Summary
Der er fastsat en protokol til opsætning af et standardkonfokalt laserscanningsmikroskop til in vivo Förster resonansenergioverførselsmålinger efterfulgt af dataevaluering.
Abstract
Sensibiliserede emissionsbaserede Förster resonansenergioverførselsforsøg (FRET) udføres let, men afhænger af det mikroskopiske setup. Confocal laser scanning mikroskoper er blevet en arbejdshest for biologer. Kommercielle systemer giver høj fleksibilitet i laser effekt justering og detektor følsomhed og ofte kombinere forskellige detektorer for at opnå det perfekte billede. Sammenligningen af intensitetsbaserede data fra forskellige eksperimenter og opsætninger er imidlertid ofte umulig på grund af denne fleksibilitet. Biologvenlige procedurer er en fordel og giver mulighed for enkel og pålidelig justering af laser- og detektorindstillinger.
Da FRET-eksperimenter i levende celler påvirkes af variationen i proteinudtryk og forholdet mellem donor-acceptor, skal proteinekspressionsniveauer overvejes til dataevaluering. Beskrevet her er en simpel protokol for pålidelige og reproducerbare FRET målinger, herunder rutiner til vurdering af protein udtryk og justering af laser intensitet og detektor indstillinger. Dataevaluering vil blive udført ved kalibrering med en fluorophor fusion af kendt FRET effektivitet. For at forbedre enkelheden er der blevet sammenlignet korrektionsfaktorer, der er opnået i celler og ved at måle rekombinante fluorescerende proteiner.
Introduction
Förster resonansenergioverførsel ((F)RET) observeres typisk ved fluorescensspektroskopi, selv om selve processen ikke er begrænset til at forekomme mellem fluorophorer. Den underliggende dipol-dipolkobling kræver simpelthen et lysudsende donormolekyle og en lysabsorberende acceptor. Dette er afledt af den krævede spektrale overlapning integreret J af den normaliserede donor emission og acceptor absorbans spektre1. Men fordi RET konkurrerer med fluorescens, energioverførslen bliver målbar ved ændringer i fluorescens emission: RET inducerer donor quenching og sensibiliseret acceptor emission.
Fluorophore-baserede RET er blevet kaldt fluorescens resonans energioverførsel (FRET) for at adskille det fra bioluminescens resonans energioverførsel (BRET). RET afhænger stærkt af afstanden mellem donor og acceptor, som er bredt i intervallet 0,5-10 nm2 og dermed i samme interval som proteinernes dimensioner og deres komplekser. For det andet, RET afhænger af dipol-dipol orientering kappa kvadreret. Kombineret med det faktum, at rotationsfriheden for proteinbundne fluorophorer kan overses på grund af molekylvægten og den langsomme rotationslempelse, giver RET mulighed for analyse af kropslige ændringer3.
Den såkaldte Förster radius er baseret på den spektrale overlapning integreret og bølgelængde rækkevidde af overlapning, således at rødt lysabsorberende kromohorer resultere i længere Förster radier end blå lysabsorberende farvestoffer. Da fret-målingernes dynamiske område er begrænset med 0,5 × R0 og 1,5 × R0, har FRET-parret ECFP-EYFP et dynamisk interval på 2,5-7,3 nm på grund af R0 på 4,9 nm4.
Lysstyrken af en fluorophore er givet ved produktet af dens molarudryddelseskoefficient og dens kvanteudbytte. For FRET-målinger er det fordelagtigt at vælge fluorophorer med næsten samme lysstyrke. Dette øger påvisning af donorslukning og sensibiliseret acceptor emission. Det favoriserer også kalibreringen af mikroskopisystemet. Ser man på de ofte anvendte FRET par cyan og fluorescerende proteiner, den lavere lysstyrke af cyan fluorescerende proteiner bliver indlysende (Figur 1A).
