Summary
インビボフェルスター共鳴エネルギー移動測定に対して標準の共焦点レーザー走査顕微鏡を設定し、その後データ評価を行うためのプロトコルが提供されています。
Abstract
感作発光ベースのフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)実験は簡単に行われますが、顕微鏡の設定に依存します。共焦点レーザー顕微鏡は生物学者の役馬となっています。商用システムは、レーザーパワー調整と検出器感度に高い柔軟性を提供し、多くの場合、完璧な画像を得るために異なる検出器を組み合わせます。しかし、この柔軟性により、異なる実験やセットアップによる強度ベースのデータの比較は、しばしば不可能です。生物学者に優しい手順は利点があり、レーザーおよび検出器の設定の簡単で、信頼できる調節を可能にする。
さらに、生細胞におけるFRET実験は、タンパク質発現およびドナー・アクセクター比の変動の影響を受けるため、データ評価のためにタンパク質発現レベルを考慮する必要があります。ここで説明するのは、タンパク質発現の推定とレーザー強度と検出器の設定の調整のためのルーチンを含む、信頼性と再現性FRET測定のための簡単なプロトコルです。データ評価は、既知のFRET効率の蛍光色素融合を用いた較正により行われる。簡便性を向上させるために、細胞内で得られた補正因子と、組換え蛍光タンパク質の測定によって得られた補正因子が比較されてきた。
Introduction
フェルスター共鳴エネルギー移動((F)RETは、通常、蛍光分光法によって観察されるが、プロセス自体は、フルオロフォア間で発生するに限定されない。基礎となる双極子双極子結合は単に発光のドナー分子および光吸収の受け入れ器を必要とする。これは、正規化されたドナー発光とアクピケータ吸光度スペクトル1の必要なスペクトルオーバーラップ積分Jに由来する。しかし、RETは蛍光と競合するため、蛍光発光の変化によりエネルギー移動が測定可能になる:RETはドナーの焼入れおよび感作アクセプターの放出を誘導する。
蛍光系RETは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)と呼び、これを生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)から分離する。RETは、0.5〜10 nm2の範囲で広く、したがって、タンパク質とその複合体の寸法と同じ範囲にあるドナーとアクセクターの間の距離に強く依存します。第二に、RETは双極子双極子方向カッパ二乗に依存する。タンパク質結合フルオロフォアの回転自由度は分子量と回転緩和の遅さにより無視され得るという事実と相まって、RETは立体構造変化の解析を可能にする3。
いわゆるフェルスター半径は、スペクトル重複積分とオーバーラップの波長範囲に基づいているため、赤色光吸収性のクロモフォアは青色光吸収色素よりも長いフェルスター半径をもたらす。FRET測定のダイナミックレンジはR0×0と1.5×R0によって制限されているため、FRETペアECFP-EYFPは4.9 nm4のR0により2.5-7.3 nmのダイナミックレンジを有します。
蛍光色素の明るさは、そのモル絶滅係数とその量子収率の積で与えられます。FRET測定では、ほぼ同じ輝度の蛍光体を選択することが有利です。これにより、ドナーの焼入れおよび感作アクセプター放出の検出が強化される。また、顕微鏡システムのキャリブレーションを好みます。頻繁に使用されるFRET対のシアンおよび蛍光タンパク質を見ると、シアン蛍光タンパク質の輝度が低いほど明らかになる(図1A)。
しかし、アクシーザの寿命はドナーの寿命よりも低く、エネルギー移動のためのアクシークサの利用可能性を確保しなければならない。アクセクサの寿命がドナーの存続期間を超えた場合、ドナーが再び興奮したときに、アクセクサは興奮状態にある可能性があります。mTurquoiseのような高度なシアン蛍光タンパク質は、寿命が長く、FRETの増加確率に寄与します(図1B)。FRET の確率も、アクシペクタのモル絶滅係数に依存します。
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Protocol
注: 以下のプロトコルでは、前述のとおり、プロトプラストの一時的トランスフェクションが行われました。簡単な説明を以下に示します。
1. プロトプラストの一過性トランスフェクション
- シロイヌナズナエコタイプコロンビアの健康な葉の〜4 gを1mmスライスに切り、20 mLの酵素溶液(1.5%セルラーゼ;0.4% マセロザイム; 0.1% ウシ血清アルブミンフラクション V; 0.4 M マンニトール; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N モルフォリノ)エタネスルホン酸 (MES), pH 5.7; 10 mM CaCl2.
