Summary
Ici, le protocole présente la préparation de la solution de naringénine pour l’administration intrapéritonéale in vivo . La naringénine est complètement dissoute dans un mélange de diméthylsulfoxyde, de Tween 80 et de solution saline. Les effets ostéoporotiques antidiabétiques de la naringénine ont été évalués par des tests de glycémie, une coloration de la phosphatase acide résistante au tartrate et un dosage immuno-enzymatique.
Abstract
La préparation d’une solution composée (phytochimique) est une étape négligée mais critique avant son application dans des études telles que le dépistage de médicaments. La solubilisation complète du composé est nécessaire pour son utilisation sûre et des résultats relativement stables. Ici, un protocole pour la préparation de la solution de naringénine et son administration intrapéritonéale dans un régime riche en graisses et un modèle diabétique induit par la streptozotocine (STZ) est démontré à titre d’exemple. Une petite quantité de naringénine (3,52-6,69 mg) a été utilisée pour tester sa solubilisation dans des solvants, y compris l’éthanol, le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le DMSO plus Tween 80 reconstitué dans une solution saline physiologique (PS), respectivement. La solubilisation complète du composé est déterminée en observant la couleur de la solution, la présence de précipités après centrifugation (2000 x g pendant 30 s), ou en laissant la solution reposer pendant 2 h à température ambiante (RT). Après avoir obtenu une solution composée/phytochimique stable, la concentration/quantité finale du composé requise pour les études in vivo peut être préparée dans une solution mère contenant uniquement du solvant (sans PS), puis diluée/mélangée avec du PS selon les besoins. Les effets ostéoporotiques antidiabétiques de la naringénine chez la souris (administration intrapéritonéale à 20 mg/kg de poids corporel, 2 mg/mL) ont été évalués en mesurant la glycémie, la masse osseuse (micro-TDM) et le taux de résorption osseuse (coloration TRAP et ELISA). Les chercheurs à la recherche de préparations détaillées de solutions organiques/phytochimiques bénéficieront de cette technique.
Introduction
Avec l’augmentation des études concernant l’utilisation de composés phytochimiques pour le dépistage de médicaments, les approches visant à préparer des solutions phytochimiques pour évaluer leurs effets optimaux méritent une attention particulière. De nombreux aspects tels que la méthodologie de dissolution, la posologie et la concentration doivent être pris en compte lors de la préparation du composé1.
La dissolution à base de solvant est largement utilisée pour la préparation de composés organiques1. Les solvants couramment utilisés comprennent l’eau, l’huile, le diméthylsulfoxyde (DMSO), le méthanol, l’éthanol, l’acide formique, le Tween, la glycérine, etc.2. Bien qu’une suspension avec des substances non dissoutes soit acceptable lorsque le composé est administré par gavage gastrique, un soluté entièrement dissous est essentiel pour l’administration intraveineuse. Étant donné que la solution d’huile, la suspension et l’émulsion peuvent provoquer des embolies capillaires, une solution aqueuse pour la préparation de composés est suggérée, en particulier lors de l’administration d’injections intraveineuses, intramusculaires et intrapéritonéales3.
La gamme de doses efficaces varie selon les composés et même entre les maladies traitées avec le même composé. La détermination de la dose efficace et sûre et de la concentration dépend de la littérature et des expériences préliminaires4. Ici, la préparation du composé naringénine est démontrée à titre d’exemple.
La naringénine (4,5,7-trihydroxy-flavanone), un composé polyphénolique, a été étudiée dans le traitement de la maladie pour ses activités hépatoprotectrices5, antidiabétiques6, anti-inflammatoires7 et anti-oxydantes8. Pour les applications in vivo, l’administration orale de naringénine est couramment utilisée. Des études antérieures ont rapporté la préparation d’une solution de naringénine dans 0,5% -1% de carboxyméthylcellulose, une dose de méthylcellulose à 0,5%, 0,01% de DMSO et une solution saline physiologique (PS) à 50-100 mg / kg, administrée par gavage oral 9,10,11,12. En outre, d’autres études ont rapporté une supplémentation en naringénine avec du chow à 3% (poids / poids) pour une prise orale à une dose de 3,6 g / kg / j13,14. Des études ont également rapporté l’utilisation d’éthanol (0,5% v/v), de PS et de DMSO pour dissoudre la naringénine pour injection intrapéritonéale à raison de 10-50 mg / kg15,16,17,18. Dans une étude de l’épilepsie du lobe temporal, des souris ont reçu une injection de naringénine en suspension dans 0,25% de carboxyméthylcellulose dissoute dans PS19. Bien que ces études rapportent l’utilisation de différents solvants pour préparer des solutions de naringénine, d’autres détails, tels que le statut de dissolution et la réponse animale, n’ont pas été rapportés.
