Summary
Her presenterer protokollen fremstilling av naringeninoppløsning for in vivo intraperitoneal administrering. Naringenin er fullstendig oppløst i en blanding av dimetylsulfoksid, Tween 80 og saltvann. De antidiabetiske osteoporotiske effektene av naringenin ble vurdert ved blodglukosetesting, tartratresistent syrefosfatasefarging og enzymbundet immunosorbentanalyse.
Abstract
Fremstillingen av en sammensatt (fytokjemisk) løsning er et oversett, men kritisk skritt før det brukes i studier som narkotikascreening. Den komplette oppløseliggjøringen av forbindelsen er nødvendig for sikker bruk og relativt stabile resultater. Her er en protokoll for fremstilling av naringeninoppløsning og dens intraperitoneale administrering i et fettfattig kosthold og streptozotocin (STZ) -indusert diabetisk modell vist som et eksempel. En liten mengde naringenin (3,52-6,69 mg) ble brukt til å teste dets oppløselighet i løsningsmidler, inkludert etanol, dimetylsulfoksid (DMSO) og DMSO pluss Tween 80 rekonstituert i fysiologisk saltvann (PS). Fullstendig oppløsning av forbindelsen bestemmes ved å observere fargen på løsningen, tilstedeværelsen av utfellinger etter sentrifugering (2000 x g i 30 s), eller la løsningen stå i 2 timer ved romtemperatur (RT). Etter å ha oppnådd en stabil forbindelse/fytokjemisk løsning, kan den endelige konsentrasjonen/mengden av forbindelsen som kreves for in vivo-studier fremstilles i en løsemiddelbasert (ingen PS) stamløsning, og deretter fortynnes/blandes med PS etter ønske. De antidiabetiske osteoporotiske effektene av naringenin hos mus (intraperitoneal administrering ved 20 mg/kg kroppsvekt, 2 mg/ml) ble vurdert ved å måle blodsukker, benmasse (mikro-CT) og benresorpsjonshastighet (TRAP-farging og ELISA). Forskere som leter etter detaljerte organiske / fytokjemiske løsningspreparater, vil dra nytte av denne teknikken.
Introduction
Med økende studier om bruk av fytokjemiske forbindelser for narkotika screening, tilnærminger til å forberede fytokjemiske løsninger for å evaluere deres optimale effekter er verdt å gi oppmerksomhet til. Mange aspekter som oppløsningsmetodikk, dosering og konsentrasjon skal vurderes ved fremstilling av forbindelsen1.
Løsningsmiddelbasert oppløsning er mye brukt til fremstilling av organiske forbindelser1. De vanlige løsningsmidlene inkluderer vann, olje, dimetylsulfoksid (DMSO), metanol, etanol, maursyre, Tween, glyserin, etc2. Selv om en suspensjon med uoppløste stoffer er akseptabel når forbindelsen administreres ved gastrisk gavage, er et fullstendig oppløst løsemiddel kritisk for intravenøs administrering. Siden oljeløsning, suspensjon og emulsjon kan forårsake kapillæremboli, foreslås en vandig løsning for sammensatt fremstilling, spesielt ved administrering av intravenøse, intramuskulære og intraperitoneale injeksjoner3.
Det effektive doseområdet varierer mellom forbindelser og til og med blant sykdommer behandlet med samme forbindelse. Bestemmelse av effektiv og sikker dose og konsentrasjon er avhengig av litteratur og foreløpige eksperimenter4. Her er fremstillingen av forbindelsen naringenin demonstrert som et eksempel.
Naringenin (4,5,7-trihydroksy-flavanon), en polyfenolisk forbindelse, har blitt studert i sykdomsbehandling for sin hepatoprotektive5, antidiabetiske6, antiinflammatoriske7 og antioksidantaktiviteter8. For in vivo applikasjoner brukes ofte oral administrering av naringenin. Tidligere studier rapporterte fremstilling av naringeninoppløsning i 0,5% -1% karboksymetylcellulose, 0,5% metylcellulosedose, 0,01% DMSO og fysiologisk saltvann (PS) ved 50-100 mg / kg, administrert av oral gavage 9,10,11,12. Dessuten har andre studier rapportert å supplere naringenin med chow ved 3% (wt / wt) for oralt inntak i en dose på 3,6 g / kg / d13,14. Studier har også rapportert bruk av etanol (0,5% v / v), PS og DMSO for å oppløse naringenin for intraperitoneal injeksjon ved 10-50 mg / kg15,16,17,18. I en studie av temporal lobe epilepsi fikk mus en injeksjon av naringenin suspendert i 0,25% karboksymetylcellulose oppløst i PS19. Selv om disse studiene rapporterer bruk av forskjellige løsningsmidler for å fremstille naringeninløsninger, har ytterligere detaljer, som oppløsningsstatus og dyrerespons, ikke blitt rapportert.