Acceptorens levetid skal dog være lavere end donorens levetid, hvilket sikrer accepterens tilgængelighed til energioverførsel. Hvis acceptorens levetid overstiger donorens levetid, kan acceptoren stadig være i ophidset tilstand, når donoren er begejstret igen. Avancerede cyan fluorescerende proteiner såsom mTurquoise viser en længere levetid og bidrager dermed til en øget sandsynlighed for FRET (Figur1B). Sandsynligheden for FRET afhænger også af acceptens molarudryddelseskoefficient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: For følgende protokol blev der udført forbigående transfektion af protoplaster, som beskrevet tidligere12. En kort beskrivelse er angivet nedenfor.
1. Forbigående transfektion af protoplaster
- Skær ~4 g sunde blade af Arabidopsis thaliana ecotype Columbia i 1 mm skiver og overfør dem til 20 mL enzymopløsning (1,5% cellulase; 0,4% macerozyme; 0,1% kvægserumalbumin Fraktion V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre (MES), pH 5,7; 10 mM CaCl2).
- Vakuuminfiltrere bladskiverne efterfulgt af en inkubation med omrøring i 2 timer ved stuetemperatur. Høst cellerne ved centrifugering i 3 min ved 100 × g.
- Protoplasterne vaskes med W5-opløsning (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) og genbruges i MMG-opløsning (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7).
- Udfør transfekten i et 8-brønds dias ved osmotisk stød i nærværelse af polyethylenglycol (PEG) 4000. Bland 20 μL af protoplastaffjedringen med 5 μL plasmid-DNA (5 μg/μL) og 25 μL PEG-opløsning (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, 40% PEG 4000).
- Bak det osmotiske stød ved en skånsom justering af de osmotiske forhold.
BEMÆRK: Ud over prøven af interesse, udtryk for donor alene og acceptor alene er forpligtet til at bestemme spektrale blødning af donor og acceptor, henholdsvis. Et fusionsprotein fra donoren og acceptoren skal også udtrykkes til kalibreringsformål. Det fluorescerende proteinudtryk var under kontrol af en blomkålmosaikvirus 35S promotor (pCaMV35S). Til alle målinger blev der anvendt to konfokale laserscanningsmikroskoper (LSM1 og LSM2). LSM1 har to typer detektorer: Til FRET-målinger blev donorsignalet detekteret af en GaAsP-detektor, mens FRET og acceptor emission blev registreret med en fotomultiplier. LSM2 har to fotomultipliere, som blev brugt til påvisning af donor, FRET, og acceptor emission.
2. Laserjustering
BEMÆRK: Her er der anvendt 458 nm og 514 nm linjer af en argon-ion laser til FRET-analyse mellem forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) - og forbedret gult fluorescerende protein (EYFP)-mærkede proteiner. For reproducerbar dataindsamling blev begge linjer justeret til samme intensitet. Dette blev opnået ved enten en transmission photomultiplier eller refleksion tilstand.
- Laserjustering med transmissionsfotomultiplier
- Brug en tom brønd til justering.
- Vælg linjescanningstilstand og histogramvisning.
- Sænk laserintensiteten til et minimum, og juster detektorforøgelsen til detekterbar baggrundsstøj.
- Forøg laserintensiteten i trin på 0,5%, og registrer det tilsvarende signal.
- Anvend rutinen for begge laserlinjer.
- Laserjustering med refleksionstilstand
- Brug en tom brønd til justering.
- Anvend et refleksionsfilter, tænd refleksionstilstanden, hvis det er tilgængeligt.
- Sørg for, at detektorbølgelængdeområdet dækker laserens bølgelængde.
- Vælg linjescanningstilstand og histogramvisning.
- Sænk laserintensiteten til et minimum, og juster detektorforøgelsen til detekterbar baggrundsstøj.
- Flyt målsætningen til den laveste placering.
- Flyt målsætningen op, indtil refleksionen af dæksleren er synlig.
- Forøg laserintensiteten i trin på 0,5%, og registrer det tilsvarende signal.
- Anvend rutinen for begge laserlinjer.
- Dataevaluering
- Tabuler dataene, og sorter dataene efter signalintensiteter.
- Plot signalintensiteterne mod den relative lasereffekt.
- Vælg laserintensiteter, der resulterer i lignende signalintensitet.
3. Justering af fotomultipliers
BEMÆRK: Efter laserjustering blev fotomultiperne justeret til individuelle gevinster for at opnå lignende følsomhed. Denne kalibrering blev udført med 514 nm laser linje, som er i midten af bølgelængde vifte af interesse.