Ce protocole introduit une procédure de préparation de la solution de naringénine pour application in vivo dans l’ostéoporose induite par le diabète. La préparation de la solution injectable comprend la préparation des solvants et des composés, l’estimation du dosage, le processus de dissolution et la filtration. La posologie a été déterminée sur la base de recherches documentaires et d’expériences préliminaires en surveillant les souris après avoir administré des injections tous les jours pendant 3 jours et en modifiant la posologie en fonction des comportements des souris. La concentration finale choisie (20 mg/kg de poids corporel) a été administrée par voie intrapéritonéale 5 jours par semaine pendant 8 semaines chez des souris diabétiques riches en graisses et induites par la streptozotocine (STZ)20,21. Les effets de la naringénine dans l’ostéoporose diabétique ont été évalués par des tests de glycémie, une micro-TDM, une coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et un test immuno-enzymatique (ELISA).
Dans l’ensemble, il a été observé que la naringénine à une plage de concentration de 40 à 400 mg/mL ne se dissolvait pas complètement dans l’éthanol ou le DMSO ou 5 % (éthanol ou DMSO) plus 95 % de PS (v/v). Cependant, la naringénine s’est complètement dissoute dans un mélange de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 et 92,96% de PS. La procédure détaillée aidera les chercheurs à préparer le composé en tant que solution d’injection pour une application in vivo .
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Protocol
Les enquêtes décrites étaient conformes aux Lignes directrices sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches du Canada et ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Lors de l’exécution des expériences, des blouses de laboratoire, des gants jetables en nitrile et des lunettes de protection sont nécessaires pour des raisons de sécurité.
1. Préparation des solvants et estimation de la naringénine requise pour l’application in vivo
- Préparer les solvants suivants : Tween-80 (plage de concentration finale : 0,5 %-1 %), DMSO, glycérine (plage de concentration finale : 15 %-20 %), éthanol (plage de concentration finale : 12 % pour l’injection intramusculaire)22 et 0,9 % PS.
- Estimez la quantité de naringénine nécessaire en fonction de la dose, du nombre de souris et de la fréquence d’injection.
- Commandez 10 souris (C57BL/6, mâle, 5 semaines, FPS) pour administrer la naringénine 5 jours par semaine pendant 8 semaines. Gardez les souris dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS).
NOTA : La dose requise pour l’injection intrapéritonéale est de 20 mg/kg de poids corporel23. - Peser 160 mg de naringénine selon le calcul suivant : 20 mg/kg x 0,02 kg/souris x 10 souris x 5 jours/semaine x 8 semaines = 160 mg.
- Commandez 10 souris (C57BL/6, mâle, 5 semaines, FPS) pour administrer la naringénine 5 jours par semaine pendant 8 semaines. Gardez les souris dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS).
- Calculer la concentration de naringénine à injecter in vivo.
- Préparez le volume recommandé en fonction du poids corporel des souris. Le volume recommandé de naringénine appliqué à chaque souris est de 1 % du poids corporel (0,3 mL). Dans cette expérience, 0,2 mL par souris a été utilisé.
- Calculer le volume total : 0,2 mL par souris x 10 souris x 5 jours/semaine x 8 semaines = 80 mL.
- Calculer la concentration de naringénine en stock : 160 mg/80 mL de solvants = 2 mg/mL.
- Calculez le volume pour chaque jour : 0,2 mL par souris x 10 souris = 2 mL.
2. Dissolution
- Solution d’éthanol
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 3,52 mg de naringénine et l’ajouter dans un tube de 2,0 mL.
REMARQUE : Pour atteindre une concentration de 2 mg/mL, le volume total requis sera de 1760 μL (calcul : 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/mL). - Filer rapidement vers le bas (2000 x g pendant 30 s) pour que la poudre de naringénine se dépose au fond du tube (Figure 1A).
