Summary
Här presenterar protokollet beredningen av naringeninlösning för in vivo intraperitoneal administrering. Naringenin är helt upplöst i en blandning av dimetylsulfoxid, Tween 80 och saltlösning. De antidiabetiska osteoporotiska effekterna av naringenin bedömdes genom blodsockertestning, tartratresistent syrafosfatasfärgning och enzymbunden immunosorbentanalys.
Abstract
Beredningen av en förening (fytokemisk) lösning är ett förbisett men kritiskt steg innan den tillämpas i studier såsom läkemedelsscreening. Den fullständiga solubiliseringen av föreningen är nödvändig för säker användning och relativt stabila resultat. Här demonstreras ett protokoll för beredning av naringeninlösning och dess intraperitoneala administrering i en fettrik diet och streptozotocin (STZ) -inducerad diabetesmodell som ett exempel. En liten mängd naringenin (3,52-6,69 mg) användes för att testa dess solubilisering i lösningsmedel, inklusive etanol, dimetylsulfoxid (DMSO) och DMSO plus Tween 80 rekonstituerad i fysiologisk saltlösning (PS). Fullständig solubilisering av föreningen bestäms genom att observera lösningens färg, närvaron av utfällningar efter centrifugering (2000 x g i 30 s) eller låta lösningen stå i 2 timmar vid rumstemperatur (RT). Efter erhållande av en stabil förening/fytokemisk lösning kan den slutliga koncentrationen/mängden av den förening som krävs för in vivo-studier beredas i en lösningsmedelslösning (ingen PS) stamlösning och sedan spädas/blandas med PS efter önskemål. De antidiabetiska osteoporotiska effekterna av naringenin hos möss (intraperitoneal administrering vid 20 mg/kg kroppsvikt, 2 mg/ml) bedömdes genom mätning av blodsocker, benmassa (mikro-CT) och benresorptionshastighet (TRAP-färgning och ELISA). Forskare som letar efter detaljerade organiska / fytokemiska lösningspreparat kommer att dra nytta av denna teknik.
Introduction
Med ökande studier om användningen av fytokemiska föreningar för läkemedelsscreening är metoder för att förbereda fytokemiska lösningar för att utvärdera deras optimala effekter värda att uppmärksamma. Många aspekter såsom upplösningsmetodik, dosering och koncentration ska beaktas vid framställning av föreningen1.
Lösningsmedelsbaserad upplösning används ofta för organisk föreningsberedning1. De vanliga lösningsmedlen inkluderar vatten, olja, dimetylsulfoxid (DMSO), metanol, etanol, myrsyra, Tween, glycerin, etc2. Även om en suspension med oupplösta ämnen är acceptabel när föreningen administreras genom magsond, är ett helt upplöst löst ämne avgörande för intravenös administrering. Eftersom oljelösning, suspension och emulsion kan orsaka kapillärembolier föreslås en vattenhaltig lösning för sammansatt beredning, speciellt vid administrering av intravenösa, intramuskulära och intraperitoneala injektioner3.
Det effektiva dosintervallet varierar mellan föreningar och även bland sjukdomar som behandlas med samma förening. Bestämningar av den effektiva och säkra dosen och koncentrationen är beroende av litteratur och preliminära experiment4. Här demonstreras beredningen av föreningen naringenin som ett exempel.
Naringenin (4,5,7-trihydroxi-flavanon), en polyfenolförening, har studerats i sjukdomsbehandling för dess leverskyddande5, antidiabetika6, antiinflammatoriska7 och antioxidantaktiviteter8. För in vivo-applikationer används vanligtvis oral administrering av naringenin. Tidigare studier rapporterade beredning av naringeninlösning i 0,5%-1% karboximetylcellulosa, 0,5% metylcellulosados, 0,01% DMSO och fysiologisk saltlösning (PS) vid 50-100 mg/kg, administrerad genom oral sondmatning 9,10,11,12. Förutom, andra studier har rapporterat komplettera naringenin med chow på 3% (wt/wt) för oralt intag vid en dos av 3.6 g/kg/d13,14. Studier har också rapporterat att använda etanol (0.5% v / v), PS, och DMSO för att lösa naringenin för intraperitoneal injektion vid 10-50 mg/kg15,16,17,18. I en studie av temporallobsepilepsi fick möss en injektion av naringenin suspenderad i 0,25% karboximetylcellulosa upplöst i PS19. Även om dessa studier rapporterar användningen av olika lösningsmedel för att förbereda naringeninlösningar, har ytterligare detaljer, såsom upplösningsstatus och djurrespons, inte rapporterats.