Denne protokollen introduserer en prosedyre for fremstilling av naringeninløsning for in vivo påføring ved diabetisk indusert osteoporose. Fremstillingen av injeksjonsoppløsningen inkluderer fremstilling av løsningsmidler og forbindelser, doseringsestimering, oppløsningsprosess og filtrering. Dosen ble bestemt basert på litteraturforskning og foreløpige eksperimenter ved å overvåke mus etter administrering av injeksjoner hver dag i 3 dager og modifisere doseringen i henhold til museadferd. Den endelige valgte konsentrasjonen (20 mg/kg kroppsvekt) ble administrert intraperitonealt 5 dager per uke i 8 uker i et fettrikt kosthold og streptozotocin (STZ)-induserte diabetiske mus20,21. Effekten av naringenin ved diabetisk osteoporose ble evaluert ved blodglukosetesting, mikro-CT, tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farging og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
Totalt ble det observert at naringenin i et konsentrasjonsområde på 40-400 mg/ml ikke ble fullstendig oppløst i verken etanol eller DMSO eller 5 % (etanol eller DMSO) pluss 95 % PS (v/v). Imidlertid oppløste naringenin helt i en blanding av 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 og 92,96% PS. Den detaljerte prosedyren vil hjelpe forskere til å forberede forbindelsen som en injeksjonsløsning for in vivo applikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøkelsene som ble beskrevet var i samsvar med retningslinjene for pleie og bruk av laboratoriedyr fra National Research Council og ble godkjent av Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. Når du utfører forsøkene, er laboratoriefrakker, engangshansker i nitril og vernebriller nødvendig for sikkerhetsformål.
1. Tilberedning av løsemidler og estimering av naringenin som kreves for in vivo påføring
- Forbered følgende løsningsmidler: Tween-80 (endelig konsentrasjonsområde: 0,5% -1%), DMSO, glyserin (endelig konsentrasjonsområde: 15% -20%), etanol (endelig konsentrasjonsområde: 12% for intramuskulær injeksjon) 22 og 0,9% PS.
- Beregn mengden naringenin som kreves basert på dose, antall mus og injeksjonsfrekvens.
- Bestill 10 mus (C57BL/6, hann, 5 uker gammel, SPF) for å administrere naringenin 5 dager i uken i 8 uker. Hold mus i spesifikke patogenfrie (SPF) forhold.
MERK: Dosen som kreves for intraperitoneal injeksjon er 20 mg/kg b.w.23. - Vei 160 mg naringenin basert på følgende beregning: 20 mg / kg x 0,02 kg / mus x 10 mus x 5 dager / uke x 8 uker = 160 mg.
- Bestill 10 mus (C57BL/6, hann, 5 uker gammel, SPF) for å administrere naringenin 5 dager i uken i 8 uker. Hold mus i spesifikke patogenfrie (SPF) forhold.
- Beregn konsentrasjonen av naringenin som skal injiseres in vivo.
- Forbered det anbefalte volumet basert på kroppsvekten til musene. Det anbefalte volumet av naringenin påført hver mus er 1% kroppsvekt (0,3 ml). I dette eksperimentet ble 0,2 ml per mus brukt.
- Beregn totalvolumet: 0,2 ml per mus x 10 mus x 5 dager/uke x 8 uker = 80 ml.
- Beregn konsentrasjonen av Naringenin i lager: 160 mg / 80 ml løsningsmidler = 2 mg / ml.
- Beregn volumet for hver dag: 0,2 ml per mus x 10 mus = 2 ml.
2. Oppløsning
- Etanol løsning
- For å forberede naringeninoppløsning ved 2 mg / ml, vei 3,52 mg naringenin og legg den inn i et 2,0 ml rør.
