Summary
Bu protokol, Escherichia coli'nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.
Abstract
Hücresiz gen ekspresyasyonu, canlı bir organizmanın komplikasyonları olmadan biyolojinin gücünü sunar. Bu tür birçok gen ekspresyon sistemi olmasına rağmen, çoğu satın almak için oldukça pahalıdır ve / veya etkili bir şekilde üretmek için özel ekipman ve ince honlanmış uzmanlık gerektirir. Bu protokol, sadece standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak ve minimum işlem gerektiren, yüksek düzeyde gen ekspresyonını destekleyen bakteri hücresiz lisat üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, büyümeyi etkilemeyen, ancak basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben hasat edilen bir hücre peletini verimli bir şekilde yukan bir endolysin üreten bir Escherichia coli suşu kullanır. Gerekli olan tek işlem, hücresel kalıntıların otomatik olarak temizlenmesi için kısa bir inkübasyon ve ardından santrifüjlemedir. Dinamik gen devreleri, hasattan önce hücrelerdeki ClpX proteazının heterolog ifadesi ile elde edilebilir. LacZ geni olmayan bir E. coli suşu, kolorimetrik veya floresan bir okuma kullanılarak yüksek hassasiyetli, hücresiz biyosens uygulamaları için kullanılabilir. Tüm protokol, aşılamadan tamamlanmaya kadar sadece 1-2 saatlik uygulamalı çalışma ile 8-9 saat kadar az bir süre gerektirir. Hücre içermeyen lisat elde etmek için maliyeti ve zamanı azaltarak, bu yöntem çeşitli uygulamalar için hücresiz gen ekspresyonunun karşılanabilirliğini artırmalıdır.
Introduction
Hücresiz lisatlarda gen ekspresyoz, canlı hücreler1, 2,3,4kullanma konusunda çeşitliavantajlarasahiptir. Lysates biyokimyasal olarak kolayca değiştirilebilir ve canlı hücrelerde elde edilmesi zararlı veya imkansız olabilecek koşullarda kullanılabilir. Gen ekspresyon devreleri konak biyolojik süreçlerle uğraşmak veya rekabet etmek zorunda değildir ve yeni genetik devreleri test etmek DNA eklemek kadar basittir. Bu nedenlerden dolayı, hücresiz gen ekspresyözü biyosensörlerden5,6'dan hızlı prototipleme sentetik gen devrelerine 7 ,8'den yapay hücreler geliştirmeye kadar çeşitli uygulamalar bulmuş9. Çoğu hücresiz gen ekspresyasyonu, genellikle uzun ve karmaşık protokoller, özel ekipmanlar ve / veya kullanıcılar ve partiler arasında önemli farklılıklara yol açabilecek hassas adımlar gerektiren, yüksek oranda işlenmiş hücresel lysates kullanır10,11.
Bu makalede, minimum işleme ve uzmanlık gerektiren hücresiz lisat üretmek için basit ve verimli bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1A)12. Yöntem, basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben iyse için tasarlanmış E. coli hücrelerine dayanır. Hücreler, hücre duvarını bozan faj lambda'dan bir endolysin ifade eder. Hücreler büyüdükçe, bu endolysin hücre duvarından inzit edilen sitoplazmda kalır. Bununla birlikte, basit bir donma-çözülme döngüsü sitoplazmik zarı bozar, endolizi periplazma bırakır, burada hücre duvarını bozar ve hızlı hücre lizisine neden olur. Protokol sadece birkaç saatlik uygulamalı çalışma ile tamamlanabilir ve sadece bir dondurucu, 30.000 × g kapasiteli bir santrifüj (optimum sonuçlar için; peleti rahatsız etmemek için daha düşük hızlar kullanılabilir), bir girdap karıştırıcısı ve basit bir tampon çözeltisi gerektirir. Fonksiyonel lisat, hücrelerin dondurularak kurutılması ve yerinde yeniden sulandırılmasıyla bile üretilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, muhtemelen kalan hücre kalıntıları nedeniyle daha düşük aktiviteye sahip lysates üretir.
