Summary
הפרוטוקול מתאר התפתחות של מודל סטנדרטי, חוזר, פרה-אקליני של מכת חום מאמץ (EHS) בעכברים ללא גירויים חיצוניים שליליים כגון הלם חשמלי. המודל מהווה פלטפורמה ללימודים מכאניסטיים, מונעים וטיפוליים.
Abstract
מכת חום היא הביטוי החמור ביותר של מחלות הקשורות לחום. מכת חום קלאסית (CHS), הידועה גם בשם שבץ חום פסיבי, מתרחשת במנוחה, ואילו מכת חום מאמץ (EHS) מתרחשת במהלך פעילות גופנית. EHS שונה CHS באטיולוגיה, מצגת קלינית, והמשך של תפקוד רב איברים. עד לאחרונה, רק דגמים של CHS הוקמו היטב. פרוטוקול זה נועד לספק קווים מנחים למודל עכבר פרה-אקליני מעודן של EHS, הנאווה בגורמים מגבילים מרכזיים כגון שימוש בהרדמה, איפוק, בדיקות רקטליות או הלם חשמלי. גברים ונקבות C57Bl/6 עכברים, מכשירים עם טמפרטורת הליבה (Tc) בדיקות טלמטריות נוצלו במודל זה. לצורך היכרות עם מצב הריצה, עכברים עוברים 3 שבועות של הכשרה באמצעות גלגלי ריצה מרצון וכפויים כאחד. לאחר מכן, עכברים רצים על גלגל כפוי בתוך תא אקלים להגדיר ב 37 °C (5 °F) ו 40%-50% לחות יחסית (RH) עד הצגת מגבלת סימפטום (למשל, אובדן הכרה) ב Tc של 42.1-42 °C (5 °F), אם כי תוצאות מתאימות ניתן להשיג בטמפרטורות החדר בין 34.5-39.5 °C (למשל, אובדן הכרה) ב Tc של 42.1-42 °C (5 °F), אם כי תוצאות מתאימות ניתן להשיג בטמפרטורות החדר בין 34.5-39.5 °C (30%-90%. בהתאם לחומרה הרצויה, עכברים מוסרים מהתא באופן מיידי להתאוששות בטמפרטורת הסביבה או נשארים בתא המחומם למשך זמן רב יותר, מה גרימת חשיפה חמורה יותר ושכיחות גבוהה יותר של תמותה. התוצאות מושוות לבקרות פעילות גופנית תואמות מזויפות (EXC) ו/או פקדים נאיביים (NC). המודל משקף רבות מהתוצאות הפתופיזיולוגיות שנצפו ב- EHS האנושי, כולל אובדן הכרה, היפרתרמיה חמורה, נזק רב-איברי כמו גם שחרור ציטוקינים דלקתיים, ותגובות פאזה חריפות של המערכת החיסונית. מודל זה אידיאלי למחקר מונחה השערות כדי לבחון אסטרטגיות מניעה וטיפולית שעלולות לעכב את הופעת EHS או להפחית את הנזק הרב-איברי המאפיין ביטוי זה.
Introduction
שבץ חום מאופיין בתפקוד מערכת העצבים המרכזית ונזק לאיברים הבאים בנבדקים היפרתרמיים1. ישנם שני ביטויים של מכת חום. מכת חום קלאסית (CHS) משפיעה בעיקר על אוכלוסיות קשישים במהלך גלי חום או ילדים שנותרו בכלי רכב חשופי שמש במהלך ימי הקיץ החמים1. מכת חום מאמץ (EHS) מתרחשת כאשר יש חוסר יכולת thermoregulate כראוי במהלך מאמץ פיזי, בדרך כלל, אבל לא תמיד, תחת טמפרטורות סביבה גבוהות וכתוצאה מכך תסמינים נוירולוגיים, היפרתרמיה, ולאחר מכן תפקוד רב איברים ונזק2. EHS מתרחשת ספורטאי פנאי ואליטה, כמו גם אנשי צבא ובפועלים עם ובלי התייבשות במקביל3,4. ואכן, EHS הוא הגורם המוביל השלישי לתמותה אצל ספורטאים במהלך פעילות גופנית5. זה מאוד מאתגר ללמוד EHS בבני אדם כמו הפרק יכול להיות קטלני או להוביל לתוצאות בריאותיות שליליות לטווח ארוך6,7. לכן, מודל פרה קליני אמין של EHS יכול לשמש ככלי רב ערך כדי להתגבר על המגבלות של תצפיות קליניות רטרוספקטיביות אסוציאטיביות בקורבנות EHS אנושיים. דגמים פרה-קליניים של CHS במכרסמים וחזירים אופיינו היטב8,9,10. עם זאת, מודלים פרה-אקליניים של CHS אינם מתורגמים ישירות לפתופיזיולוגיה EHS בשל ההשפעות הייחודיות של פעילות גופנית על הפרופיל התרמו-ריאלטורי ותגובה חיסוניתמולדת 11. בנוסף, ניסיונות קודמים לפתח מודלים פרה-אקליניים של EHS במכרסמים הציבו הגבלות משמעותיות, כולל גירויי לחץ מובחרים הנגרמים על ידי הלם חשמלי, החדרת בדיקה רקטלית וטמפרטורות גוף בסיסיות מוגדרות מראש עם שיעורי תמותה גבוהים12,13,14,15,16 שאינם תואמים את הנתונים האפידמיולוגיים הנוכחיים. אלה מייצגים מגבלות משמעותיות שעלולות לבלבל את פרשנות הנתונים ולספק מדדי סמנים ביולוגיים לא אמינים. לכן, הפרוטוקול נועד לאפיין ולתאר את הצעדים של מודל פרה-קליני מתוקנן, חוזר על עצמו וניתן לתרגום של EHS בעכברים, שהוא ברובו חופשי מהמגבלות שהוזכרו לעיל. התאמות למודל שיכולות לגרום לתוצאות פיזיולוגיות מדורגות ממכת חום בינונית עד קטלנית מתוארות. למיטב ידיעת המחברים, זהו המודל הקדם-אקליני היחיד של EHS עם מאפיינים כאלה, מה שמאפשר להמשיך במחקר EHS רלוונטי באופן מונחה השערה11,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נבדקו ואושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת פלורידה. עכברים זכרים או נקבות C57BL/6J, ~ 4 חודשים, במשקל בטווח של 27-34 גרם ו 20-25 גרם, בהתאמה, משמשים למחקר.