MERK: For å oppnå en konsentrasjon på 2 mg / ml, vil det totale volumet som kreves være 1760 μL (beregning: 3,52 mg / 1760 μL = 2 mg / ml). - Spinn raskt ned (2000 x g i 30 s) for å få naringeninpulveret til å sette seg i bunnen av røret (figur 1A).
- Tilsett 8,8 μL 100% etanol til røret for å fremstille en 0,5% (v / v) løsning med hensyn til det totale volumet som kreves2. Naringenin oppløses ikke helt (figur 1B).
- Fortsett å tilsette 79,2 μL 100% etanol til røret for å fremstille en 5% (v / v) løsning med hensyn til det totale volumet som kreves (beregning: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin oppløses ikke helt (figur 1B).
- Tilsett 1672 μL 0,9% PS til røret som inneholder 5% etanol som beskrevet i trinn 2.1.4. Dette vil gi en emulsjon (figur 1D). Sentrifuge (2000 x g i 30 s) løsningen for å kontrollere om naringenin er fullstendig oppløst i løsningen. Hvite bunnfall av uoppløst naringenin vises i oppløsningen (figur 1E).
- For å forberede naringeninoppløsning ved 2 mg / ml, vei 3,52 mg naringenin og legg den inn i et 2,0 ml rør.
- DMSO-løsning
- For å forberede naringeninoppløsning ved 2 mg / ml, vei 3,95 mg naringenin og tilsett i et 2,0 ml rør.
MERK: For å oppnå en konsentrasjon på 2 mg / ml, vil det totale volumet som kreves være 1975 μL (beregning: 3,95 mg / 1975 μL = 2 mg / ml). - Spinn raskt ned (2000 x g i 30 s) for å få naringeninpulveret til å sette seg i bunnen av røret.
- Tilsett 9,8 μL DMSO til røret for å lage en 0,5% (v / v) løsning (beregning: 9,8 μL / 1975 μL x 100% = 5%). Naringenin oppløses fullstendig (figur 2A).
- Tilsett 88,2 μL DMSO til røret for å lage en 5% (v / v) løsning med hensyn til det totale volumet som kreves (beregning: (88,2 μL + 9,8 μL) / 1975 μL x 100% = 5%). Naringenin oppløses fullstendig (figur 2B).
- Tilsett 1877 μL 0,9 % PS (v/v prosent av 95 %) til oppløsningen fremstilt i trinn 2.2.4. En emulsjon produseres (figur 1C). Sentrifuge (2000 x g i 30 s) løsningen for å kontrollere om naringenin er fullstendig oppløst i løsningen. Hvite bunnfall av uoppløst naringenin vises i oppløsningen (figur 1D).
- For å forberede naringeninoppløsning ved 2 mg / ml, vei 3,95 mg naringenin og tilsett i et 2,0 ml rør.
- Tween-80 og DMSO-løsning
- For å forberede naringeninoppløsningen ved 2 mg / ml, veier 6,69 mg naringenin og tilsettes i et 5,0 ml rør.
MERK: For å oppnå den endelige konsentrasjonen på 2 mg/ml vil det totale nødvendige oppløsningsvolumet være 3345 μL (beregning: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml). - Spinn raskt ned (2000 x g i 30 s) for å få naringeninpulveret til å sette seg i bunnen av røret.
- Tilsett 117,7 μL DMSO for å lage en 3,5% (v / v) løsning med hensyn til det totale volumet som kreves (beregning: 117,7 μL / 3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin oppløses fullstendig (figur 3A)
- Tilsett 117,7 μL mellom 80 i oppløsningen tilberedt i trinn 2.3.3 for å oppnå 3,5 % (v/v) mellom 80 og 3,5 % (v/v) DMSO. Vær oppmerksom på fullstendig oppløsning av naringenin (figur 3B)
- Tilsett oppløsningen som er tilberedt i trinn 2.3.4 langsomt til et 5,0 ml rør inneholdende 3109,6 μL 0,9 % PS (v/v prosent av 93 %) og rist godt for å oppnå en tilsynelatende naringeninoppløsning (figur 3C).