Lysates hücresiz gen ekspresyonu için oldukça aktiftir ve son kullanıma bağlı olarak çeşitli şekillerde geliştirilebilir. Protein sentezi oranı, standart spin konsantratörleri kullanılarak lizat konsantre edilerek daha da arttırılabilir. Doğrusal DNA, saflaştırılmış GamS proteini eklenerek bozulmaya karşı korunabilir. Salınım gibi daha karmaşık devre dinamikleri için gerekli olan protein bozulması, otolisat üreten gerinim13'tebir ClpX heksamerinin birlikte ifade edilmesiyle elde edilebilir. Son olarak, LacZ tabanlı görsel okumalar, lacZolmayan otomatik olarak bir gerinim kullanılarak etkinleştirilir. Genel olarak, bu yöntem çok çeşitli uygulamalar için uygun olan son derece aktif hücresiz lisat üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ortam ve tamponlar hazırlayın.
- 2xYTPG ortamı hazırlayın.
- 62 g 2xYT tozu, 5.99 g potasyum fosfat monobasik, 13.93 g potasyum fosfat dibasik ve deiyonize suyu 2 L'ye karıştırın.
- 30 dk14maruz kalma süresi ile sıvı döngüsü üzerinde otoklav.
- 1.1.2'den 400 mL 2xYTP ortama 7.2 g D-glikoz (dekstroz) ekleyin ve çözünene kadar karıştırın.
- 0,2 μm filtre ile filtre sterilize edin.
- S30A arabelleği hazırlayın.
- Tris-HCl (pH 7.7, 50 mM son konsantrasyon), potasyum glutamat (60 mM final) ve magnezyum glutamat (14 mM final) karıştırın.
- 10 M KOH kullanarak pH'ı 7,7'ye ayarlayın.
- Çözüm 1'i Hazırlayın (bkz. Tablo 1).
- 2 mL suda 4-(2-hidroksyetil)-1- piperazineethanesülonik asit (HEPES) resuspend.
- KOH kullanarak pH'ı 8.0'a ayarlayın.
- Tablo 1'dendiğer tüm bileşenleri ekleyin.
- 10 M KOH kullanarak pH'ı 7,6'ya ayarlayın. Filtre sterilize edin.
- 2,5x premiks çözeltisi hazırlayın (bkz. Tablo 2).
- Tablo 2'dekitüm bileşenleri karıştırın.
- KOH kullanarak pH'ı 7,5'e ayarlayın.
- Aliquot ve donma -80 °C.
NOT: 20 μL reaksiyon 8,9 μL premiks kullanır.
2. Hücreleri hazırlayın.
- Otomatik olarak hücreleri aşılayıcı bir döngü kullanarak 50 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakalarına dizin ve 37 °C'de büyüyün (bkz. Not 1).
- Bir pipet ucu kullanarak LB/ampisilin ortamının başlangıç kültürüne tek bir koloni seçin ve bir gecede 37 °C'de büyüyün.
- 400 μL başlangıç kültürüne sahip 50 μg/mL ampisilin içeren 2xYTPG ortamının 400 mL'lik kısmını aşıla ve 1 L Erlenmeyer şişesinde 37 °C'de büyüyerek 300 rpm'de sallanır.
- 1 cm yol uzunluğuna sahip bir optik cuvette okumak için spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu periyodik olarak 600 nm (OD600)olarak ölçün. OD600 1'i aştığında, ölçümlerin tipik bir laboratuvar spektrofotometresinin doğrusal aralığında kalmasını sağlamak için ölçümlerden önce kültürü 5 kat seyreltmeye başlayın. 5 kat seyreltilmiş kültür0,3'ün 600'üne ulaşana kadar hücreleri büyütmeye devam edin (1,5'in600'ün bir kültür OD'sine karşılık gelen).
3. Lisat hazırlayın.
- 2 mM dithiothreitol (DTT) ile desteklenmiş S30A tampon hazırlayın. 3 mL S30A tamponunu 1 M'de 6 μL DTT stok çözeltisi ile karıştırın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1800 × g'da santrifüjleme yaparak hücreleri hasat edin.