1. השתלה כירורגית של מערכת ניטור הטמפרטורה הטלמטרית
- עם ההגעה מהמוכר, אפשר לבעלי החיים לנוח בויבריום לפחות שבוע לפני הניתוח כדי למזער את הלחץ של התחבורה.
- קבוצה בית העכברים (מקסימום של 5 לכלוב על פי הנחיות IACUC מקומיות) עד יום הניתוח להשתלת מכשיר טלמטרי טמפרטורה. שלם אותם בכלובים סטנדרטיים 7.25" (W) x 11.75" (L) x 5" (H) המכילים מצעים של קלח תירס. לשמור על מחזור האור על מחזור אור 12 x 12 (על: 7 בבוקר; כבוי: 7 בערב). לשמור על טמפרטורת הדיור ב 20-22 °C (50 °F) ולחות יחסית (RH) ב 30%-60%. ספק את דיאטת הצ'או הסטנדרטית ואת ליביטום אדי המים עד לפרוטוקול EHS.
הערה: הרציונל לדיור יחיד הוא להימנע מפגיעה תכופה בלחימה בעכברים זכר C57bl/6J ולספק הזדמנות בשפע לריצה ספונטנית של גלגל לכל עכבר. - למיקום התקני הטלמטריה, יש להרדים את העכבר עם איזופלוריין (4%, 0.4-0.6 ליטר/דקה של זרימת O2) בתא אינדוקציה. לאחר מכן, מניחים את העכבר תחת הרדמה רציפה באמצעות חרוט באף (1.5%, 0.6 ליטר / דקה).
- יש להשתמש חומר סיכה לעיניים, כגון משחת וטרינר, כדי להגן על עיני החיה מפני נזק או פציעה במהלך הניתוח.
- כדי להכין את האתר הכירורגי, לגלח את הבטן התחתונה עם קוצץ שיער בעלי חיים קטן או להשתמש מסיר שיער זמין מסחרית. לנהל את המנה הראשונה של buprenorphine תת עורי (0.1 מ"ג/ק"ג) במהלך תקופה זו.
- לשפשף את האזור עם שלוש שטיפות של povidone-יוד (או קרצוף חיידקים דומה) ואחריו 70% שטיפת אלכוהול איזופרופיל (או מלוחים סטריליים בהתאם לדרישות וטרינריות מקומיות). לאחר מכן, העבר את העכבר לאזור הניתוח.
- השתמש בוילונות דבק כדי לבודד את האתר הכירורגי על העכבר. באמצעות מכשירים סטריליים וטכניקה אספטית, לבצע חתכה ~ 1 ס"מ בקו האמצע לאורך אלבה לינאה, כ 0.5 ס"מ מן השוליים היקרים. לאחר מכן, להפריד את העור משכיית השריר ולעשות ירידה קטנה מעט יותר על אלבה לינאה, זהיר לא לפגוע במעיים או איברים פנימיים.
- לאחר ששכבת השריר פתוחה, הניחו את הטלמטר הסטרילי (מכשיר רדיו-מדידת מטרדיה זעיר רב פעמי ללא סוללה; 16.5 x 6.5 מ"מ) לתוך חלל התוך-פריתוניאלי מול העורקים והוורידים הססנים וגב לאיברים העיכול כדי לאפשר לו לצוף בחופשיות.
הערה: כל הטלמטרים מנוקים עם מים וסבון, שטופים ביסודיות וגז מעוקר עם תחמוצת אתילן בין השימושים. אם עיקור הגז אינו זמין, טבילה בפתרונות עיקור (בעקבות המלצת היצרן לזמן דילול וטבילה) מתקבלת לחיטוי וחיטוי הטלמטרים. - סגור את פתח הבטן עם תפר סטרילי 5-0 נספג, ולסגור את העור באמצעות תפר פשוט מופרע עם תפר פרולין 5-0.
הערה: מתן אפשרות לטלמטר לצוף בתא הבטן מבלי לקשר אותו לקיר הבטן (שיטה המומלצת על ידי היצרן) הוכח כמוצלח ומועדף על ידי המחברים כדי למנוע מתח עודף בדופן הבטן במהלך הריפוי. יתר על כן, אין לכך כל השפעה על יכולתו של המקלט להשיג את האות מהמפלט. - מניחים את העכבר בכלוב הנקי שלו עם כרית חימום ניידת מתחת לכלוב. לפקח על העכבר כל 15 דקות במהלך השעה הראשונה של התאוששות מהרדמה, ולאחר מכן לחזור למתקן דיור בעלי חיים.