- La oppløsningen tilberedt i trinn 2.3.5 oppbevares i romtemperatur (RT) i 2 timer. Løsningen er fortsatt tydelig uten synlige utfellinger (figur 3D).
- For å forberede naringeninoppløsningen ved 2 mg / ml, veier 6,69 mg naringenin og tilsettes i et 5,0 ml rør.
- Tilberedning av naringeninoppløsning for in vivo administrering
- I henhold til trinn 1.2.2 veier du 160 mg naringenin (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
- Tilsett 2,8 ml DMSO for å oppnå 3,5 % (v/v) løsning (beregning: 2,8 ml / 80 ml x 100 % = 3,5 %)
- Deretter tilsettes 2,8 ml mellom 80 i oppløsningen som ble klargjort i trinn 2.4.2 for å oppnå 3,5 % (v/v) mellom 80 og 3,5 % (v/v) DMSO.
- Aliquot oppløsningen fremstilt i trinn 2.4.3 i fire rør, 1,4 ml per rør [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
- Aliquot 18,6 ml 0,9% PS til fem 15 ml rør.
- Oppbevar oppløsningen klargjort i trinn 2.4.3 (stamløsning) og 2.4.5 ved 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
- Ta 140 μL av stamløsningen (trinn 2.4.3) og bland den med 1860 μL 0,9% PS for å tilberede 2 ml naringeninoppløsning i 1 dags administrering.
- Filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter.
3. Administrasjon av Naringenins løsning
- Håndtering og tilbakeholdenhet
- Spray buret og hendene med 70-75% alkohol før du åpner lokket. Løft musen ved foten av halen og legg den på en solid overflate for å plassere halen forsiktig tilbake.
- Ta tak i halsen bak ørene med venstre tommel og pekefinger og plasser halen mellom lillefingeren og ringfingeren. Hold musen i en liggende stilling med den bakre enden litt forhøyet.
- Innsprøytning
- Ta tak i musens bakhud slik at bukhuden er stram.
- Skyv kanylen (insulinsprøyten) inn i en vinkel på 10° mellom nålen og bukoverflaten, i nedre høyre eller venstre kvadrant av magen for å unngå å treffe blæren, leveren eller andre indre organer.
- Kjør nålen subkutant i kranial retning i 3-5 mm, og sett den deretter i 45 ° vinkel inn i bukhulen.
- Når nålen passerer gjennom bukveggen og motstanden forsvinner, utfør en aspirasjon for å bekrefte at ingen refluksmateriale trekkes ut. Skyv deretter løsningen sakte.
- Etter injeksjonen trekkes kanylen sakte ut og roteres litt for å forhindre lekkasje. Det anbefalte volumet er 50-100 μL / 10 g.
- Kast Naringenin som er til overs i en biohazardbeholder.
4. Blodsukker test
MERK: Test blodsukkeret 1 dag før injeksjonen og 1 og 2 måneder etter injeksjonen.
- Rask musene i 15 timer før blodsukkertesten. Vann kan fortsette å bli gitt.
- Åpne teststrimlene og merk datoen. Når de er åpnet, bruk teststrimlene innen 3 måneder. Oppbevar teststrimlene ved 2-30 °C. Lukk lokket tett etter at du har fjernet stripen for å forhindre dannelse av fuktighet.
- Plasser dyret i induksjonskammeret. Slå på fordamperen ved et induksjonsnivå på 4 % for isofluran og 4 l/min for oksygen. Etter at dyret er fullstendig bedøvet, opprettholder bedøvelsen med nesekeglen og bedøvelsesavsetningen på et nivå på 1,5% for isofluran og 0,4 l / min for oksygen.
- Tørk halen med bomullsballer/vattpinner dynket i 70%-75% alkohol.
- Start fra det laveste punktet på halen, gjør en liten punktering på den laterale halevenen med en 25G nålpinne og klem ut en dråpe blod.
- Tørk bloddråpen med et silkepapir.
- Klem ut en annen dråpe blod og samle den på kanten av en teststrimmel.
- Les av og registrer resultatet som vises på glukosemåleren.
- For å stoppe blødningen, klem halen på musen med en steril gasbind og tørk området med 75% alkohol.
- Ytterligere prøver kan oppnås ved en lignende teknikk som beveger seg kranialt oppover halen.