- 葉のスライスに真空浸潤し、続いて室温で2時間攪拌してインキュベーションを行います。100×gで3分間遠心分離して細胞を収穫 する。
- プロトプラストをW5溶液(154 mM NaCl;125 mM CaCl2;5 mM KCl;2 mM MES、pH 5.7)で洗浄し、MMG溶液(0.4 Mマンニトール;15 mM MgCl2;4 mM MES、pH 5.7)で再中断します。
- ポリエチレングリコール(PEG)4000の存在下で浸透性ショックにより8ウェルスライドでトランスフェクションを行います。プロトプラスト懸濁液の20 μLをプラスミドDNA(5 μg/μL)5 μL、PEG溶液25 μL(0.2 M マンニトール、0.1 M CaCl2、40% PEG 4000)と混合します。
- 浸透性条件の穏やかな再調整によって浸透衝撃を逆にする。
注:目的のサンプルに加えて、ドナーとアクシペサのスペクトルブリードスルーをそれぞれ決定するために、ドナー単独とアクサクサの発現が必要です。ドナーとアクセクサの融合タンパク質は、較正目的でも発現する必要があります。蛍光タンパク質発現は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(pCaMV35S)の制御下にあった。すべての測定に対して、2つの共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM1およびLSM2)が使用された。LSM1には2種類の検出器があります:FRET測定では、ドナー信号はGaAsP検出器によって検出され、FRETおよびアクセプターの放出はフォトマルチプライヤで記録されました。LSM2は、ドナー、FRET、およびアクセプタ放出の検出に使用された2つのフォトマルチプライヤを有する。
2. レーザー調整
注:ここでは、アルゴンイオンレーザーの458 nmおよび514 nmラインが、強化シアン蛍光タンパク質(ECFP)および強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)標識タンパク質の間のFRET分析に適用されています。再現性のあるデータ取得のために、両行とも同様の強度に調整した。これは、伝送フォトマルチプライヤまたは反射モードのいずれかによって達成されました。
- 透過光増倍器によるレーザー調整
- 調整には空の井戸を使用します。
- ラインスキャンモードとヒストグラム表示を選択します。
- レーザー強度を最小限に抑え、検出可能なバックグラウンドノイズに検出器のゲインを調整します。
- 0.5%のステップでレーザー強度を増加させ、対応する信号を記録します。
- 両方のレーザーラインにルーチンを適用します。
- 反射モードによるレーザー調整
- 調整には空の井戸を使用します。
- 反射フィルタを適用し、反射 モードをオンにします(可能な場合)。
- 検出器の波長範囲がレーザーの波長をカバーしていることを確認します。
- ラインスキャンモードとヒストグラム表示を選択します。
- レーザー強度を最小限に抑え、検出可能なバックグラウンドノイズに検出器のゲインを調整します。
- 目標を最も低い位置に移動します。
- カバースリップの反射が見えるまで、目的を上に移動します。
- 0.5%のステップでレーザー強度を増加させ、対応する信号を記録します。
- 両方のレーザーラインにルーチンを適用します。
- データ評価
- データを集計し、信号強度でデータをソートします。
- 相対レーザーパワーに対して信号強度をプロットします。
- 同様の信号強度をもたらすレーザー強度を選択します。
3. フォトマルチプライヤの調整
注:レーザー調整後、フォトマルチプライヤーは、同様の感度を得るために個々のゲインに調整されました。このキャリブレーションは、対象波長範囲の中心にある514 nmレーザーラインで行われました。
