Summary
Viene fornito un protocollo per la creazione di un microscopio a scansione laser confocale standard per misure in vivo di trasferimento di energia di risonanza Förster, seguito da una valutazione dei dati.
Abstract
Gli esperimenti FRET (Sensitized emission-based Förster resonance energy transfer) sono facilmente eseguibili ma dipendono dalla configurazione microscopica. I microscopi a scansione laser confocale sono diventati un cavallo di battaglia per i biologi. I sistemi commerciali offrono un'elevata flessibilità nella regolazione della potenza laser e nella sensibilità del rilevatore e spesso combinano diversi rilevatori per ottenere l'immagine perfetta. Tuttavia, il confronto dei dati basati sull'intensità di diversi esperimenti e configurazioni è spesso impossibile a causa di questa flessibilità. Le procedure di compatibilità con i biologi sono vantaggiose e consentono una regolazione semplice e affidabile delle impostazioni del laser e del rilevatore.
Inoltre, poiché gli esperimenti FRET nelle cellule viventi sono influenzati dalla variabilità nell'espressione proteica e nei rapporti donatore-accettore, i livelli di espressione proteica devono essere considerati per la valutazione dei dati. Qui è descritto un semplice protocollo per misurazioni FRET affidabili e riproducibili, comprese le routine per la stima dell'espressione proteica e la regolazione dell'intensità del laser e delle impostazioni del rilevatore. La valutazione dei dati sarà eseguita mediante calibrazione con una fusione fluoroforica di efficienza FRET nota. Per migliorare la semplicità, sono stati confrontati i fattori di correzione che sono stati ottenuti nelle cellule e misurando le proteine fluorescenti ricombinanti.
Introduction
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster ((F)RET) è tipicamente osservato dalla spettroscopia di fluorescenza, sebbene il processo stesso non sia limitato a verificarsi tra i fluorofori. L'accoppiamento dipolo-dipolo sottostante richiede semplicemente una molecola donatrice che emette luce e un accettore che assorbe la luce. Questo è derivato dall'integrale J di sovrapposizione spettrale richiesto degli spettri normalizzati di emissione del donatore e di assorbanza dell'accettore1. Tuttavia, poiché ret compete con la fluorescenza, il trasferimento di energia diventa misurabile dalle alterazioni dell'emissione di fluorescenza: RET induce la tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati.
Il RET a base di fluorofori è stato definito trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) per separarlo dal trasferimento di energia di risonanza di bioluminescenza (BRET). La RET dipende fortemente dalla distanza tra donatore e accettore, che è ampiamente nell'intervallo di 0,5-10 nm2 e, quindi, nello stesso intervallo delle dimensioni delle proteine e dei loro complessi. In secondo luogo, RET dipende dall'orientamento dipolo-dipolo kappa al quadrato. In combinazione con il fatto che la libertà rotazionale dei fluorofori legati alle proteine può essere trascurata a causa del peso molecolare e del lento rilassamento rotazionale, RET consente l'analisi delle alterazioni conformazionali3.
Il cosiddetto raggio di Förster si basa sull'integrale di sovrapposizione spettrale e sull'intervallo di lunghezze d'onda della sovrapposizione, in modo che i cromofori che assorbono la luce rossa producano raggi di Förster più lunghi rispetto ai coloranti che assorbono la luce blu. Poiché la gamma dinamica delle misurazioni FRET è limitata da 0,5 × R0 e 1,5 × R0, la coppia FRET ECFP-EYFP ha una gamma dinamica di 2,5-7,3 nm grazie al suo R0 di 4,9 nm4.
La luminosità di un fluoroforo è data dal prodotto del suo coefficiente di estinzione molare e dalla sua resa quantistica. Per le misurazioni FRET, è vantaggioso scegliere fluorofori di luminosità quasi simile. Ciò migliora il rilevamento della tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati. Favorisce inoltre la calibrazione del sistema di microscopia. Osservando le coppie FRET frequentemente utilizzate di proteine ciano e fluorescenti, la minore luminosità delle proteine fluorescenti ciano diventa evidente (Figura 1A).
