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Biochemistry

Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण जीवित संयंत्र कोशिकाओं में माप

Published: June 28, 2021 doi: 10.3791/62758
Automatic Translation
1, 1
1Dynamic Cell Imaging, Biochemistry and Physiology of Plants, Faculty of Biology, Bielefeld University

Summary

विवो Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण माप में के लिए एक मानक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, डेटा मूल्यांकन के बाद।

Abstract

संवेदी उत्सर्जन आधारित Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) प्रयोगों आसानी से किया जाता है, लेकिन माइक्रोस्कोपिक सेटअप पर निर्भर करता है। Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप जीवविज्ञानियों के लिए एक workhorse बन गए हैं। वाणिज्यिक प्रणालियां लेजर पावर समायोजन और डिटेक्टर संवेदनशीलता में उच्च लचीलापन प्रदान करती हैं और अक्सर सही छवि प्राप्त करने के लिए विभिन्न डिटेक्टरों को जोड़ती हैं। हालांकि, विभिन्न प्रयोगों और सेटअपों से तीव्रता-आधारित डेटा की तुलना अक्सर इस लचीलेपन के कारण असंभव होती है। जीवविज्ञानी के अनुकूल प्रक्रियाएं लाभ की हैं और लेजर और डिटेक्टर सेटिंग्स के सरल और विश्वसनीय समायोजन के लिए अनुमति देती हैं।

इसके अलावा, चूंकि जीवित कोशिकाओं में FRET प्रयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति और दाता-स्वीकर्ता अनुपात में परिवर्तनशीलता से प्रभावित होते हैं, इसलिए डेटा मूल्यांकन के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर विचार किया जाना चाहिए। यहां वर्णित विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य FRET माप के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है, जिसमें प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुमान और लेजर तीव्रता और डिटेक्टर सेटिंग्स के समायोजन के लिए दिनचर्या शामिल है। डेटा मूल्यांकन ज्ञात FRET दक्षता के एक fluorophore संलयन के साथ अंशांकन द्वारा किया जाएगा। सादगी में सुधार करने के लिए, सुधार कारकों की तुलना की गई है जो कोशिकाओं में और पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को मापने के द्वारा प्राप्त किए गए हैं।

Introduction

Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण ((एफ) आरईटी) आमतौर पर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है, हालांकि प्रक्रिया स्वयं फ्लोरोफोरस के बीच होने तक सीमित नहीं है। अंतर्निहित द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय युग्मन को बस एक प्रकाश उत्सर्जक दाता अणु और एक प्रकाश-अवशोषित स्वीकर्ता की आवश्यकता होती है। यह आवश्यक वर्णक्रमीय ओवरलैप इंटीग्रल जे से प्राप्त होता है जो सामान्यीकृत दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा 1 का होता है। हालांकि, क्योंकि आरईटी प्रतिदीप्ति के साथ प्रतिस्पर्धा करता है, ऊर्जा हस्तांतरण प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन द्वारा औसत दर्जे का हो जाता है: आरईटी दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन को प्रेरित करता है।

फ्लोरोफोर-आधारित आरईटी को बायोल्यूमिनेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (BRET) से अलग करने के लिए प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) कहा जाता है। आरईटी दाता और स्वीकर्ता के बीच की दूरी पर दृढ़ता से निर्भर करता है, जो व्यापक रूप से 0.5-10 एनएम 2 की सीमा में है और इस प्रकार, प्रोटीन और उनके परिसरों के आयामों के समान सीमा में है। दूसरा, आरईटी द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय अभिविन्यास कप्पा वर्ग पर निर्भर करता है। इस तथ्य के साथ संयुक्त है कि प्रोटीन-बाध्य फ्लोरोफोरस की घूर्णी स्वतंत्रता को आणविक वजन और धीमी गति से घूर्णी विश्राम के कारण उपेक्षित किया जा सकता है, आरईटी संरचनात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है3।

तथाकथित Förster त्रिज्या वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न और ओवरलैप की तरंग दैर्ध्य सीमा पर आधारित है, ताकि लाल प्रकाश को अवशोषित क्रोमोफोर के परिणामस्वरूप नीले प्रकाश-अवशोषित रंगों की तुलना में लंबे समय तक फ़र्स्टर त्रिज्या हो। चूंकि FRET माप की गतिशील सीमा R0 × 0.5 और R0 × 1.5 द्वारा सीमित है, इसलिए FRET जोड़ी ECFP-EYFP में 4.9 nm4 के R0 के कारण 2.5-7.3 nm की गतिशील सीमा है।

फ्लोरोफोर की चमक इसके दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक और इसकी क्वांटम उपज के उत्पाद द्वारा दी जाती है। FRET माप के लिए, लगभग समान चमक के fluorophores का चयन करना फायदेमंद है। यह दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन का पता लगाने को बढ़ाता है। यह माइक्रोस्कोपी सिस्टम के अंशांकन का भी पक्षधर है। सियान और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अक्सर उपयोग किए जाने वाले FRET जोड़े को देखते हुए, सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कम चमक स्पष्ट हो जाती है (चित्रा 1 ए)।