- Ajouter 8,8 μL d’éthanol à 100 % dans le tube pour préparer une solution à 0,5 % (v/v) par rapport au volume total requis2. La naringénine ne se dissout pas complètement (Figure 1B).
- Continuer d’ajouter 79,2 μL d’éthanol à 100 % dans le tube pour préparer une solution à 5 % (v/v) par rapport au volume total requis (calcul : (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100 % = 5 %). La naringénine ne se dissout pas complètement (Figure 1B).
- Ajouter 1672 μL de 0,9 % PS dans le tube contenant 5 % d’éthanol comme décrit à l’étape 2.1.4. Cela produira une émulsion (Figure 1D). Centrifuger (2000 x g pendant 30 s) la solution pour vérifier si la naringénine est complètement dissoute dans la solution. Des précipités blancs de naringénine non dissoute apparaissent dans la solution (Figure 1E).
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 3,52 mg de naringénine et l’ajouter dans un tube de 2,0 mL.
- Solution DMSO
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 3,95 mg de naringénine et ajouter dans un tube de 2,0 mL.
REMARQUE : Pour atteindre une concentration de 2 mg/mL, le volume total requis sera de 1975 μL (calcul : 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/mL). - Filer rapidement vers le bas (2000 x g pendant 30 s) pour que la poudre de naringénine se dépose au fond du tube.
- Ajouter 9,8 μL de DMSO dans le tube pour préparer une solution à 0,5 % (v/v) (calcul : 9,8 μL/1975 μL x 100 % = 5 %). La naringénine se dissout complètement (Figure 2A).
- Ajouter 88,2 μL de DMSO dans le tube pour préparer une solution à 5 % (v/v) par rapport au volume total requis (calcul : (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100 % = 5 %). La naringénine se dissout complètement (Figure 2B).
- Ajouter 1877 μL de 0,9 % PS (v/v pour cent de 95 %) à la solution préparée à l’étape 2.2.4. Une émulsion est produite (Figure 1C). Centrifuger (2000 x g pendant 30 s) la solution pour vérifier si la naringénine est complètement dissoute dans la solution. Des précipités blancs de naringénine non dissoute apparaissent dans la solution (Figure 1D).
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 3,95 mg de naringénine et ajouter dans un tube de 2,0 mL.
- Tween-80 et solution DMSO
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 6,69 mg de naringénine et ajouter dans un tube de 5,0 mL.
REMARQUE : Pour atteindre la concentration finale de 2 mg/mL, le volume total de solution requis sera de 3345 μL (calcul : 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/mL). - Filer rapidement vers le bas (2000 x g pendant 30 s) pour que la poudre de naringénine se dépose au fond du tube.
- Ajouter 117,7 μL de DMSO pour préparer une solution à 3,5 % (v/v) par rapport au volume total requis (calcul : 117,7 μL/3345 μL x 100 % = 3,5 %). La naringénine se dissout complètement (Figure 3A)
- Ajouter 117,7 μL de Tween 80 à la solution préparée à l’étape 2.3.3 pour obtenir 3,5 % (v/v) de Tween 80 et 3,5 % (v/v) de DMSO. Observer la dissolution complète de la naringénine (Figure 3B)
- Ajouter lentement la solution préparée à l’étape 2.3.4 dans un tube de 5,0 mL contenant 3109,6 μL de 0,9 % PS (v/v % de 93 %) et bien agiter pour obtenir une solution apparente de naringénine (figure 3C).
- Laisser la solution préparée à l’étape 2.3.5 rester à température ambiante (RT) pendant 2 h. La solution est toujours apparente sans précipités visibles (Figure 3D).
- Pour préparer la solution de naringénine à 2 mg/mL, peser 6,69 mg de naringénine et ajouter dans un tube de 5,0 mL.
- Préparation de la solution de naringénine pour administration in vivo
- Selon l’étape 1.2.2, peser 160 mg de naringénine (160 mg / 2 mg / mL = 80 mL).
- Ajouter 2,8 mL de DMSO pour obtenir une solution à 3,5 % (v/v) (calcul : 2,8 mL / 80 mL x 100 % = 3,5 %)
- Ensuite, ajouter 2,8 mL de Tween 80 à la solution préparée à l’étape 2.4.2 pour obtenir 3,5 % (v/v) Tween 80 et 3,5 % (v/v) DMSO.
- Aliquote : solution préparée à l’étape 2.4.3 en quatre tubes, 1,4 mL par tube [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].
