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Neuroscience

माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी

Published: June 21, 2021 doi: 10.3791/62756
Automatic Translation
1, 2, 1,4, 1, 2, 3, 3, 2, 1,5
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

Summary

हम मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के मॉडलिंग में उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल रोग चयापचय की जन्मजात त्रुटियों के सबसे बड़े वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और वर्तमान में लाइलाज हैं। ये बीमारियां न्यूरोडेवलपमेंटल दोषों का कारण बनती हैं जिनके अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया जाना बाकी है। एक प्रमुख रोडब्लॉक प्रभावी मॉडल की कमी है जो रोगियों में देखी जाने वाली प्रारंभिक शुरुआत न्यूरोनल हानि को दोहराता है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की तकनीक में प्रगति तीन आयामी (3 डी) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी को सक्षम करती है जिसका उपयोग तंत्रिका तंत्र के विकास और संगठन पर बीमारियों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इन लेखकों सहित शोधकर्ताओं ने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रियल विकारों को मॉडल करने के लिए मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स पेश किए हैं। यह पेपर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की मजबूत पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग और इमेजिंग विश्लेषण में उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करता है। ये प्रयोग चयापचय और विकासात्मक शिथिलताओं की जांच करने के लिए मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के उपयोग की अनुमति देंगे और माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों की न्यूरोनल विकृति को विच्छेदित करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रियल रोग चयापचय की जन्मजात त्रुटियों के सबसे बड़े वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं1। वे विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं को बाधित करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण होते हैं, जिसमें ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) 2, श्वसन श्रृंखला असेंबली, माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिलेखन या प्रतिकृति 3 शामिल हैं। ऊर्जा आवश्यकताओं वाले ऊतक विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 4 से प्रभावित होते हैं। तदनुसार, माइटोकॉन्ड्रियल रोगों वाले रोगी आमतौर पर शुरुआती शुरुआत न्यूरोलॉजिकल अभिव्यक्तियों को विकसित करते हैं।

वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित बच्चों के लिए कोई उपचार उपलब्ध नहीं है5। माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के दवा विकास के लिए एक प्रमुख बाधा मानव रोग course6 recapitulating प्रभावी मॉडल की कमी है। वर्तमान में अध्ययन किए गए जानवरों के कई मॉडल रोगियों में मौजूद न्यूरोलॉजिकल दोषों को प्रदर्शित नहीं करते हैं7। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के न्यूरोनल पैथोलॉजी के अंतर्निहित तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं।

हाल के अध्ययनों ने माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित रोगियों से आईपीएससी उत्पन्न किया और रोगी-विशिष्ट न्यूरोनल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग किया। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम से जुड़े आनुवंशिक दोषों को सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स 8,9, प्रोटीन संश्लेषण 10, और कैल्शियम होमियोस्टैसिस 9,11 में विपथन का कारण पाया गया है। इन रिपोर्टों ने माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों में होने वाली न्यूरोनल हानि पर महत्वपूर्ण यांत्रिक सुराग प्रदान किए, जिससे इन लाइलाज बीमारियों के लिए दवा की खोज का मार्ग प्रशस्त हुआ।

दो आयामी (2 डी) संस्कृतियां, हालांकि, 3 डी अंगों की वास्तुकला जटिलता और क्षेत्रीय संगठन की जांच को सक्षम नहीं करती हैं। इस अंत तक, रोगी-विशिष्ट iPSCs14 से व्युत्पन्न 3 डी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग शोधकर्ताओं को अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने की अनुमति दे सकता है और इस प्रकार यह विच्छेदन करने में मदद कर सकता है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग तंत्रिका तंत्र के विकास और कार्य को कैसे प्रभावित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों की जांच करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को नियोजित करने वाले अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के न्यूरोडेवलपमेंटल घटकों को उजागर करना शुरू कर रहे हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल रोग, माइटोकॉन्ड्रियल एन्सेफैलोपैथी, लैक्टिक एसिडोसिस, और स्ट्रोक जैसे एपिसोड सिंड्रोम (MELAS) से जुड़े उत्परिवर्तन ों को ले जाने वाले रीढ़ की हड्डी के ऑर्गेनोइड्स ने दोषपूर्ण न्यूरोजेनेसिस और विलंबित मोटर न्यूरॉन भेदभाव 16 दिखाया। माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम के साथ रोगियों से व्युत्पन्न कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड्स ने कम आकार, तंत्रिका उपकला कली पीढ़ी में दोष, और कॉर्टिकल आर्किटेक्चर 17 के नुकसान को दिखाया। लेह सिंड्रोम के रोगियों से मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स से पता चला है कि रोग दोष तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के स्तर पर शुरू होते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय के लिए प्रतिबद्ध नहीं हो सकते हैं, जिससे अनियमित न्यूरोनल ब्रांचिंग और मॉर्फोजेनेसिस 18 होता है। इस प्रकार, तंत्रिका पूर्वज माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के लिए एक सेलुलर चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, और उनके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बढ़ावा देने वाली रणनीतियां तंत्रिका तंत्र के कार्यात्मक विकास का समर्थन कर सकती हैं।

मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के न्यूरोडेवलपमेंटल घटकों को उजागर करने में मदद कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल रोगों को मुख्य रूप से शुरुआती शुरुआत न्यूरोडीजेनेरेशन 5 के रूप में माना जाता है। हालांकि, न्यूरोडेवलपमेंटल दोष माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित रोगियों में भी मौजूद हैं, जिसमें विकास ता्मक देरी और संज्ञानात्मक हानि शामिल है। रोगी-विशिष्ट मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स इन पहलुओं को संबोधित करने में मदद कर सकते हैं और स्पष्ट कर सकते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग मानव मस्तिष्क के विकास को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन अन्य अधिक सामान्य न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में भी एक पैथोजेनेटिक भूमिका निभा सकता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और हंटिंगटन रोग 4। इसलिए, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके न्यूरोडेवलपमेंट में माइटोकॉन्ड्रियल दोषों के प्रभाव को स्पष्ट करना भी उन बीमारियों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। यह पेपर पुनरुत्पादक मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के रोग मॉडलिंग के संचालन के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: मानव iPSCs के उपयोग के लिए एक नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले आईपीएससी को स्थानीय नैतिक अनुमोदन (# 2019-681) के बाद स्वस्थ नियंत्रण व्यक्तियों से प्राप्त किया गया था। सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं को एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत किया जाना चाहिए, हुड के तहत स्थानांतरित करने से पहले सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य पदार्थों को सावधानीपूर्वक कीटाणुरहित करना चाहिए। भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मानव आईपीएससी में संभावित जीनोमिक विपथन से बचने के लिए 50 से नीचे एक मार्ग संख्या होनी चाहिए जो व्यापक संस्कृति पर हो सकती है। कोशिकाओं की प्लुरिपोटेंट स्थिति को ऑर्गेनोइड पीढ़ी से पहले मान्य किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, नैनोजी या OCT4 जैसे प्लूरिफिकेशन-संबद्ध मार्करों की अभिव्यक्ति की निगरानी करके। माइकोप्लाज्मा परीक्षण ों को माइकोप्लाज्मा-मुक्त संस्कृतियों को सुनिश्चित करने के लिए साप्ताहिक रूप से आयोजित किया जाना चाहिए।

