Summary
Um protocolo é fornecido para a criação de um microscópio de varredura a laser confocal padrão para medições de transferência de energia de ressonância in vivo Förster, seguido de avaliação de dados.
Abstract
Os experimentos de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) baseados em emissões sensibilizadas são facilmente feitos, mas dependem da configuração microscópica. Microscópios de varredura a laser confocal tornaram-se um cavalo de trabalho para biólogos. Os sistemas comerciais oferecem alta flexibilidade no ajuste de energia a laser e sensibilidade ao detector e muitas vezes combinam diferentes detectores para obter a imagem perfeita. No entanto, a comparação de dados baseados em intensidade de diferentes experimentos e configurações é muitas vezes impossível devido a essa flexibilidade. Procedimentos amigáveis ao biólogo são vantajosos e permitem um ajuste simples e confiável das configurações de laser e detector.
Além disso, como os experimentos de FRET em células vivas são afetados pela variabilidade na expressão proteica e nas razões de aceitação de doadores, os níveis de expressão proteica devem ser considerados para avaliação de dados. Descrito aqui é um protocolo simples para medições de FRET confiáveis e reprodutíveis, incluindo rotinas para a estimativa de expressão proteica e ajuste da intensidade do laser e configurações do detector. A avaliação dos dados será realizada por calibração com uma fusão fluoróvasa de eficiência fret conhecida. Para melhorar a simplicidade, foram comparados fatores de correção que foram obtidos nas células e medindo proteínas fluorescentes recombinantes.
Introduction
A transferência de energia de ressonância förster ((F)RET) é tipicamente observada pela espectroscopia de fluorescência, embora o processo em si não se limite a ocorrer entre fluoroforos. O acoplamento dipolo-dipolo subjacente simplesmente requer uma molécula de doador emissor de luz e um aceitador absorvedor de luz. Isso é derivado da sobreposição espectral necessária J integral da emissão de doadores normalizada e espectros de absorção de aceitação1. No entanto, como o RET compete com a fluorescência, a transferência de energia torna-se mensurável por alterações na emissão de fluorescência: RET induz a extinção de doadores e emissão de aceitadores sensibilizados.
O RET baseado em fluorophore foi chamado de fluorescência resonance energy transfer (FRET) para separá-lo da transferência de energia de ressonância bioluminescência (BRET). O RET depende fortemente da distância entre doador e aceitador, que está amplamente na faixa de 0,5-10 nm2 e, portanto, na mesma faixa das dimensões das proteínas e seus complexos. Em segundo lugar, o RET depende da orientação dipolo-dipolo kappa ao quadrado. Combinado com o fato de que a liberdade rotacional de fluoroforos ligados à proteína pode ser negligenciada devido ao peso molecular e ao relaxamento rotacional lento, o RET permite a análise de alterações conformais3.
O chamado raio Förster é baseado na sobreposição espectral integral e na faixa de comprimento de onda da sobreposição, de modo que os cromóforos absorventes de luz vermelha resultam em raios de Förster mais longos do que corantes absorventes de luz azul. Como a faixa dinâmica das medições fret é limitada por 0,5 × R0 e 1,5 × R0, o par FRET ECFP-EYFP tem um alcance dinâmico de 2,5-7,3 nm devido ao seu R0 de 4,9 nm4.
O brilho de um fluoróforo é dado pelo produto de seu coeficiente de extinção molar e seu rendimento quântico. Para as medidas do FRET, é vantajoso escolher fluoroforos de brilho quase semelhante. Isso aumenta a detecção de emissão de doadores saciados e sensibilizados. Também favorece a calibração do sistema de microscopia. Olhando para os pares de proteínas cianos e fluorescentes frequentemente usados, o menor brilho das proteínas fluorescentes de ciano torna-se óbvio (Figura 1A).
No entanto, a vida útil do aceitor deve ser menor do que a vida útil do doador, garantindo a disponibilidade do aceitador para transferência de energia. Se a vida útil do aceitor exceder a vida útil do doador, o aceitador ainda pode estar no estado animado quando o doador estiver animado novamente. Proteínas fluorescentes de ciano avançado, como a mTurquoise, mostram uma vida útil prolongada e, portanto, contribuem para uma maior probabilidade de FRET (Figure1B). A probabilidade de FRET também depende do coeficiente de extinção molar do aceitador.
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Protocol
NOTA: Para o seguinte protocolo, foi realizada transfesão transitória de protoplastos, conforme descrito anteriormente12. Uma breve descrição é dada abaixo.