- 調整には空の井戸を使用します。
- 反射フィルタを適用し、可能な場合は反射モードに切り替えます。
- 検出器の波長範囲がレーザーの波長(514 nm)をカバーしていることを確認してください。
- ラインスキャンモードとヒストグラム表示を選択します。
- 検出器のゲインを最大の半分に下げ、レーザー強度を検出可能なバックグラウンドノイズに調整します。
- 目標を最も低い位置に移動します。
- カバースリップの反射が見えるまで、目的を上に移動します。
- 50~100Vのステップで検出器ゲインを上げ、対応する信号を記録します。
- 両方の検出器にステップ 3.1 ~ 3.8 を適用します。
- データ評価
- 各検出器の検出器ゲインに対して強度をプロットします。
- 同様の感度を得るために、個々の検出器のゲインを選択します。
4. フレット画像の取得
注: 画像取得の設定に関するサンプルから始めます。
- 適切なフィルタ/二色性ミラー(例:FRETペアECFP/EYFP用のダブルダイクロICミラーMBS 458/514)を選択します。すべてのチャンネルで同じ二色ミラーを使用して、ラインバイラインスキャンを有効にします。生きている細胞のイメージングのための水浸漬目的を選択します。12 ビットまたは 16 ビットスキャンと中程度のスキャン速度を選択します。
- 検出範囲を定義し、好ましくはドナー検出用470-510 nm、ECFP/EYFPの場合はアクセクター/FRET検出用530-600 nmを定義する。445 nmまたは440 nmダイオードレーザーを使用する場合は、検出範囲として450〜510nmを使用してください。アヌースト光ビームスプリッター(AOBS)の場合、ドナー検出を450~500nmの範囲で定義し、不要なアクセプタ検出を防ぎます。
- 3.10.2に従って検出器設定を適用します。
- 2.3.2に従ってレーザー設定を適用します。必要に応じて、取得したレーザーパワーテーブルに基づいてレーザー強度を修正します。信号対雑音比が検出器のダイナミックレンジ全体(12ビットスキャンでは0~4095の範囲)をカバーしていることを確認します。
- レーザー強度を保ち、検出器のゲインを一定に保ちます。ピンホールの直径を微調整します。
注: ピンホール直径の変化は空間解像度に影響を与えます。 - 測定を行います(少なくとも20個の細胞の画像を撮ります)。
5. クロストーク補正の決定
注:ドナーまたはアクセクサのみを発現する細胞は、ドナースペクトルブリードスルー(DSBT)およびアクセクサスペクトルブリードスルー(ASBT)をそれぞれ決定する必要があります。セクション 4 で説明した設定と同じ設定を維持します。
- ドナー蛍光素を発現する細胞でFRET測定を行います。
- アクセクサフルオロフォアを発現する細胞でFRET測定を行います。
6. Beemillerら.13による測定値の較正
注:既知のFRET効率のドナー-アクセパシター融合を発現する細胞が必要です。ここでは、0.46のFRET効率を有するECFP-5 aa-EYFP-融合が使用されている。セクション 4 で説明した設定と同じ設定を維持します。
- ドナー-アクセクサ融合を発現する細胞でFRET測定を行う
7. データ評価
- 各プロファイルに複数のセルが含まれることを確認して、セルのライン プロファイルを取得します。プロファイルをテキスト ファイルとして保存します。
- [データ] セクションの [テキスト ファイルのインポート] オプションを使用して、テキスト ファイルをスプレッドシートにインポートします。
- Max 関数を適用して最大値を読み出します。