- Aliquote 18,6 mL de 0,9 % PS à cinq tubes de 15 mL.
- Conserver la solution préparée aux étapes 2.4.3 (solution mère) et 2.4.5 à 4 °C (2,8 mL + 2,8 mL + 18,6 mL x 4 = 80 mL).
- Prélever 140 μL de la solution mère (étape 2.4.3) et la mélanger avec 1860 μL de PS à 0,9 % pour préparer 2 mL de solution de naringénine pour 1 jour d’administration.
- Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm.
3. Administration de la solution de naringénine
- Manutention et contention
- Vaporisez la cage et les mains avec 70-75% d’alcool avant d’ouvrir le couvercle. Soulevez la souris par la base de la queue et placez-la sur une surface solide pour positionner doucement sa queue en arrière.
- Saisissez la peau du cou derrière les oreilles avec le pouce gauche et l’index et placez la queue entre le petit et l’annulaire. Gardez la souris en décubitus dorsal avec son extrémité postérieure légèrement surélevée.
- Injection
- Saisissez la peau arrière de la souris afin que la peau abdominale soit tendue.
- Poussez l’aiguille (seringue à insuline) à un angle de 10° entre l’aiguille et la surface abdominale, dans le quadrant inférieur droit ou gauche de l’abdomen pour éviter de frapper la vessie, le foie ou d’autres organes internes.
- Faites passer l’aiguille par voie sous-cutanée dans une direction crânienne sur 3-5 mm, puis insérez-la à un angle de 45 ° dans la cavité abdominale.
- Lorsque l’aiguille traverse la paroi abdominale et que la résistance disparaît, effectuez une aspiration pour confirmer qu’aucun matériau de reflux n’est retiré. Ensuite, poussez lentement la solution.
- Après l’injection, retirez lentement l’aiguille et tournez-la légèrement pour éviter les fuites. Le volume recommandé est de 50 à 100 μL/10 g.
- Jetez les restes de naringénine dans un contenant présentant un risque biologique.
4. Test de glycémie
REMARQUE: Testez la glycémie 1 jour avant l’injection et 1 et 2 mois après l’injection.
- Jeûnez les souris pendant 15 heures avant le test de glycémie. L’eau peut continuer à être fournie.
- Ouvrez les bandelettes de test et marquez la date. Une fois ouverts, utilisez les bandelettes de test dans les 3 mois. Conserver les bandelettes réactives entre 2 et 30 °C. Fermez hermétiquement le couvercle après avoir retiré la bande pour éviter la formation d’humidité.
- Placez l’animal dans la chambre d’induction. Allumez le vaporisateur à un niveau d’induction de 4% pour l’isoflurane et de 4 L/min pour l’oxygène. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, maintenir l’anesthésique avec le cône nasal et l’administration de l’anesthésique à un niveau de 1,5 % pour l’isoflurane et de 0,4 L/min pour l’oxygène.
- Essuyez la queue avec des boules de coton / tampons imbibés d’alcool à 70% à 75%.
- En partant du point le plus bas de la queue, faites une petite ponction sur la veine latérale de la queue avec une piqûre d’aiguille 25G et faites sortir une goutte de sang.
- Essuyez la goutte de sang avec un papier de soie.
- Pressez une autre goutte de sang et recueillez-la sur le bord d’une bandelette de test.
- Lire et enregistrer le résultat affiché sur le glucomètre.
- Pour arrêter le saignement, pincez la queue de la souris avec une gaze stérile et essuyez la zone avec 75% d’alcool.
- Des échantillons supplémentaires peuvent être obtenus par une technique similaire remontant la queue crâniennement.
5. Coloration des pièges
- Préparation des diapositives
- Effectuer des tests de glycémie à jeun sur les souris une fois par semaine. Lorsque la glycémie est ≥ 11,1 mmol / L (indiquant le succès des souris atteintes de diabète de type II modèle 24), euthanasier les souris en utilisant du CO2, suivi de la disclocation cervicale, et recueillir le 4 à 6e lombaire (L4-L6) (aucune euthanasie n’est effectuée pendant le test de glycémieà jeun).
- Fixer les échantillons L4-L6 avec 4% de paraformaldéhyde pendant 24 h (s’assurer que le volume de paraformaldéhyde est >20x le volume du tissu), puis laver pendant 2 h à débit continu d’eau du robinet.