5. TRAP farging
- Klargjøring av lysbilder
- Utfør faste blodsukkertester på musene en gang i uken. Når blodsukkernivået er ≥ 11,1 mmol / L (indikativ for vellykket type II diabetes mus modell 24), avlive musene ved hjelp av CO2, etterfulgt av cervikal disklokasjon, og samle Lumbal 4 th-6th (L4-L6) (ingen eutanasi utføres mens fastende blodsukker test).
- Fest L4-L6-prøvene med 4% paraformaldehyd i 24 timer (sørg for at volumet av paraformaldehyd er >20x volumet av vevet), og vask deretter i 2 timer i kontinuerlig strøm av vann fra springen.
- For å avkalke prøvene, senk dem i en 10% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning i 2 uker ved RT i statisk tilstand til prøvene er myknet. Sørg for at volumet av avkalkingsløsningen er 20-30 ganger volumet av vevet/prøven. Bytt EDTA-løsning annenhver dag.
- Dehydrer prøven ved hjelp av en dehydrator.
- Plasser prøvene i vevsbehandling som legger inn kassetter. Nummerer kassetten med en blyant.
- Sett dehydratorprogrammet som følger: 75% alkohol i 2 timer, 85% alkohol i 1 time, 95% alkohol i 1 time, 95% alkohol i 2 timer, vannfri etanol (I) i 2 timer, vannfri etanol (II) i 2 timer, vannfri etanol (III) i 2 timer, xylen (I) i 1 time, xylen (II) i 1 time, xylen (III) i 1 time, parafinvoks (I) i 2 timer, og parafinvoks (II) i 2 timer, ved RT.
- Legg inn prøvene i parafinvoks.
- Tilsett parafinvoks i kassettbrettet på parafinstasjonen og varm opp til 60 °C. Senk de dehydrerte prøvene i minst 2 timer.
- Plasser vevskassetten i kassettbrettet og forvarm.
- Tilsett parafinvoks i parafinbeholderen og varm opp til 60 °C.
- Etter 2 timer, ta både vevskassett og prøver til arbeidsområdet. Hell den forvarmede parafinvoksen fra parafinbeholderen i vevskassetten. Plasser prøven i parafinvoksen, sørg for at parafinvoksen dekker vevet helt, og flytt deretter kassetten umiddelbart til en isingsstasjon.
- Bruk en mikrotom til å kutte parafin-innebygde prøver i 5-6 μm seksjoner. Brett delene ut i 40 °C varmt vann i mindre enn 10 s. Samle seksjonene på APS (amino silan) belagt glass lysbilder. Tørk lysbildene ved RT i 1 time, og flytt deretter lysbildene til et ovnssett på 60 °C over natten.
- TRAP reagens forberedelse
- Forbered grunnleggende inkubasjonsløsning: Oppløs 9,2 g vannfritt natriumacetat, 11,4 g L-(+) vinsyre og 2,8 ml issyre i 1000 ml destillert vann. Juster pH til 4,7-5,0 og oppbevar på RT i opptil 6 måneder.
- Klargjør naftol-eteroppløsning: Oppløs 0,1 g naftol AS-BI-fosfat i 5 ml etylenglykolmonoetyleter. Oppbevares ved 4 °C i opptil 5 uker.
- Forklar natriumnitrittoppløsning: Oppløs 1 g natriumnitritt i 25 ml destillert vann. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered pararosanilinfargestoff: Tilsett 1 g pararosanilinbase til 20 ml 2N HCl (83 ml HCl i 417 ml vann). Bruk en røreplate til å løse opp basen og filtrer den før bruk.
- TRAP-farging
- Fyll to Coplin-krukker med 50 ml grunninkubasjonsløsning og sett i en 37 °C ovn i 2 timer.
- Ta en Coplin krukke og tilsett 0,5 ml naptol-eter løsning.
- Plasser lysbildene i Coplin-krukken og inkuber ved 37 °C i 1 time.
MERK: Forbered minst tre lysbilder for hver gruppe. - Noen få minutter før inkubasjonstiden er over, tilsett 1 ml natriumnitrittoppløsning og 1 ml pararosanilinfargestoff. Bland forsiktig i 30 s og la den stå i 2 min.