- 取得した値を表にリストし、ドナー排出ID、FRET排出IF、アクセクター排出IA、および少なくとも4つのデータセット(ドナーのみ、アクセクサのみ、ドナー・アクセクサ融合、および測定)のカラムを持つ。
注:ドナーの励起はまた、アクソクサの直接の励起をもたらし、α値によって記述されるASBTを引き起こす。 - 数式 (1) を使用して、アクサクタ専用データセットを使用して ASBT α値を計算します。
(1)
注: 次の方程式のすべてのα値の中央値を使用します。ドナーは、アクセプターの感作発光との発光クロストークをもたらす広域発光スペクトルを示す。この DSBT は、β値によって指定されます。 - 式 (2) を使用して、ドナーのみのデータセットを使用して、ドナースペクトルブリードスルーの値をβ計算します。
(2)
注: 次の式のすべてのβ値の中央値を使用します。キャリブレーションファクターマルケスは、FRET由来ドナーの焼入れと感作放出の線形関係を記述する。次の式では、7.5 と 7.6 の中央値を使用します。 - 式 (3) を使用して、ドナー-アクセクターフュージョン データセットとその FRET 効率効率 (0.46) を使用してキャリブレーション係数を計算します。
(3)
注: 次の式のすべての中央値を使用します。 - (4)と(5)の式を使用して、目的とするタンパク質ペアのFRET効率を計算します。
(4)
(5) - 表現強度およびドナーアクサコンダプタ比の効果を推定する: FRET 効率に対する ID、IF、および IA の合計をプロットします。線形回帰を実行します。グラフが急でR2 が高いほど、発現レベルの影響が高くなるか、ドナーとアクピケータの豊富さの差が大きくなることに注意してください。
(1)
(2)
(3)
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Representative Results
共焦点レーザー走査顕微鏡の調整
レーザー調整により、レーザー強度の増加に伴う放射の線形増加が明らかになった(図2 および 表1)。アルゴンイオンレーザーの予想通り、514 nm線の放出は、より急な斜面によって証明されるように、458 nmラインの放出よりはるかに高かった。その後の実験では、514 nm線と458nm線にそれぞれ4.5%と6.5%のレーザーパワーを選択しました。その結果、1123(514 nm)と1141(458 nm)のほぼ同じ発光強度が得られた。
一定のレーザーパワーで検出器のゲインを変化させることで、両方の分析された検出器の指数関数的な振る舞いが明らかになった。700Vのゲインに対して同様の発光強度が得られた(図3)。レーザラインの調整は線形挙動の恩恵を受けたが、検出器の調整は指数関数的挙動の影響を受ける可能性が高く、その結果、高電圧でのゲインのわずかな変化との差が顕著になる。残念ながら、この高い範囲は、レーザーパワーを増加させることが細胞毒性であり、光漂白を促進するので、生きている細胞の測定のために興味があります。
スペクトルブリードスルーの決定
最初、ドナーとアクセクサのスペクトルブリードスルーを組換え精製ECFPとEYFPで分析した。DSBT β = 0.498、ASBT α = 0.100 です。同じことが、ECFPまたはEYFPのいずれかを発現する細胞でも行われました。LSM 2 では、推定 DSBT は β 0.207 ± 1.602 ± (平均 ± SD) で、ASBT は α = 0.119 ± 0.018 でした。中央値はβ= 1.506、α = 0.120 でした。この生細胞で得られたデータと組換えタンパク質を用いて得られたデータとの間のこの不一致は、生細胞におけるスペクトルブリードスルーの決定を省略することができないことを示している。これは、細胞顔料によって引き起こされる可能性が高い.