- Brug en tom brønd til justering.
- Anvend et refleksionsfilter, og skift til refleksionstilstand, hvis det er tilgængeligt.
- Sørg for, at detektorbølgelængdeområdet dækker laserens bølgelængde (514 nm).
- Vælg linjescanningstilstanden og histogramvisningen.
- Reducer detektorforøgelsen til halvdelen af maksimumsstyrken, og juster laserintensiteten til detekterbar baggrundsstøj.
- Flyt målsætningen til den laveste placering.
- Flyt målsætningen op, indtil refleksionen af dæksleren er synlig.
- Forøg detektorgevinsten i trin fra 50 til 100 V, og registrer det tilsvarende signal.
- Påfør trin 3.1 til 3.8 for begge detektorer.
- Dataevaluering
- Plot intensiteten mod detektorgevinsten for hver detektor.
- Vælg de enkelte detektorgevinster for at opnå lignende følsomhed.
4. FRET billede erhvervelse
BEMÆRK: Start med stikprøven af interesse for opsætning af billedopsamling.
- Vælg de relevante filtre/dichroiske spejle, f.eks. et dobbelt dichroisk spejl MBS 458/514 til FRET-parret ECFP/EYFP. Brug det samme dichroiske spejl til alle kanaler for at aktivere linje-for-linje scanning. Vælg et mål for vanddåben for billeddannelse af levende celler. Vælg 12 bit- eller 16-bit scanning og moderat scanningshastighed.
- Definer detektionsområdet, helst 470-510 nm til donordetektering og 530-600 nm til acceptor/FRET-detektion for ECFP/EYFP. Når du bruger en diodelaser på 445 nm eller 440 nm, skal du bruge 450 til 510 nm som detektionsområde. I tilfælde af en acoustooptisk strålekløver (AOBS) defineres donordetektering i intervallet 450 til 500 nm for at forhindre uønsket acceptordetektering.
- Detektorindstillingen anvendes i henhold til 3.10.2.
- Laserindstillingen anvendes i henhold til 2.3.2. Revidere laserintensiteten baseret på det opnåede lasereffektbord, hvis det er nødvendigt. Sørg for, at signal-til-støj-forholdet dækker hele detektorernes dynamiske område (intensitet fra 0 til 4095 til 12-bit scanning).
- Hold laser intensiteter og detektor gevinster konstant. Brug pinhole diameter til finjustering.
BEMÆRK: Husk, at ændringer i pinhole diameter påvirker rumlig opløsning. - Udfør målingerne (tag billeder af mindst 20 celler).
5. Bestemmelse af krydstalekorrektioner
BEMÆRK: Celler, der kun udtrykker donoren eller acceptoren, er forpligtet til at bestemme henholdsvis donorspektral blødning (DSBT) og acceptorspektral blødning (ASBT). Behold de samme indstillinger, der er beskrevet i afsnit 4.
- Udfør FRET-målinger med celler, der udtrykker donorfluoriphe.
- Udfør FRET-målinger med celler, der udtrykker acceptorfluoriphe.
6. Kalibrering af målingerne i henhold til Beemiller et al.13
BEMÆRK: Celler, der udtrykker en donor-acceptor fusion af kendt FRET effektivitet er påkrævet. Her er der anvendt en ECFP-5 aa-EYFP-fusion med en FRET-effektivitet på 0,464. Behold de samme indstillinger, der er beskrevet i afsnit 4.
- Udfør FRET-målinger med celler, der udtrykker donor-acceptorfusionen
7. Dataevaluering
- Hent linjeprofiler af cellerne, hvilket sikrer, at hver profil ikke indeholder mere end én celle. Gem profilerne som tekstfiler.
- Importer tekstfilerne til et regneark ved hjælp af importindstillingen for tekstfilen i sektionen Data .
- Læs maksimumværdierne op ved at anvende funktionen Maks .
- Liste de opnåede værdier i en tabel, har en kolonne hver for donor emission ID, FRET emission IF, acceptor emission IA, og mindst fire datasæt: donor kun, acceptor kun, donor-acceptor fusion, og måling.