Detta protokoll introducerar ett förfarande för beredning av naringeninlösning för in vivo-applicering vid diabetikerinducerad osteoporos. Beredningen av injektionslösningen innefattar beredning av lösningsmedel och föreningar, doseringsuppskattning, upplösningsprocess och filtrering. Dosen bestämdes baserat på litteraturforskning och preliminära experiment genom att övervaka möss efter administrering av injektioner varje dag i 3 dagar och modifiera dosen enligt musbeteenden. Den slutliga valda koncentrationen (20 mg/kg kroppsvikt) administrerades intraperitonealt 5 dagar per vecka i 8 veckor i en fettrik diet och streptozotocin (STZ)-inducerade diabetiska möss20,21. Effekterna av naringenin vid diabetisk osteoporos utvärderades genom blodsockertestning, mikro-CT, tartratresistent syrafosfatas (TRAP) färgning och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA).
Sammantaget observerades att naringenin vid ett koncentrationsintervall på 40-400 mg / ml inte helt löstes upp i varken etanol eller DMSO eller 5% (etanol eller DMSO) plus 95% PS (v / v). Naringenin upplöstes emellertid helt i en blandning av 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 och 92,96% PS. Det detaljerade förfarandet hjälper forskare att förbereda föreningen som en injektionslösning för in vivo-applicering .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beskrivna undersökningarna överensstämde med riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur från National Research Council och godkändes av Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. När du utför experimenten krävs labbrockar, engångshandskar av nitril och skyddsglasögon av säkerhetsskäl.
1. Beredning av lösningsmedel och uppskattning av naringenin som krävs för applicering in vivo
- Förbered följande lösningsmedel: Tween-80 (slutligt koncentrationsintervall: 0,5% -1%), DMSO, glycerin (slutligt koncentrationsintervall: 15% -20%), etanol (slutligt koncentrationsintervall: 12% för intramuskulär injektion)22 och 0,9% PS.
- Uppskatta mängden naringenin som krävs baserat på dos, antal möss och injektionsfrekvens.
- Beställ 10 möss (C57BL/6, hane, 5 veckor gamla, SPF) för att administrera naringenin 5 dagar i veckan i 8 veckor. Håll möss i specifika patogenfria (SPF) förhållanden.
OBS: Den dos som krävs för intraperitoneal injektion är 20 mg/kg b.w.23. - Väg 160 mg naringenin baserat på följande beräkning: 20 mg/kg x 0,02 kg/mus x 10 möss x 5 dagar/vecka x 8 veckor = 160 mg.
- Beställ 10 möss (C57BL/6, hane, 5 veckor gamla, SPF) för att administrera naringenin 5 dagar i veckan i 8 veckor. Håll möss i specifika patogenfria (SPF) förhållanden.
- Beräkna koncentrationen av naringenin som ska injiceras in vivo.
- Förbered den rekommenderade volymen baserat på mössens kroppsvikt. Den rekommenderade volymen naringenin som appliceras på varje mus är 1% kroppsvikt (0,3 ml). I detta experiment användes 0,2 ml per mus.
- Beräkna den totala volymen: 0,2 ml per mus x 10 möss x 5 dagar/vecka x 8 veckor = 80 ml.
- Beräkna koncentrationen av Naringenin i lager: 160 mg/80 ml lösningsmedel = 2 mg/ml.
- Beräkna volymen för varje dag: 0,2 ml per mus x 10 möss = 2 ml.
2. Upplösning
- Etanollösning
- För att bereda naringeninlösning vid 2 mg/ml, väg 3,52 mg naringenin och tillsätt den i ett 2,0 ml rör.