画像は、ECFPと比較してEYFPの高輝度を明らかにします(図4 および 表2)。異なるレーザー設定によって明るさの違いを補正することで、ドナーとFRETチャンネルのダイナミックレンジを強化します。レーザー強度を測定して相対出力を提供し、調整のために行ったように、測定の再現性が向上する。
LSM 1、β = 0.171 ± 0.044、α = 0.094 ± 0.031、中央値は α = 0.084、β = 0.180 です。ASBTの決定は、レーザー調整と単一検出器に依存し、したがって、ASBTの決定は良好に行われた。DBSTは2つの検出器を含み、両方の顕微鏡で大きく異なる結果をもたらします。LSM 2には2つのフォトマルチプライヤーが装備されているのに対し、LSM 1はGaAsP検出器とフォトマルチプライヤ、異なるスペクトル特性と感度を持つ2種類の検出器を使用しています。したがって、調整は2つの同一の検出器でより良く動作します。
測定のキャリブレーション
キャリブレーションでは、αとβの中央値を適用し、ECFPとEYFPの融合を既知のFRET効率の標準として使用した(E= 0.46)。組換えおよび精製されたECFP-EYFPの較正は13.44の証値を生み出し、インビボ測定では1.525±1.844の測定値を明らかにした。中央値は0.798で、極端な外れ値と高い標準偏差が明らかになりました。LSM 1 の場合、値は中央値が median = 1.883 の 0.807 ± median 1.978 でした。LSM 2 と LSM 1 の場合、受講者の t 検定 (p > 0.2) で証明されているように、中央値 (表 3) の計算で得られたデータセットは統計的に同一でした。
フレット測定
概念実証として、ドナーとアクシプタの融合を用いてFRET測定を繰り返した。測定されたFRET効率は、精製タンパク質に対して0.47±0.07、LSM2を有する生細胞で0.47±0.06であった(表4)。生きている細胞における測定の中央値はE=0.45であった。LSM 1の場合、FRET効率は0.46±0.09で、中央値はE = 0.45でした(表4)。これらのデータは、既知のFRET効率のFRET構築物を用いて効果的な較正を示す。
発現量とドナー・アクパチパクター比の効果
分析されたデータ・セットでは、FRET 効率は式レベルの影響を受けません。ドナーとアクソクターの融合により、比率も一定であった。以前のデータセットを含めることで、1 つのケースで式レベルへの依存関係が明らかになりました (図 5)。標識された真空ATPase(V-ATPase)サブユニット、VHA-A-ECFPおよびVHA-A-EYFP間のフレット効率は、信号強度の増加に伴って減少した。これに対し、VHA-E1-ECFPとVHA-C-EYFPの相互作用は信号強度とは無関係であった。VHA-AおよびVHA-aの場合、VHA-Aの3つのコピーは、複雑な中のVHA-aの単一のコピーと比較してドナー過剰をもたらすVHA-A-ECFPによってますます置き換えられています。VHA-E1 は 3 つのコピーの形で存在する可能性がありますが、VHA-C の高い溶解度はこの例ではこの効果を廃止する可能性があります。ここでは、FRETの効率は比較的低くなっています。この単純なアプローチにより、式および比率のアーティファクトのテストが可能になります。
図1:シアン放出ドナーと蛍光タンパク質FRETペアの概要 (A) ペアのフェルスター半径とドナーとアクセンプターの明るさは、よく特徴付けられるFRETペアに与えられる。(B) ドナーとアクセクサの生涯比較灰色のアスタリスクは、多重指数減衰を示します。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;CFP = シアン蛍光タンパク質;GFP = 緑色蛍光タンパク質;YFP = 黄色の蛍光タンパク質;mX = 単量体 X;EX = 拡張 X;SX = スーパー X. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:レーザー調整 レーザーの放出は、カバースリップの反射によって記録され、LSMのアユースト視チューナブルフィルターによって変調された相対的なレーザー強度に対してプロットされた。アルゴンイオンレーザーの458nm線(A)および514 nm線(B)の放出が示される。略語: LSM = レーザー走査顕微鏡;r.u. = 相対単位。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:検出器のゲインと発光強度。 得られた発光強度は、検出器1(A)と検出器2(B)に対して300~750V及び300~750Vの範囲の検出器ゲインの反射モードでそれぞれ記録した。