BEMÆRK: Excitation af donoren resulterer også i direkte excitation af acceptoren og forårsager ASBT, der er beskrevet af den α værdi. - Beregn ASBT-α-værdierne med acceptordatasættet ved hjælp af ligning (1).
(1)
BEMÆRK: Brug medianen af alle α-værdier i følgende ligninger. Donoren viser et bredt emissionsspektrum, der resulterer i emission krydstale med den sensibiliserede emission af acceptoren. Denne DSBT er givet af den β værdi. - Beregn donorspektrale udblødning β værdier med donordatasættet ved hjælp af ligning (2).
(2)
BEMÆRK: Brug medianen af alle β værdier i følgende ligninger. Kalibreringsfaktoren ξ beskriver det lineære forhold mellem FRET-afledt donorslukning og sensibiliseret emission af acceptoren. Brug medianerne på 7,5 og 7,6 i de følgende ligninger. - Kalibreringsfaktorerne ξ beregnes med donor-acceptor fusionsdatasættet og dets FRET-effektivitet E (0,46) ved hjælp af ligning (3).
(3)
BEMÆRK: Brug medianen af alle ξ værdier i følgende ligninger. - Fret-effektiviteten af proteinparret af interesse ved hjælp af ligninger (4) og (5).
(4)
(5) - Vurder effekten af udtryksstyrken og/eller donor-acceptor-forholdet: Plot summen af ID, IF og IA i forhold til FRET-effektivitetsgevinsterne. Udfør en lineær regression. Bemærk, at jo stejlere grafen og den højere R2 er, jo højere er virkningen af udtryksniveauet, eller jo større er forskellen mellem donor og acceptor overflod.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Justering af det konfokale laserscanningsmikroskop
Laserjusteringen afslørede en lineær stigning i emissionen med stigende laserintensitet (figur 2 og tabel 1). Som forventet for argon-ion lasere, emissionen af 514 nm linje var meget højere end emissionen af 458 nm linje, som det fremgår af en stejlere hældning. Til efterfølgende forsøg blev lasereffekten på henholdsvis 4,5% og 6,5% valgt til 514 nm linjen og 458 nm linjen. Dette resulterede i næsten lige emissionsintensitet på 1123 (514 nm) og 1141 (458 nm).
Varierende detektor gevinster ved konstant laserkraft afslørede en eksponentiel adfærd for begge analyserede detektorer. Tilsvarende emissionsintensiteter blev opnået med en gevinst på 700 V (figur 3). Selvom justeringen af laserlinjer nød godt af den lineære adfærd, påvirkes justeringen af detektorerne sandsynligvis af den eksponentielle adfærd, hvilket resulterer i markante forskelle med mindre ændringer i gevinsten ved højere spændinger. Desværre er dette højere interval af interesse for målinger i levende celler, da det er cytotoksisk at øge lasereffekten og fremmer fotobleaching.
Bestemmelse af spektral gennemblødning
I første omgang blev donorens og acceptorens spektrale gennemblødning analyseret med rekombinant renset ECFP og EYFP; DSBT β = 0,498 og ASBT α = 0,100. Det samme skete med celler, der udtrykker enten ECFP eller EYFP. Med LSM 2 blev den anslåede DSBT β = 1.602 ± 0,207 (gennemsnitlig ± SD), og ASBT blev α = 0,119 ± 0,018. Medianværdierne blev β = 1.506 og α = 0,120. Denne uoverensstemmelse mellem de data, der er opnået i levende celler, og de data, der er opnået med rekombinant protein, viser, at det er umuligt at udelade bestemmelse af spektral gennemblødning i levende celler. Dette er sandsynligvis forårsaget af cellulære pigmenter.
Billederne afslører EYFP's højere lysstyrke i forhold til ECFP (figur 4 og tabel 2). Kompensation af forskellene i lysstyrke ved forskellige laserindstillinger forbedrer donorens og FRET-kanalens dynamiske område. Forudsat den relative output ved at måle laser intensiteter, som gjort for justeringen, stadig øger reproducerbarheden af målingerne.
For LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 med medianer på α = 0,084 og β = 0,180. Bestemmelsen af ASBT afhænger af laserjusteringen og en enkelt detektor, og dermed klarede bestemmelsen af ASBT sig godt. DBST involverer to detektorer, hvilket resulterer i meget forskellige resultater for begge mikroskoper. Det skal huskes, at LSM 2 er udstyret med to fotomultipliers, mens LSM 1 bruger en GaAsP-detektor og en fotomultiplier, to forskellige typer detektorer med forskellige spektrale egenskaber og følsomhed. Derfor fungerer justeringen bedre med to identiske detektorer.
Kalibrering af målingen
Til kalibrering blev medianværdierne for α og β anvendt, og en fusion af ECFP og EYFP blev anvendt som standard for kendt FRET-effektivitet (E = 0,46). Kalibreringen af rekombinant og renset ECFP-EYFP resulterede i en ξ værdi på 13,44, mens in vivo målingerne afslørede en ξ værdi på 1.525 ± 1.844. Medianen var 0,798, afslører ekstreme outliers sammen med den høje standardafvigelse. For LSM 1 var værdierne ξ = 1.978 ± 0,807 med en median på ξ = 1,883. For LSM 2 og LSM 1 var de datasæt, der blev opnået til beregning af ξ (tabel 3), statistisk identiske, som det fremgår af Student's t-test (s > 0,2).
FRET-måling
Som et proof of concept blev FRET-målingen gentaget med donor-acceptorfusionen. Den målte FRET-effektivitet var 0,47 ± 0,07 for det rensede protein og 0,47 ± 0,06 i levende celler med LSM 2 (tabel 4). Medianen af målingerne i levende celler var E = 0,45. For LSM 1 var FRET-effektiviteten 0,46 ± 0,09 med en median på E = 0,45 (tabel 4). Disse data demonstrerer den effektive kalibrering med en FRET-konstruktion af kendt FRET-effektivitet.
Virkninger af udtryksniveau og forholdet mellem donor-acceptor
For det analyserede datasæt blev FRET-effektiviteten ikke påvirket af udtryksniveauet. På grund af sammensmeltningen af donoren og acceptoren var forholdet også konstant. Inkluderingen af tidligere datasæt afslørede en afhængighed af udtryksniveauet i ét tilfælde (figur 5). FRET-effektiviteten mellem de mærkede vacuolar ATPase (V-ATPase) underenheder, VHA-A-ECFP og VHA-a-EYFP, faldt med stigende signalintensitet. I modsætning hertil var samspillet mellem VHA-E1-ECFP og VHA-C-EYFP uafhængigt af signalintensiteten. I tilfælde af VHA-A og VHA-a erstattes de tre kopier af VHA-A i stigende grad af VHA-A-ECFP, hvilket resulterer i et donoroverskud i forhold til den enkelte kopi af VHA-a i komplekset. Selvom VHA-E1 kan være til stede i form af tre eksemplarer, kan VHA-C's høje opløselighed afskaffe denne effekt i dette eksempel. Her har FRET-effektiviteten været forholdsvis lav. Denne enkle tilgang giver mulighed for test af udtryk og forhold artefakter.