हालांकि, स्वीकर्ता का जीवनकाल दाता के जीवनकाल से कम होना चाहिए, जिससे ऊर्जा हस्तांतरण के लिए स्वीकर्ता की उपलब्धता सुनिश्चित हो। यदि स्वीकर्ता का जीवनकाल दाता के जीवनकाल से अधिक है, तो स्वीकर्ता अभी भी उत्साहित अवस्था में हो सकता है जब दाता फिर से उत्साहित होता है। उन्नत सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे mTurquoise एक विस्तारित जीवनकाल दिखाते हैं और इस प्रकार FRET (चित्रा 1 B) की बढ़ी हुई संभावना में योगदान करते हैं। FRET की संभावना भी स्वीकर्ता के दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक पर निर्भर करती है।

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Protocol

नोट:: निम्न प्रोटोकॉल के लिए, protoplasts के क्षणिक अभिकर्मक किया गया था, के रूप में पहले वर्णित 12. एक संक्षिप्त विवरण नीचे दिया गया है।

1. प्रोटोप्लास्ट का क्षणिक अभिकर्मक

  1. Arabidopsis thaliana ecotype Columbia के स्वस्थ पत्तियों के ~ 4 ग्राम को 1 मिमी स्लाइस में काटें और उन्हें एंजाइम समाधान के 20 मिलीलीटर (1.5% सेल्युलस; 0.4% मैकेरोजाइम; 0.1% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन अंश V; 0.4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), pH 5.7; 10 mM CaCl2) में स्थानांतरित करें।
  2. वैक्यूम-कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए आंदोलन के साथ एक इनक्यूबेशन के बाद पत्ती स्लाइस घुसपैठ. 100 × जी पर 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
  3. W5-समाधान (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) के साथ प्रोटोप्लास्ट को धोएं और उन्हें MMG समाधान (0.4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7) में पुन: निलंबित करें।
  4. polyethyleneglycol (PEG) 4000 की उपस्थिति में आसमाटिक सदमे से एक 8-अच्छी तरह से स्लाइड में अभिकर्मक प्रदर्शन। प्लास्मिड डीएनए (5 μg / μL) के 5 μL और PEG समाधान के 25 μL (0.2 M mannitol, 0.1 M CaCl2, 40% PEG 4000) के 25 μL के साथ प्रोटोप्लास्ट निलंबन के 20 μL को मिलाएं।
  5. आसमाटिक स्थितियों के कोमल पुनर्समायोजन द्वारा आसमाटिक सदमे को उलट दें।
    नोट: ब्याज के नमूने के अलावा, अकेले दाता और अकेले स्वीकर्ता की अभिव्यक्ति क्रमशः दाता और स्वीकर्ता के वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। दाता और स्वीकर्ता का एक संलयन प्रोटीन भी अंशांकन उद्देश्यों के लिए व्यक्त किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति एक फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर (pCaMV35S) के नियंत्रण में थी। सभी मापों के लिए, दो कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (LSM1 और LSM2) का उपयोग किया गया था। LSM1 में दो प्रकार के डिटेक्टर होते हैं: FRET माप के लिए, दाता सिग्नल को GAAsP-डिटेक्टर द्वारा पता लगाया गया था, जबकि FRET और स्वीकर्ता उत्सर्जन को एक फोटोमल्टीप्लायर के साथ दर्ज किया गया था। LSM2 में दो फोटोमल्टीप्लायर हैं, जिनका उपयोग दाता, FRET और स्वीकर्ता उत्सर्जन का पता लगाने के लिए किया गया था।

2. लेजर समायोजन

नोट: यहां, एक आर्गन-आयन लेजर की 458 एनएम और 514 एनएम लाइनों को एन्हांस्ड सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईसीएफपी) के बीच फ्रेट विश्लेषण के लिए लागू किया गया है - और बढ़े हुए पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी) - लेबल किए गए प्रोटीन। पुन: प्रस्तुत करने योग्य डेटा अधिग्रहण के लिए, दोनों लाइनों को समान तीव्रता के लिए समायोजित किया गया था। यह या तो एक संचरण photomultiplier या प्रतिबिंब मोड द्वारा प्राप्त किया गया था।