1. मस्तिष्क organoids की पीढ़ी

  1. मानव iPSCs की संस्कृति
    1. संस्कृति iPSC माध्यम में फीडर मुक्त परिस्थितियों के तहत मानव iPSCs ( सामग्री की तालिका देखें) लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों पर और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर एक humidified ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: फीडर कोशिकाओं का कैरीओवर ऑर्गेनोइड भेदभाव को बाधित कर सकता है। फीडर-मुक्त स्थितियों में कम से कम एक बार कोशिकाओं को पारित करें।
    2. 1: 4 से 1: 12 तक के अनुपात में एंजाइम-मुक्त टुकड़ी माध्यम का उपयोग करके 80% confluency पर iPSCs को पारित करें। सेल उत्तरजीविता को बढ़ाने के लिए, प्रत्येक विभाजन के बाद 10 μM Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor (Y27632) जोड़ें।
  2. iPSCs को अलग करें (80% confluency) - दिन 0।
    1. कॉर्टिकल भेदभाव माध्यम I (CDMI) तैयार करें (तालिका 1)। प्रीवार्म सीडीएमआई माध्यम कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर इसे कोशिकाओं में जोड़ने से पहले।
    2. मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ आईपीएससी युक्त कुओं को धोएं।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए prewarmed अभिकर्मक ए (सामग्री की तालिका) के 500 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। सेल टुकड़ी सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच करें।
    4. अपनी गतिविधि को बेअसर करने के लिए अभिकर्मक ए को पतला करने के लिए आईपीएससी माध्यम का 1 एमएल जोड़ें।
    5. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक 1000 μL पिपेट का उपयोग करें और सेल निलंबन को 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. धीरे से कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए 125 x g पर iPSCs centrifuge.
    7. ध्यान से सेल गोली परेशान करने से बचने के लिए supernatant aspirate.
    8. एक एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए CDMI के 1 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, और सेल संख्या की गणना करें।
    9. CDMI में 9,000 iPSCs प्रति 100 μL के साथ 20 μM ROCK अवरोधक, 3 μM WNT-कैटेनिन अवरोधक (IWR1), और 5 μM SB431542 के साथ पूरक के साथ सीडिंग माध्यम तैयार करें।
    10. एक 96-अच्छी तरह से वी-बॉटम प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 100 μL सीडिंग माध्यम जोड़ें।
    11. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
  3. न्यूरोस्फीयर पीढ़ी
    1. दिन 1 पर, ध्यान दें कि परिभाषित चिकनी सीमाओं के साथ गोल सेल समुच्चय (न्यूरोस्फीयर) बन रहे हैं। समुच्चय के आस-पास मृत कोशिकाओं को नोट करें. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर इनक्यूबेटर में संस्कृति जारी रखें।
    2. दिन 3 पर, मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए तीन बार पक्षों पर टैप करके प्लेट को उत्तेजित करें।
    3. CDMI के 100 μL जोड़ें 20 μM रॉक अवरोधक, 3 μM IWR1, और 5 μM SB431542 प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए के साथ पूरक.
    4. प्लेट को इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर वापस कर दें।
    5. दिन 6 पर, ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से supernatant माध्यम के 80 μL निकालें। कुएं के नीचे को छूने से बचें।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 3 μM IWR1 और 5 μM SB431542 के साथ पूरक CDMI के 100 μL जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर वापस कर दें।
    7. 18 वें दिन तक हर 3 दिनों में चरण 5 और 6 को दोहराएं।
  4. न्यूरोस्फीयर का स्थानांतरण
    1. दिन 18 पर, कॉर्टिकल भेदभाव मध्यम II (CDMII) (तालिका 1) तैयार करें और 100 मिमी अल्ट्रा-कम अनुलग्नक सेल संस्कृति प्लेट में 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 96-अच्छी तरह से प्लेट से 100 मिमी अल्ट्रा-कम अनुलग्नक सेल संस्कृति प्लेट में गोल न्यूरोस्फीयर को स्थानांतरित करने के लिए टिप कट के साथ एक 200 μL पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करके न्यूरोस्फीयर को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कोमल रहें कि टिप का उद्घाटन काफी व्यापक है और समुच्चय बहुत जल्दी एस्पिरेटेड नहीं हैं।
    3. neurospheres युक्त प्लेट से माध्यम के 5 मिलीलीटर निकालें और ताजा CDMII के 5 mL जोड़ें।
      नोट: यह प्रक्रिया CDMI माध्यम की मात्रा को कम करने में मदद करती है जो न्यूरोस्फीयर के हस्तांतरण से अधिक हो सकती है।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर एक humidified ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर 70 rpm पर एक कक्षीय शेकर पर प्लेट रखें।
      नोट: नेत्रहीन अगले दिन neurospheres का निरीक्षण करें। कक्षीय शेकर की गति में वृद्धि यदि neurospheres एक साथ clumped या प्लेट के नीचे से जुड़े हुए हैं।
    5. हर 3 दिनों में, सावधानी से supernatant माध्यम aspirate और ताजा CDMII के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। neurospheres को सूखने से रोकने के लिए माध्यम की एक छोटी राशि छोड़ दें।
    6. दिन 35 पर, Cortical Differentiation Medium III (CDMIII) (तालिका 1) तैयार करें।
      नोट: मैट्रिक्स घटक ठंडे CDMIII में भंग किया जाना चाहिए।
    7. प्लेट से माध्यम aspirate और ठंड CDMIII के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
      नोट: ठंडे माध्यम का उपयोग करना अधिक प्रभावी है ताकि मैट्रिक्स घटक clumps बनाने के बिना organoids कोट कर सकते हैं।
    8. माध्यम को बदलने के बाद, प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर 70 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर वापस रखें।
    9. विकास की दर के आधार पर हर 3-5 दिनों में माध्यम को बदलें, जैसा कि माध्यम के रंग द्वारा इंगित किया गया है।
    10. दिन 70 पर, Cortical Differentiation Medium IV (CDMIV) (तालिका 1) तैयार करें। CDMIV माध्यम का उपयोग करें जब तक organoids की वांछित उम्र तक पहुँच गया है. इस अवधि के दौरान, प्लेट को एक आर्द्रीकृत ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के अंदर 70 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर सेट पर रखें।
    11. विकास दर के आधार पर हर 3-5 दिनों में माध्यम बदलें।