1. Transfecção transitória de protoplastos
- Corte ~4 g de folhas saudáveis de Arabidopsis thaliana ecotype Columbia em fatias de 1 mm e transfira-as para 20 mL de solução enzimática (1,5% de celulase; 0,4% macerozyme; 0,1% de soro bovino albumina Fração V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)ácido esfórfico (MES), pH 5.7; 10 mM CaCl2).
- Infiltrar-se a vácuo nas fatias de folhas seguidas de uma incubação com agitação por 2 h à temperatura ambiente. Colher as células por centrifugação por 3 min a 100 × g.
- Lave os protoplastos com solução W5 (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) e resuspensá-los em solução MMG (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7).
- Realize a transfecção em um slide de 8 poços por choque osmótico na presença de polietilenoglicol (PEG) 4000. Misture 20 μL da suspensão protoplasta com 5 μL de DNA plasmídeo (5 μg/μL) e 25 μL de solução PEG (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, 40% PEG 4000).
- Reverter o choque osmótico por um reajuste suave das condições osmóticas.
NOTA: Além da amostra de interesse, somente a expressão do doador e do usuário é necessária para determinar o sangramento espectral do doador e do usuário, respectivamente. Uma proteína de fusão do doador e do aceitador deve ser expressa também para fins de calibração. A expressão de proteína fluorescente estava sob o controle de um vírus mosaico de couve-flor 35S promotor (pCaMV35S). Para todas as medidas, foram utilizados dois microscópios de varredura a laser confocal (LSM1 e LSM2). O LSM1 possui dois tipos de detectores: para medições de FRET, o sinal do doador foi detectado por um detector de GaAsP, enquanto o FRET e a emissão de aceitadores foram registrados com um fotomultiplier. O LSM2 possui dois fotomultipliers, que foram utilizados para a detecção de doadores, FRET e emissão de aceitadores.
2. Ajuste a laser
NOTA: Aqui, foram aplicadas linhas de 458 nm e 514 nm de um laser de íon-argônio para análise de FRET entre proteína fluorescente de ciano aumentada (ECFP) e proteínas fluorescentes amarelas aprimoradas (EYFP). Para aquisição de dados reprodutíveis, ambas as linhas foram ajustadas para intensidade semelhante. Isso foi conseguido por uma fotomultiplier de transmissão ou pelo modo de reflexão.
- Ajuste a laser com fotomultiplier de transmissão
- Use um poço vazio para ajuste.
- Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
- Diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruídos de fundo detectáveis.
- Aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% e regissou o sinal correspondente.
- Aplique a rotina para ambas as linhas de laser.
- Ajuste a laser com modo de reflexão
- Use um poço vazio para ajuste.
- Aplique um filtro de reflexão, ligue o modo de reflexão, se disponível.
- Certifique-se de que o comprimento de onda do detector cobre o comprimento de onda do laser.
- Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
- Diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruídos de fundo detectáveis.
- Mova o objetivo para a posição mais baixa.
- Mova o objetivo até que o reflexo do deslizamento seja visível.
- Aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% e regissou o sinal correspondente.
- Aplique a rotina para ambas as linhas de laser.
- Avaliação de dados
- Tabular os dados e classificar os dados por intensidades de sinal.
- Plote as intensidades do sinal contra a potência relativa do laser.
- Escolha intensidades de laser que resultem em intensidade de sinal semelhante.
3. Ajuste de fotomultipliers
NOTA: Após o ajuste do laser, os fotomultipliers foram ajustados a ganhos individuais para obter sensibilidade semelhante. Esta calibração foi feita com a linha laser de 514 nm, que está no centro da faixa de comprimento de onda de interesse.
- Use um poço vazio para ajuste.
- Aplique um filtro de reflexão e mude para o modo de reflexão, se disponível.
- Certifique-se de que o comprimento de onda do detector cobre o comprimento de onda do laser (514 nm).
- Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma.
- Diminuir o ganho do detector para metade do máximo e ajustar a intensidade do laser ao ruído de fundo detectável.
- Mova o objetivo para a posição mais baixa.
- Mova o objetivo até que o reflexo do deslizamento seja visível.
- Aumente o ganho do detector em etapas de 50 a 100 V e regise o sinal correspondente.
- Aplique as etapas 3.1 a 3.8 para ambos os detectores.
- Avaliação de dados
- Plote a intensidade contra o ganho do detector para cada detector.
- Escolha os ganhos individuais do detector para obter sensibilidade semelhante.