  1. एक संचरण फोटोमल्टीप्लायर के साथ लेजर समायोजन
    1. समायोजन के लिए एक खाली कुएं का उपयोग करें।
    2. लाइन-स्कैनिंग मोड और हिस्टोग्राम दृश्य चुनें.
    3. लेजर तीव्रता को न्यूनतम करने के लिए कम करें, और डिटेक्टर लाभ का पता लगाने योग्य पृष्ठभूमि शोर करने के लिए समायोजित करें।
    4. 0.5% के चरणों में लेजर तीव्रता बढ़ाएं और संबंधित संकेत रिकॉर्ड करें।
    5. दोनों लेजर लाइनों के लिए दिनचर्या लागू करें।
  2. प्रतिबिंब मोड के साथ लेजर समायोजन
    1. समायोजन के लिए एक खाली कुएं का उपयोग करें।
    2. एक प्रतिबिंब फ़िल्टर लागू करें, यदि उपलब्ध हो तो प्रतिबिंब मोड पर स्विच करें।
    3. सुनिश्चित करें कि डिटेक्टर तरंग दैर्ध्य रेंज लेजर की तरंग दैर्ध्य को कवर करती है।
    4. लाइन-स्कैनिंग मोड और हिस्टोग्राम दृश्य चुनें.
    5. लेजर तीव्रता को न्यूनतम करने के लिए कम करें, और डिटेक्टर लाभ का पता लगाने योग्य पृष्ठभूमि शोर करने के लिए समायोजित करें।
    6. उद्देश्य को निम्नतम स्थिति में ले जाएँ.
    7. उद्देश्य को तब तक ऊपर ले जाएँ जब तक कि कवरस्लिप का प्रतिबिंब दिखाई न दे।
    8. 0.5% के चरणों में लेजर तीव्रता बढ़ाएं और संबंधित संकेत रिकॉर्ड करें।
    9. दोनों लेजर लाइनों के लिए दिनचर्या लागू करें।
  3. डेटा मूल्यांकन
    1. डेटा को सारणीबद्ध करें और डेटा को सिग्नल तीव्रता के आधार पर सॉर्ट करें।
    2. सापेक्ष लेजर शक्ति के खिलाफ संकेत तीव्रता प्लॉट.
    3. लेजर तीव्रता चुनें जिसके परिणामस्वरूप समान संकेत तीव्रता होती है।

3. फोटोमल्टीप्लायर का समायोजन

नोट: लेजर समायोजन के बाद, photomultipliers समान संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत लाभ के लिए समायोजित किए गए थे। यह अंशांकन 514 एनएम लेजर लाइन के साथ किया गया था, जो ब्याज की तरंग दैर्ध्य सीमा के केंद्र में है।

  1. समायोजन के लिए एक खाली कुएं का उपयोग करें।
  2. एक प्रतिबिंब फ़िल्टर लागू करें, और यदि उपलब्ध हो तो प्रतिबिंब मोड पर स्विच करें.
  3. सुनिश्चित करें कि डिटेक्टर तरंग दैर्ध्य सीमा लेजर (514 एनएम) की तरंग दैर्ध्य को कवर करती है।
  4. लाइन स्कैनिंग मोड और हिस्टोग्राम दृश्य चुनें.
  5. डिटेक्टर लाभ को अधिकतम आधा करने के लिए कम करें, और पता लगाने योग्य पृष्ठभूमि शोर के लिए लेजर तीव्रता को समायोजित करें।
  6. उद्देश्य को निम्नतम स्थिति में ले जाएँ.
  7. उद्देश्य को तब तक ऊपर ले जाएँ जब तक कि कवरस्लिप का प्रतिबिंब दिखाई न दे।
  8. 50 से 100 V के चरणों में डिटेक्टर लाभ को बढ़ाएं और संबंधित सिग्नल रिकॉर्ड करें।
  9. दोनों डिटेक्टरों के लिए चरण 3.1 से 3.8 तक लागू करें।
  10. डेटा मूल्यांकन
    1. प्रत्येक डिटेक्टर के लिए डिटेक्टर लाभ के खिलाफ तीव्रता प्लॉट।
    2. समान संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत डिटेक्टर लाभ चुनें।

4. FRET छवि अधिग्रहण

नोट:: छवि अधिग्रहण की स्थापना के लिए रुचि के नमूने के साथ प्रारंभ करें।

  1. उचित फ़िल्टर/डाइक्रोइक दर्पण चुनें, उदाहरण के लिए, FRET-जोड़ी ECFP/EYFP के लिए एक डबल डाइक्रोइक दर्पण MBS 458/514. लाइन-दर-लाइन स्कैनिंग को सक्षम करने के लिए सभी चैनलों के लिए एक ही डाइक्रोइक दर्पण का उपयोग करें। जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए एक जल विसर्जन उद्देश्य का चयन करें। 12 बिट- या 16-बिट स्कैनिंग और मध्यम स्कैनिंग गति चुनें।
  2. पता लगाने की सीमा को परिभाषित करें, अधिमानतः दाता का पता लगाने के लिए 470-510 एनएम और ECFP / EYFP के मामले में स्वीकर्ता / FRET का पता लगाने के लिए 530-600 एनएम। 445 एनएम या 440 एनएम डायोड लेजर का उपयोग करते समय, पता लगाने की सीमा के रूप में 450 से 510 एनएम का उपयोग करें। एक acousto-ऑप्टिक बीम विभाजक (AOBS) के मामले में, अवांछित स्वीकर्ता का पता लगाने को रोकने के लिए 450 से 500 एनएम की सीमा में दाता का पता लगाने को परिभाषित करें।
  3. 3.10.2 के अनुसार डिटेक्टर सेटिंग लागू करें।
  4. 2.3.2 के अनुसार लेजर सेटिंग लागू करें। यदि आवश्यक हो, तो प्राप्त लेजर पावर टेबल के आधार पर लेजर तीव्रता को संशोधित करें। सुनिश्चित करें कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात डिटेक्टरों की पूरी गतिशील सीमा को कवर करता है (12-बिट स्कैनिंग के लिए 0 से 4095 तक की तीव्रता)।
  5. लेजर तीव्रता रखें और डिटेक्टर लाभ स्थिर. ठीक ट्यूनिंग के लिए पिनहोल व्यास का उपयोग करें।
    नोट: ध्यान रखें कि पिनहोल व्यास में परिवर्तन स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को प्रभावित करते हैं।
  6. माप निष्पादित करें (कम से कम 20 कोशिकाओं की छवियां लें)।

5. crosstalk सुधार का निर्धारण

नोट: केवल दाता या स्वीकर्ता को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को क्रमशः दाता वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू (DSBT) और स्वीकर्ता वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू (ASBT) निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। अनुभाग 4 में वर्णित समान सेटिंग्स रखें.