- Pour décalcifier les échantillons, les immerger dans une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 10% pendant 2 semaines à TA en état statique jusqu’à ce que les échantillons soient ramollis. Assurez-vous que le volume de la solution de décalcification est 20 à 30 fois le volume du tissu/échantillon. Changez la solution EDTA tous les deux jours.
- Déshydrater l’échantillon à l’aide d’un déshydrateur.
- Placez les échantillons dans des cassettes d’incorporation de traitement tissulaire. Numérotez la cassette à l’aide d’un crayon.
- Réglez le programme de déshydratation comme suit : 75 % d’alcool pendant 2 h, 85 % d’alcool pendant 1 h, 95 % d’alcool pendant 1 h, 95 % d’alcool pendant 2 h, éthanol anhydre (I) pendant 2 h, éthanol anhydre (II) pendant 2 h, éthanol anhydre (III) pendant 2 h, xylène (I) pendant 1 h, xylène (II) pendant 1 h, xylène (III) pendant 1 h, cire de paraffine (I) pendant 2 h, et cire de paraffine (II) pendant 2 h, à RT.
- Incorporer les échantillons dans de la cire de paraffine.
- Ajouter de la cire de paraffine dans le plateau à cassette de la station d’encastrement de paraffine et chauffer à 60 °C. Immerger les échantillons déshydratés pendant au moins 2 h.
- Placez la cassette en tissu dans le plateau de cassette et préchauffez.
- Ajouter de la cire de paraffine dans le réservoir de paraffine et chauffer à 60 °C.
- Après 2 h, apportez la cassette de tissu et les échantillons à l’aire de travail. Versez la cire de paraffine préchauffée du réservoir de paraffine dans la cassette de tissu. Placez le spécimen dans la cire de paraffine, assurez-vous que la cire de paraffine recouvre complètement le tissu, puis déplacez immédiatement la cassette sur une station de glaçage.
- Utilisez un microtome pour couper les échantillons incorporés dans la paraffine en sections de 5 à 6 μm. Déplier les sections dans de l’eau tiède à 40 °C pendant moins de 10 s. Collectez les sections sur les lames de verre revêtues d’APS (amino silane). Sécher les lames à TA pendant 1 h, puis les placer dans un four réglé à 60 °C pendant toute la nuit.
- Préparation du réactif TRAP
- Préparer la solution d’incubation de base : Dissoudre 9,2 g d’acétate de sodium anhydre, 11,4 g d’acide tartrique L-(+) et 2,8 mL d’acide glacial dans 1000 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 4,7-5,0 et conserver à TA jusqu’à 6 mois.
- Préparer la solution de naphtol-éther : Dissoudre 0,1 g de phosphate de naphtol AS-BI dans 5 mL d’éther monoéthylique d’éthylèneglycol. Conserver à 4 °C jusqu’à 5 semaines.
- Préparer la solution de nitrite de sodium : Dissoudre 1 g de nitrite de sodium dans 25 mL d’eau distillée. Conserver à 4 °C.
- Préparer le colorant pour pararosaniline : Ajouter 1 g de base de pararosaniline à 20 mL de HCl 2N (83 mL de HCl dans 417 mL d’eau). Utilisez une plaque d’agitation pour dissoudre la base et filtrez-la avant utilisation.
- Coloration des pièges
- Remplir deux pots Coplin avec 50 ml de solution d’incubation de bouillon de base et placer dans un four à 37 °C pendant 2 h.
- Prenez un pot de Coplin et ajoutez 0,5 mL de solution de naptol-éther.
- Placer les lames dans le pot Coplin et incuber à 37 °C pendant 1 h.
REMARQUE : Préparez au moins trois diapositives pour chaque groupe. - Quelques minutes avant la fin du temps d’incubation, ajouter 1 mL de solution de nitrite de sodium et 1 mL de colorant pararosaniline. Mélanger doucement pendant 30 s et laisser agir pendant 2 min.
- Ajouter la solution préparée à l’étape 5.2.2 dans l’autre pot Coplin préchauffé contenant la solution mère de base. Bien mélanger la solution et insérer les lames du pot Coplin à l’étape 5.3.3.
- Incuber pendant 15-20 min à RT.
- Rincer les tranches dans un autre pot Coplin avec 200 ml de PBS pendant 5 min.
