Summary
Hier presenteert het protocol de bereiding van naringenine-oplossing voor in vivo intraperitoneale toediening. Naringenine is volledig opgelost in een mengsel van dimethylsulfoxide, Tween 80 en zoutoplossing. De antidiabetische osteoporotische effecten van naringenine werden beoordeeld door bloedglucosetesten, tartraatresistente zure fosfatasekleuring en enzymgebonden immunosorbenttest.
Abstract
De bereiding van een samengestelde (fytochemische) oplossing is een over het hoofd geziene maar kritieke stap voorafgaand aan de toepassing ervan in studies zoals geneesmiddelenscreening. De volledige oplosbaarheid van de verbinding is noodzakelijk voor een veilig gebruik en relatief stabiele resultaten. Hier wordt een protocol voor het bereiden van naringenine-oplossing en de intraperitoneale toediening ervan in een vetrijk dieet en streptozotocine (STZ) -geïnduceerd diabetisch model als voorbeeld gedemonstreerd. Een kleine hoeveelheid naringenine (3,52-6,69 mg) werd gebruikt om de oplosbaarheid ervan te testen in oplosmiddelen, waaronder ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO) en DMSO plus Tween 80 gereconstitueerd in fysiologische zoutoplossing (PS), respectievelijk. Volledige oplosbaarheid van de verbinding wordt bepaald door de kleur van de oplossing te observeren, de aanwezigheid van neerslag na centrifugatie (2000 x g gedurende 30 s), of de oplossing 2 uur bij kamertemperatuur (RT) te laten staan. Na het verkrijgen van een stabiele verbinding/fytochemische oplossing kan de uiteindelijke concentratie/hoeveelheid van de verbinding die nodig is voor in vivo onderzoek worden bereid in een oplosmiddel-only (geen PS) stamoplossing en vervolgens worden verdund/gemengd met PS naar wens. De antidiabetische osteoporotische effecten van naringenine bij muizen (intraperitoneale toediening bij 20 mg/kg lichaamsgewicht, 2 mg/ml) werden beoordeeld door het meten van bloedglucose, botmassa (micro-CT) en botresorptiesnelheid (TRAP-kleuring en ELISA). Onderzoekers die op zoek zijn naar gedetailleerde organische / fytochemische oplossingspreparaten zullen baat hebben bij deze techniek.
Introduction
Met toenemende studies over het gebruik van fytochemische verbindingen voor geneesmiddelenscreening, zijn benaderingen om fytochemische oplossingen voor te bereiden om hun optimale effecten te evalueren de moeite waard om aandacht aan te besteden. Veel aspecten zoals de oplossingsmethodologie, dosering en concentratie moeten worden overwogen bij het bereiden van de verbinding1.
Oplossing op basis van oplosmiddelen wordt veel gebruikt voor de bereiding van organische verbindingen1. De meest gebruikte oplosmiddelen zijn water, olie, dimethylsulfoxide (DMSO), methanol, ethanol, mierenzuur, Tween, glycerine, enz. 2. Hoewel een suspensie met onopgeloste stoffen aanvaardbaar is wanneer de verbinding wordt toegediend via een maagsonde, is een volledig opgeloste opgeloste opgeloste stof van cruciaal belang voor intraveneuze toediening. Aangezien olieoplossing, suspensie en emulsie capillaire embolie kunnen veroorzaken, wordt een waterige oplossing voor samengestelde bereiding voorgesteld, vooral bij het toedienen van intraveneuze, intramusculaire en intraperitoneale injecties3.
Het effectieve dosisbereik varieert tussen verbindingen en zelfs tussen ziekten die met dezelfde verbinding worden behandeld. De bepaling van de effectieve en de veilige dosis en de concentratie zijn afhankelijk van literatuur en voorbereidende experimenten4. Hier wordt de bereiding van de verbinding naringenine als voorbeeld gedemonstreerd.