4. Aquisição de imagem fret
NOTA: Comece com a amostra de interesse para a configuração da aquisição de imagens.
- Escolha os filtros/espelhos dirítmicos apropriados, por exemplo, um espelho dicromático duplo MBS 458/514 para o ECFP/EYFP do par FRET. Use o mesmo espelho dicroico para todos os canais para permitir a varredura linha por linha. Selecione um objetivo de imersão em água para a imagem de células vivas. Escolha a varredura de 12 bits ou 16 bits e velocidade de varredura moderada.
- Defina a faixa de detecção, preferencialmente 470-510 nm para detecção de doadores e 530-600 nm para detecção de acceptor/FRET no caso de ECFP/EYFP. Ao usar um laser de diodo de 445 nm ou 440 nm, use 450 a 510 nm como faixa de detecção. No caso de um divisor de feixe acousto-óptico (AOBS), defina a detecção de doadores na faixa de 450 a 500 nm para evitar a detecção indesejada de aceitadores.
- Aplique a configuração do detector de acordo com 3.10.2.
- Aplique a configuração do laser de acordo com 2.3.2. Revise a intensidade do laser com base na tabela de alimentação laser obtida, se necessário. Certifique-se de que a relação sinal-ruído cubra toda a gama dinâmica dos detectores (intensidade que varia de 0 a 4095 para varredura de 12 bits).
- Mantenha as intensidades de laser e os ganhos do detector constantes. Use o diâmetro do orifício para ajuste fino.
NOTA: Tenha em mente que as alterações no diâmetro do orifício afetam a resolução espacial. - Realizar as medições (tirar imagens de pelo menos 20 células).
5. Determinação de correções de crosstalk
NOTA: As células que expressam apenas o doador ou o usuário são obrigadas a determinar o sangramento espectral do doador (DSBT) e o sangramento espectral aceitor (ASBT), respectivamente. Mantenha as mesmas configurações descritas na seção 4.
- Realize medições de FRET com células expressando o fluorophore doador.
- Realize medições de FRET com células expressando o fluorophore aceitor.
6. Calibração das medidas de acordo com Beemiller et al.13
NOTA: São necessárias células que expressem uma fusão aceitadora de doadores da eficiência conhecida do FRET. Aqui, foi utilizada uma fusão AA-EYFP EA-EYFP com eficiência DE 0,46 FRET. Mantenha as mesmas configurações descritas na seção 4.
- Realizar medições de FRET com células expressando a fusão doador-aceitante
7. Avaliação de dados
- Obtenha perfis de linha das células, garantindo que cada perfil não contenha mais do que uma célula. Salve os perfis como arquivos de texto.
- Importe os arquivos de texto em uma planilha usando a opção de importação de arquivos de texto na seção Dados .
- Leia os valores máximos aplicando a função Max .
- Liste os valores obtidos em uma tabela, tenha uma coluna cada para ID de emissão de doadores, IF de emissão de FRET, IA de emissão aceitadora e pelo menos quatro conjuntos de dados: apenas doador, apenas aceitador, fusão doador-aceitador e medição.
NOTA: A excitação do doador também resulta em excitação direta do aceitador e causa ASBT descrito pelo valor α. - Calcule os valores de α ASBT com o conjunto de dados somente para aceitador usando equação (1).
(1)
NOTA: Use a mediana de todos os valores α nas seguintes equações. O doador apresenta um amplo espectro de emissões que resulta em crosstalk de emissões com a emissão sensibilizada do aceitador. Este DSBT é dado pelo valor β. - Calcule os valores de sangria β espectral do doador com o conjunto de dados somente para doadores usando equação (2).
(2)
NOTA: Use a mediana de todos os valores β nas seguintes equações. O fator de calibração descreve a relação linear de doadores derivados do FRET e emissão sensibilizada do aceitador. Use as medianas de 7,5 e 7,6 nas equações a seguir. - Calcule os fatores de calibração com o conjunto de dados de fusão doador-aceitor e sua eficiência FRET E (0,46) usando equação (3).
(3)
NOTA: Use a mediana de todos os valores nas seguintes equações. - Calcule as eficiências fret do par de proteínas de interesse usando equações (4) e (5).
(4)
(5) - Estime os efeitos da força de expressão e/ou relação doador-aceitador: plote a soma do ID, IF e IA contra as eficiências do FRET. Realizar uma regressão linear; note que quanto mais íngreme o gráfico e quanto maior for o R2 , maior é o impacto do nível de expressão ou maior é a diferença de abundância de doador e aceitador.