- לספק עכברים עם זריקות buprenorphine תת עורי כל 12 שעות עבור 48 שעות במהלך ההתאוששות ולהמשיך לעקוב אחר סימני מצוקה. אם זמין, לתת בופרנורפין שחרור איטי תת עורית כל 24 שעות (1 מ"ג/ק"ג) עבור 48 שעות. אפשר לעכברים להתאושש במשך ~ 2 שבועות לאחר הניתוח לפני הצגת גלגל מרצון פועל.
2. היכרות: ריצת גלגל מרצון וכפויה
- לאחר החלמה מניתוח, הניחו את גלגלי הריצה מרצון בכלוב לגישה חופשית לגלגל. בחירות אחרות של גלגלי ריצה עשויות להיות יעילות באותה מידה, אך להבטיח שהן מתאימות לגדלי הכלוב המוגבלים הזמינים.
הערה: גלגלי הריצה היו צריכים להיות מופחתים מעט בממד כדי להתאים לכלוב סטנדרטי. - התאקלם בעכבר לגלגל ההתנדבותי בכלוב במשך שבועיים. לאחר התאקלמותו, העכבר מוכן לאימון עם הליכי היכרות עם גלגלי הריצה הכפויים.
- בצע את ארבעת האימונים (יום/יום) בתא הסביבתי בטמפרטורת החדר (כ-25 מעלות צלזיוס, 30% לחות יחסית).
הערה: למרות שזה אידיאלי, עכברים הוכשרו בהצלחה גם גלגלי ריצה מאולצים זהים מחוץ לתא. לאחר מכן ניתן לאמן מספר עכברים בו זמנית מבלי להפריע לשימוש בתא. - כדי להתחיל את האימון הראשון, אפשר לעכבר גלגל חופשי בגלגל הריצה שהשתנה למשך 15 דקות על ידי הסרה או התרופפות של חגורת הכונן המנוע כדי לאפשר לעכבר לקבוע את מהירות הגלגל ולהתאקלם אליו בצורה לא מלחיצה.
הערה: פרוטוקולים יכולים להיות מופעלים עם תוכנה וחומרה המסופקים על ידי יצרן גלגל הריצה או עשויים להיות מוחלפים על ידי ספק כוח חיצוני לתכנות כי הוא קווית ישירות למנוע גלגל, המאפשר אוטומציה של פרוטוקול התרגיל המצטבר. - כייל את המערכת עבור כל גלגל ריצה כדי לקבוע את הקשר בין מתח ספק הכוח לבין מטרים/דקה (מ'/דקה) של כל גלגל.
הערה: גלגלי הריצה הכפויים שונו גם כדי להעלות את המנוע 15 ס"מ, הפוך ולהזיז את הגלגלת המניעה את הגלגל עד 5 ס"מ מעל פלטפורמת מקלט הטלמטריה. זה הבטיח כי פלטפורמת המקלט השיגה נתוני טלמטריה מדויקים במהלך פרוטוקול הריצה ללא הפרעה מהמנוע. - לאחר תקופת מנוחה קצרה (<5 דקות), הפעל את פרוטוקול גלגל הריצה הכפוי. התחל את הגלגל ב 2.5 מ '/דקה ולהגדיל 0.3 מ '/דקה כל 10 דקות בסך הכל 1 שעה כדי לחקות את השעה הראשונה של משפט EHS בפועל, אבל בטמפרטורת החדר. החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו ואפשר התאוששות של 24 שעות. נהל את שלושת מפגשי הריצה הכפויים הבאים באותו אופן בימים רצופים. אחרי היום הראשון, החלק של התאקלות גלגל חופשי הוא מיותר.
- אפשר לעכבר 2-3 ימים של שטיפה או התאוששות מהלחץ של תרגול גלגל הריצה הכפוי, אך אפשר לעכבר גישה חופשית לגלגל ההתנדבותי של הכלוב הביתי. העכבר מוכן כעת לעבור את פרוטוקול EHS.
3. פרוטוקול EHS
- בלילה שלפני פרוטוקול EHS, הנח את העכבר בתא הסביבתי בטמפרטורת החדר (~ 25 °C (~ 25 °C (25 °F, ≈30% לחות יחסית) כדי להתאקלם לתא.
- השתמש במערכת רכישת נתונים כדי לאסוף Tc רציף, בממוצע מעל 30-s מרווחים בן לילה.
- בבוקר פרוטוקול EHS, ודא שהעכבר נמצא בטווח רגיל של טמפרטורת יומיים או מתחתיו לפני העלאת טמפרטורת החדר (כלומר, 36-37 °C (37°F). זה מבטיח שלעכבר אין חום ולא חווה מתח מופרז בתקופה זו.
- ברגע שהעכבר יציב ובטווח טמפרטורת הליבה הרגילה של מנוחה, הסר את המזון והמים ושקל את החיה. סגרו את דלת החדר והגדילו את טמפרטורת התא ליעד של 37 °C (5 °F) ו-40%-50% לחות יחסית, או את הטמפרטורה והלחות הסביבתית הרצויה19. אמת את טמפרטורת החדר והלחות באמצעות צג טמפרטורה ולחות מכויל.