OBS: För att uppnå en koncentration på 2 mg / ml kommer den totala volymen som krävs att vara 1760 μL (beräkning: 3,52 mg / 1760 μL = 2 mg / ml). - Snurra snabbt ner (2000 x g i 30 s) för att få naringeninpulvret att sätta sig i botten av röret (figur 1A).
- Tillsätt 8,8 μl 100% etanol till röret för att bereda en 0,5% (v / v) lösning med avseende på den totala volymensom krävs 2. Naringenin upplöses inte helt (figur 1B).
- Fortsätt att tillsätta 79,2 μl 100% etanol till röret för att bereda en 5% (v / v) lösning med avseende på den totala volymen som krävs (beräkning: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin upplöses inte helt (figur 1B).
- Tillsätt 1672 μl 0,9 % PS till röret som innehåller 5 % etanol enligt beskrivningen i steg 2.1.4. Detta kommer att producera en emulsion (figur 1D). Centrifugera (2000 x g i 30 s) lösningen för att kontrollera om naringenin är helt upplöst i lösningen. Vita utfällningar av oupplöst naringenin visas i lösningen (figur 1E).
- För att bereda naringeninlösning vid 2 mg/ml, väg 3,52 mg naringenin och tillsätt den i ett 2,0 ml rör.
- DMSO-lösning
- För att bereda naringeninlösning vid 2 mg/ml, väg 3,95 mg naringenin och tillsätt i ett 2,0 ml rör.
OBS: För att uppnå en koncentration på 2 mg/ml kommer den totala volym som krävs att vara 1975 μL (beräkning: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml). - Snurra snabbt ner (2000 x g i 30 s) för att få naringeninpulvret att sätta sig i botten av röret.
- Tillsätt 9,8 μL DMSO till röret för att bereda en 0,5% (v / v) lösning (beräkning: 9,8 μl / 1975 μL x 100% = 5%). Naringenin upplöses helt (figur 2A).
- Tillsätt 88,2 μl DMSO till röret för att bereda en 5% (v / v) lösning med avseende på den totala volymen som krävs (beräkning: (88,2 μL + 9,8 μL) / 1975 μL x 100% = 5%). Naringenin upplöses helt (figur 2B).
- Tillsätt 1877 μl 0,9 % PS (v/v procent 95 %) till den lösning som bereds i steg 2.2.4. En emulsion produceras (figur 1C). Centrifugera (2000 x g i 30 s) lösningen för att kontrollera om naringenin är helt upplöst i lösningen. Vita utfällningar av oupplöst naringenin visas i lösningen (figur 1D).
- För att bereda naringeninlösning vid 2 mg/ml, väg 3,95 mg naringenin och tillsätt i ett 2,0 ml rör.
- Tween-80 och DMSO-lösning
- För att bereda naringeninlösningen vid 2 mg/ml, väg 6,69 mg naringenin och tillsätt i ett 5,0 ml rör.
OBS: För att uppnå den slutliga koncentrationen på 2 mg / ml kommer den totala lösningsvolymen som krävs att vara 3345 μL (beräkning: 6,69 mg / 3345 μL = 2 mg / ml). - Snurra snabbt ner (2000 x g i 30 s) för att få naringeninpulvret att sätta sig i botten av röret.
- Tillsätt 117,7 μl DMSO för att bereda en 3,5% (v / v) lösning med avseende på den totala volymen som krävs (beräkning: 117,7 μL / 3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin upplöses helt (figur 3A)
- Tillsätt 117,7 μl Tween 80 till den lösning som beretts i steg 2.3.3 för att uppnå 3,5 % (v/v) Tween 80 och 3,5 % (v/v) DMSO. Observera fullständig upplösning av naringenin (figur 3B)
- Tillsätt långsamt den lösning som beretts i steg 2.3.4 till ett 5,0 ml rör innehållande 3109,6 μl 0,9 % PS (v/v procent 93 %) och skaka väl för att få en skenbar naringeninlösning (figur 3C).
- Låt den lösning som beretts i steg 2.3.5 stanna vid rumstemperatur (RT) i 2 timmar. Lösningen är fortfarande synlig utan några synliga fällningar (figur 3D).