Tuttavia, la durata dell'accettore deve essere inferiore alla durata di vita del donatore, garantendo la disponibilità dell'accettore per il trasferimento di energia. Se la vita dell'accettore supera la vita del donatore, l'accettore potrebbe essere ancora nello stato eccitato quando il donatore è di nuovo eccitato. Le proteine fluorescenti ciano avanzate come mTurquoise mostrano una durata prolungata e quindi contribuiscono ad aumentare la probabilità di FRET (Figura 1B). La probabilità di FRET dipende anche dal coefficiente di estinzione molare dell'accettore.
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Protocol
NOTA: Per il seguente protocollo, è stata eseguita la trasfezione transitoria di protoplasti, come descritto in precedenza12. Di seguito è riportata una breve descrizione.
1. Trasfezione transitoria di protoplasti
- Tagliare ~4 g di foglie sane di Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia in fette da 1 mm e trasferirle in 20 ml di soluzione enzimatica (1,5% cellulasi; 0,4% macerozima; 0,1% albumina sierica bovina Frazione V; 0,4 M mannitolo; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morfolino)etanosolfonico (MES), pH 5,7; 10 mM CaCl2).
- Infiltrare sottovuoto le fette fogliari seguite da un'incubazione con agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 3 minuti a 100 × g.
- Lavare i protoplasti con soluzione W5 (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) e risospenderli in soluzione MMG (0,4 M mannitolo; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
- Eseguire la trasfezione in uno scivolo a 8 pozzetti mediante shock osmotico in presenza di polietileneglicole (PEG) 4000. Mescolare 20 μL della sospensione del protoplasto con 5 μL di DNA plasmidico (5 μg/μL) e 25 μL di soluzione PEG (0,2 M mannitolo, 0,1 M CaCl2, 40% PEG 4000).
- Invertire lo shock osmotico mediante un delicato riaggiustamento delle condizioni osmotiche.
NOTA: Oltre al campione di interesse, l'espressione del solo donatore e dell'accettore da solo è necessaria per determinare il sanguinamento spettrale del donatore e dell'accettore, rispettivamente. Una proteina di fusione del donatore e dell'accettore deve essere espressa anche ai fini della calibrazione. L'espressione della proteina fluorescente era sotto il controllo di un promotore del virus del mosaico del cavolfiore 35S (pCaMV35S). Per tutte le misurazioni sono stati utilizzati due microscopi a scansione laser confocale (LSM1 e LSM2). LSM1 ha due tipi di rivelatori: per le misurazioni FRET, il segnale donatore è stato rilevato da un rilevatore GaAsP, mentre l'emissione FRET e accettore è stata registrata con un fotomoltiplicatore. LSM2 ha due fotomoltiplicatori, che sono stati utilizzati per il rilevamento dell'emissione di donatori, FRET e accettori.
2. Regolazione laser
NOTA: Qui, linee a 458 nm e 514 nm di un laser agli ioni di argon sono state applicate per l'analisi FRET tra proteine marcate con proteina fluorescente ciano potenziata (ECFP) e proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP). Per l'acquisizione dei dati riproducibile, entrambe le linee sono state regolate a un'intensità simile. Ciò è stato ottenuto da un fotomoltiplicatore di trasmissione o dalla modalità di riflessione.
- Regolazione laser con fotomoltiplicatore a trasmissione
- Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
- Scegliere la modalità di scansione delle linee e la vista dell'istogramma.
- Ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile.
- Aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% e registrare il segnale corrispondente.
- Applicare la routine per entrambe le linee laser.
- Regolazione laser con modalità di riflessione
- Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
- Applicare un filtro di riflessione, attivare la modalità di riflessione, se disponibile.
- Assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser.
- Scegliere la modalità di scansione delle linee e la vista dell'istogramma.
- Ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile.
- Spostare l'obiettivo nella posizione più bassa.
- Sposta l'obiettivo verso l'alto fino a quando il riflesso della copertina è visibile.
- Aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% e registrare il segnale corrispondente.
- Applicare la routine per entrambe le linee laser.
- Valutazione dei dati
- Tabulare i dati e ordinarli in base alle intensità del segnale.
- Traccia le intensità del segnale rispetto alla potenza relativa del laser.
- Scegli le intensità del laser che si traducono in un'intensità del segnale simile.
3. Regolazione dei fotomoltiplicatori
NOTA: Dopo la regolazione laser, i fotomoltiplicatori sono stati regolati in base ai singoli guadagni per ottenere una sensibilità simile. Questa calibrazione è stata eseguita con la linea laser a 514 nm, che si trova al centro della gamma di lunghezze d'onda di interesse.
- Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
- Applicare un filtro di riflessione e passare alla modalità di riflessione, se disponibile.
- Assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rivelatore copra la lunghezza d'onda del laser (514 nm).
- Scegliere la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma.
- Ridurre il guadagno del rilevatore alla metà del massimo e regolare l'intensità del laser per rilevare il rumore di fondo.
- Spostare l'obiettivo nella posizione più bassa.
- Sposta l'obiettivo verso l'alto fino a quando il riflesso della copertina è visibile.
- Aumentare il guadagno del rilevatore a passi da 50 a 100 V e registrare il segnale corrispondente.
- Applicare i passaggi da 3.1 a 3.8 per entrambi i rilevatori.
- Valutazione dei dati
- Traccia l'intensità rispetto al guadagno del rilevatore per ciascun rilevatore.
- Scegli i singoli guadagni del rilevatore per ottenere una sensibilità simile.
4. Acquisizione di immagini FRET
NOTA: iniziare con l'esempio di interesse per l'impostazione dell'acquisizione delle immagini.
- Scegli i filtri/specchi dicroici appropriati, ad esempio un doppio specchio dicroico MBS 458/514 per la coppia FRET ECFP/EYFP. Utilizzare lo stesso specchio dicroico per tutti i canali per abilitare la scansione riga per riga. Selezionare un obiettivo di immersione in acqua per l'imaging di cellule viventi. Scegli la scansione a 12 bit o a 16 bit e una velocità di scansione moderata.
- Definire l'intervallo di rilevamento, preferibilmente 470-510 nm per il rilevamento del donatore e 530-600 nm per il rilevamento dell'accettore/FRET nel caso dell'ECFP/EYFP. Quando si utilizza un laser a diodi da 445 nm o 440 nm, utilizzare da 450 a 510 nm come intervallo di rilevamento. Nel caso di uno splitter a fascio acusto-ottico (AOBS), definire il rilevamento del donatore nell'intervallo da 450 a 500 nm per evitare il rilevamento indesiderato di accettori.
- Applicare l'impostazione del rilevatore secondo il punto 3.10.2.
- Applicare l'impostazione laser secondo il punto 2.3.2. Rivedere l'intensità del laser in base alla tabella di potenza laser ottenuta, se necessario. Assicurarsi che il rapporto segnale-rumore copra l'intera gamma dinamica dei rilevatori (intensità compresa tra 0 e 4095 per la scansione a 12 bit).
- Mantieni costanti le intensità del laser e i guadagni del rilevatore. Utilizzare il diametro del foro stenopeico per la messa a punto.
NOTA: tenere presente che le modifiche del diametro del foro stenopeico influiscono sulla risoluzione spaziale. - Eseguire le misurazioni (scattare immagini di almeno 20 celle).
5. Determinazione delle correzioni della diafonia
NOTA: le cellule che esprimono solo il donatore o l'accettore sono tenute a determinare rispettivamente il sanguinamento spettrale del donatore (DSBT) e l'accettore spettrale bleed-through (ASBT). Mantenere le stesse impostazioni descritte nella sezione 4.
- Eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono il fluoroforo del donatore.
- Eseguire misurazioni FRET con celle che esprimono il fluoroforo dell'accettore.
6. Calibrazione delle misure secondo Beemiller et al.13
NOTA: sono necessarie cellule che esprimono una fusione donatore-accettore di efficienza FRET nota. Qui è stata utilizzata una fusione ECFP-5 aa-EYFP con un'efficienza FRET di 0,464. Mantenere le stesse impostazioni descritte nella sezione 4.
- Eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono la fusione donatore-accettore
7. Valutazione dei dati
- Ottenere profili di linea delle celle, assicurando che ogni profilo non contenga più di una cella. Salvare i profili come file di testo.
- Importare i file di testo in un foglio di calcolo utilizzando l'opzione di importazione del file di testo nella sezione Dati .
- Leggere i valori massimi applicando la funzione Max .
- Elencare i valori ottenuti in una tabella, avere una colonna ciascuno per l'emissione del donatore ID, l'emissione FRET IF, l'emissione dell'accettore IA e almeno quattro set di dati: solo donatore, solo accettore, fusione donatore-accettore e misurazione.