- הקיפו את החדר עם וילון האפלה כדי לשמור על אור והפרעות מינימליות במהלך הפרוטוקול. נטר את העכבר ברציפות במהלך הפרוטוקול באמצעות מצלמות IR מוארות מרחוק. מקד מצלמה שנייה על צג הטמפרטורה והלחות, ממוקם קרוב לגלגל הריצה. בצע את כל ההתאמות לבקר עבור הגדרת התא הסביבתי כדי להבטיח קריאות טמפרטורה מדויקות ליד החיה.
- לאחר שהתא הגיע לטמפרטורת היעד שלו כפי שנמדד על ידי המצלמה השנייה על צג הטמפרטורה (זה יכול לקחת ~ 30 דקות), פתח במהירות את דלת החדר והנח את העכבר בגלגל הריצה הכפוי.
- ליזום את פרוטוקול גלגל ריצה כפוי במהירות של 2.5 מ '/דקה ולהגדיל את המהירות 0.3 מ '/דקה כל 10 דקות עד העכבר מגיע Tc של 41 °C (5 °F). לאחר שהעכבר הגיע לטמפרטורת הליבה הזו, אפשר למהירות להישאר קבועה עד להגבלת סימפטום, המאופיינת באובדן הכרה לכאורה, נפילה לאחור או התעלפות, וחוסר היכולת להמשיך לרוץ או להיאחז בגלגל. אשר נקודת זמן זו כאשר לעכבר יש שלושה סיבובים לאחור על ההגה ללא סימנים של תגובה פיזית. לחלופין, זהה נקודת קצה הומאנית בהתאם לכללי IACUC המקומיים כדי לקבוע מתי להפסיק את הפרוטוקול (למשל, כאשר Tc ~ 43 °C ). נקודת קצה זו היא מעט מעל מגבלת סימפטום בעצם כל העכברים.
- כדי לבצע את פרוטוקול הקירור המהיר (R), ברגע שהעכבר מגיע למגבלת התסמינים, עצור את הגלגל והסר אותו מיד מגלגל הריצה הכפוי. שקול את העכבר והחזיר אותו לכלוב הביתי שלו כדי להתאושש בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, להשאיר את דלת החדר פתוח ולהחזיר את האינקובטור להגדיר נקודה לטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתא להתקרר במהירות. הליך זה גורם להישרדות ארוכת טווח של >99%.
- כדי לבצע חשיפה חמורה יותר (S) EHS, שמור על הכלוב הביתי של החיה בתוך תא 37 °C (37°C) במהלך פרוטוקול EHS. כאשר החיה מגיעה למגבלת התסמינים, אפשר להם להישאר בגלגל הריצה עד שהם חוזרים לתודעה כפי שנצפה על ידי המצלמה המרוחקת (~ 5-9 דקות).
- לאחר מכן הסירו במהירות את העכבר מגלגל הריצה והחזירו אותו ישירות לכלוב שהתחמם מראש כדי לגרום לפרופיל קירור איטיבהרבה (איור 1A,קו מקווקו אדום), ולמעשה מבטלים את השלב ההיפותרמי EHS. הסר את החלק העליון של המסנן מהכלוב במהלך תקופה זו כדי לשפר את שיווי משקל עם התא.
- השתמש בכלוב התאוששות מראש לטמפרטורת החדר כדי לבצע הליך חלופי פחות חמור כדי לגרום לשלב היפותרמי מדוכא אבל עם שיעור הישרדות של 100%20.
- עבור פרוטוקול S, נטר בקפידה את העכבר במהלך השחזור ובדוק ברציפות אם קיימות נקודות קצה הומאנות. למרות שקשה לבדוק מרחוק נקודות קצה הומאנות נפוצות (למשל, רפלקס ימין), התבונן בעכברים מרחוק לתנועות רגילות במהלך ההתאוששות כגון טיפוח, נשימה רגילה, ליקוק וכו '. לפקח על TC במהלך תקופה זו.
- עכברים לא סביר להתאושש אם טמפרטורת הליבה שלהם הופכת כיוון במהלך שלב ההתאוששות, בסופו של דבר עולה על 40 °C (50 °F); בשלב זה, לסיים את הניסוי ולהעריך את העכבר עבור נקודות קצה אנושיות סטנדרטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרופילים התרמו-גולטוריים הטיפוסיים במהלך כל פרוטוקול EHS ושחזור מוקדם של עכבר מודגמים באיור 1A. פרופיל זה כולל ארבעה שלבים נפרדים שניתן להגדיר כשלב חימום התא, שלב פעילות גופנית מצטברת, שלב פעילות גופנית במצב יציב, ושלב התאוששות על ידי שיטת קירור מהירה (R) או חמורה (S)17. התוצאות התרמו-רגולאטוריות העיקריות כוללות Tc מרבי שהושג (Tc, מקסימום) ואת הזמן הנדרש כדי להגיע Tc, מקסימום. אזור תרמי עולה מאפשר לקבוע את החשיפה היעילה לטמפרטורה >39°C21 ועומק היפותרמיה (Tc,min). ערכים אופייניים עבור משתנים אלה המסוכמים ממספר מחקרים מוצגים בטבלה 1. משתני תוצאה אחרים הנמדדים באופן שגרתי כוללים את ריצת המרחק הכוללת, את המהירות המרבית שהושגה ואת משקל האחוזים שאבד במהלך פרוטוקול EHS (מדד פונדקאי להתייבשות). שוב, ניתן לצפות בערכים אופייניים בטבלה 1. עכברות נקבות עמידות יותר לשבץ חום במודל זה וממשיכות מרחקים ארוכים כמעט פי 2 מאשר עכברים זכרים17, כפי שמודגם באופן סכמטי באיור 1B ומסכמת מספרית בטבלה 1.