- För att bereda naringeninlösningen vid 2 mg/ml, väg 6,69 mg naringenin och tillsätt i ett 5,0 ml rör.
- Beredning av naringeninlösning för in vivo-administrering
- Enligt steg 1.2.2, väg 160 mg naringenin (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
- Tillsätt 2,8 ml DMSO för att uppnå 3,5% (v / v) lösning (beräkning: 2,8 ml / 80 ml x 100% = 3,5%)
- Tillsätt sedan 2,8 ml Tween 80 till lösningen som beretts i steg 2.4.2 för att uppnå 3,5 % (v/v) Tween 80 och 3,5 % (v/v) DMSO.
- Alikvotera lösningen beredd i steg 2.4.3 i fyra rör, 1,4 ml per rör [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
- Alikvot 18,6 ml 0,9% PS till fem 15 ml rör.
- Förvara lösningen i steg 2.4.3 (stamlösning) och 2.4.5 vid 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
- Ta 140 μl av stamlösningen (steg 2.4.3) och blanda den med 1860 μl 0,9 % PS för att bereda 2 ml naringeninlösning under 1 dags administrering.
- Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter.
3. Administrering av Naringenin-lösning
- Hantering och fasthållning
- Spraya buret och händerna med 70-75% alkohol innan du öppnar locket. Lyft musen vid svansens botten och placera den på en fast yta för att placera svansen försiktigt bakåt.
- Ta tag i nacken bakom öronen med vänster tumme och pekfinger och placera svansen mellan lill- och ringfingret. Håll musen i en bakre position med den bakre änden något förhöjd.
- Injektion
- Ta tag i musens bakre hud så att bukhuden är spänd.
- Tryck in nålen (insulinsprutan) i en vinkel på 10° mellan nålen och bukytan, i nedre högra eller vänstra kvadranten i buken för att undvika att träffa urinblåsan, levern eller andra inre organ.
- Kör nålen subkutant i kranialriktning i 3-5 mm och sätt sedan in den i 45° vinkel i bukhålan.
- När nålen passerar genom bukväggen och motståndet försvinner, utför en aspiration för att bekräfta att inget återflödesmaterial dras tillbaka. Tryck sedan långsamt på lösningen.
- Efter injektionen drar du långsamt ut nålen och roterar den något för att förhindra läckage. Den rekommenderade volymen är 50-100 μL/10 g.
- Kassera överblivna Naringenin i en biohazardbehållare.
4. Blodsockertest
OBS: Testa blodsockret 1 dag före injektionen och 1 och 2 månader efter injektionen.
- Snabba mössen i 15 timmar före blodsockertestet. Vatten kan fortsätta att tillhandahållas.
- Öppna testremsorna och markera datumet. När du har öppnat, använd testremsorna inom 3 månader. Förvara testremsorna vid 2–30 °C. Stäng locket ordentligt efter att du har tagit bort remsan för att förhindra fuktbildning.
- Placera djuret i induktionskammaren. Slå på förångaren vid en induktionsnivå på 4% för isofluran och 4 L/min för syre. Efter att djuret är helt bedövat, behåll bedövningsmedlet med näskonen och bedövningstillförseln på en nivå av 1,5% för isofluran och 0,4 L / min för syre.
- Torka av svansen med bomullstussar/pinnar indränkta i 70%-75% alkohol.
- Börja från den lägsta punkten i svansen, gör en liten punktering på den laterala svansvenen med en 25G nålstick och pressa ut en droppe blod.
- Torka av bloddroppen med ett silkespapper.
- Pressa ut en annan droppe blod och samla den på kanten av en testremsa.
- Läs och registrera resultatet som visas på glukosmätaren.
- För att stoppa blödningen, kläm musens svans med en steril gasbindning och torka av området med 75% alkohol.
- Ytterligare prover kan erhållas genom en liknande teknik som rör sig uppåt i svanskraniellen.