NOTA: l'eccitazione del donatore comporta anche l'eccitazione diretta dell'accettore e causa ASBT descritto dal valore α. - Calcolare i valori asBT α con il set di dati solo accettore utilizzando l'equazione (1).
(1)
NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori α nelle equazioni seguenti. Il donatore mostra un ampio spettro di emissione che si traduce in una diafonia di emissione con l'emissione sensibilizzata dell'accettore. Questo DSBT è dato dal valore β. - Calcola i valori di β di sanguinamento spettrale del donatore con il set di dati solo donatore usando l'equazione (2).
(2)
NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori β nelle equazioni seguenti. Il fattore di calibrazione ξ descrive la relazione lineare tra la tempra del donatore derivata da FRET e l'emissione sensibilizzata dell'accettore. Utilizzare le mediane di 7,5 e 7,6 nelle seguenti equazioni. - Calcola i fattori di calibrazione ξ con il set di dati di fusione donatore-accettore e la sua efficienza FRET E (0,46) usando l'equazione (3).
(3)
NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori ξ nelle seguenti equazioni. - Calcola le efficienze FRET della coppia proteica di interesse usando le equazioni (4) e (5).
(4)
(5) - Stimare gli effetti della forza di espressione e/o del rapporto donatore-accettore: tracciare la somma di ID, IF e IA rispetto alle efficienze FRET. Eseguire una regressione lineare; si noti che più ripido è il grafico e più alto è R2 , maggiore è l'impatto del livello di espressione o maggiore è la differenza di abbondanza del donatore e dell'accettore.
(1)
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Representative Results
Regolazione del microscopio a scansione laser confocale
La regolazione laser ha rivelato un aumento lineare dell'emissione con l'aumentare dell'intensità del laser (Figura 2 e Tabella 1). Come previsto per i laser agli ioni di argon, l'emissione della linea a 514 nm è stata molto superiore all'emissione della linea a 458 nm, come evidenziato da una pendenza più ripida. Per gli esperimenti successivi, la potenza del laser del 4,5% e del 6,5% è stata scelta rispettivamente per la linea a 514 nm e la linea a 458 nm. Ciò ha comportato un'intensità di emissione quasi uguale a 1123 (514 nm) e 1141 (458 nm).
Variare i guadagni del rivelatore a potenza laser costante ha rivelato un comportamento esponenziale per entrambi i rivelatori analizzati. Intensità di emissione simili sono state ottenute per un guadagno di 700 V (Figura 3). Sebbene la regolazione delle linee laser abbia beneficiato del comportamento lineare, la regolazione dei rivelatori è probabilmente influenzata dal comportamento esponenziale, con conseguenti marcate differenze con lievi variazioni nel guadagno a tensioni più elevate. Sfortunatamente, questa gamma più elevata è di interesse per le misurazioni nelle cellule viventi, poiché l'aumento della potenza del laser è citotossico e promuove il fotosbiancamento.
Determinazione del bleed-through spettrale
In un primo momento, il sanguinamento spettrale del donatore e dell'accettore è stato analizzato con ECFP e EYFP purificati ricombinanti; DSBT β = 0,498 e ASBT α = 0,100. Lo stesso è stato fatto con le cellule che esprimono ECFP o EYFP. Con LSM 2, il DSBT stimato era β = 1,602 ± 0,207 (media ± SD) e ASBT era α = 0,119 ± 0,018. I valori mediani erano β = 1,506 e α = 0,120. Questa discrepanza tra i dati ottenuti nelle cellule viventi e i dati ottenuti con la proteina ricombinante dimostra che è impossibile omettere la determinazione del sanguinamento spettrale nelle cellule viventi. Questo è probabilmente causato da pigmenti cellulari.
Le immagini rivelano la maggiore luminosità di EYFP rispetto a ECFP (Figura 4 e Tabella 2). La compensazione delle differenze di luminosità con diverse impostazioni laser migliora la gamma dinamica del donatore e del canale FRET. Fornire l'output relativo misurando le intensità del laser, come fatto per la regolazione, aumenta comunque la riproducibilità delle misurazioni.
Per LSM 1, β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 con mediane di α = 0,084 e β = 0,180. La determinazione dell'ASBT dipende dalla regolazione laser e da un singolo rilevatore e, quindi, la determinazione dell'ASBT ha funzionato bene. Il DBST coinvolge due rivelatori, con risultati molto diversi per entrambi i microscopi. Va ricordato che LSM 2 è dotato di due fotomoltiplicatori, mentre LSM 1 utilizza un rivelatore GaAsP e un fotomoltiplicatore, due diversi tipi di rivelatori con diverse proprietà spettrali e sensibilità. Di conseguenza, la regolazione funziona meglio con due rilevatori identici.