- Contre-colorer les tranches avec 100% d’hématoxyline pendant 30 s dans un pot Coplin.
- Déshydrater les tranches avec 85 %, 95 % et 100 % d’alcool (200 mL) pendant 2 min chacune et traiter au xylène (200 mL) pendant 2 min pendant 3x. Utilisez des pots Coplin pour effectuer chaque étape.
- Fixez la section sur le verre de couverture avec un bordereau de couverture en utilisant de la résine. Assurez-vous d’éviter le piégeage des bulles d’air.
6. ELISA
- Préparation des échantillons
- Retirez les tissus mous du fémur et du tibia de la souris. Nettoyez les os avec de la gaze.
- Placer les échantillons d’os dans un tube microcentrifuge de 1 mL et conserver les tubes à échantillon à -80 °C.
REMARQUE: Les échantillons peuvent également être stockés dans un réservoir d’azote liquide pendant 6 mois maximum. - Peser l’échantillon d’os. Diluer avec 0,9% PS dans un rapport de 1:10. Par exemple, diluer 0,1 g d’os avec 1 mL de PS.
- Ajouter des billes de zircone de 3 mm dans le tube et broyer les échantillons 3x à 70 Hz pendant 30 s avec 20 s de repos entre les deux.
- Centrifuger les échantillons à 4 °C et 12 000 x g pendant 5 min. Récupérez le surnageant.
- Kit de dosage ELISA
REMARQUE : Effectuer un test ELISA conformément au protocole de dosage spécifié par le fabricant.- Ajouter 100 μL de chaque dilution de l’étalon, de l’essai blanc et de l’échantillon dans les puits appropriés. Incuber pendant 90 min à 37 °C.
- Décanter le liquide de chaque puits et ajouter 100 μL de solution de travail d’anticorps de détection biotinylée. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Décanter la solution, ajouter 350 μL de tampon de lavage à chaque puits. Faire tremper pendant 1 min, répéter 3x.
- Ajouter 100 μL de solution de travail conjuguée HRP à chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Décanter la solution. Répétez le processus de lavage 5x comme décrit à l’étape 6.2.3.
- Ajouter 90 μL du réactif substrat. Incuber pendant 15 min à 37 °C à l’abri de la lumière.
- Ajouter 50 μL de la solution d’arrêt.
- Utilisez un lecteur de plaques pour enregistrer l’absorbance de chaque puits à 450 nm.
- Génération de courbes standard
- Tracer les valeurs d’absorbance moyennes respectives par rapport aux concentrations de protéines diluées en série.
- Joignez les points pour créer la courbe d’ajustement la plus optimale. Utilisez toute application informatique appropriée (tableur) pour générer l’équation de courbe standard.
- Substituer la valeur d’absorbance de chaque échantillon dans l’équation de la courbe standard pour obtenir la concentration de l’échantillon respectif.
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Representative Results
Le poids corporel des souris diabétiques nourries avec un régime riche en graisses et induites par STZ a diminué par rapport à celui des groupes témoins de 0 à 8 semaines après le traitement par STZ. La perte de poids des souris traitées à la naringénine était significative par rapport aux souris non traitées (groupe STZ) à la semaine 4. Les groupes témoin et STZ ont été administrés avec le même volume de PS (tableau 1). Le taux de glucose sanguin chez les souris diabétiques a considérablement augmenté dans le mois suivant l’induction de STZ. Il a ensuite automatiquement diminué à un niveau observé il y a 2 mois lorsque le modèle animal a été établi. Le traitement par naringénine a abaissé la glycémie de 51,8 % et 34,8 % à 1 et 2 mois, respectivement (tableau 2). Les souris diabétiques induites par les STZ ont présenté une perte osseuse, comme l’indique la diminution du volume osseux / volume tissulaire (BV / TV) (30,97%) et du nombre de trabécules (Tb.N) (11,4%), respectivement. Les changements dans les valeurs de ces deux paramètres suggèrent que le traitement à la naringénine a significativement sauvé la perte osseuse (tableau 3). L’activité des ostéoclastes indiquée par N.oc/Tb.Ar (nombre d’ostéoclastes par zone osseuse trabéculaire) a été augmentée chez les souris diabétiques riches en graisses et les souris diabétiques induites par les STZ, bien qu’aucune signification statistique n’ait été observée entre le modèle témoin et le modèle de la maladie. Le traitement par naringénine a significativement diminué les activités ostéoclastes, comme le montrent la figure 4 et le tableau 4. Le télopeptide C-terminal du collagène de type I (CTIX) et le propeptide N-terminal du procollagène de type I (PINP) étaient élevés de 68,09% et 204,88% chez les animaux diabétiques, respectivement, indiquant une augmentation spectaculaire du taux de résorption osseuse. La naringénine a significativement diminué les deux indicateurs du taux de résorption osseuse (tableau 5).