5. TRAP-färgning
- Förberedelse av bilder
- Utför fasta blodsockertester på mössen en gång i veckan. När blodsockernivån är ≥ 11,1 mmol / L (indikerar framgångsrika typ II-diabetesmöss modell 24), avliva mössen med CO2, följt av cervikal dislokation, och samla ländryggen 4: e-6:e (L4-L6) (ingen eutanasi utförs under fastande blodsockertest).
- Fixa L4-L6-proverna med 4% paraformaldehyd i 24 timmar (se till att volymen paraformaldehyd är >20x volymen av vävnaden) och tvätta sedan i 2 timmar i kontinuerligt flöde av kranvatten.
- För att avkalka proverna, sänk ner dem i en 10% etylendiamintetraättiksyralösning (EDTA) i 2 veckor vid RT i statiskt tillstånd tills proverna mjukas upp. Se till att volymen på avkalkningslösningen är 20-30 gånger volymen på vävnaden/provet. Byt EDTA-lösning varannan dag.
- Dehydrera provet med hjälp av en dehydrator.
- Placera proverna i vävnadsbehandlingsinbäddningskassetter. Numrera kassetten med en penna.
- Ställ in dehydratorprogrammet enligt följande: 75% alkohol i 2 h, 85% alkohol i 1 timme, 95% alkohol i 1 timme, 95% alkohol i 2 timmar, vattenfri etanol (I) i 2 timmar, vattenfri etanol (II) i 2 timmar, vattenfri etanol (III) i 2 h, xylen (I) i 1 h, xylen (II) i 1 timme, xylen (III) i 1 h, paraffinvax (I) i 2 timmar och paraffinvax (II) i 2 timmar vid RT.
- Bädda in proverna i paraffinvax.
- Tillsätt paraffinvax i kassettfacket på paraffinbäddningsstationen och värm till 60 °C. Sänk ner de uttorkade proverna i minst 2 timmar.
- Placera vävnadskassetten i kassettfacket och förvärm det.
- Tillsätt paraffinvax i paraffinbehållaren och värm till 60 °C.
- Efter 2 h, ta både vävnadskasett och prover till arbetsområdet. Häll det förvärmda paraffinvaxet från paraffinbehållaren i vävnadskassetten. Placera provet i paraffinvaxet, se till att paraffinvaxet täcker vävnaden helt och flytta sedan omedelbart kassetten till en isbildningsstation.
- Använd en mikrotom för att skära de paraffinbäddade proverna i 5-6 μm sektioner. Vik ut sektionerna i 40 °C varmt vatten i mindre än 10 s. Samla sektionerna på APS (amino silane) belagda glasskivor. Torka bilderna vid RT i 1 timme och flytta sedan bilderna till en ugn som är inställd på 60 °C över natten.
- Beredning av TRAP-reagens
- Bered basstaminkubationslösning: Lös upp 9,2 g vattenfritt natriumacetat, 11,4 g L-(+) vinsyra och 2,8 ml isättningssyra i 1000 ml destillerat vatten. Justera pH till 4,7-5,0 och förvara vid RT i upp till 6 månader.
- Förbered naftoleterlösning: Lös upp 0,1 g naftol AS-BI-fosfat i 5 ml etylenglykolmonoetyleter. Förvaras vid 4 °C i upp till 5 veckor.
- Förbered natriumnitritlösning: Lös upp 1 g natriumnitrit i 25 ml destillerat vatten. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered pararosanilinfärgämne: Tillsätt 1 g pararosanilinbas till 20 ml 2N HCl (83 ml HCl i 417 ml vatten). Använd en omrörningsplatta för att lösa upp basen och filtrera den före användning.
- TRAP färgning
- Fyll två Coplinburkar med 50 ml basstaminkubationslösning och placera i en 37 °C ugn i 2 timmar.
- Ta en Coplin-burk och tillsätt 0,5 ml naprateterlösning.
- Placera objektglasen i Coplinburken och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
OBS: Förbered minst tre bilder för varje grupp. - Några minuter innan inkubationstiden är över, tillsätt 1 ml natriumnitritlösning och 1 ml pararosanilinfärgämne. Blanda försiktigt i 30 s och låt det stå i 2 min.