省略形 = r.u. = 相対単位。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スペクトルブリードスルー。 画像はドナー、FRET、およびアクソクザチャネルで得られた。(A) 精製蛍光タンパク質を用いて得られた画像スケールバー= 100 μm;(B)蛍光タンパク質を発現する細胞に対応する画像スケールバー= 10 μm( C) 取得した SBT 値のグラフ;SD±与えられる意味です。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;SBT = スペクトルブリードスルー;ECFP =強化シアン蛍光タンパク質;EYFP = 強化黄色蛍光タンパク質;LSM = レーザー走査顕微鏡;ASBT = アクセクター SBT;DSBT = ドナー SBT. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:発現量およびドナー受入比率の影響 ドナー、FRET、およびアクセプタチャネルの排出量の合計は、FRET効率に対してプロットされています。これは、VHA-E1-ECFPおよびVHA-C-EYFP(A)、VHA-A-ECFPおよびVHA-A-EYFP(B)、およびECFP-EYFP融合(C)のために行われました。線形回帰が実行されました。式と R2 が与えられます。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;ECFP =強化シアン蛍光タンパク質;EYFP = 強化黄色蛍光タンパク質;VHA = 真空アパーゼサブユニット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ECFPとEYFPのドナーおよびアクセクターのブリードスルー 蛍光タンパク質のスペクトルは、FPデータベース14から得た。(A) 感作放出実験の間、ドナーとアクセプターの広大な部分は、それぞれPMT1とPMT2という名前の個々のフォトマルチプライヤによって検出される。ECFPの放出はまた458 nmの励起のアクセクターの探知器によって検出可能である。PMT2への計算されたドナースペクトルブリードスルーは、PMT1によって検出された放出の40.6%である。(B) EYFPの発光スペクトルは、EYFPがシアンドナーの励起に頻繁に適用される458 nmで直接励起を示していることを示している。期待される励起効率は514 nmの励起の9.6%である。略語: FP = 蛍光タンパク質;ECFP =強化シアン蛍光タンパク質;EYFP = 強化黄色蛍光タンパク質;PMT = フォトマルチプライヤ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:レーザーパワーと信号強度 458 nm線の信号強度は青色で、514nm線の信号強度は緑色に与えられる。実験に適用される強度はグレーでハイライト表示されます。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:SBT判定のための信号強度 記録された最大値と計算されたαとβ値が与えられます。略語: SBT = スペクトルブリードスルー;LSM = レーザー走査顕微鏡;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;ASBT = アクセクター SBT;DSBT = ドナー SBT. このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:キャリブレーション用の信号強度。 記録された最大値と計算された最小値の値が与えられます。補正された値は、FRET 信号強度から SBT を引いた値に対応します。略語: SBT = スペクトルブリードスルー;LSM = レーザー走査顕微鏡;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:FRET測定の信号強度。 記録された最大値とE値が与えられます。補正された値は、FRET 信号強度から SBT を引いた値に対応します。較正されたE値は較正によって計算した。略語: SBT = スペクトルブリードスルー;LSM = レーザー走査顕微鏡;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;cal. = 校正されています。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ドナーの急流および感作アクセプター放出は、ドナーまたはアクセプターベースのFRETの計算を可能にする線形関係によって特徴付けられる。線形性の対応する要因は、G因子(受入者へのドナー)またはxi(ドナーへのアクシー)と呼ばれ、これは逆の値4である。蛍光顕微鏡による蛍光タンパク質間のフレット測定では、蛍光タンパク質の広い吸収および発光スペクトルにより、DSBTおよびASBTの補正が必要な場合が多い。しかし、多くの補正は、測定可能なASBTに依存し、これはプロトコルセクション7の方程式の分母の要因であり、α= 0は未定義の方程式5,6になります。