Naringenine (4,5,7-trihydroxy-flavanon), een polyfenolische verbinding, is bestudeerd bij de behandeling van ziekten voor zijn hepatoprotectieve5, antidiabetica6, ontstekingsremmende7 en antioxiderende activiteiten8. Voor in vivo toepassingen wordt de orale toediening van naringenine vaak gebruikt. Eerdere studies meldden de bereiding van naringenine-oplossing in 0,5% -1% carboxymethylcellulose, 0,5% methylcellulosedosis, 0,01% DMSO en fysiologische zoutoplossing (PS) bij 50-100 mg / kg, toegediend door orale maagsonde 9,10,11,12. Bovendien hebben andere studies gemeld dat naringenine wordt aangevuld met chow met 3% (wt /wt) voor orale inname in een dosis van 3,6 g / kg / d13,14. Studies hebben ook gemeld dat ethanol (0,5% v/v), PS en DMSO worden gebruikt om naringenine op te lossen voor intraperitoneale injectie bij 10-50 mg/kg 15,16,17,18. In een studie van temporale kwab epilepsie kregen muizen een injectie van naringenine gesuspendeerd in 0,25% carboxymethylcellulose opgelost in PS19. Hoewel deze studies het gebruik van verschillende oplosmiddelen melden om naringenine-oplossingen te bereiden, zijn verdere details, zoals de oplossende status en de respons van dieren, niet gemeld.
Dit protocol introduceert een procedure voor het bereiden van naringenine-oplossing voor in vivo toepassing bij diabetisch geïnduceerde osteoporose. De bereiding van de injectieoplossing omvat het bereiden van oplosmiddelen en verbindingen, doseringsschatting, oplossingsproces en filtratie. De dosering werd bepaald op basis van literatuuronderzoek en voorbereidende experimenten door muizen te controleren na het dagelijks toedienen van injecties gedurende 3 dagen en de dosering aan te passen aan het gedrag van de muis. De uiteindelijk gekozen concentratie (20 mg/kg lichaamsgewicht) werd intraperitoneaal toegediend 5 dagen per week gedurende 8 weken in een vetrijk dieet en streptozotocine (STZ)-geïnduceerde diabetische muizen20,21. De effecten van naringenine bij diabetische osteoporose werden geëvalueerd door bloedglucosetesten, micro-CT, tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Over het algemeen werd waargenomen dat naringenine in een concentratiebereik van 40-400 mg / ml niet volledig oploste in ethanol of DMSO of 5% (ethanol of DMSO) plus 95% PS (v / v). Naringenine loste echter volledig op in een mengsel van 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 en 92,96% PS. De gedetailleerde procedure zal onderzoekers helpen om de verbinding voor te bereiden als een injectieoplossing voor in vivo toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beschreven onderzoeken voldeden aan de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council en werden goedgekeurd door de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. Bij het uitvoeren van de experimenten zijn laboratoriumjassen, nitril wegwerphandschoenen en brillen vereist voor veiligheidsdoeleinden.
1. Bereiding van oplosmiddelen en schatting van naringenine die nodig is voor in vivo toepassing
- Bereid de volgende oplosmiddelen: Tween-80 (eindconcentratiebereik: 0,5%-1%), DMSO, glycerine (eindconcentratiebereik: 15%-20%), ethanol (eindconcentratiebereik: 12% voor intramusculaire injectie)22 en 0,9% PS.
- Schat de benodigde hoeveelheid naringenine op basis van de dosis, het aantal muizen en de injectiefrequentie.
- Bestel 10 muizen (C57BL/6, mannelijk, 5 weken oud, SPF) om naringenine 5 dagen per week gedurende 8 weken toe te dienen. Houd muizen in specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden.
OPMERKING: De dosis die nodig is voor intraperitoneale injectie is 20 mg/kg lichaamsgewicht 23. - Weeg 160 mg naringenine op basis van de volgende berekening: 20 mg/kg x 0,02 kg/muis x 10 muizen x 5 dagen/week x 8 weken = 160 mg.
- Bestel 10 muizen (C57BL/6, mannelijk, 5 weken oud, SPF) om naringenine 5 dagen per week gedurende 8 weken toe te dienen. Houd muizen in specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden.
- Bereken de concentratie naringenine die in vivo moet worden geïnjecteerd.
- Bereid het aanbevolen volume voor op basis van het lichaamsgewicht van de muizen. Het aanbevolen volume naringenine dat op elke muis wordt toegepast, is 1% van het lichaamsgewicht (0,3 ml). In dit experiment werd 0,2 ml per muis gebruikt.
- Bereken het totale volume: 0,2 ml per muis x 10 muizen x 5 dagen/week x 8 weken = 80 ml.
- Bereken de concentratie van de Naringenine op voorraad: 160 mg/80 ml oplosmiddelen = 2 mg/ml.
- Bereken het volume voor elke dag: 0,2 ml per muis x 10 muizen = 2 ml.