Figure 1 : Dissoudre la naringénine dans l’éthanol. (A) Poudre de naringénine dans le tube après essorage. (B) Naringénine + éthanol (400 mg/mL - 3,52 mg de naringénine dans 8,8 μL d’éthanol). (C) Naringénine + éthanol (40 mg/mL - 3,52 mg de naringénine dans 8,8 μL d’éthanol) (D) Naringénine dans 5 % (v/v) d’éthanol et 95 % PS (0,9 %). (E) Précipite en D après spin down. (F) Mesure pour l’obtention de la barre d’échelle pour les figures 1, 2 et 3. Nar : Naringénine. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissoudre la naringénine dans le DMSO. (A) Naringénine + DMSO (400 mg/mL - 3,95 mg de naringénine dans 9,8 μL de DMSO). (B) Naringénine + DMSO (40 mg/mL- 3,95 mg de naringénine dans 98 μL de DMSO). (C) Naringénine dans 5% (v/v) DMSO et 95% PS (0,9%). (D) Précipite en C après spin down. Nar : Naringénine. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dissolution de la naringénine dans le DMSO et le Tween 80. (A) Naringénine + DMSO (57,2 mg/mL - 6,69 mg de naringénine dans 117,7 μL de DMSO). (B) Naringénine + DMSO + Préadolescent (57,2 mg/mL - 6,69 mg de naringénine dans 117,7 μL de DMSO et 117,7 μL de Tween 80). (C) Naringénine dans le mélange de 3,5 % (v/v) de DMSO, 3,5 % (v/v) Tween 80 et 93 % PS (0,9 %). (D) Pas de précipités en C après spin down. Nar : Naringénine. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet de la naringénine sur l’activité ostéoclastique des souris nourries avec un régime riche en graisses et injectées par STZ (STZ). Coloration TRAP de l’os trabéculaire et des ostéoclastes des vertèbres L4. Les triangles indiquaient des ostéoclastes. Barre d’échelle = 100 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Liu et al.25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| g) | 0 semaine | 1 semaine | 2 semaines | 4 semaines | 5 semaines | 6 semaines | 8 semaines |
| Contrôle | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26,2 ± 1,0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringénine | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 par rapport au contrôle | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 contre STZ | |||||||
Tableau 1 : Poids corporel des souris nourries avec un régime riche en graisses et des souris auxquelles on a injecté des STZ (STZ) pour différents groupes et périodes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. ** p < 0,01 vs contrôle, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 mois | 1 mois | 2 mois |
| Contrôle | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringénine | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 par rapport au contrôle | |||
| ΔΔ p < 0,01 contre STZ | |||
Tableau 2 : glycémie à jeun des souris STZ selon les groupes et les périodes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 par rapport au contrôle, ΔΔ p < 0,01 par rapport à STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Contrôle | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringénine | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 par rapport au contrôle | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 contre STZ | ||
Tableau 3 : Paramètres liés à la masse osseuse des souris STZ dans tous les groupes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. * p < 0,05 par rapport au contrôle, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 par rapport à STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Contrôle | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringénine | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 contre STZ | |
Tableau 4 : Activité des ostéoclastes des souris STZ dans tous les groupes. Les données sont présentées comme la moyenne ± s.d. ΔΔ p < 0,01 par rapport à STZ.
| ng/mL | CTIX | Le |
| Contrôle | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringénine | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 par rapport au contrôle | ||
| ΔΔ p < 0,01 contre STZ | ||
Tableau 5 : Taux de résorption osseuse des souris STZ dans tous les groupes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. * p < 0,05 vs contrôle, ΔΔ p < 0,01 vs STZ.