- Tillsätt den lösning som beretts i steg 5.2.2 till den andra förvärmda Coplinburken som innehåller basstamlösningen. Blanda lösningen väl och sätt in bilderna från Coplin-burken i steg 5.3.3.
- Inkubera i 15-20 min vid RT.
- Skölj skivorna i en annan Coplin-burk med 200 ml PBS i 5 minuter.
- Motfläcka skivorna med 100% hematoxylin i 30 s i en Coplin-burk.
- Torka ut skivorna med 85%, 95% och 100% alkohol (200 ml) i 2 min vardera och behandla i xylen (200 ml) i 2 min i 3x. Använd Coplin-burkar för att utföra varje steg.
- Säkra sektionen på täckglaset med en täckglas med harts. Se till att undvika att luftbubblor fastnar.
6. ELISA
- Beredning av prov
- Ta bort mjuka vävnader från lårbenet och skenbenet på musen. Rengör benen med gasväv.
- Placera benproverna i ett 1 ml mikrocentrifugrör och förvara provrören vid -80 °C.
OBS: Proverna kan också förvaras i en flytande kvävetank i högst 6 månader. - Väg benprovet. Späd med 0,9% PS i förhållandet 1:10. Späd till exempel 0,1 g ben med 1 ml PS.
- Tillsätt 3 mm zirkoniumoxidpärlor i röret och slipa proverna 3x vid 70 Hz i 30 s med 20 s vila däremellan.
- Centrifugera proverna vid 4 °C och 12 000 x g i 5 minuter. Samla supernatanten.
- ELISA-analyssats
OBS: Utför ELISA enligt analysprotokollet som anges av tillverkaren.- Tillsätt 100 μl av varje utspädning av standard, blindprov och prov i lämpliga brunnar. Inkubera i 90 minuter vid 37 °C.
- Dekantera vätskan från varje brunn och tillsätt 100 μL biotinylerad detektionsantikroppsarbetslösning. Inkubera i 1 timme vid 37 °C.
- Dekantera lösningen, tillsätt 350 μL tvättbuffert till varje brunn. Blötlägg i 1 min, upprepa 3x.
- Tillsätt 100 μL HRP-konjugatarbetslösning till varje brunn. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Dekantera lösningen. Upprepa tvättprocessen 5x enligt beskrivningen i steg 6.2.3.
- Tillsätt 90 μl av substratreagensen. Inkubera i 15 minuter vid 37 °C skyddad mot ljus.
- Tillsätt 50 μl av stopplösningen.
- Använd en plattläsare för att registrera absorbansen för varje brunn vid 450 nm.
- Standard kurva generering
- Plotta respektive genomsnittliga absorbansvärden mot de seriellt utspädda proteinkoncentrationerna.
- Gå med i punkterna för att skapa den bästa passformskurvan. Använd ett lämpligt datorprogram (kalkylblad) för att generera standardkurvekvationen.
- Ersätt absorbansvärdet för varje prov i standardkurvekvationen för att erhålla koncentrationen av respektive prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kroppsvikten hos de fettrika dietmatade och STZ-inducerade diabetesmössen visade sig minska jämfört med kontrollgruppernas från 0-8 veckor efter STZ-behandling. Viktminskningen av naringeninbehandlade möss var signifikant jämfört med de obehandlade mössen (STZ-gruppen) vid vecka 4. Kontroll- och STZ-grupperna administrerades med samma volym PS (tabell 1). Blodsockernivån hos diabetiska möss ökade dramatiskt inom 1 månad efter STZ-induktion. Den minskade sedan automatiskt till en nivå som observerades för 2 månader sedan när djurmodellen etablerades. Naringeninbehandling sänkte blodsockernivån med 51,8% och 34,8% vid 1 respektive 2 månader (tabell 2). STZ-inducerade diabetiska möss uppvisade benförlust, vilket indikeras av minskningen av benvolymen/vävnadsvolymen (BV/TV) (30,97%) respektive antalet trabeculae (Tb.N) (11,4%). Förändringarna i värdena för dessa två parametrar tyder på att naringeninbehandling signifikant räddade benförlusten (tabell 3). Osteoklastaktivitet som indikeras av N.oc/Tb.Ar (osteoklastantal per trabekulärt benområde) ökade i fettrik kost och STZ-inducerade diabetiska möss, även om ingen statistisk signifikans observerades mellan kontroll- och sjukdomsmodellerna. Naringeninbehandling minskade signifikant osteoklastaktiviteter, vilket visas i figur 4 och tabell 4. Den C-terminala telopeptiden av typ I-kollagen (CTIX) och N-terminal propeptid av typ I-prokollagen (PINP) förhöjdes med 68,09% respektive 204,88% hos diabetiska djur, vilket indikerar en dramatisk ökning av benresorptionshastigheten. Naringenin minskade signifikant båda indikatorerna för benresorptionshastigheten (tabell 5).