  1. दाता fluorophore व्यक्त कोशिकाओं के साथ FRET माप प्रदर्शन.
  2. स्वीकर्ता फ्लोरोफोर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के साथ FRET मापन करें.

6. Beemiller एट al.13 के अनुसार माप का अंशांकन

नोट: ज्ञात FRET दक्षता के एक दाता-स्वीकर्ता संलयन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। यहां, 0.46 की FRET दक्षता के साथ एक ECFP-5 aa-EYFP-संलयन का उपयोग किया गया है। अनुभाग 4 में वर्णित समान सेटिंग्स रखें.

  1. दाता-स्वीकर्ता संलयन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के साथ FRET माप निष्पादित करें

7. डेटा मूल्यांकन

  1. कक्षों की पंक्ति प्रोफ़ाइल प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक प्रोफ़ाइल में एक से अधिक कक्ष नहीं हैं. प्रोफ़ाइल को पाठ फ़ाइलों के रूप में सहेजें.
  2. डेटा अनुभाग में पाठ फ़ाइल आयात विकल्प का उपयोग करके पाठ फ़ाइलों को स्प्रेडशीट में आयात करें .
  3. अधिकतम फ़ंक्शन लागू करके अधिकतम मानों को पढ़ें.
  4. एक तालिका में प्राप्त मूल्यों को सूचीबद्ध करें, दाता उत्सर्जन आईडी, फ्रेट उत्सर्जन आईएफ, स्वीकर्ता उत्सर्जन आईए, और कम से कम चार डेटा सेट के लिए एक कॉलम है: केवल दाता, स्वीकर्ता केवल, दाता-स्वीकर्ता संलयन, और माप।
    नोट:: दाता की उत्तेजना भी स्वीकर्ता की प्रत्यक्ष उत्तेजना में परिणाम और α मान द्वारा वर्णित ASBT का कारण बनता है।
  5. समीकरण (1) का उपयोग करके स्वीकर्ता-केवल डेटासेट के साथ ASBT α मानों की गणना करें.
    Equation 1 (1)
    नोट:: निम्न समीकरणों में सभी α-मानों की माध्यिका का उपयोग करें। दाता एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखाता है जिसके परिणामस्वरूप स्वीकर्ता के संवेदनशील उत्सर्जन के साथ उत्सर्जन क्रॉसस्टॉक होता है। यह DSBT β मान द्वारा दिया गया है।
  6. समीकरण (2) का उपयोग करके दाता-केवल डेटासेट के साथ दाता वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू β मानों की गणना करें।
    Equation 2 (2)
    नोट:: निम्न समीकरणों में सभी β मानों की माध्यिका का उपयोग करें। अंशांकन कारक π FRET-व्युत्पन्न दाता शमन और स्वीकर्ता के संवेदनशील उत्सर्जन के रैखिक संबंध का वर्णन करता है। निम्नलिखित समीकरणों में 7.5 और 7.6 के माध्यिकाओं का उपयोग करें।
  7. समीकरण (3) का उपयोग करके दाता-स्वीकर्ता संलयन डेटासेट और इसकी FRET दक्षता E (0.46) के साथ अंशांकन कारकों की गणना करें।
    Equation 3 (3)
    नोट:: निम्न समीकरणों में सभी π मानों की माध्यिका का उपयोग करें।
  8. समीकरण (4) और (5) का उपयोग करके ब्याज की प्रोटीन जोड़ी की FRET दक्षता की गणना करें।
    Equation 4 (4)
    Equation 5 (5)
  9. अभिव्यक्ति शक्ति और / या दाता-स्वीकर्ता अनुपात के प्रभावों का अनुमान लगाएं: FRET दक्षता के खिलाफ आईडी, आईएफ और आईए का योग प्लॉट करें। एक रैखिक प्रतिगमन निष्पादित करें; ध्यान दें कि ग्राफ और उच्च R2 steeper है, उच्च अभिव्यक्ति के स्तर का प्रभाव है या अधिक से अधिक दाता और स्वीकर्ता बहुतायत का अंतर है.