Taratura della misura
Per la calibrazione, sono stati applicati i valori mediani di α e β e una fusione di ECFP ed EYFP è stata utilizzata come standard di efficienza FRET nota (E = 0,46). La calibrazione di ECFP-EYFP ricombinante e purificato ha portato a un valore ξ di 13,44, mentre le misurazioni in vivo hanno rivelato un valore ξ di 1,525 ± 1,844. La mediana era 0,798, rivelando valori anomali estremi insieme all'elevata deviazione standard. Per LSM 1, i valori erano ξ = 1,978 ± 0,807 con una mediana di ξ = 1,883. Per LSM 2 e LSM 1, i set di dati ottenuti per il calcolo di ξ (Tabella 3) erano statisticamente identici, come dimostrato dal t-test di Student (p > 0.2).
Misura FRET
Come prova di concetto, la misurazione FRET è stata ripetuta con la fusione donatore-accettore. L'efficienza FRET misurata era di 0,47 ± 0,07 per la proteina purificata e 0,47 ± 0,06 nelle cellule viventi con LSM 2 (Tabella 4). La mediana delle misurazioni nelle cellule viventi era E = 0,45. Per LSM 1, l'efficienza FRET era 0,46 ± 0,09 con una mediana di E = 0,45 (Tabella 4). Questi dati dimostrano l'effettiva calibrazione con un costrutto FRET dell'efficienza FRET nota.
Effetti del livello di espressione e del rapporto donatore-accettore
Per il set di dati analizzato, le efficienze FRET non sono state influenzate dal livello di espressione. A causa della fusione del donatore e dell'accettore, anche il rapporto era costante. L'inclusione di set di dati precedenti ha rivelato una dipendenza dal livello di espressione in un caso (Figura 5). L'efficienza FRET tra le subunità ATPasi vacuolare marcate (V-ATPasi), VHA-A-ECFP e VHA-a-EYFP, è diminuita con l'aumentare dell'intensità del segnale. Al contrario, l'interazione tra VHA-E1-ECFP e VHA-C-EYFP era indipendente dall'intensità del segnale. Nel caso di VHA-A e VHA-a, le tre copie di VHA-A sono sempre più sostituite da VHA-A-ECFP, il che si traduce in un eccesso di donatore rispetto alla singola copia di VHA-a nel complesso. Sebbene VHA-E1 possa essere presente sotto forma di tre copie, l'elevata solubilità di VHA-C potrebbe abolire questo effetto in questo esempio. Qui, le efficienze FRET sono state relativamente basse. Questo semplice approccio consente di testare gli artefatti di espressione e rapporto.
Figura 1: Panoramica delle coppie di proteine fluorescenti FRET con donatori che emettono ciano. (A) I raggi di Förster delle coppie e la luminosità del donatore e dell'accettore sono dati per coppie FRET ben caratterizzate. (B) Confronto tra la vita del donatore e dell'accettore. Gli asterischi grigi indicano un decadimento multiesponenziale. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; CFP = proteina fluorescente ciano; GFP = proteina fluorescente verde; YFP = proteina fluorescente gialla; mX = X monomerico; EX = X potenziato; SX = super X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Regolazione laser. L'emissione dei laser è stata registrata dal riflesso del coverslip e tracciata contro l'intensità relativa del laser modulata dal filtro sintonizzabile acusto-ottico del LSM. Viene mostrata l'emissione della linea a 458 nm (A) e della linea a 514 nm (B) di un laser agli ioni di argon. Abbreviazioni: LSM = microscopio a scansione laser; r.u. = unità relative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Guadagno del rilevatore e intensità di emissione. Le intensità di emissione risultanti sono state registrate in modalità di riflessione per guadagni del rivelatore che vanno da 300 a 750 V e da 300 a 750 V per il rivelatore 1 (A) e il rilevatore 2 (B), rispettivamente. Abbreviazione = r.u. = unità relative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spurgo spettrale. Le immagini sono state ottenute nei canali donatore, FRET e accettatore. (A) Immagini ottenute con proteine fluorescenti purificate; barre di scala = 100 μm; (B) immagini corrispondenti per le cellule che esprimono le proteine fluorescenti; barre di scala = 10 μm. (C) Grafici dei valori SBT ottenuti; media ± SD è dato. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; SBT = spurgo spettrale; ECFP = proteina fluorescente ciano potenziata; EYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; LSM = microscopio a scansione laser; ASBT = accettore SBT; DSBT = donatore SBT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetti del livello di espressione e/o del rapporto donatore-accettore. La somma delle emissioni nei canali donatore, FRET e accettore è stata tracciata rispetto all'efficienza FRET. Questo è stato fatto per VHA-E1-ECFP e VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP e VHA-a-EYFP (B) e la fusione ECFP-EYFP (C). È stata eseguita la regressione lineare; l'equazione e R2 sono dati. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; ECFP = proteina fluorescente ciano potenziata; EYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; VHA = subunità vacuolare dell'ATPasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Sanguinamento del donatore e dell'accettore di ECFP e EYFP. Gli spettri delle proteine fluorescenti sono stati ottenuti dal database FP14. (A) Durante gli esperimenti di emissione sensibilizzata, le vaste porzioni del donatore e dell'accettore vengono rilevate da singoli fotomoltiplicatori, denominati rispettivamente PMT1 e PMT2. L'emissione ECFP è rilevabile anche dal rilevatore accettore dopo l'eccitazione con 458 nm. Il sanguinamento spettrale del donatore calcolato in PMT2 è pari al 40,6% dell'emissione rilevata da PMT1. (B) Lo spettro di emissione dell'EYFP dimostra che l'EYFP mostra l'eccitazione diretta a 458 nm, che viene spesso applicata per l'eccitazione dei donatori di ciano. L'efficienza di eccitazione prevista è del 9,6% dell'eccitazione a 514 nm. Abbreviazioni: FP = proteina fluorescente; ECFP = proteina fluorescente ciano potenziata; EYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; PMT = fotomoltiplicatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Potenza del laser e intensità del segnale. Le intensità del segnale della linea 458 nm sono indicate in blu, le intensità del segnale della linea 514 nm in verde. Le intensità applicate per l'esperimento sono evidenziate in grigio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Intensità del segnale per la determinazione SBT. Vengono forniti valori massimi registrati e valori α e β calcolati. Abbreviazioni: SBT = spurgo spettrale; LSM = microscopio a scansione laser; FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster; ASBT = accettore SBT; DSBT = donatore SBT. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Intensità del segnale per la calibrazione. Vengono forniti massimi registrati e valori ξ calcolati. I valori corretti corrispondono alle intensità del segnale FRET meno SBT. Abbreviazioni: SBT = spurgo spettrale; LSM = microscopio a scansione laser; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Förster. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Intensità del segnale per le misurazioni FRET. Vengono forniti i valori massimi ed E registrati. I valori corretti corrispondono alle intensità del segnale FRET meno SBT. I valori E calibrati sono stati calcolati con calibrazione di ξ. Abbreviazioni: SBT = spurgo spettrale; LSM = microscopio a scansione laser; FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster; = calibrato. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'estinzione del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati sono caratterizzate da una relazione lineare che consente il calcolo basato sul donatore o sull'accettore di FRET. I corrispondenti fattori di linearità sono chiamati fattore G (da donatore ad accettore) o xi (da accettore a donatore), che sono valori reciproci4. La misurazione del FRET tra proteine fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza richiede spesso correzioni per DSBT e ASBT a causa dell'ampio spettro di assorbimento ed emissione delle proteine fluorescenti. Tuttavia, molte correzioni dipendono da un ASBT misurabile, che è un fattore nel denominatore delle equazioni nella sezione 7 del protocollo, e un α = 0 si traduce in equazioni indefinite5,6.
Si raccomanda una regolazione delle intensità del laser per evitare tali effetti. Ciò consente l'uso di calcoli basati su accettori e un facile rilevamento di rapporti donatore-accettore inappropriati. In questo protocollo, è stata applicata l'equazione di Beemiller e colleghi, che ha il vantaggio di una semplice calibrazione da parte di un singolo costrutto di riferimento di efficienza FRET nota. La regolazione dei rilevatori è fondamentale, soprattutto quando vengono applicati due diversi tipi di rilevatori. Dati precedenti ottenuti con due fotomoltiplicatori identici e guadagni identici hanno portato a un β costante = 0,61 per esperimenti multipli nel corso degli anni7,8,9 e dimostrano che la regolazione del rivelatore è vantaggiosa per la riproducibilità. Se i rilevatori non consentono una regolazione affidabile, una scansione sequenziale con un singolo rilevatore in modalità fotogramma per fotogramma potrebbe essere un'opzione per evitare distorsioni dalle proprietà del rilevatore.