ניסויים סופניים בוצעו בנקודות זמן שונות לאחר EHS, החל מיד לפני ואחרי קריסה19 עד 30 ימים11,17,22. מודל זה מדגים באופן עקבי נזק היסתולוגי למעיים, לכליות ולכבד19. תוצאות צפויות אחרות כוללות סמנים ביולוגיים נפוצים של מתח או תגובה חיסונית11,17, ( טבלה2), כמו גם תפקוד לקוי של איברי קצה כולל אינדיקטורים של הכבד (אלנין transaminase), שריר (קריאטין קינאז), מעיים (חלבון מחייב חומצת שומן 2), וכליות (קריאטינין: יחס חנקן אוריאה בדם) כפי שמוצג בטבלה 319. חקירות עתידיות עשויות לשקול מדידת סמנים אחרים של נזק לרקמות או עקה חמצונית.
במודל פרה-קליני, >99% מבעלי החיים שורדים עד איסוף דגימות. עם זאת, במודל S, כפי שתואר לעיל, התמותה עולה ל ->30% (N = 32, P < 0.003). פרופיל טמפרטורת התאוששות טיפוסי עבור דגם S מומחש באיור 1A (קו אדום מקווקו), שבו Tc נשאר מעל 37 °C (50 °F) לאורך תקופת השחזור של 2 שעות. החלוקה של תקופות שחזור EHS במהלך כל שלב בפרוטוקול EHS והשחזור מושוות באיור 2 בין המודלים הקלאסיים וה-S. מעניין, אין הבדל בזמן הנדרש כדי להתאושש ל 39 °C (5 °F) בשני הדגמים. עם זאת, הזמן להתקרר לטמפרטורה הסביבתית (37 °C (37 °F), מעל טמפרטורת הגוף הרגילה) היה ממושך מאוד (P < 0.0001).
איור 1: פרופילים תרמו-גולטוריים במהלך כל פרוטוקול EHS ושחזור מוקדם של עכבר. (A)פרופיל טמפרטורת הליבה הטיפוסי של עכבר C57Bl6 העובר את הפרוטוקול בציר האנכי. על הציר האופקי, ככל שהזמן מתקדם מחימום החדר (-50) לתחילת החלק המצטבר של הפרוטוקול. כאשר העכבר מגיע ל 41 °C (70 °F), המהירות נשמרת קבועה במהלך שלב מצב יציב עד שהוא מגיע סימפטום-הגבלה. במהלך ההתאוששות, טמפרטורת הליבה יורדת בשיעורים שונים עבור מודלים חמורים (קו מקווקו אדום) וקירור מהיר (קו מוצק). (B)ייצוג סכמטי של הבדלי המין שנצפו בטמפרטורת הליבה ובמשך הזמן. הקו המקווקו הוא זכר, והקו המוצק הוא נקבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: משך הזמן שבו טמפרטורת הליבה של העכבר נותרה >39°C (39°F) לקירור מהיר (R) ופרוטוקולי קירור איטי (S). שים לב כי הבדלים משמעותיים קיימים במגזרי Tc, מקסימום עד 37 °C (5 °F) ו- Tc, מקסימום עד Tc, דקות מקטעים. נתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| זכרים | הנקבות | EXC | |
| Tc,מקסימום (°C) | 42.1 ± 0.2 | 42.3 (42.2–42.4) | 38.5 ± 0.2 |
| זמן ל- Tc (דקה) | 123 ± 11 | 208 (152–252) | 113 ± 10 |
| %ירידה במשקל ב- EHS | 8.1 ± 2.1 | 6.0 (5.1–7.6 | 4.5% ± 1.0% |
| עומק היפותרמיה (°C) | 33.0 ± 1.1 | 31.7 (30.7–33.1) | n/a |
| אזור תרמי עולה (°C >39.5 • S) | 96.5 ± 14.7 | 240 (202–285) | n/a |
| מרחק כולל (מטר) | 444.9 ± 89.3 | 623 (424–797) | תואם |
| מהירות מרבית (מ'/דקה) | 5.3 ± 0.6 | 8.1 (7.1–9.2) | 5.2 |
טבלה 1: הטמפרטורה הצפויה ותגובות פעילות גופנית באמצעות מודל הקירור המהיר של מכת חום מאמץ. כל הנתונים מטמפרטורה סביבתית = 37.5 מעלות צלזיוס, 30%-40% לחות יחסית. פירושו ± SD מסכם מקינג ואח' 201519, גרסיה ואח ' 201817, גרסיה ואח ' 202018.
Tc,max = טמפרטורת ליבה מקסימלית מושגת במגבלת סימפטום או ליד במהלך מכת חום מאמץ (EHS).
% ירידה במשקל = %הפרש משקל מיד לפני ואחרי EHS. אזור תרמי עולה = מחוון של עומס תרמי. זהו תוצר של זמן x טמפרטורה > 39 °C (5 °F) במהלך פרוטוקול EHS.
| זכר | נקבה | |||||||
| זכרים | EXC | 30 דקות | 3 שעות | 24 שעות | EXC | 30 דקות | 3 שעות | 24 שעות |
| קורטיקוסטרון (ng/mL) | 50 ± 10 | 175 ± 42 | 152 ± 28 | 46 ± 26 | 72 ± 11 | 219 ± 78 | 259 ± 36 | 95 ± 24 |
| IL-6 (pg/mL) | 3.8 ± 0 | 58.0 ± 50.0 | 37.0 ± 43 | 5.1 ± 4.0 | 3.7 ± 0.3 | 97.0 ± 48 | 10.4 ± 16.0 | 5.0 ± 4.2 |
| GCS-F (pg/mL) | 34.2 ± 16.4 | 573 ± 462 | 1080 ± 52 | 87.8 ± 40.5 | 44.2 ± 20.0 | 238 ± 194 | 1712 ± 1700 | 208.4 ± 193 |
טבלה 2: סמן ביולוגי של תגובות הורמון הלחץ/ציטוקינים במודל קירור מהיר של מכת החום המאמץ.
