Summary
Aqui, o protocolo apresenta o preparo da solução de naringenina para administração intraperitoneal in vivo. A naringenina é totalmente dissolvida em uma mistura de dimetilsulfóxido, Tween 80, e solução salina. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina foram avaliados por teste de glicose no sangue, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato e ensaio de imunoabsorção enzimática.
Abstract
A preparação de uma solução composta (fitoquímica) é uma etapa negligenciada, mas crítica, antes de sua aplicação em estudos como a triagem de medicamentos. A solubilização completa do composto é necessária para o seu uso seguro e resultados relativamente estáveis. Aqui, um protocolo para o preparo de solução de naringenina e sua administração intraperitoneal em uma dieta rica em gordura e modelo diabético induzido por estreptozotocina (STZ) é demonstrado como exemplo. Uma pequena quantidade de naringenina (3,52-6,69 mg) foi usada para testar sua solubilização em solventes, incluindo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e DMSO mais Tween 80 reconstituído em solução salina fisiológica (PS), respectivamente. A solubilização completa do composto é determinada observando a cor da solução, a presença de precipitados após a centrifugação (2000 x g por 30 s) ou permitindo que a solução permaneça por 2 h à temperatura ambiente (RT). Após a obtenção de um composto estável/solução fitoquímica, a concentração/quantidade final do composto necessária para estudos in vivo pode ser preparada numa solução-mãe apenas com solvente (sem PS) e, em seguida, diluída/misturada com PS conforme desejado. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina em camundongos (administração intraperitoneal a 20 mg/kg de p.c., 2 mg/mL) foram avaliados pela medição da glicemia, massa óssea (micro-TC) e taxa de reabsorção óssea (coloração TRAP e ELISA). Os pesquisadores que procuram preparações detalhadas de soluções orgânicas / fitoquímicas se beneficiarão dessa técnica.
Introduction
Com o aumento dos estudos sobre o uso de compostos fitoquímicos para triagem de medicamentos, vale a pena dar atenção às abordagens para preparar soluções fitoquímicas para avaliar seus efeitos ótimos. Muitos aspectos, como a metodologia de dissolução, dosagem e concentração, devem ser considerados ao preparar o composto1.
A dissolução à base de solvente é amplamente utilizada para a preparação de compostos orgânicos1. Os solventes comumente usados incluem água, óleo, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Embora uma suspensão com substâncias não dissolvidas seja aceitável quando o composto é administrado por gavagem gástrica, um soluto totalmente dissolvido é crítico para administração intravenosa. Como a solução oleosa, a suspensão e a emulsão podem causar embolias capilares, sugere-se uma solução aquosa para o preparo de compostos, especialmente quando se administram injeções intravenosas, intramusculares e intraperitoneais3.
A faixa de dose efetiva varia entre os compostos e até mesmo entre as doenças tratadas com o mesmo composto. As determinações da dose efetiva e segura e da concentração dependem da literatura e de experimentos preliminares4. Aqui, a preparação do composto naringenina é demonstrada como um exemplo.
A naringenina (4,5,7-trihidroxi-flavanona), um composto polifenólico, tem sido estudada no tratamento da doença por suas atividades hepatoprotetoras5, antidiabéticas6, anti-inflamatórias7 e antioxidantes8. Para aplicações in vivo, a administração oral de naringenina é comumente usada. Estudos prévios relataram o preparo de solução de naringenina em carboximetilcelulose a 0,5%-1%, dose de metilcelulose a 0,5%, DMSO a 0,01% e solução salina fisiológica (PS) a 50-100 mg/kg, administrada por gavagem oral 9,10,11,12. Além disso, outros estudos relataram a suplementação de naringenina com ração a 3% (em peso/m) para ingestão oral na dose de 3,6 g/kg/d13,14. Estudos também relataram o uso de etanol (0,5% v/v), PS e DMSO para dissolver naringenina para injeção intraperitoneal a 10-50 mg/kg15,16,17,18. Em um estudo de epilepsia do lobo temporal, camundongos receberam uma injeção de naringenina suspensa em carboximetilcelulose a 0,25% dissolvida em PS19. Embora esses estudos relatem o uso de diferentes solventes para preparar soluções de naringenina, mais detalhes, como o estado de dissolução e a resposta animal, não foram relatados.