- Tilsett oppløsningen tilberedt i trinn 5.2.2 til den andre forvarmede Coplin-krukken som inneholder den grunnleggende stamløsningen. Bland løsningen godt og sett inn lysbildene fra Coplin-krukken i trinn 5.3.3.
- Inkuber i 15-20 min på RT.
- Skyll skivene i en annen Coplin-krukke med 200 ml PBS i 5 min.
- Motflekk skivene med 100% hematoksylin i 30 s i en Coplin-krukke.
- Dehydrer skivene med 85%, 95% og 100% alkohol (200 ml) i 2 minutter hver og behandle i xylen (200 ml) i 2 minutter i 3x. Bruk Coplin-krukker til å utføre hvert trinn.
- Fest delen på dekselglasset med et deksel ved hjelp av harpiks. Sørg for å unngå fangst av luftbobler.
6. ELISA
- Forberedelse av prøver
- Fjern det myke vevet fra lårbenet og musens tibia. Rengjør beinene med gasbind.
- Plasser beinprøvene i et 1 ml mikrosentrifugerør og oppbevar prøverørene ved -80 °C.
MERK: Prøvene kan også lagres i en flytende nitrogentank i ikke mer enn 6 måneder. - Vei beinprøven. Fortynn med 0,9 % PS i forholdet 1:10. Fortynn for eksempel 0,1 g bein med 1 ml PS.
- Tilsett 3 mm zirkoniumperler i røret og slip prøvene 3x ved 70 Hz i 30 s med 20 s hvile i mellom.
- Sentrifuger prøvene ved 4 °C og 12 000 x g i 5 minutter. Samle supernatanten.
- ELISA analysesett
MERK: Utfør ELISA i henhold til analyseprotokollen spesifisert av produsenten.- Tilsett 100 μL av hver fortynning av standard, emne og prøve i de aktuelle brønnene. Inkuber i 90 minutter ved 37 °C.
- Dekanter væsken fra hver brønn og tilsett 100 μL biotinylert deteksjonsantistoffarbeidsløsning. Rug i 1 time ved 37 °C.
- Dekanter løsningen, tilsett 350 μL vaskebuffer til hver brønn. Soak i 1 min, gjenta 3x.
- Tilsett 100 μL HRP-konjugatarbeidsløsning til hver brønn. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Dekanter løsningen. Gjenta vaskeprosessen 5x som beskrevet i trinn 6.2.3.
- Tilsett 90 μL av substratreagenset. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C beskyttet mot lys.
- Tilsett 50 μL av stoppoppløsningen.
- Bruk en plateleser til å registrere absorbansen til hver brønn ved 450 nm.
- Standard kurve generasjon
- Plott de respektive gjennomsnittlige absorbansverdiene mot de serielt fortynnede proteinkonsentrasjonene.
- Slå sammen punktene for å skape den beste passformkurven. Bruk et passende dataprogram (regneark) for å generere standardkurveligningen.
- Erstatt absorbansverdien til hver prøve i standardkurveligningen for å oppnå konsentrasjonen av den respektive prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kroppsvekten til de fettfattige diettmatede og STZ-induserte diabetiske musene ble funnet å redusere sammenlignet med kontrollgruppene fra 0-8 uker etter STZ-behandling. Vekttapet til naringeninbehandlede mus var signifikant sammenlignet med de ikke-behandlede musene (STZ-gruppen) ved uke 4. Kontroll- og STZ-gruppen ble gitt med samme ps-volum (tab 1). Blodsukkernivået hos diabetiske mus økte dramatisk innen 1 måned etter STZ-induksjon. Den ble deretter automatisk redusert til et nivå observert for 2 måneder siden da dyremodellen ble etablert. Naringeninbehandling senket blodsukkernivået med henholdsvis 51,8 % og 34,8 % ved 1 og 2 måneder (tabell 2). STZ-induserte diabetiske mus viste bentap, noe som indikeres av reduksjonen i henholdsvis benvolum/vevsvolum (BV/TV) (30,97 %) og antall trabeculae (Tb.N) (11,4 %). Endringene i verdiene av disse to parametrene tyder på at naringeninbehandling signifikant reddet bentapet (tabell 3). Osteoklastaktivitet som indikert med N.oc/Tb.Ar (osteoklastnummer per trabekulært benområde) ble økt hos fettrike dietter og STZ-induserte diabetiske mus, selv om det ikke ble observert statistisk signifikans mellom kontroll- og sykdomsmodellene. Naringeninbehandling reduserte osteoklastaktiviteten signifikant, som vist i figur 4 og tabell 4. Det C-terminale telopeptidet av type I kollagen (CTIX) og N-terminalt propeptid av type I prokollagen (PINP) ble forhøyet med henholdsvis 68,09 % og 204,88 % hos diabetikere, noe som indikerer en dramatisk økning i benresorpsjonsraten. Naringenin reduserte signifikant begge indikatorene på benresorpsjonshastigheten (tabell 5).