- Üstnatantı dökerek ve kalan sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanarak atın.
- Peleti 45 mL soğuk (4-10 °C) S30A tamponunda bir girdap karıştırıcı kullanarak yeniden depolayın.
- Boş bir 50 mL santrifüj tüpü tartın, hücreleri içine aktarın ve hücreleri yıkamak için 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Boş bir 50 mL tüpün ağırlığını çıkararak peleni tartın. Pelet ağırlığının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için kalan herhangi bir üst öğeyi dikkatlice aspire ettiğinden emin olun.
NOT: Tipik bir verim, 400 mL üretim kültüründen ~1,3 g hücre pelezidir. - Her 1 g hücre peleti için 2 mM dithiothreitol, yani 2 mL tampon ile desteklenmiş 2 hacim soğuk S30A tampon ekleyin ve güçlü bir şekilde girdap karıştırma ile hücreleri yeniden depolayın.
- Hücreleri dondurun. Hücreleri içeren 50 mL'lik tüpü pelet iyice donana kadar -20 °C veya -80 °C dondurucuya yerleştirin.
NOT: Donma adımı gün için iyi bir durma noktasıdır. - Oda sıcaklığındaki su banyosundaki hücreleri çözün.
- 2-3 dakika boyunca güçlü bir şekilde girdap.
- 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatır ve 300 rpm'de sallan.
- 4 °C'de 45 dakika boyunca 30.000 × g'da şeffaf santrifüj tüplerinde santrifüjleme yaparak ağır hücresel döküntü örneğini temizleyin.
NOT: 30.000 x g kapasiteli bir santrifüj mevcut değilse, 21.000 × g'da45 dakika santrifüj kullanın ve pelet daha az kompakt olacağından 3.13. - Peletin mümkün olduğunca rahatsız edilmesine karşı, süpernatant'ı bir pipet ile yeni bir tüpe dikkatlice aktarın. Aktarılan süpernatant peletten elde edilen malzeme ile kirlenmişse, önceki adımı tekrarlayın.
- Süpernatantı 1,5 mL santrifüj tüplerine ve santrifüje bir kez daha 21.000 × g'da (veya masa üstü santrifüjün maksimum hızına) 5 dakika aktarın.
- Temizlenen otolizotu istenen hacimlere aliquot, kalan peletlerden dikkatlice kaçının ve -80 ° C'de dondurun veya hemen kullanın.
NOT: Tek bir 20 μL reaksiyon 8 μL otomatik tamamlama kullanır.
4. Hücresiz gen ekspresyolü
NOT: Otomatik kullanım artık istenen son kullanım için hazırdır. Aşağıda, hücresiz gen ekspresyolü için örnek bir standart protokol verilmiştir.
- 20 μL reaksiyon için, buz üzerinde karıştırın 8 μL otomatik ve 8.9 μL premiks. Magnezyum glutamat ve PEG 8000 konsantrasyonlarının optimizasyonu ile ilgili protokol bölümünün sonundaki NOT'a bakın.
- DNA (örneğin, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500'ü 8 nM'lik son konsantrasyona), diğer reaktifleri ve suyu 20 μL'ye ekleyin.
- Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya yerleştirin ve bir plaka okuyucu kullanarak floresan zaman seyrini ve/veya uç noktaları ölçün. Yeşil floresan protein (GFP) için 485 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 520 nm emisyon dalga boyu kullanın.
5. Protokol değişiklikleri
NOT: Protokolün aşağıdaki değişiklikleri, diğer uygulamalara hizmet etmesini sağlar.
- Doğrusal DNA şablonları kullanarak hücresiz gen ekspresyolü
- Doğrusal DNA'nın eklenmesinden önce reaksiyonun 2.2 μM saflaştırılmış GamS proteini(12'deaçıklandığı gibi ifade edilir ve saflaştırılmıştır) ile desteklenerek bölüm 4'teki adımları uygulayın.