Figur 1: Oversigt over fluorescerende protein FRET parrer med cyanudløsende donorer. (A) Parernes Förster-radier og donorens og acceptorens lysstyrke gives til velkarakteriseret FRET-par. (B) Sammenligning af donor- og acceptors levetid. Grå stjerner indikerer et multiexponentielt forfald. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; FFP = cyan fluorescerende protein; GFP = grønt fluorescerende protein; YFP = gult fluorescerende protein; mX = monomerisk X; EX = forbedret X; SX = super X. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Laserjustering. Emissionen af lasere blev registreret ved afspejling af coverlip og plottet mod den relative laser intensitet som moduleret af acousto-optisk tunable filter af LSM. Emission af 458 nm linje (A) og 514 nm linje (B) af en argon-ion laser er vist. Forkortelser: LSM = laserscanningsmikroskop; r.u. = relative enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Detektorforøgelse og emissionsintensitet. De resulterende emissionsintensiteter blev registreret i refleksionstilstand for detektorgevinster fra henholdsvis 300 til 750 V og 300 til 750 V for henholdsvis detektor 1 (A) og detektor 2 (B). Forkortelse = r.u. = relative enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Spektral gennemblødning. Billeder blev opnået i donoren, FRET og acceptorkanalerne. A) Billeder fremstillet med rensede fluorescerende proteiner skalastænger = 100 μm B) tilsvarende billeder for celler, der udtrykker fluorescerende proteiner skalastænger = 10 μm. (C) Grafer over de opnåede SBT-værdier betyder ± SD er givet. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; SBT = spektral gennemblødning; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; LSM = laserscanningsmikroskop; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donor SBT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkninger af udtryksniveau og/eller donor-acceptor-forhold. Summen af emissionerne i donoren, FRET, og acceptor kanaler er blevet plottet mod FRET effektivitet. Dette er sket for VHA-E1-ECFP og VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP og VHA-a-EYFP (B) og ECFP-EYFP-fusionen (C). Lineær regression blev udført; ligningen og R2 er givet. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; VHA = vacuolar ATPase subunit. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Donor og acceptor bleed-through af ECFP og EYFP. Spektret af fluorescerende proteiner blev fremstillet fra FP-databasen14. (A) Under sensibiliserede emissionsforsøg opdages de store dele af donoren og acceptoren af individuelle fotomultipliere med navnet PMT1 og PMT2. ECFP-emissionen kan også påvises af acceptordetektoren ved excitation med 458 nm. Den beregnede donorspektrale gennemblødning i PMT2 er 40,6 % af den emission, der påvises af PMT1. B) EYFP's emissionsspektrum viser, at EYFP udviser direkte excitation ved 458 nm, som ofte anvendes til excitation af cyandonorer. Den forventede excitationseffektivitet er 9,6% af excitationen ved 514 nm. Forkortelser: FP = fluorescerende protein; ECFP = forbedret cyan fluorescerende protein; EYFP = forbedret gult fluorescerende protein; PMT = fotomultiplier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Lasereffekt og signalintensitet. Signalintensiteterne på 458 nm linjen er angivet i blåt, signalintensiteterne på 514 nm linjen i grønt. De intensiteter, der anvendes til forsøget, fremhæves med gråt. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Signalintensiteter for SBT-bestemmelse. Registrerede maksimer og beregnede α og β værdier er angivet. Forkortelser: SBT = spektral gennemblødning; LSM = laserscanningsmikroskop; FRET = Förster resonans energioverførsel; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donor SBT. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Signalintensiteter til kalibrering. Registrerede maxima og beregnede ξ værdier er givet. Korrigerede værdier svarer til FRET-signalintensiteterne minus SBT. Forkortelser: SBT = spektral gennemblødning; LSM = laserscanningsmikroskop; FRET = Förster resonans energioverførsel. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Signalintensiteter for FRET-målinger. Der angives registrerede maxima- og E-værdier. Korrigerede værdier svarer til FRET-signalintensiteterne minus SBT. Kalibrerede E-værdier blev beregnet med kalibrering med ξ. Forkortelser: SBT = spektral gennemblødning; LSM = laserscanningsmikroskop; FRET = Förster resonans energioverførsel; cal. = kalibreret. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Donorslukning og sensibiliseret acceptoremission er kendetegnet ved et lineært forhold, der giver mulighed for enten donor- eller acceptorbaseret beregning af FRET. De tilsvarende faktorer af linearitet kaldes enten G-faktor (donor til acceptor) eller xi (acceptor til donor), som er gensidige værdier4. Måling af FRET mellem fluorescerende proteiner ved fluorescensmikroskopi kræver ofte korrektioner for DSBT og ASBT på grund af de fluorescerende proteiners brede absorptions- og emissionsspektre. Men mange korrektioner afhænger af en målbar ASBT, som er en faktor i nævneren af ligninger i protokol afsnit 7, og en α = 0 resulterer i udefinerede ligninger5,6.