2. Ontbinding
- Ethanol oplossing
- Om naringenine-oplossing te bereiden bij 2 mg / ml, weeg 3,52 mg naringenine en voeg het toe aan een buis van 2,0 ml.
OPMERKING: Om een concentratie van 2 mg/ml te bereiken, is het totale benodigde volume 1760 μL (berekening: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml). - Draai snel naar beneden (2000 x g gedurende 30 s) om het naringeninepoeder op de bodem van de buis te laten bezinken (figuur 1A).
- Voeg 8,8 μL 100% ethanol toe aan de buis om een oplossing van 0,5% (v/v) te bereiden ten opzichte van het totale vereiste volume2. Naringenine lost niet volledig op (figuur 1B).
- Blijf 79,2 μL 100% ethanol aan de buis toevoegen om een oplossing van 5% (v/v) te bereiden ten opzichte van het totale vereiste volume (berekening: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenine lost niet volledig op (figuur 1B).
- Voeg 1672 μL van 0,9% PS toe aan de buis met 5% ethanol zoals beschreven in stap 2.1.4. Dit zal een emulsie produceren (figuur 1D). Centrifugeer (2000 x g gedurende 30 s) de oplossing om te controleren of naringenine volledig is opgelost in de oplossing. Witte neerslagen van onopgelost naringenine verschijnen in de oplossing (figuur 1E).
- Om naringenine-oplossing te bereiden bij 2 mg / ml, weeg 3,52 mg naringenine en voeg het toe aan een buis van 2,0 ml.
- DMSO-oplossing
- Om naringenine-oplossing bij 2 mg / ml te bereiden, weegt u 3,95 mg naringenine en voegt u deze toe aan een tube van 2,0 ml.
OPMERKING: Om een concentratie van 2 mg/ml te bereiken, is het totale benodigde volume 1975 μL (berekening: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml). - Snel spin naar beneden (2000 x g voor 30 s) om het naringeninepoeder op de bodem van de buis te laten bezinken.
- Voeg 9,8 μL DMSO toe aan de buis om een 0,5% (v/v) oplossing te bereiden (berekening: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenine lost volledig op (figuur 2A).
- Voeg 88,2 μL DMSO toe aan de buis om een 5% (v/v) oplossing te bereiden ten opzichte van het totale benodigde volume (berekening: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenine lost volledig op (figuur 2B).
- Voeg 1877 μL van 0,9% PS (v/v procent van 95%) toe aan de oplossing bereid in stap 2.2.4. Er wordt een emulsie geproduceerd (figuur 1C). Centrifugeer (2000 x g gedurende 30 s) de oplossing om te controleren of naringenine volledig is opgelost in de oplossing. Witte neerslagen van onopgelost naringenine verschijnen in de oplossing (figuur 1D).
- Om naringenine-oplossing bij 2 mg / ml te bereiden, weegt u 3,95 mg naringenine en voegt u deze toe aan een tube van 2,0 ml.
- Tween-80 en DMSO oplossing
- Om de naringenine-oplossing bij 2 mg / ml te bereiden, weegt u 6,69 mg naringenine en voegt u deze toe aan een tube van 5,0 ml.
OPMERKING: Om de eindconcentratie van 2 mg/ml te bereiken, is het totale benodigde oplossingsvolume 3345 μL (berekening: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml). - Snel spin naar beneden (2000 x g voor 30 s) om het naringeninepoeder op de bodem van de buis te laten bezinken.
- Voeg 117,7 μL DMSO toe om een oplossing van 3,5% (v/v) te bereiden ten opzichte van het totale vereiste volume (berekening: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenine lost volledig op (figuur 3A)
- Voeg 117,7 μL Tween 80 toe aan de oplossing bereid in stap 2.3.3 om 3,5% (v/v) Tween 80 en 3,5% (v/v) DMSO te bereiken. Observeer de volledige oplossing van naringenine (figuur 3B)
- Voeg de in stap 2.3.4 bereide oplossing langzaam toe aan een buis van 5,0 ml met 3109,6 μL van 0,9% PS (v/v procent van 93%) en schud goed om een schijnbare naringenine-oplossing te verkrijgen (figuur 3C).
- Laat de in stap 2.3.5 bereide oplossing 2 uur op kamertemperatuur (RT) blijven. De oplossing is nog steeds zichtbaar zonder zichtbare neerslag (figuur 3D).