2. मस्तिष्क organoids के immunostaining

  1. ऊतक तैयारी
    1. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें, और इसे सुरक्षा हुड के नीचे रखें।
      नोट: पीएफए को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    2. मस्तिष्क organoids ले लीजिए और धीरे से उन्हें एक कुंद के साथ स्थानांतरित-3 mL प्लास्टिक पाश्चर पिपेट एक 6 अच्छी तरह से पीएफए से भरा प्लेट करने के लिए इत्तला दी.
      नोट: उच्च सेलुलर जटिलता के साथ संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए 40 दिनों से अधिक पुराने ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करें।
    3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीएफए समाधान में ऑर्गेनोइड्स रखें।
    4. 3 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ पीएफए को सावधानीपूर्वक हटा दें, और पीबीएस का उपयोग करके निश्चित ऑर्गेनोइड्स को तीन बार धोएं।
    5. आगे के उपयोग तक पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर निश्चित ऑर्गेनोइड्स को स्टोर करें।
  2. मस्तिष्क organoid स्लाइस की तैयारी
    1. एक 3% आगर समाधान तैयार करें और तरलीकृत होने तक धीरे-धीरे गर्म करें।
    2. मोल्ड (एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के कट अंत) को शोषक फिल्टर पेपर (चिकनी साइड अप) के एक टुकड़े पर रखें। उस पर आगर की एक बूंद रखें।
    3. जल्दी से एक स्पैटुला के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट से एक एकल ऑर्गेनोइड लें और फ़िल्टर पेपर के साथ अत्यधिक पीबीएस को हटा दें।
      नोट: सावधान रहें कि फ़िल्टर पेपर के साथ सीधे ऑर्गेनोइड को न छुएं।
    4. ऑर्गेनोइड को आगर ड्रॉपलेट पर रखें।
    5. इस प्रक्रिया को तीन ऑर्गेनोइड्स तक दोहराएं।
      नोट:: इस चरण के दौरान आगर के solidification से बचने के लिए तेजी से काम करें।
    6. अगर के साथ मोल्ड फिर से भरें जब तक कि सभी organoids पूरी तरह से कवर कर रहे हैं.
    7. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि आगर ठोस होना शुरू न हो जाए, और फिर धीरे-धीरे ऑर्गेनोइड्स युक्त पूरे मोल्ड को स्थानांतरित करें, जिसमें शोषक फ़िल्टर पेपर भी शामिल है, एक शीतलन तत्व पर।
      नोट: यदि कोई शीतलन तत्व अनुपलब्ध है, तो ऑर्गेनोइड्स को कुछ मिनटों के लिए रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    8. इस बीच, स्लाइसिंग प्रक्रिया के लिए तैयार करें: वाइब्रेटोम के धारक में एक रेजर ब्लेड (एसीटोन के साथ साफ किया गया और डबल-आसुत पानी से धोया गया) रखें, स्नान पर माउंट करें, और इसे पीबीएस के साथ भरें।
    9. मोल्ड को (ठोस) आगर से निकालें और एक क्यूब बनाने के लिए इसे ट्रिम करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
    10. चिपकने वाले जेल के साथ वाइब्रेटोम के वाहक प्लेट पर ऑर्गेनोइड्स युक्त आगर क्यूब संलग्न करें ( सामग्री की तालिका देखें), और इसे पीबीएस युक्त स्नान में रखें।
    11. 150 μm की मोटाई पर स्लाइस काटने के लिए वाइब्रेटोम ( सामग्री की तालिका देखें) को समायोजित करें।
      नोट: वाइब्रेटोम सेटिंग्स (उचित कोण, आयाम, आवृत्ति, और ब्लेड का वेग) प्रारंभिक प्रसवोत्तर जानवरों से व्युत्पन्न निश्चित मस्तिष्क ऊतक को टुकड़ा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान हो सकता है। हालांकि, आदर्श सेटिंग्स वाइब्रेटोम के प्रकार पर दृढ़ता से निर्भर करती हैं और काटने के दौरान विरूपण या यहां तक कि ऊतक को रिप करने से रोकने के लिए पहले चरण में निर्धारित की जानी चाहिए।
    12. काटने की प्रक्रिया शुरू करें। पीबीएस से भरी 24-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक ताजा कटे हुए स्लाइस को धीरे-धीरे स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास पिपेट या स्पैटुला का उपयोग करें।
    13. आगे की प्रक्रिया तक 4 डिग्री सेल्सियस (कुछ दिनों तक) पर स्लाइस युक्त प्लेट को स्टोर करें।
    14. स्लाइस को प्लेट से बाहर एक ग्लास पिपेट या माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक स्पैटुला के साथ स्थानांतरित करें। प्रति स्लाइड कम से कम 2 स्लाइस का उपयोग करें।
    15. ध्यान से एक सिरिंज के साथ आगर और अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें।
    16. स्लाइस को तब तक सूखने दें जब तक कि वे स्लाइड्स का पालन न करें।
      नोट: जबकि माइक्रोस्कोप स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस से भरे प्लास्टिक कक्षों में संग्रहीत किया जा सकता है, उन्हें स्लाइसिंग प्रक्रिया के बाद जितनी जल्दी हो सके दाग दिया जाना चाहिए।
  3. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला
    1. ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें (तालिका 1)।
    2. स्लाइड पर सभी समाधानों को रखने में मदद करने के लिए स्लाइड पर स्लाइस के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक बॉर्डर खींचने के लिए एक PAP पेन का उपयोग करें.
    3. स्लाइड पर ब्लॉकिंग समाधान को ध्यान से जोड़ें, और कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। ऊतक को नष्ट करने से बचने के लिए, स्लाइस के शीर्ष पर सीधे समाधान न जोड़ें।
    4. अवरुद्ध समाधान aspirate और अवरुद्ध समाधान में पतला वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में रात भर स्लाइड इनक्यूबेट.
    6. प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ स्लाइड को तीन बार कुल्ला।
    7. ब्लॉकिंग समाधान में पतला विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइस को इनक्यूबेट करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए होचस्ट स्टेनिंग (1: 2,500) करें।
      नोट:: कोई गैर-विशिष्ट बाइंडिंग या स्वत:-प्रतिदीप्ति हैं की पुष्टि करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए याद रखें।
    8. अंधेरे में प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार कुल्ला।
    9. स्लाइस में बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें, ड्रॉप के किनारे पर एक कवरस्लिप रखें, और धीरे-धीरे हवा के बुलबुले से बचने के लिए स्लाइस की ओर कवरस्लिप को नीचे रखें।
    10. स्लाइड को कमरे के तापमान पर रात भर आराम करने की अनुमति दें। स्लाइड को और सील करने के लिए कवरस्लिप की सीमा पर नेल पॉलिश लागू करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. धुंधला करने का प्रलेखन
    1. सिलाई के लिए बड़ी छवियों को स्कैन करने के लिए, एक उच्च गुणवत्ता वाले उद्देश्य से सुसज्जित एक मोटरचालित सीधा चौड़ा क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें); DAPI फ़िल्टर सेट (उदाहरण के लिए, उत्तेजना (EX): 340-380 nm, dichroic दर्पण (DM): 400 nm, बाधा फ़िल्टर (BA): 435-485 nm); फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट फ़िल्टर सेट (उदाहरण के लिए, पूर्व: 465-495 एनएम, डीएम: 505 एनएम, बीए: 515-555 एनएम); Alexa594 फ़िल्टर सेट (उदाहरण के लिए, ET 575/40; टी 600 LPXR; HC 623/24); डिजिटल कैमरा; उच्च प्रदर्शन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्वचालित टांके और स्टैक संचालन के लिए अनुमति देता है।
    2. छवि हैंडलिंग के लिए, एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करें जो 8-बिट टिफ-फाइलें उत्पन्न करने, टांके क्रॉप करने, कंट्रास्ट और चमक को समायोजित करने, चैनलों को विलय करने (जैसे, नीले, हरे और लाल) को मर्ज करने और स्केल बार जोड़ने में सक्षम है।
    3. विवरण को स्कैन करने के लिए, एक उच्च गुणवत्ता वाले उद्देश्य से सुसज्जित एक मोटरचालित कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, एक यूवी लेजर (पूर्व: 408 एनएम), एक आर्गन लेजर (पूर्व: 488 एनएम), एक हीलियम-नियॉन लेजर (पूर्व: 543), एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर।
    4. विवरण की छवि हैंडलिंग के लिए, एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करें जो कॉन्फोकल जेड-स्टैक (उदाहरण के लिए, प्रत्येक 0.6 μm के ऑप्टिकल वर्गों) के अधिकतम-तीव्रता अनुमानों को उत्पन्न करने में सक्षम है, 8-बिट टिफ-फाइलें उत्पन्न करता है, इसके विपरीत और चमक को समायोजित करता है, चैनलों को विलय करता है (जैसे, नीला, हरा और लाल), स्केल सलाखों को जोड़ना।
    5. आंकड़ों को व्यवस्थित करने के लिए ग्राफ़िक संपादक का उपयोग करें.

