पेस में डाला जाता है, पेरिकार्डियल गुहा में 100 μL बाँझ खारा इंजेक्ट करें।
- लवण को हृदय के पीछे की ओर से पूल और इकट्ठा करने की अनुमति दें, इस प्रक्रिया में पेरिकार्डियम को पंचर या फाड़ न दें। इस चरण को दो बार दोहराएं और हृदय को संसाधित करते समय बर्फ पर लैवेज द्रव रखें।
- हृदय में प्रवेश करने और बाहर निकलने वाली प्रमुख वाहिकाओं (महाधमनी, फुफ्फुसीय धमनी, नस और वेना कावा) को काटकर हृदय का उत्पादन करें। दाएं और बाएं एट्रिया को हटा दें और वेंट्रिकुलर हृदय ऊतक का वजन करें।
- कैंची का उपयोग करके छोटे 1 मिमी2 टुकड़ों में ऊतक को कीमा करें और 10 एमएल पाचन बफर में रखें जिसमें 450 यू / एमएल कोलेजनेज आई, 125 यू / एमएल कोलेजनेज एक्सआई, 60 यू / एमएल डीनेस आई, और पीबीएस में 60 यू / एमएल हाइलूरोनिडेस शामिल हैं।
- हृदय के ऊतकों को 70 μm सेल स्ट्रेनर ( सामग्री की तालिका देखें) के माध्यम से पारित करें और कार्डियक पैरेन्काइमल कोशिकाओं को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 60 x g पर घूमते हैं।
- सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें, एकल सेल निलंबन के लिए 40 μm सेल स्ट्रेनर ( सामग्री की तालिका देखें) से गुजरें, और कोशिकाओं को छर्रेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 400 x g पर नीचे घूमें।
- जैसा कि पहले वर्णित 8. पेरिकार्डियल और कार्डियक कोशिकाओं पर सेलुलर मार्करों के टुकड़े क्रिस्टलेबल (एफसी) रिसेप्टर ब्लॉकिंग और धुंधलापन का प्रदर्शनकरें।
- प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएँ।
5. फुफ्फुस अंतरिक्ष (आईसीएपीएस) विधि के लिए इंटरकोस्टल दृष्टिकोण का उपयोग करके पेरिकार्डियल मैक्रोफेज को लेबल करना
- सर्जिकल उपकरणों (बीड स्टरलाइज़र या ऑटोक्लेव के माध्यम से) को निष्फल करें और शुरू करने से पहले 70% इथेनॉल स्प्रे करें।
- 1.5-2% आइसोफ्लुरेन और 800 एमएल / मिनट ऑक्सीजन के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत माउस को प्रेरित और बनाए रखें। पैर की उंगलियों को चुटकी मारकर और रिफ्लेक्स की कमी के लिए जानवर को देखकर एनेस्थेटिक प्लेन की पुष्टि करें।
- एनाल्जेसिक को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें (ब्यूप्रेनोर्फिन 0.1 मिलीग्राम /
- सर्जरी के दौरान माउस को गर्म सर्जिकल पैड पर रखें।
- दाहिने एंटेरोलेटरल थोरैसिक क्षेत्र को शेव करें।
- इथेनॉल और बीटाडाइन के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
- त्वचा में 3 सेमी लंबा चीरा लगाएं, और बल के साथ पसली के पिंजरे को उजागर करें।
- फ्लोरोसेंट मोतियों के 5 μL लोड करें (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स, 1 μm, सामग्री की तालिका देखें) और 45 μL खारा एक पीई -10 ट्यूबिंग सिरिंज कैथेटर में एक घुमावदार टिप के साथ।
- कैथेटर को इंटरकोस्टल स्पेस में गाइड करें जैसा कि पहले वर्णित9, धीरे-धीरे मोती समाधान इंजेक्ट करें और कैथेटर को एक गति में हटा दें।
- स्टेपल का उपयोग करके त्वचा को बंद करें।
नोट: चीरा के संभावित पुन: उद्घाटन को कम करने के लिए स्टेपल का उपयोग सीवन के स्थान पर किया जाता है। - आइसोफ्लुरेन को बंद करें, माउस को रिकवरी पिंजरे में रखें और पहले 24 घंटे में जटिलताओं के लिए निगरानी करें।