(1)
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Representative Results
Ajuste do microscópio de varredura a laser confocal
O ajuste a laser revelou um aumento linear da emissão com aumento da intensidade do laser (Figura 2 e Tabela 1). Como esperado para os lasers de íons de argônio, a emissão da linha de 514 nm foi muito maior do que a emissão da linha de 458 nm, como evidenciado por uma inclinação mais íngreme. Para experimentos subsequentes, foi escolhida potência laser de 4,5% e 6,5% para a linha de 514 nm e a linha de 458 nm, respectivamente. Isso resultou em intensidade de emissão quase igual de 1123 (514 nm) e 1141 (458 nm).
A variação dos ganhos do detector com energia laser constante revelou um comportamento exponencial para ambos os detectores analisados. Intensidades de emissão semelhantes foram obtidas para um ganho de 700 V (Figura 3). Embora o ajuste das linhas laser tenha se beneficiado do comportamento linear, o ajuste dos detectores é provavelmente afetado pelo comportamento exponencial, resultando em diferenças acentuadas com pequenas alterações no ganho em tensões mais altas. Infelizmente, essa faixa mais alta é de interesse para medições em células vivas, pois o aumento da potência do laser é citotóxico e promove o fotobleaching.
Determinando sangramento espectral
Inicialmente, o sangramento espectral do doador e do aceitador foram analisados com ECFP e EYFP purificados recombinantes; DSBT β = 0,498 e ASBT α = 0,100. O mesmo foi feito com células expressando ECFP ou EYFP. Com o LSM 2, o DSBT estimado foi β = 1,602 ± 0,207 (média ± SD) e ASBT foi α = 0,119 ± 0,018. Os valores medianos foram β = 1,506 e α = 0,120. Essa discrepância entre os dados obtidos em células vivas e os dados obtidos com proteína recombinante demonstra que é impossível omitir a determinação do sangramento espectral em células vivas. Isso provavelmente é causado por pigmentos celulares.
As imagens revelam o maior brilho do EYFP em comparação com o ECFP (Figura 4 e Tabela 2). Compensar as diferenças de brilho por diferentes configurações de laser aumenta o alcance dinâmico do doador e do canal FRET. Fornecer a saída relativa medindo as intensidades do laser, como feito para o ajuste, ainda aumenta a reprodutibilidade das medidas.
Para LSM 1, β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 com medianas de α = 0,084 e β = 0,180. A determinação do ASBT depende do ajuste a laser e de um único detector, e, portanto, a determinação do ASBT teve um bom desempenho. O DBST envolve dois detectores, resultando em resultados muito diferentes para ambos os microscópios. Deve-se lembrar que o LSM 2 é equipado com dois fotomultipliers, enquanto o LSM 1 usa um detector GaAsP e um fotomultiplier, dois tipos diferentes de detectores com diferentes propriedades espectrais e sensibilidade. Assim, o ajuste funciona melhor com dois detectores idênticos.
Calibração da medição
Para calibração, foram aplicados os valores medianos de α e β, sendo utilizada uma fusão de ECFP e EYFP como padrão de eficiência fret conhecida (E = 0,46). A calibração do ECFP-EYFP recombinante e purificado resultou em um valor de 13,44, enquanto as medições in vivo revelaram um valor de 1.525 ± 1.844. A mediana foi de 0,798, revelando outliers extremos juntamente com o desvio padrão elevado. Para o LSM 1, os valores foram de 1,978 ± 0,807 com mediana de φ = 1.883. Para o LSM 2 e lSM 1, os conjuntos de dados obtidos para o cálculo da tabela φ (Tabela 3) foram estatisticamente idênticos, conforme comprovado pelo t-teste do Aluno (p > 0,2).
Medição do FRET
Como prova de conceito, a medição do FRET foi repetida com a fusão doador-aceitador. A eficiência da FRET medida foi de 0,47 ± 0,07 para a proteína purificada e 0,47 ± 0,06 em células vivas com LSM 2 (Tabela 4). A mediana das medidas em células vivas foi E = 0,45. Para o LSM 1, a eficiência do FRET foi de 0,46 ± 0,09 com mediana de E = 0,45 (Tabela 4). Esses dados demonstram a calibração eficaz com uma construção FRET da eficiência fret conhecida.