- Protein bozulmasını içeren hücresiz gen ekspresyasyonu
- Adım 2.1'de, plazmid pACYC-FLAG-dN6-His içeren hücreleri otomatik olarak kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm büyüme ortamlarında ayrıca 34 μg/mL kloramfenikol ekleyin.
- Adım 2.3'te, plazmidden ifadeyi indük etmek için büyüme ortamına 40 μM izopropil β-D-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) ekleyin.
- Çeviri inhibitörü olan kloramfenikolün tamamen çıkarılmasını sağlamak için 3.2-3.4 (yıkama) adımlarını iki kez (toplam üç yıkama için) tekrarlayın. İlk iki yıkama için (adım 3.4), S30A tamponu fosfat tamponlu salin (pH 7.4) ile değiştirin.
- Adım 4.2'de, ClpXP'nin yüksek ATP kullanımını telafi etmek için ek 3 mM ATP (sudaki 100 mM ATP stok çözeltisinden eklenen, pH 7.2) ve 4.5 mM magnezyum glutamat (suda 1 M stok çözeltisi kullanılarak) (son konsantrasyonlar) ile takviye ve ek ATP ile magnezyum şelasyonu.
- LacZ tabanlı okumalar kullanarak hücresiz gen ifadesi (kolorimetrik dahil)
- Adım 2.1'de, LacZ'yi yerel olarak ifade etmeyen hücreleri otomatik olarak kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Alternatif olarak, lisat doğrudan dondurularak kurutulmuş hücrelerden hazırlayın.
- 1.1 ile 3.7 arasında tüm adımları gerçekleştirin.
- 8 μL hücre süspansiyonu ile 8,9 μL premiksi karıştırın.
- 20 μL'lik son hacme ulaşmak için plazmid DNA (istenirse), diğer özel reaktifler ve su ekleyin.
- Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya aktarın ve dondurarak kurutun.
NOT: Dondurularak kurutulmuş numuneler bir haftaya kadar ve muhtemelen daha uzun süre saklanabilir. - Reaksiyona başlamak için, istenen DNA veya diğer reaktiflerle desteklenmiş 18 μL deiyonize su ile yeniden sulandırın.
- Bir plaka okuyucusunda floresan dinamiklerini izleyin.
NOT 1: Otomatik olarak hücreleri dondurma-çözme döngüsü üzerine sulayacak şekilde tasarlanmıştır, bu nedenle donmuş stoklar yaparken kriyoprotektant kullanmak özellikle önemlidir. Stokları % 24 wt / vol gliserolde dondurduk ve -80 ° C'de depoladık.
NOT 2: Magnezyum iyonları ve PEG 8000, lysate performansı için kritik öneme sahiptir. Daha önce yayınlanan verilere dayanan 2,5x baz premiks, son reaksiyonda sırasıyla 2,4 mM ve% 1,9 olan 6 mM magnezyum glutamat ve% 4,8 wt / vol PEG 8000 içerir. Buradaki protokolle hazırlanan otomatikleştirme, tipik olarak son reaksiyonda ek 5 mM Mg-glutamat ve% 1.5 PEG 8000 ile en iyi performansı gösterir. Bununla birlikte, bu ek bir 0-10 mM Mg glutamat ve ek bir% 0-3 PEG 8000 aralığında optimize edilebilir (baz premiks ile karşılaştırıldığında). Premiksi önerilen ek 5 mM Mg-glutamat ve % 1,5 PEG 8000 (son konsantrasyonlar) ile hazırlamak için, 380 μL premiksi 1 M'de 4,75 μL magnezyum glutamat ve % 40 ağırlıkta / hacimde 36,1 μL PEG 8000 ile karıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar, GFP'yi bir konsitütif olarak ifade eden plazmidden ifade etmek için otomatik olarak kullanılarak, burada pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 ve bir plaka okuyucusunda GFP floresanının bir zaman seyrini kaydederek gözlemlenebilir (Şekil 1B). Bir seyreltme serisi plazmid DNA,1 nM DNA'da bile güçlü bir ifade buldu. Ticari olarak mevcut bir lisate ile karşılaştırıldığında, otolisat daha fazla toplam verim üretebilir ve GFP zaman kursunun zaman türevi olarak hesaplanan daha yüksek bir maksimum üretim oranı elde edebilir (Şekil 1C,D). Bu yöntemi kullanarak ek sonuçlar için,bkz. Bu iletişim kuralının nispeten az hata noktası vardır; ancak, otolisat hücre kalıntılarından yeterince temizlenmezse, yetersiz sonuçlar elde edilebilir. Optimum sonuçlar ayrıca her bir lisat grubu için PEG-8000 ve Mg2+ konsantrasyonlarının optimize edilmesini gerektirebilir (bkz.