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Representative Results
इस संशोधित कोरोनरी बंधाव मॉडल को प्रजनन क्षमता और पशु अस्तित्व प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, हृदय में प्रेरित महत्वपूर्ण चोट के कारण, कुछ अपेक्षित इंट्रा-ऑपरेटिव और पोस्ट-ऑपरेटिव मृत्यु दर प्रक्रिया से जुड़ी हुई है। मानक मृत्यु दर आमतौर पर महिलाओं (~ 10-15%) की तुलना में पुरुषों (~ 25-35%) में अधिक होती है।
संशोधित कोरोनरी बंधाव के साथ एमआई का सफल प्रेरण हृदय के कार्यात्मक मापदंडों और संरचनात्मक विशेषताओं में परिवर्तन से स्पष्ट होना चाहिए। कार्य के लिए, इकोकार्डियोग्राफी द्वारा मूल्यांकन किए गए बाएं वेंट्रिकल (एलवी) इजेक्शन अंश जैसे मापदंडों में कमी एमआई के बाद 3-4 सप्ताह के भीतर ध्यान देने योग्य होगी (चित्रा 1 ए)। इन कार्यात्मक परिवर्तनों को एलवी की मुक्त दीवार के महत्वपूर्ण फाइब्रोसिस के साथ होना चाहिए जैसा कि हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग जैसे कि पिकोसिरियस रेड (पीआर) (चित्रा 1 बी) द्वारा मूल्यांकन किया गया है। इस विश्लेषण के लिए, इन्फ्रैक्टेड के माध्यम से अनुदैर्ध्य क्रॉस-सेक्शन के उपयोग से दिल के इन्फ्रैक्टेड क्षेत्र, पेरी-इन्फार्क्ट और दूरस्थ क्षेत्रों के प्रतिनिधित्व की अनुमति मिलनी चाहिए।
पूरी प्रक्रिया में एक बरकरार पेरिकार्डियम बनाए रखना पेरिकार्डियल गुहा में समवर्ती भड़काऊ प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। यह यह निर्धारित करने की भी अनुमति देता है कि इस डिब्बे के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाएं चल रही रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं में कैसे योगदान कर सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ फ्लोरोसेंट बीड लेबलिंग विधि का संयोजन उच्च चयनात्मकता निवासी गाटा 6 + पेरिकार्डियल मैक्रोफेज (जीपीसीएम) के साथ ट्रैक करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में फुफ्फुस स्थान में सीधे मोतियों को इंजेक्ट करना शामिल है। इन दो गुहाओं10 के बीच संचार के कारण फुफ्फुस और पेरिकार्डियल गुहाओं (चित्रा 2 ए) दोनों में निवासी गाटा 6 मैक्रोफेज द्वारा इन्हें समान रूप से लिया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, हृदय या रक्त में बहुत कम से कोई लेबलिंग का पता नहीं लगाया जाना चाहिए (चित्रा 2 ए)। एक बार लेबल किए जाने के बाद, एमआई जैसी भड़काऊ चुनौतियों के बाद कोशिकाओं के स्थानांतरण को फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 2 बी) और / या इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जा सकता है। आईसीएपीएस प्रक्रिया से किसी भी संभावित भड़काऊ प्रभाव से बचने के लिए, इस लेबलिंग को बाद के हस्तक्षेपों से एक सप्ताह पहले किया जाना चाहिए।