3. मस्तिष्क organoids के Bioenergetic प्रोफाइलिंग

  1. बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग के लिए ऑर्गेनोइड्स की तैयारी
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पपेन और डीएनएस समाधान तैयार करें।
    2. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में 3-5 organoids हस्तांतरण। उन्हें prewarmed PBS के साथ दो बार धोएं।
    3. DNase युक्त prewarmed सक्रिय पपेन समाधान के 2 mL जोड़ें। ब्लेड का उपयोग करके, ऑर्गेनोइड्स को छोटे टुकड़ों में काट लें।
    4. प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर) के अंदर 27 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर सेट पर रखें, और 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन का समय ऑर्गेनोइड चरण पर निर्भर करता है। प्रारंभिक चरण के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जा सकता है जैसे वे हैं। 3 महीने से अधिक पुराने ऑर्गेनोइड्स के लिए, पृथक्करण से पहले ऑर्गेनोइड्स को 2-3 टुकड़ों में काटने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए 27 आरपीएम पर सेट की गई रॉकिंग गति से टुकड़ों को इनक्यूबेट करने की सिफारिश की जाती है। यह प्रक्रिया नेक्रोटिक ऊतक को हटाने में मदद कर सकती है जो बाद के चरण के ऑर्गेनोइड्स में मौजूद हो सकती है।
    5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पचे हुए ऊतकों को इकट्ठा करें और ऑर्गेनोइड कल्चर माध्यम CDMIV (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. 10-15 बार ऊपर और नीचे पिपेट करके 10 मिलीलीटर प्लास्टिक पिपेट के साथ ऊतक को ट्राइट्यूरेट करें। अविच्छिन्न ऊतक को ट्यूब के नीचे बसने दें।
    7. ध्यान से सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, अविच्छिन्न ऊतक के किसी भी टुकड़े से बचें। एक 40 μm सेल छलनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर (उदाहरण के लिए, सेल छलनी टोपी के साथ polystyrene गोल नीचे ट्यूब).
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं गोली.
    9. ट्राइपैन नीले रंग का उपयोग करके सेल नंबर और गुणवत्ता का आकलन करें।
    10. लेपित 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर कोशिकाओं की वांछित संख्या (~ 20,000 / अच्छी तरह से) प्लेट करें। न्यूरोनल माध्यम (तालिका 1) में चढ़ाना के बाद माध्यम 6-8 घंटे बदलें।
    11. 4 दिनों के लिए एक CO2 इनक्यूबेटर (37 °C, 5% CO2) में लेपित 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. जैव ऊर्जावादी प्रोफाइलिंग
    1. अलग-अलग कोशिकाओं को फिर से तैयार करने के बाद दिन 3 पर, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के निचले हिस्से के प्रत्येक कुएं में अंशांकन समाधान के 200 μL जोड़ें, और हाइड्रेटेड माइक्रोप्लेट पर शीर्ष हरे सेंसर कारतूस को रखें।
      नोट:: सही अभिविन्यास में माइक्रोप्लेट के शीर्ष पर सेंसर कारतूस रखें, और सुनिश्चित करें कि कैलिब्रेंट समाधान सभी सेंसर को कवर करता है।
    2. हाइड्रेटेड 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. उपकरण को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करने की अनुमति देने के लिए विश्लेषक को चालू करें।
    4. Replating के बाद दिन 4 पर, माइक्रोस्कोप के नीचे 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर असंबद्ध ऑर्गेनोइड संस्कृति का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं एक confluent monolayer के रूप में दिखाई देती हैं।
    5. परख मध्यम तैयार करें (तालिका 1).
    6. सेल क्षति को रोकने के लिए अच्छी तरह से नीचे को छूने के बिना एक पिपेट के साथ सभी कुओं से न्यूरोनल माध्यम निकालें। वैकल्पिक रूप से, पूरी प्लेट को ध्यान से उलटें और फिर इसे साफ कागज पर सुखाएं। सेल की मौत से बचने के लिए जल्दी से काम करें।
    7. परख माध्यम के prewarmed 200 μL के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। अच्छी तरह से प्रति 180 μL की एक अंतिम मात्रा के लिए परख मध्यम जोड़ें. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को इनक्यूबेट करें।
    8. परख माध्यम में माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के 10 μM समाधान तैयार करें। ध्यान दें कि इंजेक्शन के बाद अंतिम एकाग्रता 1 μM है।
    9. माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के 10x समाधान के साथ हाइड्रेटेड माइक्रोप्लेट में रखे गए सेंसर कारतूस को लोड करें।
      1. पोर्ट ए में माइटोकॉन्ड्रियल इनहिबिटर 1 के 18 μL जोड़ें।
      2. पोर्ट बी में माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधक 2 के 19.8 μL जोड़ें।
      3. पोर्ट सी में माइटोकॉन्ड्रियल इनहिबिटर 2 के 21.6 μL जोड़ें।
      4. पोर्ट डी में माइटोकॉन्ड्रियल इनहिबिटर 3 के 23.4 μL जोड़ें।
    10. परख की शुरुआत तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-CO2 इनक्यूबेटर में हाइड्रेटेड माइक्रोप्लेट में लोड किए गए कारतूस रखें।
    11. उपकरण के सॉफ़्टवेयर (तालिका 2) में एक चल रहे प्रोटोकॉल सेट अप करें।