Este protocolo introduz um procedimento para preparar solução de naringenina para aplicação in vivo na osteoporose induzida por diabetes. A preparação da solução injetável inclui a preparação de solventes e compostos, estimativa de dosagem, processo de dissolução e filtração. A dosagem foi determinada com base em pesquisas bibliográficas e experimentos preliminares, monitorando camundongos após a administração de injeções todos os dias durante 3 dias e modificando a dosagem de acordo com os comportamentos dos camundongos. A concentração final escolhida (20 mg/kg de p.c.) foi administrada por via intraperitoneal 5 dias por semana durante 8 semanas em uma dieta rica em gordura e camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Os efeitos da naringenina na osteoporose diabética foram avaliados por meio de testes de glicose no sangue, micro-TC, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e ensaio imunoenzimático (ELISA).
No geral, observou-se que a naringenina em uma faixa de concentração de 40-400 mg/mL não se dissolveu completamente em etanol ou DMSO ou 5% (etanol ou DMSO) mais 95% PS (v/v). No entanto, a naringenina se dissolveu completamente em uma mistura de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 e 92,96% de PS. O procedimento detalhado ajudará os pesquisadores a preparar o composto como uma solução de injeção para aplicação in vivo.
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Protocol
As investigações descritas estavam em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa e foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Ao realizar os experimentos, jalecos, luvas nitrílicas descartáveis e óculos de proteção são necessários para fins de segurança.
1. Preparação de solventes e estimativa da naringenina necessária para aplicação in vivo
- Preparar os seguintes solventes: Tween-80 (faixa de concentração final: 0,5%-1%), DMSO, glicerina (faixa de concentração final: 15%-20%), etanol (faixa de concentração final: 12% para injeção intramuscular)22 e 0,9% PS.
- Estime a quantidade de naringenina necessária com base na dose, número de camundongos e frequência de injeção.
- Encomende 10 ratos (C57BL/6, macho, 5 semanas de idade, SPF) para administrar naringenina 5 dias por semana durante 8 semanas. Mantenha os ratos em condições específicas livres de patógenos (SPF).
NOTA: A dose necessária para a injeção intraperitoneal é de 20 mg/kg de p.c.23. - Pesar 160 mg de naringenina com base no seguinte cálculo: 20 mg/kg x 0,02 kg/rato x 10 ratinhos x 5 dias/semana x 8 semanas = 160 mg.
- Encomende 10 ratos (C57BL/6, macho, 5 semanas de idade, SPF) para administrar naringenina 5 dias por semana durante 8 semanas. Mantenha os ratos em condições específicas livres de patógenos (SPF).
- Calcular a concentração de naringenina a injetar in vivo.
- Prepare o volume recomendado com base no peso corporal dos camundongos. O volume recomendado de naringenina aplicado a cada rato é de 1% do peso corporal (0,3 ml). Neste experimento, foram utilizados 0,2 mL por camundongo.
- Calcule o volume total: 0,2 mL por camundongo x 10 camundongos x 5 dias/semana x 8 semanas = 80 mL.
- Calcular a concentração do Naringenina em stock: 160 mg/80 ml solventes = 2 mg/ml.
- Calcule o volume para cada dia: 0,2 mL por rato x 10 camundongos = 2 mL.
2. Dissolução
- Solução de etanol
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,52 mg de naringenina e adicioná-la a um tubo de 2,0 mL.
NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1760 μL (cálculo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/mL). - Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer com que o pó de naringenina se deposite no fundo do tubo (Figura 1A).
- Adicionar 8,8 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) em relação ao volume total necessário2. Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).
- Continue a adicionar 79,2 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).
- Adicionar 1672 μL de 0,9% PS ao tubo contendo 5% de etanol, conforme descrito na etapa 2.1.4. Isso produzirá uma emulsão (Figura 1D). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1E).
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,52 mg de naringenina e adicioná-la a um tubo de 2,0 mL.
- Solução DMSO
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,95 mg de naringenina e adicionar a um tubo de 2,0 mL.
NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1975 μL (cálculo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/mL). - Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.
- Adicionar 9,8 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) (cálculo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2A).
- Adicionar 88,2 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2B).
- Adicionar 1877 μL de 0,9% PS (v/v por cento de 95%) à solução preparada no passo 2.2.4. Uma emulsão é produzida (Figura 1C). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1D).
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,95 mg de naringenina e adicionar a um tubo de 2,0 mL.