הנתונים הם אמצעי ± SD, כל הנתונים מטמפרטורה סביבתית = 37 °C (5 °F), 30%-40% יחסי
לחות. סיכום מתוך גרסיה ואח' 201817.
| נקודת זמן | EXC | 30 דקות | 3 שעות | 24 שעות |
| קריאטין קינאז (IU/L) | 215 ± 108 | 309 ± 145 | 1392 ± 1797 | 344 ± 196 |
| חנקן אוריאה בדם (מ"ג/ד"ל) | 23 ± 2.7 | 66 ± 2.6 | 34 ± 8.5 | 17.2 ± 0.4 |
| קריאטינין:יחס BUN | 131 ± 70.0 | 210.7 ± 22.8 | 268.6 ± 118 | 52.3 ± 14 |
| אלנין טרנסאמינאז | 25 ± 3.7 | 367 ± 744 | 123 ± 167 | 207 ± 236 |
| FABP-2 (ng/mL) | 2.3 ± 1.0 | 10.2 ± 1.0 | 2.6 ± 3.1 | 1.2 ± 0.5 |
טבלה 3: סמנים ביולוגיים של פגיעה באיברים בעכברים זכרים במהלך ההחלמה ממודל הקירור המהיר של מכת חום מאמץ.
נתונים הם אמצעי ± SD. כל הנתונים מטמפרטורה סביבתית = 37 °C (5 °F). המלך ואח' 201519.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סקירה טכנית זו שואפת לספק קווים מנחים לביצועים של מודל פרה-אקליני של EHS בעכברים. שלבים וחומרים מפורטים הנדרשים לביצוע פרק EHS לשחזור של חומרות משתנות מסופקים. חשוב לציין, המודל מחקה במידה רבה את הסימנים, הסימפטומים, ותפקוד לקוי מרובה איברים שנצפו בקורבנות EHSאנושיים 11,19. יתר על כן, מודל זה מאפשר בדיקה של המנגנון שבבסיסו התאוששות EHS לטווח קצר וארוך19,20,22,23 ואת ההשפעה של התערבויות על thermoregulation, מדידות ביצועים בחום, קצב הפחתות הטמפרטורה לאחר שבץ, אינדיקטורים של תפקוד לקוי של איברים מרובים ובדיקות תפקודיות של התאוששות. מודל זה מאפשר לחוקרים לערוך השוואות בין מודלים אחרים שעשויים להיות רלוונטיים להשוואות כגון אלה המתארים היפרתרמיה ממאירה או rhabdomyolysis24,25,26.
מודל פרה-אקליני זה מבטל גורמי לחץ מיותרים, כגון שימוש בגירוי חשמלי, בדיקות רקטליות, הרדמה או ניתוקי Tc קבועים מראש. יתר על כן, הוא מדגיש הבדלי מין וסובלנות מולדת ל- EHS. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לדבוק בהם. לדוגמה, עליות קלות בלחות יחסית עשויות להאריך את משך הפרוטוקול מכיוון שהעכברים מסוגלים להשתמש בלטייה של אדי מים כדי לקרר את עצמם (בניגוד להשפעות הלחות בבני אדם)19. כמו כן, חשוב לציין כי בעת שימוש במצב S, הכלוב הריק חייב להישמר בתוך התא במהלך כל תקופת הבדיקה. אם הכלוב נשאר מחוץ לתא, חשוף לטמפרטורת החדר, הוא יוצר שיפוע מספיק כדי לקרר את העכבר גם אם חזר במהירות לתא המחומם20. תכונה ייחודית אך לא בהכרח נדרשת של הפרוטוקול היא שימוש בגלגל ריצה קטן ומאולץ (קוטר 17.1 ס"מ). קוטר זה מחייב את העכברים להרים את פלג הגוף העליון שלהם כדי לפגוש את הגלגל ככל שהמהירות עולה ולעבור תיאום ניכר כדי לעמוד בקצב מהירות הגלגל ולצעוד על השלבים המרווחים של הגלגל. לכן, היעילות, המהירות והביצועים באמצעות גלגל כזה שונים בהרבה מהזמנים שבהם עכברים רצים על משטח שטוח כגון הליכון או גלגלים בקוטר גדול בהרבה הזמינים. אם נעשה שימוש בגלגלים בקוטר שונה, הנתונים לדוגמה המוצגים כאן אינם צפויים להיות מייצגים. בהתחשב בכך שפעילות הריצה מורכבת יותר בגלגל הקטן יותר, השימוש בה עשוי לדמות כראוי פעילויות מוטוריות מורכבות בחום האופייני לפעילויות מגוונות ולא פשוט לרוץ על משטחים שטוחים.