Le misurazioni nelle cellule vegetali sono influenzate da molti pigmenti, che provocano l'assorbimento della luce di eccitazione e l'autofluorescenza di fondo. I pigmenti cellulari sono principalmente eccitati dalla luce nella gamma da UV a blu4,10. Questo spiega la discrepanza tra le misurazioni nelle cellule e quelle con proteine purificate. Le proteine purificate potrebbero servire come prova di aggiustamento perché i valori attesi per ASBT α e DSBT β possono essere derivati rispettivamente dallo spettro di assorbimento dell'accettore e dallo spettro di emissione del donatore (Figura 6). I valori di ASBT sono simili nelle cellule (α = 0,094) e con fluorofori purificati (α = 0,114) e vicini al valore atteso di 0,096 a causa del basso assorbimento cellulare a 514 nm. Anche il DSBT di β = 0,498 con proteine purificate è vicino al valore atteso di 0,406. Il bleed-through spettrale dipende ulteriormente dalla configurazione; i laser a diodi da 445 o 440 nm riducono l'eccitazione diretta di EYFP e quindi riducono l'ASBT. Gli AOBS sono caratterizzati da un gap di trasmissione più piccolo rispetto agli specchi dicroici. Pertanto, il rilevamento di EYFP è migliorato nell'intervallo da 500 a 510 nm e potrebbe comportare ulteriori ASBT nel canale donatore. Tuttavia, le proprietà spettrali di EYFP indicano un'emissione inferiore all'1% del picco massimo, considerando sia l'eccitazione meno efficace che la bassa intensità di emissione. Lo spazio tra i filtri è molto più ampio con gli specchi dicroici, con conseguente soppressione aggiuntiva di tale diafonia dell'accettore.
L'uso dei valori delle proteine purificate non riflette la situazione nella cellula. Lo stesso vale per la calibrazione da parte del fattore ξ. Sebbene il fattore di calibrazione sia stato simile per entrambi gli LSM, è stato molto più alto nelle misurazioni con la proteina ricombinante, rivelando l'impatto dei pigmenti cellulari. Va detto che in queste misurazioni, il rumore di fondo era trascurabile ma rilevabile e non ha influenzato le intensità osservate. A differenza delle misurazioni della durata della vita del donatore, gli esperimenti di emissione sensibilizzati sono sensibili al rapporto donatore-accettore in modo che un eccesso di donatore si traduca in una diminuzione dell'efficienza FRET.
Tuttavia, l'espressione proteica è stata sotto il controllo del promotore CaMV35S nei presenti esperimenti. Questo promotore è spesso utilizzato per la sovraespressione di proteine nelle piante e potrebbe causare quantità non fisiologicamente elevate di proteine13. In tali condizioni, la probabilità di interazione aumenta e i risultati falsi positivi potrebbero verificarsi con concentrazioni proteiche più elevate. Tracciare le intensità di emissione rispetto all'efficienza FRET si traduce quindi in un aumento dell'efficienza FRET con l'aumentare dell'intensità di emissione e consente la valutazione dei dati FRET rispetto al livello di espressione.
Si raccomanda di separare gli esperimenti di colocalizzazione ad alta risoluzione dalle misurazioni FRET. Per la colocalizzazione, vengono scelte impostazioni ottimali per ciascun fluoroforo, mentre per la registrazione FRET, le intensità di emissione e la messa a punto del diametro stenopeico interferiscono con le condizioni ottimali dell'immagine. Tuttavia, la separazione degli organelli e le informazioni sulle strutture subcellulari sono ancora incluse nelle misurazioni FRET.
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Disclosures
Ci assicuriamo che tutti gli autori abbiano divulgato tutti i conflitti di interesse e non abbiano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli esperimenti sono stati eseguiti presso la Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) della Facoltà di Biologia dell'Università di Bielefeld. Questo lavoro è stato finanziato dall'Università di Bielefeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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