- Solução Tween-80 e DMSO
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina e adicionar num tubo de 5,0 ml.
NOTA: Para atingir a concentração final de 2 mg/mL, o volume total de solução necessário será de 3345 μL (cálculo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/mL). - Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.
- Adicionar 117,7 μL de DMSO para preparar uma solução a 3,5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 3A)
- Adicionar 117,7 μL de Tween 80 à solução preparada no passo 2.3.3 para obter 3,5% (v/v) de Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO. Observe a dissolução completa da naringenina (Figura 3B)
- Adicionar lentamente a solução preparada na etapa 2.3.4 a um tubo de 5,0 mL contendo 3109,6 μL de PS a 0,9% (v/v por cento de 93%) e agitar bem para obter uma solução aparente de naringenina (Figura 3C).
- Deixar a solução preparada na etapa 2.3.5 permanecer à temperatura ambiente (RT) por 2 h. A solução ainda é aparente sem quaisquer precipitados visíveis (Figura 3D).
- Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina e adicionar num tubo de 5,0 ml.
- Preparação da solução de naringenina para administração in vivo
- De acordo com a etapa 1.2.2, pesar 160 mg de naringenina (160 mg / 2 mg / mL = 80 mL).
- Adicionar 2,8 mL de DMSO para obter solução a 3,5% (v/v) (cálculo: 2,8 mL / 80 mL x 100% = 3,5%)
- Em seguida, adicione 2,8 mL de Tween 80 à solução preparada na etapa 2.4.2 para atingir 3,5% (v/v) Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO.
- Aliquotar a solução preparada na etapa 2.4.3 em quatro tubos, 1,4 mL por tubo [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].
- Alíquota de 18,6 mL de 0,9% PS a cinco tubos de 15 mL.
- Conservar a solução preparada nas fases 2.4.3 (solução-mãe) e 2.4.5 a 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
- Tomar 140 μL da solução-mãe (passo 2.4.3) e misturá-la com 1860 μL de PS a 0,9% para preparar 2 ml de solução de naringenina durante 1 dia de administração.
- Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm.
3. Administração da solução de naringenin
- Manuseio e contenção
- Pulverize a gaiola e as mãos com álcool 70-75% antes de abrir a tampa. Levante o rato pela base da cauda e coloque-o sobre uma superfície sólida para posicionar a cauda suavemente para trás.
- Segure o pescoço atrás das orelhas com o polegar esquerdo e o dedo indicador e posicione a cauda entre o dedo pequeno e o dedo anelar. Mantenha o rato em decúbito dorsal com a sua extremidade posterior ligeiramente elevada.
- Injecção
- Segure a pele traseira do rato para que a pele abdominal fique tensa.
- Empurre a agulha (seringa de insulina) em um ângulo de 10 ° entre a agulha e a superfície abdominal, no quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen para evitar atingir a bexiga, o fígado ou outros órgãos internos.
- Passe a agulha por via subcutânea em uma direção craniana por 3-5 mm e, em seguida, insira-a em um ângulo de 45 ° na cavidade abdominal.
- Quando a agulha passar pela parede abdominal e a resistência desaparecer, realize uma aspiração para confirmar que nenhum material de refluxo é retirado. Em seguida, empurre lentamente a solução.
- Após a injeção, puxe lentamente a agulha para fora e gire-a ligeiramente para evitar vazamentos. O volume recomendado é de 50-100 μL/10 g.
- Descarte as sobras de Naringenin em um recipiente de risco biológico.
4. Teste de glicose no sangue
NOTA: Teste a glicose no sangue 1 dia antes da injeção e 1 e 2 meses após a injeção.
- Jejue os ratos por 15 h antes do teste de glicose no sangue. A água pode continuar a ser fornecida.
- Abra as tiras de teste e marque a data. Uma vez abertas, use as tiras de teste dentro de 3 meses. Conservar as tiras de ensaio a 2-30 °C. Feche bem a tampa depois de remover a tira para evitar a formação de umidade.
- Coloque o animal na câmara de indução. Ligue o vaporizador a um nível de indução de 4% para o isoflurano e 4 L/min para o oxigénio. Após o animal estar totalmente anestesiado, manter o anestésico com o cone nasal e o anestésico a um nível de 1,5% para isoflurano e 0,4 L/min para oxigênio.
- Limpe a cauda com bolas de algodão / cotonetes embebidos em álcool de 70% a 75%.