चित्रा 1: बरकरार पेरिकार्डियल कोरोनरी लिगेशन मॉडल हृदय में कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तनों को प्रेरित करता है। (ए) बाधित या बरकरार पेरिकार्डियम वाले जानवरों के लिए बेसलाइन या 4 सप्ताह के बाद कोरोनरी लिगेशन पर योजनाबद्ध समयरेखा और एलवी इजेक्शन अंश परिमाणीकरण। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। ***= p < 0.001, *= p < 0.05 बनाम बेसलाइन, एक-तरफ़ा ANOVA। एल्सेवियर8 की अनुमति के साथ डेनिसेट जेएफ, एट अल से अनुकूलित। (बी) बाधित या बरकरार पेरिकार्डियल कोरोनरी लिगेशन मॉडल के साथ 4 सप्ताह के बाद माउस हार्ट क्रॉस-सेक्शन में पिकरोसिरियस रेड फाइब्रोसिस धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां और परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) फ्लोरोसेंट बीड के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट जिसमें फुफ्फुस गुहा, पेरिकार्डियल गुहा, हृदय ऊतक और रक्त से माइलॉयड कोशिकाएं होती हैं, बेसलाइन पर या आईसीएपीएस विधि का उपयोग करके फ्लोरोसेंट मोतियों के स्थानीय इंजेक्शन के बाद 7 दिनों के बाद। नीचे पैनल- मुख्य रूप से गाटा 6 + पेरिकार्डियल मैक्रोफेज (जीपीसीएम) के रूप में पेरिकार्डियल गुहा में मोती और कोशिकाओं का लक्षण वर्णन। (बी) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण और एमआई के साथ या उसके बिना पेरिकार्डियल गुहा और हृदय में पेरिकार्डियल माइलॉयड कोशिकाओं के लेबल वाले फ्लोरोसेंट बीड < < मात्रा का परिमाणीकरण। एल्सेवियर8 की अनुमति के साथ डेनिसेट जेएफ, एट अल से अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कृन्तकों में एक बंद पेरिकार्डियम में एमआई को प्रेरित करना अद्वितीय है और संभावित रूप से महत्वपूर्ण अनुप्रयोग हो सकते हैं। प्रक्रिया कृंतक मॉडल और कृंतक हृदय शरीर रचना विज्ञान के साथ सर्जन की परिचितता पर बहुत निर्भर करती है। सफलता तीन महत्वपूर्ण चरणों के दौरान दी गई देखभाल पर भी निर्भर करती है: इंटरकोस्टल मांसपेशी चीरा और रिब रिट्रेक्शन (चरण 1.11-1.13), इन्फ्रैक्ट बनाना (चरण 1.17), और पशु वसूली (चरण 1.22-1.24)।
पेरिकार्डियम को खराब करने या पतला करने से बचने के लिए थोराकोटॉमी को लगन से किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम रोधगलन को प्रेरित करने के लिए एलएडी का उत्थान है। जैसा कि सभी एलएडी लिगेशन मॉडल के मामले में होता है, एलएडी पर लिगेशन सीवन का उचित प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है: समीपस्थ बंधाव के परिणामस्वरूप घातक एमआई हो सकता है, जबकि डिस्टल लिगेशन कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक एमआई का कारण नहीं हो सकता है। चूंकि एलएडी बंधाव दिल की धड़कन के साथ किया जाता है, धीरे से बल के साथ दिल को स्थिर करने से आंदोलन को कम करने में मदद मिल सकती है, जिससे एलएडी को नुकसान पहुंचाए बिना सीवन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के दौरान एपिकार्डियम पर छोटे पोत लेसेशन हो सकते हैं। मामूली रक्तस्राव 2-3 दिनों में हल हो जाएगा और पेरिकार्डियल द्रव को दूषित नहीं करेगा। कृंतक पेरिकार्डियम, विशेष रूप से चूहों में, बहुत पतला होता है और यदि सर्जन सावधानी नहीं बरतता है तो इसे आसानी से फाड़ा जा सकता है। अंत में, ऑपरेटर को पोस्ट-प्रक्रिया (यानी, वसूली) चरण में जानवर पर पूरा ध्यान देना चाहिए। आइसोफ्लुरेन को रोकने और एंडोट्रैकियल ट्यूब को हटाने का समय यह सुनिश्चित करने के लिए व्यवस्थित रूप से किया जाना चाहिए कि कृंतक स्वयं-हवादार हो सके। ठीक होने के बाद माउस की भी निगरानी की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पशु आवास सुविधाओं में डालने से पहले ऑपरेटिव के बाद की जटिलताओं को तत्काल हस्तक्षेप की आवश्यकता न हो। इन जटिलताओं के उदाहरणों में हेमोथोरैक्स, न्यूमोथोरैक्स और संज्ञाहरण के बाद चेतना हासिल करने में असमर्थता शामिल है।