- Om de naringenine-oplossing bij 2 mg / ml te bereiden, weegt u 6,69 mg naringenine en voegt u deze toe aan een tube van 5,0 ml.
- Bereiding van naringenineoplossing voor in vivo toediening
- Weeg volgens stap 1.2.2 160 mg naringenine (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
- Voeg 2,8 ml DMSO toe om 3,5% (v/v) oplossing te bereiken (berekening: 2,8 ml / 80 ml x 100% = 3,5%)
- Voeg vervolgens 2,8 ml Tween 80 toe aan de oplossing die is bereid in stap 2.4.2 om 3,5% (v / v) Tween 80 en 3,5% (v / v) DMSO te bereiken.
- Aliquot de oplossing bereid in stap 2.4.3 in vier buizen, 1,4 ml per buis [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
- Aliquot 18,6 ml van 0,9% PS tot vijf buizen van 15 ml.
- Bewaar de oplossing bereid in stap 2.4.3 (stamoplossing) en 2.4.5 bij 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
- Neem 140 μL van de stamoplossing (stap 2.4.3) en meng deze met 1860 μL van 0,9% PS om 2 ml naringenineoplossing te bereiden voor 1 dag toediening.
- Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm.
3. Toediening van Naringenin-oplossing
- Hantering en terughoudendheid
- Spuit de kooi en de handen met 70-75% alcohol voordat u het deksel opent. Til de muis op bij de basis van de staart en plaats hem op een stevig oppervlak om zijn staart voorzichtig naar achteren te positioneren.
- Pak het nekvel achter de oren vast met de linkerduim en wijsvinger en plaats de staart tussen de kleine en de ringvinger. Houd de muis in rugligging met het achterste uiteinde iets verhoogd.
- Injectie
- Pak de achterhuid van de muis vast zodat de buikhuid strak is.
- Duw de naald (insulinespuit) in een hoek van 10° tussen de naald en het buikoppervlak, in het kwadrant rechtsonder of linksonder in de buik om te voorkomen dat u de blaas, lever of andere inwendige organen raakt.
- Laat de naald gedurende 3-5 mm subcutaan in een schedelrichting lopen en steek hem vervolgens in een hoek van 45° in de buikholte.
- Wanneer de naald door de buikwand gaat en de weerstand verdwijnt, voert u een aspiratie uit om te bevestigen dat er geen refluxmateriaal wordt teruggetrokken. Duw vervolgens langzaam op de oplossing.
- Trek na de injectie de naald langzaam uit en draai hem iets om lekkage te voorkomen. Het aanbevolen volume is 50-100 μL/10 g.
- Gooi overgebleven Naringenin weg in een biohazard-container.
4. Bloedglucosetest
OPMERKING: Test de bloedglucose 1 dag voorafgaand aan de injectie en 1 en 2 maanden na de injectie.
- Vast de muizen gedurende 15 uur voor de bloedglucosetest. Water kan worden verstrekt.
- Open de teststrips en markeer de datum. Na opening gebruikt u de teststrips binnen 3 maanden. Bewaar de teststrips bij 2-30 °C. Sluit het deksel goed na het verwijderen van de strip om vochtvorming te voorkomen.
- Plaats het dier in de inductiekamer. Zet de vaporizer aan op een inductieniveau van 4% voor isofluraan en 4 L/min voor zuurstof. Nadat het dier volledig is verdoofd, houdt u het verdovingsmiddel met de neuskegel en de verdovingsafgifte op een niveau van 1,5% voor isofluraan en 0,4 l / min voor zuurstof.
- Veeg de staart af met wattenstaafjes/wattenstaafjes gedrenkt in 70%-75% alcohol.
- Begin vanaf het laagste punt van de staart en maak een kleine punctie op de laterale staartader met een 25G-naaldprik en knijp een druppel bloed uit.
- Veeg de druppel bloed af met een tissuepapier.
- Knijp er nog een druppel bloed uit en verzamel het op de rand van een teststrip.
- Lees en noteer het resultaat dat op de glucosemeter wordt weergegeven.
- Om het bloeden te stoppen, knijp u de staart van de muis met een steriel gaasje en veegt u het gebied af met 75% alcohol.
- Aanvullende monsters kunnen worden verkregen door een vergelijkbare techniek die de staart craniaal op beweegt.