- Começando pelo ponto mais baixo da cauda, faça uma pequena punção na veia lateral da cauda com uma picada de agulha 25G e esprema uma gota de sangue.
- Limpe a gota de sangue com um papel de seda.
- Esprema outra gota de sangue e colete-a na borda de uma tira de teste.
- Leia e registre o resultado exibido no medidor de glicose.
- Para parar o sangramento, aperte a cauda do rato com uma gaze estéril e limpe a área com álcool a 75%.
- Amostras adicionais podem ser obtidas por uma técnica semelhante movendo-se para cima da cauda cranialmente.
5. Coloração TRAP
- Preparação de slides
- Realize testes de glicose no sangue em jejum nos ratos uma vez por semana. Quando os níveis de glicose no sangue estiverem ≥ 11,1 mmol / L (indicativo de camundongos com diabetes tipo II bem-sucedidos modelo 24), eutanasie os camundongos usando CO2, seguido de disclocação cervical, e colete o 4º-6º lombar (L4-L6) (nenhuma eutanásia é realizada durante o teste de glicose no sangue em jejum).
- Fixe as amostras de L4-L6 com paraformaldeído a 4% por 24 h (certifique-se de que o volume de paraformaldeído seja >20x o volume do tecido) e, em seguida, lave por 2 h em fluxo contínuo de água da torneira.
- Para descalcificar as amostras, mergulhe-as em uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% por 2 semanas no RT em condição estática até que as amostras sejam amolecidas. Certifique-se de que o volume da solução descalcificante é de 20-30 vezes o volume do tecido/amostra. Mude a solução EDTA a cada dois dias.
- Desidratar a amostra com um desidratador.
- Coloque os espécimes no processamento de tecidos incorporando. Numere o usando um lápis.
- Defina o programa de desidratador da seguinte forma: álcool a 75% por 2 h, álcool a 85% por 1 h, álcool a 95% por 1 h, álcool a 95% por 2 h, etanol anidro (I) por 2 h, etanol anidro (II) por 2 h, etanol anidro (III) por 2 h, xileno (I) por 1 h, xileno (II) por 1 h, xileno (III) por 1 h, xileno (III) por 1 h, cera de parafina (I) por 2 h, e cera de parafina (II) por 2 h, a RT.
- Incorpore as amostras em cera de parafina.
- Adicionar cera de parafina ao tabuleiro de da estação de incorporação de parafina e aquecer a 60 °C. Imergir os espécimes desidratados durante, pelo menos, 2 h.
- Coloque o de tecido na bandeja do e pré-aqueça.
- Adicionar cera de parafina ao reservatório de parafina e aquecer a 60 °C.
- Após 2 h, leve o de tecido e os espécimes para a área de trabalho. Despeje a cera de parafina pré-aquecida do reservatório de parafina no de tecido. Coloque a amostra na cera de parafina, certifique-se de que a cera de parafina cubra completamente o tecido e, em seguida, mova imediatamente o para uma estação de gelo.
- Use um micrótomo para cortar as amostras embutidas em parafina em seções de 5-6 μm. Desdobre as seções em água morna a 40 °C por menos de 10 s. Colete as seções em lâminas de vidro revestidas com APS (amino silano). Secar as lâminas a RT durante 1 h e, em seguida, movê-las para um forno regulado a 60 °C durante a noite.
- Preparação do reagente TRAP
- Preparar solução básica de incubação de estoque: Dissolver 9,2 g de acetato de sódio anidro, 11,4 g de ácido tartárico L-(+) e 2,8 mL de ácido glacial em 1000 mL de água destilada. Ajuste o pH para 4,7-5,0 e armazene no RT por até 6 meses.
- Preparar solução de naftólio-éter: Dissolver 0,1 g de fosfato de naftol AS-BI em 5 ml de éter monoetílico de etilenoglicol. Conservar a 4 °C durante 5 semanas.
- Preparar solução de nitrito de sódio: Dissolver 1 g de nitrito de sódio em 25 mL de água destilada. Conservar a 4 °C.
- Preparar corante Pararosanilina: Adicionar 1 g de base de pararosanilina a 20 mL de HCl 2N (83 mL de HCl em 417 mL de água). Use uma placa de agitação para dissolver a base e filtrá-la antes de usá-la.