Figur 1: Oppløsning av naringenin i etanol . (A) Naringeninpulver i røret etter spinn ned. (B) Naringenin + etanol (400 mg / ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μL etanol). (C) Naringenin + etanol (40 mg / ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μL etanol) (D) Naringenin i 5% (v / v) etanol og 95% PS (0,9%). (E) Faller ut i D etter nedspinn. (F) Måling for å oppnå skalalinje for figur 1, figur 2 og figur 3. Nar: Naringenin. Skala bar = 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppløsning av naringenin i DMSO. (A) Naringenin + DMSO (400 mg / ml - 3,95 mg naringenin i 9,8 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO (40 mg / ml- 3,95 mg naringenin i 98 μL DMSO). (C) Naringenin i 5 % (v/v) DMSO og 95 % PS (0,9 %). (D) Utfelling i C etter nedsmelting. Nar: Naringenin. Skala bar = 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppløsning av naringenin i DMSO og Tween 80. (A) Naringenin + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μL DMSO og 117,7 μL Tween 80). (C) Naringenin i blandingen av 3,5% (v / v) DMSO, 3,5% (v / v) Tween 80 og 93% PS (0,9%). (D) Ingen utfelling i C etter nedspinn. Nar: Naringenin. Skala bar = 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekten av naringenin på osteoklastaktiviteten til de fettrike diettmatede og STZ-injiserte (STZ) musene. TRAP-farging av trabekulær bein og osteoklaster av L4-ryggvirvler. Trekanter indikerte osteoklaster. Skala bar = 100 μm. Dette tallet er modifisert fra Liu et al.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| (g) | 0 uke | 1 uke | 2 uker | 4 uker | 5 uker | 6 uker | 8 uker |
| Kontroll | 23.7 ± 0.2 | 25.1 ± 1.3 | 26.2 ± 1.0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32.7 ± 1.3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs Kontroll | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |||||||
Tabell 1: Kroppsvekt av fettfattige diettfôrede og STZ-injiserte (STZ) mus på tvers av grupper og perioder. Data vises som gjennomsnitt ± s.d. ** p < 0,01 vs. Kontroll, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol / L) | 0 måned | 1 måned | 2 måneder |
| Kontroll | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs Kontroll | |||
| ΔΔ p < 0,01 vs STZ | |||
Tabell 2: Fastende blodsukker av STZ-mus på tvers av grupper og perioder. Data vises som gjennomsnitt ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs . Kontroll, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Kontroll | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs Kontroll | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabell 3: Benmasserelaterte parametere for STZ-mus på tvers av grupper. Data vises som gjennomsnitt ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Kontroll | 0.000182 ± 8.84E-05 |
| STZ | 0.00024 ± 2.06E-05 |
| Naringenin | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 mot STZ | |
Tabell 4: Osteoklastaktivitet av STZ-mus på tvers av grupper. Data vises som gjennomsnitt ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| ng/ml | CTIX | PINP |
| Kontroll | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36.98 ± 22.57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs Kontroll | ||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabell 5: Benresorpsjonshastighet for STZ-mus på tvers av grupper. Data vises som gjennomsnitt ± s.d. * p < 0,05 vs. Kontroll, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstillingen av fytokjemisk løsning er grunnlaget for dets anvendelse in vivo. I denne protokollen ble fremstillingen av naringeninoppløsning demonstrert ved bruk av forskjellige løsningsmidler, som etanol, DMSO, Tween 80 og 0,9% PS. Oppløsningen i fullstendig oppløst status må overvåkes ytterligere ved å la den forbli ved romtemperatur i noen lengre timer, og deretter filtreres før den brukes in vivo.