Şekil 1: Temsili sonuçlar. (A) Protokolün görsel gösterimi. (B) Otomatik olarak dondurularak çözülmede pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500'den GFP ifadesinin örnek zaman dilimi. 2 farklı laboratuvarda 2 farklı araştırmacı tarafından hazırlanan maksimum GFP üretimi (C) ve maksimum üretim oranı(D) ticari referans lisatına (turuncu, MYtxtl-70-960M) kıyasla 30.000 x g santrifüj (mavi ve turuncu) veya 20.000 x g santrifüj (mor) kullanarak. Tüm hata çubukları, iki teknik yinelemenin mutlak hatası anlamına gelir. Bu rakam 12'den değiştirilmiştir. Telif Hakkı 2017 Amerikan Kimya Derneği. Kısaltma: GFP = yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm 1: Toplam 4 mL'ye su ekleyin | |
| Ad | Ağırlık (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| kamp | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Folik asit | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Spermidin | 8.1 |
| tRNA'lar | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tablo 1: Çözüm 1. Çözeltinin bileşenleri 1.
| 2,5x Premiks | |
| Reaktif | Hacim (μL) |
| 20 mM'de olan lösin hariç her biri 24 mM içeren amino asit karışımı | 2500 |
| dithiothreitol (DTT) 100 mM'de | 100 |
| 1 M'de magnezyum glutamat | 25 |
| PEG-8000 % 40 wt / vol'da | 500 |
| 2 M'de potasyum glutamat | 303 |
| Çözüm 1 (bkz. Tablo 1) | 714.3 |
Tablo 2: Premiks. Premiks çözeltisinin bileşenleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, hücresiz gen ekspresyözü için oldukça aktif bakteriyel lisat verir. Anahtar, lambda faj endolizini sitolizik olarak ifade eden plazmid pAD-LyseR'i taşıyan hücreleri kullanmaktır. Bu hücreler, iç zarın permeabilizasyonu üzerine kendilerini izlendirmek için güçlenir ve endolysin'in hücre duvarına erişmesini sağlar, bu da yöntemin basit bir donma-çözülme döngüsü ile elde ettiği. Hücreler kendilerini etkili bir şekilde uzatır çünkü, ürün otomatik olarak adlandırılır. Hücreler yutulduktan sonra, geriye kalan tek adımlar hücresel kalıntıların otomatik olarak temizlenmesi için inkübasyon ve santrifüjlemedir.
Bakteriyel lisat üretmek için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım özellikle basit ve hızlıdır, ancak lisat kalitesini feda etmez. Protokol, üretim kültürünü aşıladıktan sonra sadece 1-2 saatlik uygulamalı emekle 8-9 saat içinde tamamlanabilir. Moleküler biyoloji laboratuvarları için tamamen standart olmayan önerilen tek ekipman, 30.000 × g'aulaşabilen bir santrifüjdür. Bununla birlikte, karşılaştırılabilir kalitede otomatik olarak üretilebilir, daha düşük hızlı bir santrifüjle bile üretilebilir(Şekil 1C, D); kullanıcının peletten lisatı çıkarırken daha dikkatli olması gerekir, belki de temiz numuneler sağlamak için biraz daha fazla sıvı bırakır. Bu basitlik sadece bir kolaylık meselesi değildir; daha az karmaşık protokoller, farklı ellerle gerçekleştirildiğinde daha az varyasyonla daha fazla tekrarlanabilir sonuç verme eğilimindedir. Diğer tüm reaktiflerle birlikte hücrelerin dondurularak kurutulduğu 5.4. Özellikle, bu modifikasyonda, hücresel kalıntıların lisatesini temizlemek için santrifüjleme adımları atlanır, bu da işleme işçiliğini daha da azaltır; ancak, kalan enkaz lysate12'den ifadeyi azaltır.