5. VAL vlekken
- Dia's voorbereiding
- Voer eenmaal per week nuchtere bloedglucosetests uit op de muizen. Wanneer de bloedglucosespiegels ≥ 11,1 mmol / L (indicatief voor succesvolle type II diabetes muizen model24), euthanaseer de muizen met behulp van CO2, gevolgd door cervicale disclocatie, en verzamel de lumbale 4e-6e (L4-L6) (er wordt geen euthanasie uitgevoerd tijdens het nuchtere bloedglucosetest).
- Bevestig de L4-L6-monsters met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur (zorg ervoor dat het volume paraformaldehyde >20x het volume van het weefsel) is en was vervolgens gedurende 2 uur in een continue stroom van kraanwater.
- Om de monsters te ontkalken, dompelt u ze onder in een 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) -oplossing gedurende 2 weken bij RT in statische toestand totdat de monsters zijn verzacht. Zorg ervoor dat het volume van de ontkalkingsoplossing 20-30 keer het volume van het weefsel/monster is. Vervang de EDTA-oplossing om de dag.
- Droog het monster uit met behulp van een dehydrator.
- Plaats de monsters in weefselverwerkingscassettes. Nummer de cassette met een potlood.
- Stel het dehydratorprogramma als volgt in: 75% alcohol voor 2 uur, 85% alcohol voor 1 uur, 95% alcohol voor 1 uur, 95% alcohol voor 2 uur, watervrije ethanol (I) voor 2 uur, watervrije ethanol (II) voor 2 uur, watervrije ethanol (III) voor 2 uur, xyleen (I) voor 1 uur, xyleen (II) voor 1 uur, xyleen (III) voor 1 uur, paraffine (I) gedurende 2 uur en paraffine (II) gedurende 2 uur, bij RT.
- Sluit de monsters in paraffinewas in.
- Voeg paraffinewas toe aan de cassettelade van het paraffine-insluitstation en verwarm tot 60 °C. Dompel de gedehydrateerde monsters gedurende ten minste 2 uur onder.
- Plaats de tissuecassette in de cassettelade en verwarm deze voor.
- Voeg paraffinewas toe aan het paraffinereservoir en verwarm tot 60 °C.
- Neem na 2 uur zowel weefselcassette als monsters mee naar het werkgebied. Giet de voorverwarmde paraffinewas uit het paraffinereservoir in de weefselcassette. Plaats het monster in de paraffinewas, zorg ervoor dat de paraffinewas het weefsel volledig bedekt en verplaats de cassette vervolgens onmiddellijk naar een icingstation.
- Gebruik een microtoom om de in paraffine ingebedde monsters in secties van 5-6 μm te snijden. Vouw de secties uit in 40 °C warm water gedurende minder dan 10 s. Verzamel de secties op APS (aminosilaan) gecoate glasglaasjes. Droog de dia's op RT gedurende 1 uur en verplaats de glijbanen vervolgens in een oven op 60 °C voor een nacht.
- TRAP-reagensvoorbereiding
- Bereid basisincubatieoplossing: Los 9,2 g watervrij natriumacetaat, 11,4 g L-(+) wijnsteenzuur en 2,8 ml ijszuur op in 1000 ml gedestilleerd water. Stel de pH in op 4,7-5,0 en bewaar maximaal 6 maanden bij RT.
- Bereid naftol-etheroplossing: Los 0,1 g naftol AS-BI-fosfaat op in 5 ml ethyleenglycolmonoethylether. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 5 weken.
- Bereid natriumnitrietoplossing: Los 1 g natriumnitriet op in 25 ml gedestilleerd water. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid pararosanilinekleurstof: voeg 1 g pararosanilinebasis toe aan 20 ml 2N HCl (83 ml HCl in 417 ml water). Gebruik een roerplaat om de basis op te lossen en filter deze voor gebruik.
- TRAP vlekken
- Vul twee Coplin-potten met 50 ml basisincubatieoplossing en plaats gedurende 2 uur in een oven van 37 °C.
- Neem een Coplin-pot en voeg 0,5 ml naptol-etheroplossing toe.
- Plaats de dia's in de Coplin pot en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Bereid ten minste drie dia's voor elke groep voor. - Voeg een paar minuten voordat de incubatietijd voorbij is 1 ml natriumnitrietoplossing en 1 ml pararosanilinekleurstof toe. Meng zachtjes gedurende 30 s en laat het 2 min staan.