Bestemmelse av løsemidler er et kritisk trinn i denne protokollen. Det er mange løsningsmiddelalternativer for oppløsning av forbindelser, hvorav etanol, DMSO og PS er de mest brukte. Etanol kan oppløse mange vannuoppløselige forbindelser på grunn av dets svært polare egenskaper, noe som tillater hydrogenbinding og dermed oppløsning av både polare og ikke-polare stoffer. Videre kan konsentrasjonen av etanol bestemme egenskapene til den fytokjemiske forbindelsen. For eksempel anses 75 vekt% etanol / vannløsningsmiddel som det beste for å ekstrahere det høyeste utbyttet av polyfenoler og har de sterkeste antioksidantegenskapene26. En annen studie fant at etanolkonsentrasjonen kunne senkes til 32,5% ved 150 ° C for polyfenolekstrakter for å uttrykke antioksidantegenskap27. Imidlertid kan en høy konsentrasjon av etanol forårsake nevrotoksisitet og hepatotoksisitet28. Etanolinjeksjon (i.p.) i en rekke konsentrasjoner fra 8% -32% v / v brukes ofte til atferdsevaluering og kan forårsake betinget smaksaversjon og hypotermi29. DMSO er et dipolart aprotisk løsningsmiddel med høy polaritet og brukes som løsningsmiddel for å oppløse mange organiske forbindelser. En komparativ studie indikerte at DMSO/metanol (50:50 v/v) resulterte i optimalt utbytte av fenoliske syrer i sitrusskall30. Dose, konsentrasjon og frekvens er imidlertid ikke uverdige faktorer når DMSO leveres til dyr. En dose på 17,7 g/kg gitt intraperitonealt hos mus oppnådde LD50 mens senking av dosen til 2,5 g/kg i 6 uker hos mus ikke forårsaket observerbare bivirkninger31. Selv om den foreslåtte DMSO-konsentrasjonen er 0, 5% -5%, er DMSO ikke i stand til å oppløse mange forbindelser. Colucci og medarbeidere testet effekten av DMSO og DMSO-holdig saltvann i forskjellige konsentrasjoner ved intracerebroventrikulær og oral administrering hos mus. Studien viste at en løsning på 25% DMSO i saltvann ikke endret dyreadferdsresponser32. Tween 80 er et ikke-ionisk overflateaktivt middel og er mye brukt som et co-løsningsmiddel for å øke oppløseligheten av dårlig oppløselige stoffer og forbedre farmakokinetiske egenskaper33. En konsentrasjon på 1% Tween 80 ble valgt med tanke på sikkerhet33. Ovennevnte løsningsmidler og overflateaktive stoffer ved forskjellige konsentrasjoner ble således brukt til å fullstendig oppløse naringenin for intraperitoneal administrering.
Noen forslag er oppført her for vurdering. Først foreslår vi at du starter fra en liten mengde fytokjemisk forbindelse for foreløpige eksperimenter med tanke på forbrukskostnaden. For det andre er det nødvendig å utføre omfattende litteraturforskning, spesielt nære studier angående dyrearter, sykdommer, administrasjonsveier og frekvens, før du klargjør løsningen. For det tredje er konsentrasjonsområdene for løsemidler og ko-løsningsmidler som overflateaktive stoffer avhengig av tilgjengelig litteratur, foreløpige eksperimenter og formålet med studiedesignet. For det fjerde anbefales det å bruke en insulinsprøyte i stedet for en vanlig sprøyte for å redusere injeksjonsskaden fra en relativt høy administrasjonsfrekvens. For det femte, for å opprettholde sterile forhold, anbefales det å sterilisere løsningen ved hjelp av et 0,2 μm filter og bruk sterile sprøyter og bomullspinner gjennomvåt i alkohol når du injiserer løsningen i levende dyr.
Fordelene med protokollen er dens enkle drift og lave kostnader. Oppsummert demonstrerer protokollen fremstilling av en fytokjemisk løsning for intraperitoneal administrering hos mus, med naringenin som et eksempel. Protokollen vil være til nytte for forskerne som arbeider med narkotikascreening eller farmakologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81973607 og 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
- van Thriel, C.
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