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Representative Results

confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का समायोजन
लेजर समायोजन ने बढ़ती लेजर तीव्रता (चित्रा 2 और तालिका 1) के साथ उत्सर्जन की एक रैखिक वृद्धि का खुलासा किया। जैसा कि आर्गन-आयन लेजर के लिए अपेक्षित था, 514 एनएम लाइन का उत्सर्जन 458 एनएम लाइन के उत्सर्जन की तुलना में बहुत अधिक था, जैसा कि एक खड़ी ढलान से स्पष्ट है। बाद के प्रयोगों के लिए, 4.5% और 6.5% की लेजर शक्ति को क्रमशः 514 एनएम लाइन और 458 एनएम लाइन के लिए चुना गया था। इसके परिणामस्वरूप 1123 (514 एनएम) और 1141 (458 एनएम) की लगभग बराबर उत्सर्जन तीव्रता हुई।

निरंतर लेजर शक्ति पर डिटेक्टर लाभ को अलग-अलग करने से दोनों विश्लेषण डिटेक्टरों के लिए एक घातीय व्यवहार का पता चला। इसी तरह की उत्सर्जन तीव्रता 700 वोल्ट (चित्रा 3) के लाभ के लिए प्राप्त की गई थी। यद्यपि लेजर लाइनों का समायोजन रैखिक व्यवहार से लाभान्वित हुआ, डिटेक्टरों का समायोजन संभवतः घातीय व्यवहार से प्रभावित होता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च वोल्टेज पर लाभ में मामूली परिवर्तनों के साथ चिह्नित अंतर होता है। दुर्भाग्य से, यह उच्च सीमा जीवित कोशिकाओं में माप के लिए रुचि की है, क्योंकि लेजर शक्ति को बढ़ाना साइटोटॉक्सिक है और फोटोब्लीचिंग को बढ़ावा देता है।

वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से निर्धारित करना
सबसे पहले, दाता और स्वीकर्ता के वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू का पुनः संयोजक शुद्ध ईसीएफपी और ईवाईएफपी के साथ विश्लेषण किया गया था; DSBT β = 0.498 और ASBT α = 0.100 ईसीएफपी या ईवाईएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के साथ भी ऐसा ही किया गया था। LSM 2 के साथ, अनुमानित DSBT β = 1.602 ± 0.207 (एसडी ± मतलब) और ASBT α = 0.119 ± 0.018 था। माध्य मान = 1.506 β और α = 0.120 थे। जीवित कोशिकाओं में प्राप्त डेटा और पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ प्राप्त डेटा के बीच यह विसंगति दर्शाती है कि जीवित कोशिकाओं में वर्णक्रमीय रक्तस्राव के निर्धारण को छोड़ना असंभव है। यह संभवतः सेलुलर पिगमेंट के कारण होता है।

छवियों ECFP (चित्रा 4 और तालिका 2) की तुलना में EYFP की उच्च चमक से पता चलता है। विभिन्न लेजर सेटिंग्स द्वारा चमक में अंतर की क्षतिपूर्ति दाता और FRET चैनल की गतिशील सीमा को बढ़ाता है। लेजर तीव्रता को मापने के द्वारा सापेक्ष आउटपुट प्रदान करना, जैसा कि समायोजन के लिए किया गया है, अभी भी माप की पुनरुत्पादकता को बढ़ाता है।

LSM 1 के लिए, β = 0.171 ± 0.044, α = 0.094 ± 0.031 α की माध्यिकाओं के साथ = 0.084 और β = 0.180। एएसबीटी का निर्धारण लेजर समायोजन और एक एकल डिटेक्टर पर निर्भर करता है, और इस प्रकार, एएसबीटी के निर्धारण ने अच्छी तरह से प्रदर्शन किया। DBST में दो डिटेक्टर शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप दोनों माइक्रोस्कोप के लिए काफी अलग परिणाम होते हैं। यह याद रखा जाना चाहिए कि एलएसएम 2 दो फोटोमल्टीप्लायर से सुसज्जित है, जबकि एलएसएम 1 एक GAAsP डिटेक्टर और एक फोटोमल्टीप्लायर का उपयोग करता है, विभिन्न वर्णक्रमीय गुणों और संवेदनशीलता के साथ दो अलग-अलग प्रकार के डिटेक्टरों का उपयोग करता है। तदनुसार, समायोजन दो समान डिटेक्टरों के साथ बेहतर काम करता है।

माप का अंशांकन
अंशांकन के लिए, α और β के औसत मूल्यों को लागू किया गया था, और ECFP और EYFP के संलयन का उपयोग ज्ञात FRET दक्षता (E = 0.46) के मानक के रूप में किया गया था। पुनः संयोजक और शुद्ध ECFP-EYFP के अंशांकन के परिणामस्वरूप 13.44 का एक π मान हुआ, जबकि इन विवो मापों ने 1.525 ± 1.844 के मूल्य का खुलासा किया। माध्यिका 0.798 थी, जो उच्च मानक विचलन के साथ चरम बाहरी लोगों को प्रकट करती थी। LSM 1 के लिए, मान ों को π = 1.978 ± 0.807 के ± π = 1.883 की माध्यिका के साथ π = 1.883 के माध्यिका के साथ किया गया था। LSM 2 और LSM 1 के लिए, π (तालिका 3) की गणना के लिए प्राप्त डेटासेट सांख्यिकीय रूप से समान थे, जैसा कि छात्र के टी-टेस्ट (पी > 0.2) द्वारा सिद्ध किया गया था।