    12. START दबाएँ. गैर-CO2 इनक्यूबेटर से लोड किए गए कारतूस लें और इसे अंशांकन के लिए विश्लेषक में रखें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि प्लेट सही ओरिएंटेशन में और ढक्कन के बिना डाला गया है।
    13. अंशांकन चरण समाप्त होने के बाद, अंशांकन प्लेट को हटा दें। गैर-CO2 इनक्यूबेटर से 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट लें और इसे विश्लेषक में रखें। माप शुरू करने के लिए CONTINUE पर क्लिक करें।
    14. जब रन समाप्त हो जाता है, तो विश्लेषक से 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट को हटा दें और कोशिकाओं को परेशान किए बिना सभी कुओं से माध्यम एकत्र करें।
      नोट: माध्यम -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में एक उपयुक्त लैक्टेट परख किट का उपयोग कर माध्यम में कोशिकाओं द्वारा जारी लैक्टेट की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    15. प्रत्येक अच्छी तरह से 1x PBS के 200 μL के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    16. पीबीएस को हटाने के बाद, प्लेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      नोट: जमे हुए प्लेट का उपयोग माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं, प्रोटीन, या डीएनए को मापने के लिए किया जा सकता है। इस परिमाणीकरण की आवश्यकता प्राप्त bioenergetic दरों को सामान्य करने के लिए होगी। सेल, प्रोटीन, या डीएनए परिमाणीकरण assays के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल गोल ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 1 ए) की मजबूत पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है। उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में परिपक्व न्यूरॉन्स होते हैं जिन्हें अक्षतंतु (SMI312) और डेंड्राइट्स (सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन 2 (MAP2)) (चित्रा 1B) के लिए विशिष्ट प्रोटीन मार्करों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। परिपक्व ऑर्गेनोइड्स में न केवल न्यूरोनल कोशिकाएं (MAP2-positive) होती हैं, बल्कि ग्लियाल कोशिकाएं भी होती हैं (उदाहरण के लिए, एस्ट्रोसाइट्स मार्कर S100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन B (S100π) के लिए सकारात्मक) (चित्रा 1B)।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कटा हुआ मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का विश्लेषण करके, विभिन्न सेल प्रकारों और सेलुलर संरचनाओं के विस्तृत वितरण और संगठन की पहचान और निगरानी करना संभव है। यह इस बात की नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग तंत्रिका तंत्र के विकास को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, न्यूरोनल अक्षतंतु (SMI312-positive) और डेंड्राइट्स (MAP2-positive) (चित्रा 2A) या न्यूरोनल कोशिकाओं (MAP2-positive) और ग्लियाल कोशिकाओं (S100π-positive) (चित्रा 2A) की पारस्परिक घटना की निगरानी करना संभव है। Confocal छवियों को भी अधिक विस्तार से तंत्रिका पूर्वजों के वितरण और तंत्रिका पूर्वजों के संगठन की जांच करने में मदद कर सकते हैं ((लिंग निर्धारण क्षेत्र वाई) बॉक्स -2 (SOX2)-सकारात्मक) न्यूरॉन्स के संबंध में (बीटा-III ट्यूबुलिन (TUJ1)-सकारात्मक) (चित्रा 2B). अंत में, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट मार्करों (जैसे बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन, बाहरी झिल्ली 20 केडीए सबयूनिट (टीओएम 20)) के ट्रांसलोकेस) के लिए दाग दिया जा सकता है ( चित्रा 2 सी) ।

वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग करने में सक्षम बनाता है। इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) (चित्रा 2 डी) और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय दोनों को मापना संभव है, जो बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) (चित्रा 2 ई) का उपयोग करता है। Bioenergetic प्रोफाइलिंग निगरानी की अनुमति देता है कि कैसे कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के अनुक्रमिक प्रशासन के जवाब में अपने ओसीआर और ईसीएआर प्रोफाइल को संशोधित कर सकती हैं।

सबसे पहले, एटीपी सिंथेज़ अवरोधक, ऑलिगोमाइसिन, लागू किया जा सकता है। ओलिगोमाइसिन ओसीआर प्रोफ़ाइल (चित्रा 2 डी) में गिरावट का कारण बनता है, और इसलिए, एटीपी उत्पादन के लिए आवश्यक ओसीआर की पहचान करता है। ओलिगोमाइसिन उपचार पर, ईसीएआर (चित्रा 2 ई) में एक प्रतिपूरक वृद्धि भी हो सकती है, यह सुझाव देते हुए कि कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में कमी के कारण चयापचय तनाव को रोकने के लिए ग्लाइकोलाइसिस को नियंत्रित कर सकती हैं। प्रोटॉन आयनोफोर, कार्बोनिल साइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथोक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के बाद के दोहरे अनुप्रयोग, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के नुकसान का कारण बनता है। चूंकि ऑक्सीजन के अणु अब स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र हैं, यह ओसीआर (चित्रा 2 डी) में तेजी से वृद्धि का कारण बनता है।