- Coloração TRAP
- Encher dois frascos Coplin com 50 mL de solução básica de incubação de estoque e colocar em forno a 37 °C por 2 h.
- Pegue um frasco de Coplin e adicione 0,5 mL de solução de éter de naptol.
- Colocar as lâminas no frasco de Coplin e incubar a 37 °C durante 1 h.
Observação : Prepare pelo menos três slides para cada grupo. - Poucos minutos antes do término do tempo de incubação, adicione 1 mL de solução de nitrito de sódio e 1 mL de corante pararosanilina. Misture suavemente por 30 s e deixe por 2 min.
- Adicionar a solução preparada na fase 5.2.2 ao outro frasco de Coplin pré-aquecido que contém a solução-mãe de base. Misture bem a solução e insira as lâminas do frasco de Coplin na etapa 5.3.3.
- Incubar por 15-20 min em RT.
- Lave as fatias em outro frasco Coplin com 200 mL de PBS por 5 min.
- Contra-manchar as fatias com 100% de hematoxilina por 30 s em um frasco de Coplin.
- Desidrate as fatias com álcool 85%, 95% e 100% (200 mL) por 2 min cada e trate em xileno (200 mL) por 2 min por 3x. Use frascos Coplin para realizar cada etapa.
- Prenda a seção no vidro da tampa com uma tampa usando resina. Certifique-se de evitar o aprisionamento de bolhas de ar.
6. ELISA
- Preparação da amostra
- Remova os tecidos moles do fêmur e da tíbia do rato. Limpe os ossos com gaze.
- Colocar as amostras ósseas num tubo de microcentrífuga de 1 ml e armazenar os tubos de amostra a -80 °C.
NOTA: As amostras também podem ser armazenadas em um tanque de nitrogênio líquido por não mais de 6 meses. - Pesar a amostra óssea. Diluir com 0,9% PS na proporção de 1:10. Por exemplo, dilua 0,1 g de osso com 1 mL de PS.
- Adicione grânulos de zircônia de 3 mm no tubo e triture as amostras 3x a 70 Hz por 30 s com descanso de 20 s no meio.
- Centrifugar as amostras a 4 °C e 12.000 x g durante 5 minutos. Colete o sobrenadante.
- Kit de ensaio ELISA
NOTA: Execute ELISA de acordo com o protocolo de ensaio especificado pelo fabricante.- Adicionar 100 μL de cada diluição de padrão, em branco e amostra nos poços apropriados. Incubar durante 90 min a 37 °C.
- Decantar o líquido de cada poço e adicionar 100 μL de solução de trabalho de anticorpos de detecção biotinilados. Incubar durante 1 h a 37 °C.
- Decantar a solução, adicionar 350 μL de tampão de lavagem a cada alvéolo. Mergulhe por 1 min, repita 3x.
- Adicione 100 μL de solução de trabalho conjugado HRP a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 °C.
- Decantar a solução. Repetir o processo de lavagem 5x conforme descrito na etapa 6.2.3.
- Adicionar 90 μL do reagente do substrato. Incubar durante 15 min a 37 °C protegido da luz.
- Adicionar 50 μL da solução de paragem.
- Use um leitor de placas para registrar a absorvância de cada poço a 450 nm.
- Geração de curva padrão
- Traçar os respectivos valores médios de absorvância em relação às concentrações de proteínas diluídas em série.
- Junte os pontos para criar a melhor curva de ajuste. Use qualquer aplicativo de computador apropriado (planilha) para gerar a equação de curva padrão.
- Substituir o valor de absorvância de cada amostra na equação da curva padrão para obter a concentração da respectiva amostra.