このような効果を避けるためにレーザー強度の調整をお勧めします。これにより、アクセクサベースの計算を使用し、不適切なドナー-アクセクサ比率を容易に検出できます。このプロトコルでは、ビーミラーと同僚の方程式が適用されており、既知のFRET効率の単一の参照構造による簡単な較正の利点があります。特に2種類の検出器が適用される場合、検出器の調整は重要です。2つの同一のフォトマルチプライヤと同一のゲインで得られた以前のデータは、年、8,9年にわたる複数の実験で一定のβ = 0.61をもたらし、検出器の調整が再現性に有利であることを実証しました。検出器が信頼性の高い調整を可能にしない場合、フレームごとのモードで単一の検出器を使用したシーケンシャルスキャンは、検出特性からの偏りを避けるオプションです。
植物細胞の測定は多くの顔料の影響を受け、励起光吸収とバックグラウンド自家蛍光が生じる。細胞顔料は、主にUV~青色範囲の光により励起される4,10。これは、細胞内の測定値と精製タンパク質を有する測定値の間の不一致を説明します。ASBT αおよびDSBT βの期待値は、それぞれアクセプター吸収スペクトルとドナー発光スペクトルから導出できるため、精製されたタンパク質が調整の証拠となる可能性があります(図6)。ASBTの値は、細胞(α= 0.094)と精製されたフルオロフォア(α = 0.114)と同様であり、514 nmでの低い細胞吸収のために0.096の期待値に近い。精製タンパク質を含むβ=0.498のDSBTも予想値0.406に近い。スペクトルブリードスルーはさらにセットアップに依存します。445または440 nmのダイオードレーザーはEYFPの直接励起を減らし、それによってASBTを減らす。AOBSは、ダイクロアックミラーよりも伝送ギャップが小さいことを特徴とします。したがって、EYFPの検出は500〜510 nmの範囲で強化され、ドナーチャネルに追加のASBTをもたらす可能性があります。しかし、EYFPのスペクトル特性は、励起効果が低く、低い発光強度の両方を考慮して、最大ピークの1%未満の発光を指す。フィルターギャップは二色性鏡ではるかに広く、そのようなアクセプタークロストークの追加の抑制をもたらす。
精製タンパク質からの値を使用しても、細胞内の状況は反映されません。同じことが因子口径による較正についても当てはまります。校正因子は両方のLSMで同様であったが、組換えタンパク質の測定でははるかに高く、細胞顔料の影響を明らかにした。これらの測定では、バックグラウンドノイズは無視できるが検出可能であり、観測された強度には影響を与えなかったことを言及する必要があります。ドナーの寿命の測定とは対照的に、感作放出実験はドナー-アクセクサ比に敏感であり、過剰なドナーがFRET効率を低下させます。
しかしながら、本実験では、タンパク質発現はCaMV35S-プロモーターの制御下にあった。このプロモーターは、植物中のタンパク質の過剰発現に頻繁に使用され、非生理学的に高い量のタンパク質13をもたらす可能性があります。このような条件下では、相互作用の確率が高くなり、より高いタンパク質濃度で偽陽性の結果が生じる可能性があります。FRET効率に対して発光強度をプロットすると、発光強度の増加に伴うFRET効率の向上が実現し、発現レベルに対するFRETデータの評価が可能になります。
高解像度の共局化実験と FRET 測定を分離することをお勧めします。共局在化のために、各蛍光色素に最適な設定が選択され、FRET記録、発光強度、ピンホール径による微調整が最適な画像条件を妨げます。しかし、細胞内構造に関するオルガネラの分離と情報は、FRET測定に依然として包含されている。
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Disclosures
私たちは、すべての著者が利益相反を開示し、競合する財政的利益を持たないようにします。
Acknowledgments
実験はビーレフェルト大学生物学部の光顕微鏡技術プラットフォーム(LiMiTec)で行われました。この作品はビーレフェルト大学が資金を提供しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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