ओसीआर प्रोफ़ाइल में ये परिवर्तन कोशिकाओं की अधिकतम श्वसन क्षमता की पहचान करते हैं। रोटेनोन प्लस एंटीमाइसिन ए का अंतिम प्रशासन इलेक्ट्रॉन परिवहन के एक ब्लॉक का कारण बनता है, और इसलिए, ओसीआर (चित्रा 2 डी) में भारी कमी आती है। ईसीएआर कोशिकाओं की अवशिष्ट ग्लाइकोलाइटिक क्षमता के आधार पर एफसीसीपी और रोटेनोन प्लस एंटीमाइसिन ए (चित्रा 2 ई) के साथ उपचार के बाद उतार-चढ़ाव दिखा सकता है। ओसीआर और ईसीएआर प्रोफाइल को माइटोकॉन्ड्रियल रोगियों से व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में नाटकीय रूप से बदला जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: मानव iPSCs से मस्तिष्क organoids की पीढ़ी. (A) इसी संचरण छवियों के साथ मस्तिष्क organoids का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दिन 0 एक रॉक अवरोधक, एक WNT अवरोधक, और SB431542 के साथ पूरक CDMI का उपयोग कर V-नीचे के साथ एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में iPSCs के पृथक्करण और सीडिंग से मेल खाती है। दिन 18 में, neurospheres 96-अच्छी तरह से प्लेटों से 100 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन CDMII N2 के साथ पूरक के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं। इस बिंदु से आगे, संस्कृतियों को एक कक्षीय शेकर पर तैनात किया जाता है। दिन 35 पर, माध्यम को CDMII से CDMIII में बदल दिया जाता है, जिसमें एक भंग मैट्रिक्स घटक (तालिका 1) भी होता है। दिन 70 के बाद से, CDMIII CDMIV B27 के साथ पूरक करने के लिए स्विच किया गया है। 10x आवर्धन के साथ एक माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग करके 12 वें दिन एक प्रतिनिधि न्यूरोस्फीयर छवि ली गई थी। 4x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग करके 22 वें दिन एक प्रारंभिक ऑर्गेनोइड छवि ली गई थी। 4x आवर्धन के साथ एक माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग करके 40 वें दिन एक परिपक्व ऑर्गेनोइड छवि ली गई थी। (बी) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की समग्र संरचना और सेलुलर संगठन को व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। प्रतिनिधि सिले हुए वाइड-फील्ड छवियों को डेंड्राइट्स (MAP2-positive) और अक्षतंतुओं (SMI312-positive) के बीच और न्यूरोनल कोशिकाओं (MAP2-positive) और अनुमानित एस्ट्रोसाइट्स (S100π-positive) के बीच संबंधों की कल्पना करने के लिए दिखाया गया है। कोशिकाओं को नाभिक को प्रकट करने के लिए होचस्ट के साथ काउंटरकिया गया था। सभी छवियों को 78 दिन पुराने मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके लिया गया था। दायाँ स्तंभ तीन चैनलों (मर्ज) के ओवरले को दिखाता है. स्केल सलाखों = 500 μm. संक्षेप: iPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; CDM = Cortical Differentiation Medium; ROCK = Rho kinase; MAP2 = सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन 2; S100π = S100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन बी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए मस्तिष्क organoids के विज़ुअलाइज़ेशन और bioenergetic प्रोफाइलिंग। विस्तृत संगठन और organoids की वास्तुकला confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. सभी छवियों को 78 दिन पुराने मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके लिया गया था और नाभिक को प्रकट करने के लिए होचस्ट के साथ काउंटररेंटेड किया गया था। दायाँ स्तंभ तीन चैनलों (मर्ज) के ओवरले को दिखाता है. स्केल सलाखों = 50 μm. (ए) प्रतिनिधि विस्तारित-फोकस अनुमानों (44-48 ऑप्टिकल विमानों, 0.6 μm प्रत्येक) डेंड्राइट्स (MAP2-positive, arrowheads) और अक्षतंतुओं (SMI312-positive, तीर) के बीच इंटरप्ले को संबोधित करते हुए, और न्यूरोनल कोशिकाओं (MAP2-positive, arrowheads) और अनुमानित एस्ट्रोसाइट्स (S100π-positive, तीर) के बीच इंटरप्ले को संबोधित करते हैं। (बी) प्रतिनिधि विस्तारित-फोकस अनुमानों (14-31 ऑप्टिकल विमानों, 0.6 μm प्रत्येक) तंत्रिका पूर्वजों (SOX2-सकारात्मक, तीर) के संबंध में न्यूरॉन्स (TUJ1-सकारात्मक, एरोहेड्स) के वितरण को दर्शाता है। (सी) प्रतिनिधि विस्तारित-फोकस अनुमानों (20 ऑप्टिकल विमानों, 0.6 μm प्रत्येक) माइटोकॉन्ड्रिया के न्यूरॉन्स (TUJ1-सकारात्मक, एरोहेड्स) के भीतर वितरण दिखा रहा है (बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन TOM20, तीर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना)। (डी) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के अनुक्रमिक प्रशासन के बाद ओसीआर की प्रोफ़ाइल के आधार पर मॉनिटर किया जा सकता है (विवरण के लिए पाठ देखें)। (ई) माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के अनुक्रमिक प्रशासन पर ईसीएआर के आधार पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि की निगरानी की जा सकती है (विवरण के लिए पाठ देखें)। बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग के लिए, लगभग 10-15 मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर रीप्लेटिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अलग किया गया था। सलाखों दो स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त परिणामों के आधार पर SEMs इंगित करते हैं। संक्षेप: MAP2 = सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन 2; S100π = S100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन बी; TUJ1 = बीटा-III ट्यूबुलिन; SOX2 = (लिंग का निर्धारण क्षेत्र Y) बॉक्स -2; TOM20 = बाहरी झिल्ली 20 kDA सबयूनिट के ट्रांसलोकेस; OCR = ऑक्सीजन की खपत दर; ECAR = extracellular अम्लीकरण दर; ओलिगोम । = ऑलिगोमाइसिन; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड-पी-trifluoromethoxyphenylhydrazon; R = rotenone; AntA = Antimycin A; SEMs = साधनों की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मीडिया संरचना
CDMI (दिन 0-18) अंतिम conc.
ग्लासगो-एमईएम Gibco 11710-035 [1:1]
नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR) Gibco 10828010 20%
MEM-NEAA (MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान) Gibco 11140-050 0.1 mM
सोडियम पाइरूवेट Gibco 11360070 1 mM
2-mercaptethanol Gibco 31350-010 0.1 mM
पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Gibco 15140-122 100 U/mL और 100 μg/mL
CDMII (दिन 18-35) अंतिम conc.
DMEM/F12 Gibco 31330038 [1:1]
ग्लूटामैक्स Gibco 35050-061 2 mM
N-2 पूरक (100x) Gibco 17502-048 1%
रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड सांद्रता Gibco 11905031 1%
पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Gibco 15140-122 100 U/mL और 100 μg/mL
CDMIII (दिन 35-70) अंतिम conc.
DMEM/F12 Gibco 31330038 [1:1]
ग्लूटामैक्स Gibco 35050-061 2 mM
N-2 पूरक (100x) Gibco 17502-048 1%
रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड सांद्रता Gibco 11905031 1%
पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Gibco 15140-122 100 U/mL और 100 μg/mL
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) Gibco 10270-106 10%
हेपरिन मर्क H3149-25KU 5 μg/mL
Matrigel कॉर्निंग 356231 1%
CDMIV (दिन 70+) अंतिम conc.
DMEM/F12 Gibco 31330038 [1:1]
ग्लूटामैक्स Gibco 35050-061 2 mM
N-2 पूरक (100x) Gibco 17502-048 1%
रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड सांद्रता Gibco 11905031 1%
पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Gibco 15140-122 100 U/mL और 100 μg/mL
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) Gibco 10270-106 10%
हेपरिन मर्क H3149-25KU 5 μg/mL
Matrigel कॉर्निंग 356231 2%
विटामिन ए 50x के साथ बी -27 पूरक Gibco 17504044 2%
न्यूरोनल माध्यम अंतिम conc.
DMEM/F12 Gibco 31330038 [1:1]
N-2 पूरक Gibco 17502048 [1x]
विटामिन ए 50x के साथ बी -27 पूरक Gibco 17504044 [1x]
एल-एस्कॉर्बिक अम्ल सिग्मा एल्ड्रिच A92902 [200 μM]
db-cAMP (dibutyryl चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट) सिग्मा एल्ड्रिच D0627 500 μM
BDNF (Brain-derived neutrotrophic factor) MACS Miltenyi 130-093-811 [10 ng/mL]
GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) MACS Miltenyi 130-096-290 [10 ng/mL]
मानव TGF-π3 (विकास कारक-beta3 को बदलने) MACS Miltenyi 130-094-007 [1 ng/mL]
परख मध्यम अंतिम conc.
Seahorse XF DMEM माध्यम सीहोर्स बायोसाइंस 103680-100 500 mL
सोडियम पाइरूवेट Gibco 11360070 1 mM
L-Glutamine Lonza BEBP17-605E 2 mM
ग्लूकोज़ सिग्मा एल्ड्रिच 50-99-7 10 mM
अवरोधित समाधान अंतिम conc.
PBS-Tween [1:1] 0.1% Tween
गधा सीरम सिग्मा एल्ड्रिच D9663 10%
ट्राइटन-एक्स मर्क X100-5ML 1%