एमआई के अधिकांश वर्तमान माउस मॉडल को एलएडी को हटाने के लिए पेरिकार्डियम खोलने की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-बरकरार पेरिकार्डियम होता है। वर्तमान मॉडल अद्वितीय है क्योंकि यह रोधगलन के दौरान पेरिकार्डियल स्पेस के होमियोस्टैटिक पहलू को संरक्षित करता है, इसलिए एमआई का अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। पेरिकार्डियल स्पेस को बनाए रखने से पेरिकार्डियम को विभाजित करने वाली प्रक्रियाओं की तुलना में माउस हृदय की कार्यात्मक विशेषताओं में सुधार होता है। देशी पेरिकार्डियल द्रव का संरक्षण भी अनुसंधान संभावनाओं के साथ-साथ इन्फ्रैक्ट उपचार के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। इंट्रा-पेरिकार्डियल दबाव महत्वपूर्ण11,12 है, जबकि पेरिकार्डियल द्रव में प्रोटीन होते हैं जो गैर-फाइब्रोटिक उपचारमार्गों को बढ़ावा देते हैं। हाल के शोध से पता चला है कि मैक्रोफेज जो पेरिकार्डियल द्रव में रहते हैं, हृदय ऊतक की मरम्मत और उपचार में भी एक आवश्यक भूमिकानिभाते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एमआई के बाद इन मैक्रोफेज के भाग्य को ट्रैक करने के लिए एक विशिष्ट लेबलिंग विधि प्रदान करता है। कार्डियक रीमॉडेलिंग में उनकी भूमिका का आकलन करने के लिए पेरिकार्डियल स्पेस के भीतर अन्य कोशिकाओं को समान रूप से लेबल किया जा सकता है। पेरिकार्डियम को बनाए रखने वाले पशु मॉडल इन महत्वपूर्ण मार्गों को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकते हैं, जिससे उन्हें रोगियों के पैथोफिज़ियोलॉजी और उपचार प्रक्रियाओं का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व मिलता है।
यह मॉडल उपयोगकर्ता को पूरे पेरिकार्डियल स्पेस का अध्ययन और हेरफेर करने की अनुमति देता है, अनुसंधान को बढ़ाता है जो पेरिकार्डियल कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थ जटिल उपचार और भड़काऊ मार्गों की पड़ताल करता है। यह मॉडल पेरिकार्डियल स्पेस पर केंद्रित अनुसंधान के लिए एक बेहतर कृंतक इन्फ्रैक्ट मॉडल भी प्रदान करता है। संरक्षित पेरिकार्डियल चोट मार्ग इन्फ्रैक्ट्स को अधिक मानव प्रासंगिकता की अनुमति देते हैं। इस मॉडल की महत्वपूर्ण सीमाएं इसकी तकनीकी प्रकृति के कारण उपयोगकर्ता कौशल में निहित हैं। यदि सर्जन ऊतक हैंडलिंग और शल्य चिकित्सा तकनीकों में कुशल नहीं है, तो त्रुटियों के परिणामस्वरूप फटे हुए पेरिकार्डियम या मृत्यु दर हो सकती है। अंत में, इस प्रोटोकॉल के फायदों का लाभ उठाने के लिए, उपयोगकर्ताओं को इकोकार्डियोग्राफी और माइक्रोस्कोपी जैसे स्थापित और उन्नत इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करने में सक्षम होना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
कोई नहीं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
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