- Voeg de in stap 5.2.2 bereide oplossing toe aan de andere voorverwarmde Coplin-pot met de basisvoorraadoplossing. Meng de oplossing goed en plaats de dia's uit de Coplin-pot in stap 5.3.3.
- Incubeer gedurende 15-20 minuten bij RT.
- Spoel de plakjes af in een andere Coplin pot met 200 ml PBS gedurende 5 min.
- Bevlek de plakjes met 100% hematoxyline gedurende 30 s in een Coplin-pot.
- Droog de plakjes uit met 85%, 95% en 100% alcohol (200 ml) gedurende elk 2 minuten en behandel in xyleen (200 ml) gedurende 2 minuten voor 3x. Gebruik Coplin-potten om elke stap uit te voeren.
- Bevestig het gedeelte op het afdekglas met een afdekplaat met hars. Zorg ervoor dat het vangen van luchtbellen wordt voorkomen.
6. Elisa
- Monstervoorbereiding
- Verwijder de zachte weefsels van het dijbeen en het scheenbeen van de muis. Reinig de botten met gaas.
- Plaats de botmonsters in een microcentrifugebuis van 1 ml en bewaar de monsterbuizen bij -80 °C.
OPMERKING: De monsters kunnen ook niet langer dan 6 maanden in een tank met vloeibare stikstof worden bewaard. - Weeg het botmonster. Verdun met 0,9% PS in een verhouding van 1:10. Verdun bijvoorbeeld 0,1 g bot met 1 ml PS.
- Voeg 3 mm zirkonia kralen toe aan de buis en maal de monsters 3x op 70 Hz gedurende 30 s met 20 s rust ertussen.
- Centrifugeer de monsters bij 4 °C en 12.000 x g gedurende 5 minuten. Verzamel het supernatant.
- ELISA test kit
OPMERKING: Voer ELISA uit volgens het testprotocol dat door de fabrikant is opgegeven.- Voeg 100 μL van elke verdunning van standaard, blanco en monster toe aan de juiste putten. Incubeer gedurende 90 min bij 37 °C.
- Decanteer de vloeistof uit elke put en voeg 100 μL biotinylated detectie antilichaam werkoplossing toe. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Decanteer de oplossing, voeg 350 μL wasbuffer toe aan elk putje. Laat 1 min weken, herhaal 3x.
- Voeg 100 μL HRP-geconjugeerde werkoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
- Decanteer de oplossing. Herhaal het wasproces 5x zoals beschreven in stap 6.2.3.
- Voeg 90 μL van het substraatreagens toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C beschermd tegen licht.
- Voeg 50 μL van de stopoplossing toe.
- Gebruik een plaatlezer om de absorptie van elke put bij 450 nm te registreren.
- Standaard curve generatie
- Zet de respectieve gemiddelde absorptiewaarden af tegen de serieel verdunde eiwitconcentraties.
- Voeg de punten samen om de best passende curve te creëren. Gebruik een geschikte computertoepassing (spreadsheet) om de standaardcurvevergelijking te genereren.
- Vervang de absorptiewaarde van elk monster in de standaardcurvevergelijking om de concentratie van het respectieve monster te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het lichaamsgewicht van de vetrijke dieet-gevoede en STZ-geïnduceerde diabetische muizen bleek af te nemen in vergelijking met dat van de controlegroepen van 0-8 weken na STZ-behandeling. Het gewichtsverlies van met naringenine behandelde muizen was significant in vergelijking met de niet-behandelde muizen (STZ-groep) in week 4. De controle- en STZ-groepen werden toegediend met hetzelfde volume PS (tabel 1). De bloedglucosespiegel bij diabetische muizen steeg dramatisch binnen 1 maand na STZ-inductie. Het daalde vervolgens automatisch tot een niveau dat 2 maanden geleden werd waargenomen toen het diermodel werd vastgesteld. Behandeling met naringenine verlaagde de bloedglucosespiegels met respectievelijk 51,8% en 34,8% na 1 en 2 maanden (tabel 2). STZ-geïnduceerde diabetische muizen vertoonden botverlies, zoals aangegeven door de afname van respectievelijk het botvolume / weefselvolume (BV / TV) (30,97%) en het aantal trabeculae (Tb.N) (11,4%). De veranderingen in de waarden van deze twee parameters suggereren dat behandeling met naringenine het botverlies aanzienlijk heeft gered (tabel 3). Osteoclast activiteit zoals aangegeven door N.oc/Tb.Ar (osteoclastisch aantal per trabeculair botgebied) was verhoogd bij vetrijke dieet- en STZ-geïnduceerde diabetische muizen, hoewel er geen statistische significantie werd waargenomen tussen de controle- en de ziektemodellen. Behandeling met naringenine verminderde de osteoclastische activiteiten significant, zoals weergegeven in figuur 4 en tabel 4. Het C-terminale telopeptide van type I collageen (CTIX) en N-terminal propeptide van type I procollageen (PINP) waren verhoogd met respectievelijk 68,09% en 204,88% bij diabetische dieren, wat wijst op een dramatische toename van de botresorptiesnelheid. Naringenine verlaagde significant beide indicatoren van de botresorptiesnelheid (tabel 5).