तालिका 1: ऑर्गेनोइड पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया और समाधानों का विवरण।

प्रारंभ बेसलाइन (X3) ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन (एक्स३) फ्सीसीपी इंजेक्शन (एक्स३) फ्सीसीपी इंजेक्शन (एक्स३) एंटी ए + रोट इंजेक्शन (एक्स 3)
जांचना मिलाना मिलाना मिलाना मिलाना मिलाना
(04:00) (04:00) (04:00) (04:00) (04:00)
संतुलित (12:00) ज़रा रुको ज़रा रुको ज़रा रुको ज़रा रुको ज़रा रुको
(02:00) (02:00) (02:00) (02:00) (02:00)
उपाय (03:00) उपाय (03:00) उपाय (03:00) माप उपाय (03:00)
(03:00)

तालिका 2: bioenergetic प्रोफाइलिंग के लिए प्रोटोकॉल सेटअप. सीहोर्स वेव डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मिनटों में चरणों और उनकी लंबाई का विवरण। संक्षिप्त रूप: FCCP = कार्बोनिल साइनाइड-पी-trifluoromethoxyphenylhydrazon; रोट = रोटेनोन; एंटी ए = एंटीमाइसिन ए।

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Discussion

यह पेपर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पुनरुत्पादक पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित work20 के आधार पर संशोधित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह है कि इसे मचान मैट्रिक्स में प्रत्येक ऑर्गेनोइड के मैनुअल एम्बेडिंग की आवश्यकता नहीं होती है। वास्तव में, मैट्रिक्स समाधान बस सेल संस्कृति माध्यम में भंग हो जाता है। इसके अलावा, महंगे बायोरिएक्टर को नियोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है, क्योंकि ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय शेकर पर तैनात मानक ऊतक संस्कृति 6-अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया जा सकता है। यह प्रक्रिया विभिन्न व्यक्तिगत लाइनों से व्युत्पन्न विभिन्न ऑर्गेनोइड्स युक्त कई प्लेटों की समानांतर खेती को भी सक्षम बनाती है, जिससे प्रयोगों के थ्रूपुट में वृद्धि होती है और विभिन्न ऑर्गेनोइड्स के विकास प्रोफाइल में उभरने वाले संभावित अंतरों की निगरानी की अनुमति मिलती है। हमने लगातार परिणामों के साथ स्वस्थ नियंत्रण और माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित व्यक्तियों से प्राप्त विभिन्न आईपीएससी का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया।

माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के आकारिकी और संगठन की कल्पना करने के लिए विभिन्न मार्करों का उपयोग करना आवश्यक है। यह प्रक्रिया इस बात की जांच को सक्षम बनाती है कि माइटोकॉन्ड्रियल संख्या, आकृति विज्ञान, या वितरण को माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों वाले रोगियों से प्राप्त मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में बदला जा सकता है या नहीं। मस्तिष्क organoids के भीतर तंत्रिका पूर्वजों की उपस्थिति और संगठन माइटोकॉन्ड्रियल विकारों के मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण महत्व का हो सकता है। हमने हाल ही में पाया कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम के कारण उत्परिवर्तन, सेलुलर वास्तुकला और रोगी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स 18 के भीतर तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के वितरण को बाधित करते हैं।

बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग करने के लिए, हमने एक ऐसी विधि को अनुकूलित किया है जिसे पहले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल 21 के बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए वर्णित किया गया था। हाल के एक प्रोटोकॉल में बताया गया है कि माउस छोटी आंत, मानव बृहदान्त्र और कोलोरेक्टल ट्यूमर 22 से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग को कैसे पूरा किया जाए। हालांकि, वे ऑर्गेनोइड्स मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की तुलना में काफी छोटे होते हैं, और इसलिए, एक अलग प्रोटोकॉल, जैसे कि यहां रिपोर्ट किया गया है, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के लिए आवश्यक है। हमने हाल ही में मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल का आकलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को नियोजित किया है जो सर्फिट लोकस प्रोटीन 1 जीन (SURF1) में उत्परिवर्तन ले जाता है जो गंभीर माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम 18 का कारण बनता है। हमने पाया कि ओसीआर प्रोफ़ाइल विशेष रूप से लेह सिंड्रोम ऑर्गेनोइड्स में प्रभावित होती है, जैसा कि बेसल ओसीआर स्तर, एटीपी उत्पादन दर और अधिकतम श्वसन दर 18 में महत्वपूर्ण कमी से दिखाया गया है।