FRET मापन
अवधारणा के प्रमाण के रूप में, FRET माप दाता-स्वीकर्ता संलयन के साथ दोहराया गया था। मापा FRET दक्षता शुद्ध प्रोटीन के लिए 0.47 ± 0.07 और LSM 2 (तालिका 4) के साथ जीवित कोशिकाओं में 0.47 ± 0.06 था। जीवित कोशिकाओं में माप का माध्यिका E = 0.45 था। LSM 1 के लिए, FRET दक्षता 0.46 ± 0.09 थी, जिसमें E = 0.45 (तालिका 4) की माध्यिका थी। ये डेटा ज्ञात FRET दक्षता के FRET निर्माण के साथ प्रभावी अंशांकन प्रदर्शित करते हैं।

अभिव्यक्ति स्तर और दाता-स्वीकर्ता अनुपात के प्रभाव
विश्लेषण किए गए डेटा सेट के लिए, FRET दक्षता अभिव्यक्ति स्तर से प्रभावित नहीं थी। दाता और स्वीकर्ता के संलयन के कारण, अनुपात भी स्थिर था। पिछले डेटासेट को शामिल करने से एक मामले में अभिव्यक्ति स्तर पर निर्भरता का पता चला (चित्रा 5)। लेबल वाले वैक्यूलर ATPase (V-ATPase) सबयूनिट्स, VHA-A-ECFP और VHA-a-EYFP के बीच FRET दक्षता, बढ़ती सिग्नल तीव्रता के साथ कम हो गई। इसके विपरीत, VHA-E1-ECFP और VHA-C-EYFP के बीच बातचीत सिग्नल तीव्रता से स्वतंत्र थी। वीएचए-ए और वीएचए-ए के मामले में, वीएचए-ए की तीन प्रतियों को वीएचए-ए-ईसीएफपी द्वारा तेजी से बदल दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप परिसर में वीएचए-ए की एकल प्रति की तुलना में दाता की अधिकता होती है। हालांकि वीएचए-ई 1 तीन प्रतियों के रूप में मौजूद हो सकता है, वीएचए-सी की उच्च घुलनशीलता इस उदाहरण में इस प्रभाव को समाप्त कर सकती है। यहां, FRET दक्षता तुलनात्मक रूप से कम रही है। यह सरल दृष्टिकोण अभिव्यक्ति और अनुपात कलाकृतियों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: सियान उत्सर्जक दाताओं के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन FRET जोड़े का अवलोकन। (ए) जोड़े की फ़रस्टर त्रिज्या और दाता और स्वीकर्ता की चमक अच्छी तरह से विशेषता वाले फ्रेट जोड़े के लिए दी जाती है। (बी) दाता और स्वीकर्ता जीवनकाल की तुलना। ग्रे तारांकन एक बहुघातीय क्षय का संकेत देते हैं। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; CFP = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; mX = मोनोमेरिक एक्स; EX = बढ़ाया X; SX = सुपर एक्स. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लेजर समायोजन. लेजर के उत्सर्जन को कवरस्लिप के प्रतिबिंब द्वारा दर्ज किया गया था और एलएसएम के एकोस्टो-ऑप्टिक ट्यूनेबल फिल्टर द्वारा संशोधित के रूप में सापेक्ष लेजर तीव्रता के खिलाफ प्लॉट किया गया था। एक आर्गन-आयन लेजर की 458 एनएम लाइन (ए) और 514 एनएम लाइन (बी) का उत्सर्जन दिखाया गया है। संक्षेप: LSM = लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप; r.u. = सापेक्ष इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डिटेक्टर लाभ और उत्सर्जन तीव्रता. परिणामी उत्सर्जन तीव्रता को डिटेक्टर लाभ के लिए प्रतिबिंब मोड में दर्ज किया गया था, जो क्रमशः डिटेक्टर 1 (ए) और डिटेक्टर 2 (बी) के लिए 300 से 750 वी और 300 से 750 वी तक था। संक्षिप्त नाम = r.u. = सापेक्ष इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वर्णक्रमीय खून के माध्यम से. छवियों को दाता, FRET, और स्वीकर्ता चैनलों में प्राप्त किया गया था। (ए) शुद्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्राप्त छवियां; स्केल सलाखों = 100 μm; (बी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए संबंधित छवियां; स्केल सलाखों = 10 μm. (C) प्राप्त SBT मानों के रेखांकन; मतलब ± एसडी दिया गया है. संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; एसबीटी = वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से; ECFP = बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; LSM = लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप; ASBT = स्वीकर्ता SBT; DSBT = दाता SBT. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अभिव्यक्ति स्तर और / या दाता-स्वीकर्ता अनुपात के प्रभाव। दाता, FRET, और स्वीकर्ता चैनलों में उत्सर्जन का योग FRET दक्षता के खिलाफ प्लॉट किया गया है। यह VHA-E1-ECFP और VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP और VHA-a-EYFP (B), और ECFP-EYFP संलयन (C) के लिए किया गया है। रैखिक प्रतिगमन किया गया था; समीकरण और R2 दिए गए हैं। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; ECFP = बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; VHA = vacuolar ATPase subunit कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: दाता और स्वीकर्ता ईसीएफपी और ईवाईएफपी के माध्यम से खून बहाते हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्पेक्ट्रा एफपी डेटाबेस 14 से प्राप्त किया गया था। (क) संवेदी उत्सर्जन प्रयोगों के दौरान, दाता और स्वीकर्ता के विशाल भागों का पता क्रमश पीएमटी1 और पीएमटी2 नामक व्यक्तिगत फोटोमल्टीप्लायरों द्वारा लगाया जाता है। ECFP उत्सर्जन भी 458 एनएम के साथ उत्तेजना पर स्वीकर्ता डिटेक्टर द्वारा पता लगाने योग्य है। पीएमटी 2 में परिकलित दाता वर्णक्रमीय रक्तस्राव-थ्रू पीएमटी 1 द्वारा पता लगाए गए उत्सर्जन का 40.6% है। (बी) ईवाईएफपी का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दर्शाता है कि ईवाईएफपी 458 एनएम पर प्रत्यक्ष उत्तेजना दिखाता है, जिसे अक्सर सियान दाताओं की उत्तेजना के लिए लागू किया जाता है। अपेक्षित उत्तेजना दक्षता 514 एनएम पर उत्तेजना का 9.6% है। संक्षिप्त रूप: एफपी = फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ECFP = बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EYFP = बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PMT = photomultiplier कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: लेजर शक्ति और संकेत तीव्रता। 458 एनएम लाइन की सिग्नल तीव्रता नीले रंग में दी गई है, हरे रंग में 514 एनएम लाइन की सिग्नल तीव्रता। प्रयोग के लिए लागू तीव्रता को ग्रे में हाइलाइट किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: एसबीटी निर्धारण के लिए संकेत तीव्रता। रिकॉर्ड किए गए मैक्सिमा और परिकलित α और β मान दिए गए हैं। संक्षिप्त रूप: SBT = वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से; LSM = लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; ASBT = स्वीकर्ता SBT; DSBT = दाता SBT. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: अंशांकन के लिए संकेत तीव्रता। रिकॉर्ड किए गए मैक्सिमा और परिकलित π मान दिए गए हैं। सही मान FRET संकेत तीव्रता माइनस SBT के अनुरूप है। संक्षिप्त रूप: SBT = वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से; LSM = लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: FRET माप के लिए संकेत तीव्रता. रिकॉर्ड किए गए मैक्सिमा और ई मान दिए गए हैं। सही मान FRET संकेत तीव्रता माइनस SBT के अनुरूप है। कैलिब्रेटेड ई मानों की गणना अंशांकन के साथ π द्वारा की गई थी। संक्षिप्त रूप: SBT = वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से; LSM = लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप; FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; cal. = कैलिब्रेटेड। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