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Discussion
La préparation de la solution phytochimique est la base de son application in vivo. Dans ce protocole, la préparation de la solution de naringénine a été démontrée en utilisant différents solvants, tels que l’éthanol, le DMSO, le Tween 80 et le 0,9% PS. La solution à l’état complètement dissous doit être surveillée davantage en la laissant rester à température ambiante pendant quelques heures prolongées, puis filtrée avant d’être utilisée in vivo.
La détermination des solvants est une étape critique de ce protocole. Il existe de nombreuses options de solvants pour dissoudre les composés, dont l’éthanol, le DMSO et le PS sont les plus largement utilisés. L’éthanol peut dissoudre de nombreux composés insolubles dans l’eau en raison de ses propriétés hautement polaires, permettant la liaison hydrogène et dissolvant ainsi les substances polaires et non polaires. De plus, la concentration d’éthanol peut déterminer les propriétés du composé phytochimique. Par exemple, 75 % en poids d’éthanol/solvant aqueux est considéré comme le meilleur pour extraire le rendement le plus élevé en polyphénols et possède les propriétés antioxydantes les plus fortes26. Une autre étude a révélé que la concentration d’éthanol pouvait être abaissée à 32,5% à 150 ° C pour que les extraits de polyphénols expriment une propriété antioxydante27. Cependant, une concentration élevée d’éthanol peut provoquer une neurotoxicité et une hépatotoxicité28. L’injection d’éthanol (i.p.) dans une gamme de concentrations de 8% à 32% v/v est couramment utilisée pour l’évaluation comportementale et peut provoquer une aversion gustative conditionnelle et une hypothermie29. Le DMSO est un solvant aprotique dipolaire de haute polarité et est utilisé comme solvant pour dissoudre de nombreux composés organiques. Une étude comparative a indiqué que le DMSO/méthanol (50:50 v/v) entraînait un rendement optimal en acides phénoliques dans les écorces d’agrumes30. Cependant, la dose, la concentration et la fréquence ne sont pas des facteurs ignorables lorsque le DMSO est administré aux animaux. Une dose de 17,7 g/kg administrée par voie intrapéritonéale chez la souris a atteint la DL50 tout en abaissant la dose à 2,5 g/kg pendant 6 semaines chez la souris n’a pas entraîné d’effets indésirables observables31. Bien que la concentration suggérée de DMSO soit de 0,5% à 5%, le DMSO n’est pas capable de dissoudre de nombreux composés. Colucci et coll. ont testé les effets du DMSO et de la solution saline contenant du DMSO à différentes concentrations par administration intra-rébroventriculaire et orale chez la souris. L’étude a démontré qu’une solution de 25% de DMSO dans une solution saline ne modifiait pas les réponses comportementales des animaux32. Tween 80 est un tensioactif non ionique et est largement utilisé comme cosolvant pour augmenter la solubilité des médicaments peu solubles et améliorer les caractéristiques pharmacocinétiques33. Une concentration de 1% Tween 80 a été choisie en tenant compte de la sécurité33. Ainsi, les solvants et tensioactifs ci-dessus à différentes concentrations ont été utilisés pour solubiliser complètement la naringénine pour administration intrapéritonéale.
Quelques suggestions sont énumérées ici pour examen. Tout d’abord, nous suggérons de partir d’une petite quantité de composé phytochimique pour des expériences préliminaires tenant compte du coût de consommation. Deuxièmement, il est nécessaire d’effectuer des recherches approfondies sur la littérature, en particulier des études approfondies sur les espèces animales, les maladies, les voies d’administration et la fréquence, avant de préparer la solution. Troisièmement, les plages de concentration des solvants et des cosolvants tels que les surfactants dépendent de la littérature disponible, des expériences préliminaires et de l’objectif de la conception de l’étude. Quatrièmement, l’utilisation d’une seringue à insuline au lieu d’une seringue ordinaire est recommandée pour réduire les lésions par injection dues à une fréquence d’administration relativement élevée. Cinquièmement, pour maintenir des conditions stériles, il est recommandé de stériliser la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et d’utiliser des seringues stériles et des cotons-tiges imbibés d’alcool lors de l’injection de la solution à des animaux vivants.
Les avantages du protocole sont son fonctionnement simple et son faible coût. En résumé, le protocole démontre la préparation d’une solution phytochimique pour l’administration intrapéritonéale chez la souris, avec la naringénine comme exemple. Le protocole profitera aux chercheurs qui s’occupent du dépistage de médicaments ou de la pharmacologie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81973607 et 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
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