Figuur 1: Naringenine oplossen in ethanol. (A) Naringeninepoeder in de buis na spin-down. (B) Naringenine + ethanol (400 mg/ml - 3,52 mg naringenine in 8,8 μL ethanol). (C) Naringenine + ethanol (40 mg/ml - 3,52 mg naringenine in 8,8 μL ethanol) (D) Naringenine in 5% (v/v) ethanol en 95% PS (0,9%). (E) Neerslaat in D na spin down. (F) Meting voor het verkrijgen van schaalbalk voor figuur 1, figuur 2 en figuur 3. Nar: Naringenin. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Oplossen van naringenine in DMSO. (A) Naringenine + DMSO (400 mg/ml - 3,95 mg naringenine in 9,8 μL DMSO). (B) Naringenine + DMSO (40 mg / ml- 3,95 mg naringenine in 98 μL DMSO). (C) Naringenine in 5% (v/v) DMSO en 95% PS (0,9%). (D) Neerslaat in C na spin down. Nar: Naringenin. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Oplossen van naringenine in DMSO en Tween 80. (A) Naringenine + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenine in 117,7 μL DMSO). (B) Naringenine + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenine in 117,7 μL DMSO en 117,7 μL Tween 80). (C) Naringenine in het mengsel van 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 en 93% PS (0,9%). (D) Geen neerslag in C na spin down. Nar: Naringenin. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het effect van naringenine op de osteoclastische activiteit van de vetrijke dieet-gevoede en STZ-geïnjecteerde (STZ) muizen. TRAP-kleuring van trabeculair bot en osteoclasten van L4-wervels. Driehoeken duidden op osteoclasten. Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is aangepast van Liu et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| g) | 0 week | 1 week | 2 weken | 4 weken | 5 weken | 6 weken | 8 weken |
| Beheersen | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26,2 ± 1,0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs. Controle | |||||||
| ΔΔ p < 0.01 vs. STZ | |||||||
Tabel 1: Lichaamsgewicht van vetrijke dieet-gevoede en STZ-geïnjecteerde (STZ) muizen over groepen en perioden. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± s.d. ** p < 0,01 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 maand | 1 maand | 2 maanden |
| Beheersen | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. Controle | |||
| ΔΔ p < 0.01 vs. STZ | |||
Tabel 2: Nuchtere bloedglucose van STZ-muizen over groepen en perioden. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Beheersen | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Controle | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabel 3: Botmassa gerelateerde parameters van STZ-muizen in verschillende groepen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± s.d. * p < 0,05 vs. Controle, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Beheersen | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2.06E-05 |
| Naringenin | 0.000156 ± 3.88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |
Tabel 4: Osteoclast activiteit van STZ muizen over groepen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| ng/ml | Ctix | PINP |
| Beheersen | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Controle | ||
| ΔΔ p < 0.01 vs. STZ | ||
Tabel 5: Botresorptiesnelheid van STZ-muizen in verschillende groepen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± s.d. * p < 0,05 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bereiding van fytochemische oplossing is de basis voor de toepassing ervan in vivo. In dit protocol werd de bereiding van naringenine-oplossing aangetoond met behulp van verschillende oplosmiddelen, zoals ethanol, DMSO, Tween 80 en 0,9% PS. De oplossing in volledig opgeloste toestand moet verder worden gecontroleerd door deze enkele uren op kamertemperatuur te laten blijven en vervolgens te filteren voordat deze in vivo wordt gebruikt.