दाता शमन और संवेदनशील स्वीकर्ता उत्सर्जन को एक रैखिक संबंध की विशेषता है जो या तो दाता- या FRET के स्वीकर्ता-आधारित गणना के लिए अनुमति देता है। रैखिकता के संबंधित कारकों को या तो जी कारक (दाता से स्वीकर्ता) या xi (दाता के लिए स्वीकर्ता) कहा जाता है, जो पारस्परिक मान हैं4। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच FRET को मापने के लिए अक्सर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के व्यापक अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के कारण DSBT और ASBT के लिए सुधार की आवश्यकता होती है। हालांकि, कई सुधार एक औसत दर्जे के ASBT पर निर्भर करते हैं, जो प्रोटोकॉल अनुभाग 7 में समीकरणों के हर में एक कारक है, और एक α = 0 अपरिभाषित समीकरण5,6 में परिणाम देता है।

इस तरह के प्रभावों से बचने के लिए लेजर तीव्रता के समायोजन की सिफारिश की जाती है। यह स्वीकर्ता-आधारित गणनाओं के उपयोग और अनुचित दाता-स्वीकर्ता अनुपात का आसान पता लगाने में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, बीमिलर और सहकर्मियों के समीकरण को लागू किया गया है, जिसमें ज्ञात FRET दक्षता के एकल संदर्भ निर्माण द्वारा सरल अंशांकन का लाभ है। डिटेक्टरों का समायोजन महत्वपूर्ण है, खासकर जब दो अलग-अलग प्रकार के डिटेक्टरों को लागू किया जाता है। दो समान फोटोमल्टीप्लायर और समान लाभ के साथ प्राप्त पिछले डेटा के परिणामस्वरूप वर्षों में कई प्रयोगों के लिए एक निरंतर β = 0.61 = 0.61 हुआ और यह प्रदर्शित किया गया कि डिटेक्टर समायोजन पुनरुत्पादन के लिए फायदेमंद है। यदि डिटेक्टर एक विश्वसनीय समायोजन की अनुमति नहीं देते हैं, तो फ्रेम-बाय-फ्रेम मोड में एकल डिटेक्टर के साथ एक अनुक्रमिक स्कैन डिटेक्टर गुणों से पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक विकल्प हो सकता है।