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Representative Results
Verificou-se que o peso corporal dos camundongos diabéticos alimentados com dieta rica em gordura e induzidos por STZ diminuiu quando comparado com o dos grupos controle de 0-8 semanas após o tratamento com STZ. A perda de peso dos ratos tratados com naringenina foi significativa em comparação com os ratos não tratados (grupo STZ) na semana 4. Os grupos controle e STZ foram administrados com o mesmo volume de PS (Tabela 1). O nível de glicose no sangue em ratos diabéticos aumentou drasticamente dentro de 1 mês após a indução de STZ. Em seguida, diminuiu automaticamente para um nível observado há 2 meses, quando o modelo animal foi estabelecido. O tratamento com naringenina reduziu os níveis glicêmicos em 51,8% e 34,8% aos 1 e 2 meses, respectivamente (Tabela 2). Os camundongos diabéticos induzidos por STZ apresentaram perda óssea, conforme indicado pela diminuição do volume ósseo/volume tecidual (BV/TV) (30,97%) e do número de trabéculas (Tb.N) (11,4%), respectivamente. As alterações nos valores desses dois parâmetros sugerem que o tratamento com naringenina resgatou significativamente a perda óssea (Tabela 3). A atividade dos osteoclastos, conforme indicado por N.oc/Tb.Ar (número de osteoclasto por área óssea trabecular) foi aumentada em camundongos diabéticos ricos em gordura e induzidos por STZ, embora nenhuma significância estatística tenha sido observada entre os modelos controle e doença. O tratamento com naringenina diminuiu significativamente as atividades dos osteoclastos, como mostra a Figura 4 e a Tabela 4. O telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo I (CTIX) e o propeptídeo N-terminal do procolágeno tipo I (PINP) foram elevados em 68,09% e 204,88% em animais diabéticos, respectivamente, indicando um aumento dramático na taxa de reabsorção óssea. A naringenina diminuiu significativamente ambos os indicadores da taxa de reabsorção óssea (Tabela 5).
Figura 1: Dissolvendo naringenina em etanol. (A) Naringenina em pó no tubo após a rotação para baixo. (B) Naringenina + etanol (400 mg/mL - 3,52 mg de naringenina em 8,8 μL de etanol). (C) Naringenina + etanol (40 mg/mL - 3,52 mg de naringenina em 8,8 μL de etanol) (D) Naringenina em etanol a 5% (v/v) e 95% PS (0,9%). (E) Precipitados em D após a rotação para baixo. (F) Medição para obtenção da barra de escala para a Figura 1, Figura 2 e Figura 3. Nar: Naringenina. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissolvendo a naringenina em DMSO. (A) Naringenina + DMSO (400 mg/mL - 3,95 mg de naringenina em 9,8 μL de DMSO). (B) Naringenina + DMSO (40 mg / mL- 3,95 mg de naringenina em 98 μL de DMSO). (C) Naringenina em 5% (v/v) DMSO e 95% PS (0,9%). (D) Precipitados em C após a cisão para baixo. Nar: Naringenina. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dissolvendo a naringenina em DMSO e Tween 80. (A) Naringenina + DMSO (57,2 mg/mL - 6,69 mg de naringenina em 117,7 μL de DMSO). (B) Naringenina + DMSO + Tween (57,2 mg/mL - 6,69 mg de naringenina em 117,7 μL de DMSO e 117,7 μL de Tween 80). (C) Naringenina na mistura de 3,5% (v/v) de DMSO, 3,5% (v/v) de Tween 80 e 93% de PS (0,9%). (D) Sem precipitados em C após a cisão para baixo. Nar: Naringenina. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O efeito da naringenina na atividade dos osteoclastos, de camundongos alimentados com dieta rica em gordura e injetados com STZ (STZ). Coloração TRAP do osso trabecular e osteoclastos das vértebras L4. Triângulos indicavam osteoclastos. Barra de escala = 100 μm. Esse número foi modificado a partir de Liu et al.25. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| g) | 0 semana | 1 semana | 2 semanas | 4 semanas | 5 semanas | 6 semanas | 8 semanas |
| Controle | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26,2 ± 1,0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs. Controle | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |||||||
Tabela 1: Peso corporal de camundongos alimentados com dieta rica em gordura e injetados com STZ (STZ) em todos os grupos e períodos. Os dados são apresentados como a média ± s.d. ** p < 0,01 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 mês | 1 mês | 2 meses |
| Controle | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. Controle | |||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |||
Tabela 2: Glicemia de jejum de camundongos STZ em todos os grupos e períodos. Os dados são apresentados como a média ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Colher de N (1/mm) | |
| Controle | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Controle | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabela 3: Parâmetros relacionados à massa óssea de camundongos STZ em todos os grupos. Os dados são apresentados como a média ± s.d. * p < 0,05 vs. Controle, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs . STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Controle | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringenin | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |
Tabela 4: Atividade dos osteoclastos de camundongos STZ em todos os grupos. Os dados são apresentados como a média ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| ng/mL | CTIX | PINP |
| Controle | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Controle | ||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabela 5: Taxa de reabsorção óssea de camundongos STZ entre os grupos. Os dados são apresentados como a média ± s.d. * p < 0,05 vs. Controle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
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Discussion
A preparação de solução fitoquímica é a base para a sua aplicação in vivo. Neste protocolo, o preparo da solução de naringenina foi demonstrado por meio do uso de diferentes solventes, como etanol, DMSO, Tween 80 e PS a 0,9%. A solução em estado completamente dissolvido precisa ser monitorada ainda mais, permitindo que permaneça à temperatura ambiente por algumas horas prolongadas e, em seguida, filtrada antes de ser usada in vivo.