Figur 1: Upplösning av naringenin i etanol . (A) Naringeninpulver i röret efter nedspinn. B) Naringenin + etanol (400 mg/ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μl etanol). (C) Naringenin + etanol (40 mg / ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μl etanol) (D) Naringenin i 5% (v / v) etanol och 95% PS (0,9%). (E) Fälls ut i D efter nedspinning. (F) Mätning för att erhålla skalstreck för figur 1, figur 2 och figur 3. Nar: Naringenin. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Upplösning av naringenin i DMSO. (A) Naringenin + DMSO (400 mg/ml - 3,95 mg naringenin i 9,8 μl DMSO). (B) Naringenin + DMSO (40 mg / ml- 3,95 mg naringenin i 98 μl DMSO). (C) Naringenin i 5% (v / v) DMSO och 95% PS (0,9%). (D) Fälls ut i C efter nedspinning. Nar: Naringenin. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Upplösning av naringenin i DMSO och Tween 80. (A) Naringenin + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μl DMSO). (B) Naringenin + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μl DMSO och 117,7 μL Tween 80). (C) Naringenin i blandningen av 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 och 93% PS (0,9%). (D) Inga fällningar i C efter nedspinning. Nar: Naringenin. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekten av naringenin på osteoklastaktiviteten hos de fettrika dietmatade och STZ-injicerade (STZ) mössen. TRAP-färgning av trabekulärt ben och osteoklaster av L4-ryggkotor. Trianglar indikerade osteoklaster. Skalstreck = 100 μm. Denna siffra har modifierats från Liu et al.25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| g) | 0 vecka | 1 vecka | 2 veckor | 4 veckor | 5 veckor | 6 veckor | 8 veckor |
| Kontroll | 23.7 ± 0,2 | 25.1 ± 1.3 | 26.2 ± 1.0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32.7 ± 1.3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18.2 ± 2.5** | 18,6 ± 2,5** | 18.2 ± 1.4** | 21.3 ± 1.6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16.6 ± 1.1** | 17,6 ± 1,5** | 17.4 ± 1.7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 jämfört med kontroll | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ | |||||||
Tabell 1: Kroppsvikt hos fettrika och STZ-injicerade (STZ) möss i olika grupper och perioder. Data visas som medelvärdet ± s.d. ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 månad | 1 månad | 2 månader |
| Kontroll | 4.9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12.8 ± 4.2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13.2 ± 3.5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 jämfört med kontroll | |||
| ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ | |||
Tabell 2: Fastande blodsocker hos STZ-möss över grupper och perioder. Data visas som medelvärdet ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Kontroll | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 jämfört med kontroll | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ | ||
Tabell 3: Benmassarelaterade parametrar för STZ-möss i olika grupper. Data visas som medelvärdet ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Kontroll | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringenin | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ | |
Tabell 4: Osteoklastaktivitet hos STZ-möss i olika grupper. Data visas som medelvärdet ± s.d. ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ.
| ng/ml | CTIX | PINP |
| Kontroll | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 jämfört med kontroll | ||
| ΔΔ p < 0,01 jämfört med STZ | ||
Tabell 5: Benresorptionshastighet för STZ-möss över grupper. Data visas som medelvärdet ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beredningen av fytokemisk lösning är grunden för dess applicering in vivo. I detta protokoll demonstrerades beredningen av naringeninlösning genom att använda olika lösningsmedel, såsom etanol, DMSO, Tween 80 och 0,9% PS. Lösningen i helt upplöst status måste övervakas ytterligare genom att låta den förbli vid rumstemperatur under några längre timmar och sedan filtreras innan den används in vivo.