पौधे की कोशिकाओं में माप कई वर्णकों से प्रभावित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उत्तेजना प्रकाश अवशोषण और पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस होता है। सेलुलर पिगमेंट मुख्य रूप से यूवी से नीली रेंज 4,10 में प्रकाश से उत्साहित होते हैं। यह कोशिकाओं में माप और शुद्ध प्रोटीन वाले लोगों के बीच विसंगति की व्याख्या करता है। शुद्ध प्रोटीन समायोजन के प्रमाण के रूप में काम कर सकते हैं क्योंकि एएसबीटी α और डीएसबीटी β के लिए अपेक्षित मूल्य क्रमशः स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रम और दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 6)। ASBT के मान कोशिकाओं (α = 0.094) में समान हैं और शुद्ध फ्लोरोफोरस (α = 0.114) के साथ और 514 एनएम पर कम सेलुलर अवशोषण के कारण 0.096 के अपेक्षित मूल्य के करीब हैं। शुद्ध प्रोटीन के साथ β = 0.498 का DSBT भी 0.406 के अपेक्षित मूल्य के करीब है। वर्णक्रमीय रक्तस्राव के माध्यम से आगे सेटअप पर निर्भर करता है; 445 या 440 एनएम के डायोड लेजर EYFP के प्रत्यक्ष उत्तेजना को कम करते हैं और इस प्रकार ASBT को कम करते हैं। AOBS को डाइक्रोइक दर्पणों की तुलना में एक छोटे संचरण अंतर की विशेषता है। इस प्रकार, EYFP का पता लगाने को 500 से 510 एनएम की सीमा में बढ़ाया जाता है और इसके परिणामस्वरूप दाता चैनल में अतिरिक्त ASBT हो सकता है। हालांकि, EYFP के वर्णक्रमीय गुण अधिकतम शिखर के 1% से कम उत्सर्जन को इंगित करते हैं, कम प्रभावी उत्तेजना और कम उत्सर्जन तीव्रता दोनों पर विचार करते हैं। फिल्टर अंतर dichroic दर्पण के साथ बहुत व्यापक है, इस तरह के स्वीकर्ता crosstalk के एक अतिरिक्त दमन में जिसके परिणामस्वरूप.

शुद्ध प्रोटीन से मूल्यों का उपयोग करना सेल में स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करता है। वही कारक द्वारा अंशांकन के लिए सच है π. यद्यपि अंशांकन कारक दोनों एलएसएम के लिए समान रहा है, यह पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ माप में बहुत अधिक था, जो सेलुलर पिगमेंट के प्रभाव का खुलासा करता है। यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि इन मापों में, पृष्ठभूमि शोर नगण्य था लेकिन पता लगाने योग्य था और मनाया तीव्रता को प्रभावित नहीं करता था। दाता जीवनकाल के माप के विपरीत, संवेदनशील उत्सर्जन प्रयोग दाता-स्वीकर्ता अनुपात के प्रति संवेदनशील होते हैं ताकि दाता की अधिकता के परिणामस्वरूप FRET दक्षता में कमी हो।

हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति वर्तमान प्रयोगों में CaMV35S-प्रमोटर के नियंत्रण में रही है। इस प्रमोटर का उपयोग अक्सर पौधों में प्रोटीन के ओवरएक्सप्रेशन के लिए किया जाता है और इसके परिणामस्वरूप प्रोटीन 13 की अनफिजियोलॉजिकल रूप से उच्च मात्रा हो सकती है। ऐसी परिस्थितियों में, बातचीत की संभावना बढ़ जाती है, और झूठे-सकारात्मक परिणाम उच्च प्रोटीन सांद्रता के साथ हो सकते हैं। FRET दक्षता के खिलाफ उत्सर्जन तीव्रता की साजिश रचने तो उत्सर्जन तीव्रता में वृद्धि के साथ एक बढ़ती FRET दक्षता में परिणाम और अभिव्यक्ति के स्तर के संबंध में FRET डेटा के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है.

FRET माप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन सहस्थानीयकरण प्रयोगों को अलग करने की सिफारिश की जाती है। कोलोकलाइजेशन के लिए, इष्टतम सेटिंग्स को प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए चुना जाता है, जबकि FRET रिकॉर्डिंग के लिए, पिनहोल व्यास द्वारा उत्सर्जन तीव्रता और ठीक-ट्यूनिंग इष्टतम छवि स्थितियों में हस्तक्षेप करती है। फिर भी, ऑर्गेनेल का पृथक्करण और उपकोशिकीय संरचनाओं पर जानकारी अभी भी FRET माप में शामिल है।

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Disclosures

हम यह सुनिश्चित करते हैं कि सभी लेखकों ने हितों के किसी भी और सभी संघर्षों का खुलासा किया है और कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

प्रयोगों को जीव विज्ञान संकाय, Bielefeld विश्वविद्यालय के लाइट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी मंच (LiMiTec) में किया गया था। इस काम को Bielefeld University द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well slides Ibidi 80821
Immersion oil Immersol  W2010 Zeiss 444969-0000-000 refraction index of water
LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope Zeiss
LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope Zeiss

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References

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जैव रसायन अंक 172
Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण जीवित संयंत्र कोशिकाओं में माप
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Schmidtpott, S. M., Seidel, T.… More

Schmidtpott, S. M., Seidel, T. Förster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells. J. Vis. Exp. (172), e62758, doi:10.3791/62758 (2021).

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