अंत में, हम यहां मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की मजबूत पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और वर्णन करते हैं कि उन प्रयोगों को कैसे किया जाए जो माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के अंतर्निहित रोग तंत्र की जांच के लिए महत्वपूर्ण होंगे। मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स मानव मस्तिष्क में माइटोकॉन्ड्रियल विविधता और मानव स्वास्थ्य और बीमारियों में इसकी भूमिका को स्पष्ट करने के लिए भी महत्वपूर्ण महत्व के हो सकते हैं23। यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स, यहां वर्णित एक सहित, अभी भी सीमाओं को सहन करते हैं। इनमें शामिल हैं, उदाहरण के लिए, संवहनीकरण की कमी और माइक्रोग्लिया जनसंख्या की अनुपस्थिति24। परिणामों की सही व्याख्या करने के लिए इन पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

उदाहरण के लिए, वास्कुलचर और माइक्रोग्लिया की कमी प्रतिपूरक तंत्र को सीमित कर सकती है जो विवो में जगह में हो सकती है। रोगी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स इस प्रकार दोषों को प्रदर्शित कर सकते हैं जो रोगियों में देखे गए लोगों की तुलना में मजबूत हैं17,18। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल 20 की एक सामान्य पुनरुत्पादकता के बावजूद, लाइन-टू-लाइन विषमता देखी जा सकती है। इस अंत में, रोग मॉडलिंग अध्ययन करते समय, आकारिकी (आकार, परत) के पैटर्न और विभिन्न ऑर्गेनोइड्स में आणविक मार्करों के वितरण का आकलन करके नियंत्रण और रोगी ऑर्गेनोइड्स की एकरूपता को व्यवस्थित रूप से मापना हमेशा महत्वपूर्ण होता है।

अंत में, एक एकल आईपीएससी से मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना संभव नहीं है, जो CRISPR / Cas9 के साथ बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग की व्यवहार्यता को सीमित करता है। अनुसंधान की गति को देखते हुए, यह संभावना है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल की कुछ वर्तमान सीमाओं को जल्द ही दूर कर लिया जाएगा। अनुकूलित प्रोटोकॉल उपलब्ध हो जाएगा। माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के ये 3 डी मॉडल उम्मीद करते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के लिए कार्यान्वयन योग्य उपचारों की अंतिम खोज को सक्षम करेंगे, जो हानिकारक हैं, और अत्यधिक अपूर्ण चिकित्सा आवश्यकताओं के साथ लाइलाज बीमारियों के लिए।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय या गैर-वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए मिरियम Bünning धन्यवाद. हम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 से A.P.), स्पार्क और बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), The United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), और जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) (E) से समर्थन स्वीकार करते हैं। जैव युवा अन्वेषक अनुदान AZ 031L0211 A.P.) के लिए). C.R.R. की प्रयोगशाला में काम DFG द्वारा समर्थित था (2795 के लिए "तनाव के तहत Synapses", Ro 2327/13-1)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Affinity Designer Serif (Europe) Ltd Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig Sigma Aldrich SAB4600033-250UL 1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-31571 1:300
Antimycin A Sigma Aldrich 1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) Sigma Aldrich T8578 1:2000
Argon Laser Melles Griot Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid Sigma A92902
B-27 with Vitamin A Gibco 17504044
Bacto Agar Becton Dickinson 3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF Miltenyi Biotec 130-093-0811
cAMP Sigma D0627
Cell Star cell culture 6 well plate Greiner-Bio-One 657160
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031
Confocal laser scanning microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231 Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit Thermo Fisher C7026
DMEM/F12 ThermoFisher 31330038
DMSO Sigma D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3 Merck Millipore AP180C 1:300
Donkey anti-mouse Cy3 Merck Millipore AP192C 1:300
Donkey anti-rabbit Cy3 Merck Millipore AP182C 1:300
DPBS Gibco 14190250
DS-Q1Mc camera Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
FCCP Sigma Aldrich 370-86-5
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
GDNF Miltenyi Biotec 130-096-291
Glasgow MEM Gibco 11710-035
Glass Pasteur pipette Brand 747715 Inverted
Glutamax Gibco 35050-061
Helium-Neon Laser Melles Griot Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin Merck H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026331
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 1:2500
Image J 1.53c Wayne Rasband National Institute of Health Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer Braun 4606108V
Knockout Serum Replacement Gibco 10828010
Laser (407 nm) Coherent Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2 Synaptic Systems No. 188004 1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA Gibco 11140-050
mTeSR Plus Stemcell Technology 85850 iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza # LT07-218
N2 Supplement Gibco 17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW) Neoject 10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 Nikon Imaging software
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
PAP Pen Sigma Z377821-1EA To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit Worthington LK003150
Paraformaldehyde Merck 818715 4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL VWR 612-1681 Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0 Nikon Microscope Solutions Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 Nikon Microscope Solutions Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm) Greiner Bio-One 664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) Falcon 352235
Potassium chloride Roth 6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant Invitrogen P36980
Qualitative filter paper VWR 516-0813
Rock Inhibitior Merck SCM075
Rotenone Sigma 83-794
S100β Abcam Ab11178 1:600
SB-431542 Cayman Chemical Company 13031
Scalpel blades Heinz Herenz Hamburq 1110918
SMI312 Biolegend 837904 1:500
Sodium bicarbonate Merck/Sigma 31437-1kg-M
Sodium chloride Roth 3957
Sodium dihydrogen phosphate Applichem 131965
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
SOX2 Santa Cruz Biotechnology Sc-17320 1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco/StemPro A1110501 Reagent A
Super Glue Gel UHU 63261 adhesive gel
SuperFrost Plus VWR 631-0108
Syringe for single usage (1 mL) BD Plastipak 300015
TB2 Thermoblock Biometra
TC Plate 24 Well Sarstedt 83.3922
TC Plate 6 Well Sarstedt 83.392
TGFbeta3 Miltenyi Biotec 130-094-007
Tissue Culture Hood ThermoFisher 51032711
TOM20 Santa Cruz Biotechnology SC-11415 1:200
Triton-X Merck X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA Invitrogen 15575020
Vibratome Microm HM 650 V Thermo Scientific Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade Wilkinson Sword 70517470
Whatman Benchkote Merck/Sigma 28418852
Wnt Antagonist I EMD Millipore Corp 3378738
XF 96 extracellular flux analyser Seahorse Bioscience 100737-101
XF Assay DMEM Medium Seahorse Bioscience 103680-100
XF Calibrant Solution Seahorse Bioscience 100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate) Seahorse Bioscience 102416-100

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 172 मस्तिष्क organoids iPSCs माइटोकॉन्ड्रियल रोग bioenergetic प्रोफाइलिंग
माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी
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Le, S., Petersilie, L., Inak, G.,… More

Le, S., Petersilie, L., Inak, G., Menacho-Pando, C., Kafitz, K. W., Rybak-Wolf, A., Rajewsky, N., Rose, C. R., Prigione, A. Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling. J. Vis. Exp. (172), e62756, doi:10.3791/62756 (2021).

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