Oplosmiddelbepaling is een cruciale stap in dit protocol. Er zijn veel oplosmiddelopties voor het oplossen van verbindingen, waarvan ethanol, DMSO en PS de meest gebruikte zijn. Ethanol kan veel in water onoplosbare verbindingen oplossen vanwege zijn zeer polaire eigenschappen, waardoor waterstofbinding mogelijk is en dus zowel polaire als niet-polaire stoffen worden opgelost. Bovendien kan de concentratie van ethanol de eigenschappen van de fytochemische verbinding bepalen. Bijvoorbeeld, 75 wt.% ethanol / water oplosmiddel wordt beschouwd als het beste voor het extraheren van de hoogste opbrengst van polyfenolen en heeft de sterkste anti-oxidant eigenschappen26. Een andere studie wees uit dat de ethanolconcentratie kon worden verlaagd tot 32,5% bij 150 °C voor polyfenolextracten om antioxiderende eigenschap tot expressie te brengen27. Een hoge concentratie ethanol kan echter neurotoxiciteit en hepatotoxiciteit veroorzaken28. Ethanolinjectie (i.p.) in een bereik van concentraties van 8% -32% v / v wordt vaak gebruikt voor gedragsevaluatie en kan voorwaardelijke smaakaversie en hypothermie veroorzaken29. DMSO is een dipolair aprotisch oplosmiddel met een hoge polariteit en wordt gebruikt als oplosmiddel om talrijke organische verbindingen op te lossen. Een vergelijkende studie wees uit dat DMSO/methanol (50:50 v/v) resulteerde in de optimale opbrengst van fenolzuren in citrusschillen30. Dosis, concentratie en frequentie zijn echter geen onmiskenbare factoren wanneer DMSO aan dieren wordt toegediend. Een dosis van 17,7 g/kg die intraperitoneaal bij muizen werd gegeven, bereikte LD50, terwijl het verlagen van de dosis tot 2,5 g/kg gedurende 6 weken bij muizen geen waarneembare bijwerkingen veroorzaakte31. Hoewel de voorgestelde DMSO-concentratie 0,5% -5% is, is DMSO niet in staat om veel verbindingen op te lossen. Colucci et al. testten de effecten van DMSO en DMSO-bevattende zoutoplossing in verschillende concentraties door intracerebroventriculaire en orale toediening bij muizen. De studie toonde aan dat een oplossing van 25% DMSO in zoutoplossing de gedragsresponsen van dieren niet veranderde32. Tween 80 is een niet-ionogene oppervlakteactieve stof en wordt veel gebruikt als co-oplosmiddel om de oplosbaarheid van slecht oplosbare geneesmiddelen te verhogen en de farmacokinetische kenmerken te verbeteren33. Een concentratie van 1% Tween 80 werd gekozen gezien veiligheid33. Zo werden de bovenstaande oplosmiddelen en oppervlakteactieve stoffen in verschillende concentraties gebruikt om naringenine volledig op te lossen voor intraperitoneale toediening.
Enkele suggesties worden hier ter overweging vermeld. Ten eerste stellen we voor om te beginnen met een kleine hoeveelheid fytochemische verbinding voor voorlopige experimenten met betrekking tot de consumptiekosten. Ten tweede is het noodzakelijk om uitgebreid literatuuronderzoek uit te voeren, met name nauwkeurige studies met betrekking tot diersoorten, ziekten, toedieningsroutes en frequentie, voordat de oplossing wordt voorbereid. Ten derde zijn de concentratiebereiken van oplosmiddelen en co-oplosmiddelen zoals oppervlakteactieve stoffen afhankelijk van de beschikbare literatuur, voorlopige experimenten en het doel van de onderzoeksopzet. Ten vierde wordt het gebruik van een insulinespuit in plaats van een gewone spuit aanbevolen om het injectieletsel te verminderen door een relatief hoge toedieningsfrequentie. Ten vijfde, om steriele omstandigheden te behouden, wordt aanbevolen om de oplossing te steriliseren met behulp van een filter van 0,2 μm en steriele spuiten en wattenstaafjes gedrenkt in alcohol te gebruiken bij het injecteren van de oplossing in levende dieren.
De voordelen van het protocol zijn de eenvoudige bediening en lage kosten. Samenvattend demonstreert het protocol de bereiding van een fytochemische oplossing voor intraperitoneale toediening bij muizen, met naringenine als voorbeeld. Het protocol zal ten goede komen aan de onderzoekers die zich bezighouden met geneesmiddelenscreening of farmacologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81973607 en 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
- van Thriel, C.
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