A determinação de solventes é um passo crítico neste protocolo. Existem muitas opções de solventes para dissolver compostos, dos quais etanol, DMSO e PS são os mais utilizados. O etanol pode dissolver muitos compostos insolúveis em água devido às suas propriedades altamente polares, permitindo a ligação de hidrogênio e, assim, dissolvendo substâncias polares e não polares. Além disso, a concentração de etanol pode determinar as propriedades do composto fitoquímico. Por exemplo, 75% em peso de etanol/solvente de água é considerado o melhor para extrair o maior rendimento de polifenóis e tem as propriedades antioxidantes mais fortes26. Outro estudo constatou que a concentração de etanol poderia ser reduzida para 32,5% a 150 °C para extratos de polifenóis expressarem propriedade antioxidante27. No entanto, uma alta concentração de etanol pode causar neurotoxicidade e hepatotoxicidade28. A injeção de etanol (i.p.) em uma faixa de concentrações de 8% a 32% v/v é comumente usada para avaliação comportamental e pode causar aversão condicional ao paladar e hipotermia29. DMSO é um solvente aprótico dipolar de alta polaridade e é usado como solvente para dissolver numerosos compostos orgânicos. Um estudo comparativo indicou que DMSO/metanol (50:50 v/v) resultou no ótimo rendimento de ácidos fenólicos em cascas cítricas30. No entanto, dose, concentração e frequência não são fatores ignorantes quando o DMSO é administrado a animais. Uma dose de 17,7 g/kg administrada por via intraperitoneal em ratinhos atingiu DL50, ao mesmo tempo que reduziu a dose para 2,5 g/kg durante 6 semanas em ratinhos não causou efeitos adversos observáveis31. Embora a concentração sugerida de DMSO seja de 0,5%-5%, o DMSO não é capaz de dissolver muitos compostos. Colucci e col. testaram os efeitos da solução salina contendo DMSO e DMSO em diferentes concentrações por administração intracerebroventricular e oral em camundongos. O estudo demonstrou que uma solução de DMSO a 25% em soro fisiológico não alterou as respostas comportamentais dos animais32. Tween 80 é um surfactante não iônico e é amplamente utilizado como co-solvente para aumentar a solubilidade de drogas pouco solúveis e melhorar as características farmacocinéticas33. Optou-se por uma concentração de 1% Tween 80 considerando a segurança33. Assim, os solventes e surfactantes acima em diferentes concentrações foram utilizados para solubilizar totalmente a naringenina para administração intraperitoneal.
Algumas sugestões estão listadas aqui para consideração. Primeiro, sugerimos partir de uma pequena quantidade de composto fitoquímico para experimentos preliminares considerando o custo de consumo. Em segundo lugar, é necessário realizar pesquisas bibliográficas abrangentes, especialmente estudos aprofundados sobre espécies animais, doenças, vias de administração e frequência, antes de preparar a solução. Em terceiro lugar, as faixas de concentração de solventes e co-solventes, como surfactantes, dependem da literatura disponível, dos experimentos preliminares e do objetivo do desenho do estudo. Em quarto lugar, recomenda-se o uso de uma seringa de insulina em vez de uma seringa regular para reduzir a lesão por injeção a partir de uma frequência relativamente alta de administração. Em quinto lugar, para manter as condições estéreis, recomenda-se esterilizar a solução usando um filtro de 0,2 μm e usar seringas estéreis e cotonetes embebidos em álcool ao injetar a solução em animais vivos.
As vantagens do protocolo são o seu funcionamento simples e de baixo custo. Em resumo, o protocolo demonstra a preparação de uma solução fitoquímica para administração intraperitoneal em camundongos, tendo como exemplo a naringenina. O protocolo beneficiará os pesquisadores que lidam com triagem de drogas ou farmacologia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973607 e 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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