En justering af laserintensiteter anbefales for at undgå sådanne virkninger. Dette gør det muligt at bruge acceptorbaserede beregninger og nem påvisning af uhensigtsmæssige donor-acceptor-nøgletal. I denne protokol er ligningen af Beemiller og kolleger blevet anvendt, hvilket har den fordel, at simpel kalibrering ved en enkelt referencekonstruktion af kendt FRET-effektivitet. Justeringen af detektorerne er kritisk, især når der anvendes to forskellige typer detektorer. Tidligere data opnået med to identiske fotomultipliere og identiske gevinster resulterede i en konstant β = 0,61 for flere eksperimenter over år7,8,9 og viser, at detektorjustering er fordelagtig for reproducerbarhed. Hvis detektorerne ikke giver mulighed for en pålidelig justering, kan en sekventiel scanning med en enkelt detektor i frame-by-frame-tilstand være en mulighed for at undgå bias fra detektoregenskaber.
Målinger i planteceller påvirkes af mange pigmenter, hvilket resulterer i excitation lysabsorption og baggrund autofluorescence. De cellulære pigmenter er hovedsageligt ophidset af lys i UV til blå rækkevidde4,10. Dette forklarer forskellen mellem målingerne i celler og målinger med rensede proteiner. De rensede proteiner kan tjene som et bevis på justering, fordi de forventede værdier for ASBT α og DSBT β kan udledes af henholdsvis acceptorabsorptionsspektret og donoremissionsspektret (figur 6). Værdierne af ASBT er ens i celler (α = 0,094) og med rensede fluorophorer (α = 0,114) og tæt på den forventede værdi på 0,096 på grund af den lave cellulære absorption ved 514 nm. DSBT på β = 0,498 med rensede proteiner ligger også tæt på den forventede værdi på 0,406. Den spektrale gennemblødning afhænger yderligere af opsætningen; diodelasere på 445 eller 440 nm reducerer den direkte excitation af EYFP og reducerer dermed ASBT' en. AOBSs er karakteriseret ved en mindre transmission hul end dichroic spejle. Påvisning af EYFP er således forbedret i intervallet 500 til 510 nm og kan resultere i yderligere ASBT i donorkanalen. EYFP's spektrale egenskaber peger imidlertid på mindre end 1 % emissions af den maksimale top, idet der overvejes både mindre effektiv excitation og lavemissionsintensitet. Filtergabet er meget bredere med dichroiske spejle, hvilket resulterer i en yderligere undertrykkelse af en sådan acceptor krydstale.
Brug af værdierne fra rensede proteiner afspejler ikke situationen i cellen. Det samme gælder for kalibreringen med faktor ξ. Selvom kalibreringsfaktoren har været ens for begge LSM, var den meget højere i målinger med rekombinantprotein, hvilket afslørede virkningen af cellulære pigmenter. Det skal nævnes, at baggrundsstøjen i disse målinger var ubetydelig, men påviselig og ikke påvirkede de observerede intensiteter. I modsætning til målinger af donorlevetiden er sensibiliserede emissionsforsøg følsomme over for forholdet mellem donor acceptor, således at et overskud af donor resulterer i nedsat FRET-effektivitet.
Proteinudtrykket har imidlertid været under caMV35S-promotorens kontrol i de nuværende eksperimenter. Denne promotor bruges ofte til overekspression af proteiner i planter og kan resultere i ufysiologisk høje mængder proteiner13. Under sådanne forhold øges sandsynligheden for interaktion, og falsk-positive resultater kan forekomme med højere proteinkoncentrationer. Plotning af emissionsintensiteterne i forhold til FRET-effektiviteten resulterer derefter i en stigende FRET-effektivitet med stigende emissionsintensitet og giver mulighed for evaluering af FRET-dataene med hensyn til udtryksniveauet.
Det anbefales at adskille colocalization-eksperimenter i høj opløsning fra FRET-målinger. Til colocalization vælges optimale indstillinger for hver fluorophore, mens for FRET-optagelse forstyrrer emissionsintensiteter og finjustering ved pinhole diameter optimale billedforhold. Ikke desto mindre er adskillelsen af organeller og information om subcellulære strukturer stadig omfattet af FRET-målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi sikrer, at alle forfattere har afsløret enhver interessekonflikter og ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forsøgene blev udført på Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) fra Det Biologiske Fakultet, Bielefeld Universitet. Dette arbejde er finansieret af Bielefeld Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