Bestämning av lösningsmedel är ett kritiskt steg i detta protokoll. Det finns många lösningsmedelsalternativ för upplösning av föreningar, varav etanol, DMSO och PS är de mest använda. Etanol kan lösa upp många vattenolösliga föreningar på grund av dess mycket polära egenskaper, vilket möjliggör vätebindning och därmed löser upp både polära och icke-polära ämnen. Dessutom kan koncentrationen av etanol bestämma egenskaperna hos den fytokemiska föreningen. Till exempel anses 75 vikt% etanol / vattenlösningsmedel vara det bästa för att extrahera det högsta utbytet av polyfenoler och har de starkaste antioxidantegenskaperna26. En annan studie visade att etanolkoncentrationen kunde sänkas till 32.5% vid 150 ° C för polyfenol extrakt för att uttrycka antioxidant egenskap27. En hög koncentration av etanol kan dock orsaka neurotoxicitet och levertoxicitet28. Etanolinjektion (i.p.) i ett koncentrationsintervall från 8%-32% v/v används ofta för beteendeutvärdering och kan orsaka villkorlig smakaversion och hypotermi29. DMSO är ett dipolärt aprotiskt lösningsmedel med hög polaritet och används som lösningsmedel för att lösa upp många organiska föreningar. En jämförande studie visade att DMSO/metanol (50:50 v/v) resulterade i optimal utbyte av fenolsyror i citrusskal30. Dos, koncentration och frekvens är dock inte okunniga faktorer när DMSO levereras till djur. En dos på 17,7 g/kg som gavs intraperitonealt till möss uppnådde LD50 samtidigt som dosen sänktes till 2,5 g/kg i 6 veckor hos möss orsakade inte observerbara biverkningar31. Även om den föreslagna DMSO-koncentrationen är 0,5% -5%, kan DMSO inte lösa upp många föreningar. testade effekterna av DMSO och DMSO-innehållande saltlösning vid olika koncentrationer genom intracerebroventrikulär och oral administrering hos möss. Studien visade att en lösning av 25% DMSO i saltlösning inte förändrade djurens beteendemässiga svar32. Tween 80 är ett icke-joniskt ytaktivt medel och används ofta som ett co-lösningsmedel för att öka lösligheten hos dåligt lösliga läkemedel och förbättra farmakokinetiska egenskaper33. En koncentration på 1% Tween 80 valdes med tanke på säkerhet33. Således användes ovanstående lösningsmedel och ytaktiva ämnen i olika koncentrationer för att fullständigt solubilisera naringenin för intraperitoneal administrering.
Några förslag listas här för övervägande. Först föreslår vi att man börjar från en liten mängd fytokemisk förening för preliminära experiment med tanke på konsumtionskostnaden. För det andra är det nödvändigt att utföra omfattande litteraturforskning, särskilt nära studier om djurarter, sjukdomar, administreringsvägar och frekvens, innan lösningen förbereds. För det tredje är koncentrationsintervallen för lösningsmedel och co-lösningsmedel, såsom ytaktiva ämnen, beroende av tillgänglig litteratur, preliminära experiment och syftet med studiedesignen. För det fjärde rekommenderas användning av en insulinspruta istället för en vanlig spruta för att minska injektionsskadan från en relativt hög administreringsfrekvens. För det femte, för att upprätthålla sterila förhållanden, rekommenderas att sterilisera lösningen med ett 0,2 μm filter och använda sterila sprutor och bomullspinne som blötläggs i alkohol vid injektion av lösningen i levande djur.
Fördelarna med protokollet är dess enkla drift och låga kostnader. Sammanfattningsvis visar protokollet beredningen av en fytokemisk lösning för intraperitoneal administrering hos möss, med naringenin som exempel. Protokollet kommer att gynna forskarna som arbetar med läkemedelsscreening eller farmakologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81973607 och 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
- van Thriel, C.
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