היכולת לבחור את החומרה על ידי התאמת קצב הקירור היא יתרון נוסף של מודל זה. ההתערבות הטיפולית העיקרית ידוע להיות יעיל נגד תוצאות שליליות של EHS הוא קירור מיידי מתחת 40 °C27. לכן, גישת הקירור המהיר המתוארת במודל R מומלצת למי שמנסה לתרגם הפוך פרק EHS להגדרות פעילות גופנית שבהן תחנות קירור זמינות. עם זאת, במקרים רבים אחרים, כגון בתרחישים צבאיים או אירועי ספורט הנערכים בהגדרות מרוחקות, הקורבנות נשארים לעתים קרובות בחום, לאחר קריסה, לעתים קרובות במשך שעות עד תמיכה רפואית זמינה. זה הופך את הגישה לקירור האיטי (S) למודל תקף לתוצאות חמורות יותר. ככל הנראה, גישה זו יכולה להשתנות עוד יותר כדי לספק מגוון רחב של חומרת התוצאות ולבדוק פרוטוקולי קירור.
אולי הצעד הקריטי ביותר בהליך זה הוא הבטחת השתלה נכונה של מכשיר הטמפרטורה הטלמטרי ומאפשר התאוששות בשפע לאחר הניתוח. תהליך הדלקת שלאחר מכן המעורב בהתאוששות יכול לשנות מאוד את היכולת של העכבר להגיב בחיוב לפרוטוקול EHS, כמו זיהומים ודלקת הוכחו להשפיע על תגובות thermoregulatory במהלך EHS שלילי3,27. תפירה נכונה הכרחית להצלחת הניתוח ולקידום ריפוי פצעים תקין. זה קריטי כדי להבטיח כי שכבת השריר נתפר בנפרד משכן העור. שכבת השריר צריך גם להיות חתוך רק לאורך אלבה linea כדי להבטיח איבוד דם מיותר ונזק לשריר. זה הכרחי לנהל משקע רטיב בזמנים הנכונים ולספק מספיק זמן לבעלי החיים להתאושש באופן מלא מניתוח לפני הצגת גלגלי הריצה בכלוב. העכבר חייב להיות במעקב במהלך ההתאוששות עבור סימנים ותסמינים של מצוקה וירידה במשקל.
במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, מגוון של שינויים מוצלחים נבדקו. השינוי הראשון כלל את הקצב שבו נערכה ההכשרה וחיסול החלק של הגלגל החופשי במהלך ההתאקלמות. בגלל מגבלות הציוד, האימון בוצע תוך שימוש באותו פרוטוקול אך עם עליות מצטברות במהירות של 0.5 מ '/דקה כל 10 דקות במשך 60 דקות; גלגל חופשי לא נוצל באימון הראשוני. שינויים קטנים אלה לא השפיעו על התוצאה הכוללת או על מצב האימון של העכבר. שינוי שני שנבדק היה מיקום העכבר במהלך העלייה בטמפרטורת התא הסביבתי. הפרוטוקול קובע כי העכבר חייב לנוח בכלוב הבית עד טמפרטורת הסביבה היעד הוא הגיע. עם זאת, כדי לחסל את פתיחת דלת התא בטמפרטורת היעד, העכבר הונח בגלגל הריצה הכפוי לנוח בזמן שהתא הגיע לטמפרטורת היעד. Tc ופעילות העכברים לא היה שונה באופן משמעותי אם העכבר נח על ההגה או בכלוב הבית במהלך תקופה זו. לבסוף, נבדקו מגוון תנאים סביבתיים הנעים בין 37.5-39.5 מעלות צלזיוס עם 30%-90% RH19. התבנית הכוללת נותרה דומה בעוד Tc, מקסימום, ומשך פעילות גופנית היה שונה. מניפולציה של טמפרטורת היעד והלחות ולכן ניתן להתאים מטרות מחקר בודדות.
ישנן מספר מגבלות נוספות שיש לזכור עבור פרוטוקול זה. לדוגמה, מכיוון שהפרוטוקול מוגבל בסימפטום, העכבר לא יפעל מעבר לנקודת הקריסה, הדבר מקשה על יצירת מודל חמור יותר המבוסס על עוצמת פעילות גופנית. עם זאת, פרוטוקול הקירור שהשתנה לתקן מגבלה זו. מגבלה נוספת היא שכל טיפול או התערבות עתידיים חייבים להינתן מרחוק, לפני או אחרי פרוטוקול EHS. אם החיה הייתה צריכה להיעצר לניהול טיפולי, ה- Tc היה יורד מיד, ופרופיל התרמו-רגולציה היה משתנה.