Son yıllarda, hücresiz lisat üretimine yönelik birçok yaklaşım yayınlanmıştır, son zamanlarda Cole veark. Bu çalışmalar hücre tipi, büyüme koşulları, lizis metodolojileri ve post-işleme için çeşitli stratejileri araştırmıştır. Liziz için diğer yöntemlerin çoğu Fransız presi, homojenizatör, boncuk çırpıcı veya sonicator gibi özel ekipmanlara ihtiyaç malıdır. Fujiwara ve Doi, bu ekipmanı burada açıklanana benzer bir donma-çözülme döngüsü lehine atladılar, ancak hücreleri bir endolisin ifade etmek yerine lizozim ile tedavi ederek lizise duyarlı halegetirdiler. Bu kabaca burada açıklanan kadar basit bir protokol olmasına rağmen, lysozyme ile tedavi edilen hücreler kırılgan hallerindeyken zamanından önce bozulmadan yıkanmalıdır, bu da deneysel incelik gerektirebilir ve değişkenlik kaynağı getirebilir.
Lysate'e ek olarak, hücresiz gen ekspresyonu enerji kaynakları, RNA ve protein monomerleri ve diğer küçük molekülleri içeren bir premiks çözeltisi gerektirir. Premiks tarifi daha önce açıklandı ve optimize edildi17, birkaç değişiklikle. Burada kullanılan premiks, sırasıyla 7,5 mM ve% 3,5 ağırlık / hacim nihai reaksiyon konsantrasyonlarına karşılık gelen ek magnezyum glutamat ve PEG 8000'in yanı sıra yaklaşık 4 kat daha yüksek amino asit konsantrasyonları içeriyordu. En uygun sonuçlar, yukarıdaki konsantrasyonlar sürekli olarak iyi sonuçlar üretmiş olsa da, her yeni lisat grubu için ek magnezyum glutamat ve PEG 8000 konsantrasyonlarının ayarlanmasını gerektirebilir (bkz. Benzersiz uygulamalar, örneğin ClpX destekli lysate13kullanırken bu konsantrasyonların yeniden kullanılmasını gerektirebilir.
Hücresiz lisat üretmek için standart bir E. coli suşu BL21-Gold 'dur (DE3). Otoliz plazmid pAD-LyseR içeren bu hücrelerin bir türevi bir suş ve plazmid deposunda biriktirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, LacZ tabanlı çıkış kullanan devrelerin arka planını önemli ölçüde azaltmak için genomik lacZ'den yoksun bir türev ve doğrusal DNA'yı bozulmaya karşı koruyabilen GamS proteininin saflaştırılması için kullanılacak bir ifade plazmid pAD-GamS vardır. Bu hücre suşları ve plazmidleri, hücresiz gen ekspresyonunda çeşitli uygulamalar için yararlı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H., kanser terapötiklerine odaklanan GenCirq Inc.'in kurucu ortağıdır. Yönetim Kurulu'ndadır ve GenCirq'te özkaynakları vardır.
Acknowledgments
Yazarlar Zachary Sun ve Richard Murray'e (Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü) plazmid P_araBAD-gamS'i sağladıkları için ve Kaeko Kamei'ye (Kyoto Teknoloji Enstitüsü) yüksek hızlı bir soğutma santrifüjü sağladıkları için teşekkür ediyor. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ARO MURI programından hibelerle desteklendi ve kısmen Mükemmel Genç Araştırmacılar, MEXT, Japonya Lider Girişimi tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