למרות שמגבלות אלה מציגות מספר בעיות לוגיסטיות, דגם זה מציג תכונות מועילות בהשוואה לדגמים אחרים שהפעילו גירויים מלחיצים או ציוד פולשני. בעתיד, מודל זה יכול לשמש כדי לחשוף את המנגנונים שבבסיס EHS ולבדוק התערבויות חדשניות שעלולות לעכב את הופעת EHS או למנוע את תפקוד לקוי מרובה איברים המתפתחת. לסיכום, פרוטוקול זה קובע קווים מנחים לביצוע מודל פרה-קליני אמין של EHS בעכברים ובתקווה מזהה את המלכודות הפוטנציאליות שיש להימנע מהן בעת יצירה מחדש של גישה זו בסביבות אחרות ובחקירות עתידיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף. כל העבודה שבוצעה וכל התמיכה בפרויקט זה נוצרו באוניברסיטת פלורידה.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה W81XWH-15-2-0038 (TLC) ו BA180078 (TLC) וקרן BK ובטי סטיבנס (TLC). JMA נתמך בסיוע כספי מממלכת ערב הסעודית. מישל קינג הייתה עם אוניברסיטת פלורידה בזמן שהמחקר הזה נערך. כיום היא מועסקת על ידי המכון למדעי הספורט Gatorade, חטיבה של פפסיקו מו"פ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit | LaView | ||
| 5-0 Coated Vicryl Violet Braided | Ethicon | ||
| 5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament | Ethicon | ||
| Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18 | Jorgensen Labset al. | ||
| BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201 | BK Precision | ||
| DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit | DR Instruments | ||
| Energizer Power Supply | Starr Life Sciences | ||
| G2 Emitteret al. | Starr Life Sciences | ||
| Layfayette Motorized Wheel Model #80840B | Layfayette | ||
| Patterson Veterinary Isoflurane | Patterson Veterinary | ||
| Platform receiveret al. | Starr Life Sciences | ||
| Scientific Environmental Chamber Model 3911 | ThermoForma | ||
| Training Wheels | Columbus Inst. |
References
- Leon, L. R., Bouchama, A.
- Laitano, O., Leon, L. R., Roberts, W. O., Sawka, M. N. Controversies in exertional heat stroke diagnosis, prevention, and treatment. Journal of Applied Physiology. 127 (5), 1338-1348 (2019).
- King, M. A., et al. Influence of prior illness on exertional heat stroke presentation and outcome. PLOS One. 14 (8), 0221329 (2019).
- Carter, R., et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (8), 1338-1344 (2005).
- Howe, A. S., Boden, B. P.
- Wallace, R. F., Kriebel, D., Punnett, L., Wegman, D. H., Amoroso, P. J. Prior heat illness hospitalization and risk of early death. Environmental Research. 104 (2), 290-295 (2007).
- Wang, J. -C., et al. The association between heat stroke and subsequent cardiovascular diseases. PLOS One. 14 (2), 0211386 (2019).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. Journal of Applied Physiology. 100 (4), 1400-1409 (2006).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288 (1), 197-204 (2005).
- Leon, L. R., Gordon, C. J., Helwig, B. G., Rufolo, D. M., Blaha, M. D. Thermoregulatory, behavioral, and metabolic responses to heatstroke in a conscious mouse model. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299 (1), 241-248 (2010).
- King, M. A., Leon, L. R., Morse, D. A., Clanton, T. L. Unique cytokine and chemokine responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 296-306 (2016).
- Costa, K. A., et al. l-Arginine supplementation prevents increases in intestinal permeability and bacterial translocation in Male Swiss mice subjected to physical exercise under environmental heat stress. The Journal of Nutrition. 144 (2), 218-223 (2014).
- Hubbard, R. W. Effects of exercise in the heat on predisposition to heatstroke. Medicine and Science in Sports. 11 (1), 66-71 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Rat model of acute heatstroke mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 42 (6), 809-816 (1977).
- Hubbard, R. W., et al. Diagnostic significance of selected serum enzymes in a rat heatstroke model. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 46 (2), 334-339 (1979).
- Hubbard, R. W., et al. Role of physical effort in the etiology of rat heatstroke injury and mortality. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 45 (3), 463-468 (1978).
- Garcia, C. K., et al. Sex-dependent responses to exertional heat stroke in mice. Journal of Applied Physiology. 125 (3), Bethesda, Md. 841-849 (2018).
- Garcia, C. K., et al. Effects of Ibuprofen during Exertional Heat Stroke in Mice. Medicine and Science in Sports and Exercise. 52 (9), 1870-1878 (2020).
- King, M. A., Leon, L. R., Mustico, D. L., Haines, J. M., Clanton, T. L. Biomarkers of multi-organ injury in a pre-clinical model of exertional heat stroke. Journal of Applied Physiology. 118 (10), Bethesda, Md. (2015).
- Murray, K. O., et al. Exertional heat stroke leads to concurrent long-term epigenetic memory, immunosuppression and altered heat shock response in female mice. The Journal of Physiology. 599 (1), 119-141 (2021).
- Leon, L. R., DuBose, D. A., Mason, C. W. Heat stress induces a biphasic thermoregulatory response in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 288, 197-204 (2005).
- Laitano, O., et al. Delayed metabolic dysfunction in myocardium following exertional heat stroke in mice. The Journal of Physiology. 598 (5), 967-985 (2020).
- Iwaniec, J., et al. Acute phase response to exertional heat stroke in mice. Experimental Physiology. 106 (1), 222-232 (2020).
- He, S. -X., et al. Optimization of a rhabdomyolysis model in mice with exertional heat stroke mouse model of EHS-rhabdomyolysis. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Lopez, J. R., Kaura, V., Diggle, C. P., Hopkins, P. M., Allen, P. D. Malignant hyperthermia, environmental heat stress, and intracellular calcium dysregulation in a mouse model expressing the p.G2435R variant of RYR1. British Journal of Anaesthesia. 121 (4), 953-961 (2018).
- Laitano, O., Murray, K. O., Leon, L. R. Overlapping mechanisms of exertional heat stroke and malignant hyperthermia: evidence vs. conjecture. Sports Medicine. 50 (9), Auckland, N.Z. 115-123 (2020).
- Casa, D. J., Armstrong, L. E., Kenny, G. P., O'Connor, F. G., Huggins, R. A. Exertional heat stroke: new concepts regarding cause and care. Current Sports Medicine Reports. 11 (3), 115-123 (2012).