Efeitos do nível de expressão e da relação doador-aceitador
Para o conjunto de dados analisado, as eficiências do FRET não foram influenciadas pelo nível de expressão. Devido à fusão do doador e do aceitador, a razão também foi constante. A inclusão de conjuntos de dados anteriores revelou uma dependência do nível de expressão em um caso (Figura 5). A eficiência fret entre as subunidades de VACUolar ATPase (V-ATPase), VHA-A-ECFP e VHA-a-EYFP, diminuiu com o aumento da intensidade do sinal. Em contraste, a interação entre VHA-E1-ECFP e VHA-C-EYFP foi independente da intensidade do sinal. No caso de VHA-A e VHA-a, as três cópias de VHA-A são cada vez mais substituídas por VHA-A-ECFP, o que resulta em um excesso de doadores em comparação com a cópia única de VHA-a no complexo. Embora o VHA-E1 possa estar presente na forma de três cópias, a alta solubilidade do VHA-C pode abolir esse efeito neste exemplo. Aqui, as eficiências do FRET têm sido relativamente baixas. Esta abordagem simples permite o teste de artefatos de expressão e proporção.
Figura 1: Visão geral dos pares de FRET de proteína fluorescente com doadores emissores de cianos. (A) Os raios Förster dos pares e o brilho do doador e do aceitador são dados para pares FRET bem caracterizados. (B) Comparação das vidas de doadores e aceitadores. Asteriscos cinzentos indicam uma decadência multiexponencial. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; CFP = proteína fluorescente ciano; GFP = proteína fluorescente verde; YFP = proteína fluorescente amarela; mX = X monomérico; EX = X aprimorado; SX = super X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ajuste a laser. A emissão dos lasers foi registrada pelo reflexo do deslizamento de cobertura e traçada contra a intensidade relativa do laser como modulada pelo filtro acousto-óptico tunable do LSM. É mostrada a emissão da linha de 458 nm (A) e da linha de 514 nm (B) de um laser de íon-argônio. Abreviaturas: LSM = microscópio de varredura a laser; r.u. = unidades relativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ganho do detector e intensidade de emissão. As intensidades de emissão resultantes foram registradas no modo de reflexão para ganhos de detector variando de 300 a 750 V e 300 a 750 V para detector 1 (A) e detector 2 (B), respectivamente. Abreviação = r.u. = unidades relativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Hemorragia espectral. As imagens foram obtidas no doador, no FRET e nos canais de aceitação. (A) Imagens obtidas com proteínas fluorescentes purificadas; barras de escala = 100 μm; (B) imagens correspondentes para células expressas as proteínas fluorescentes; barras de escala = 10 μm. (C) Gráficos dos valores do SBT obtidos; significa ± SD é dado. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; SBT = sangria espectral; ECFP = proteína fluorescente ciano aprimorada; EYFP = proteína fluorescente amarela aprimorada; LSM = microscópio de varredura a laser; ASBT = aceitador SBT; DSBT = doador SBT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos do nível de expressão e/ou relação doador-aceitador. A soma das emissões nos canais doador, FRET e aceitador foi traçada contra a eficiência da FRET. Isso foi feito para VHA-E1-ECFP e VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP e VHA-a-EYFP (B), e a fusão ECFP-EYFP (C). Foi realizada regressão linear; a equação e R2 são dadas. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; ECFP = proteína fluorescente ciano aprimorada; EYFP = proteína fluorescente amarela aprimorada; VHA = subunidade vacuolar ATPase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Doador e aceitador sangram de ECFP e EYFP. Os espectros das proteínas fluorescentes foram obtidos a partir do banco de dados FP14. (A) Durante os experimentos de emissão sensibilizadas, as vastas porções do doador e do aceitador são detectadas por fotomultipliers individuais, chamados PMT1 e PMT2, respectivamente. A emissão de ECFP também é detectável pelo detector de aceitação após a excitação com 458 nm. O sangramento espectral calculado no PMT2 é de 40,6% da emissão detectada pelo PMT1. (B) O espectro de emissões do EYFP demonstra que o EYFP apresenta excitação direta a 458 nm, o que é frequentemente aplicado para a excitação de doadores de cianos. A eficiência de excitação esperada é de 9,6% da excitação a 514 nm. Abreviaturas: FP = proteína fluorescente; ECFP = proteína fluorescente ciano aprimorada; EYFP = proteína fluorescente amarela aprimorada; PMT = fotomultiplier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Potência laser e intensidade do sinal. As intensidades de sinal da linha de 458 nm são dadas em azul, as intensidades de sinal da linha de 514 nm em verde. As intensidades aplicadas para o experimento são destacadas em cinza. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Intensidades de sinal para determinação do SBT. São dados valores de α e β calculados. Abreviaturas: SBT = sangria espectral; LSM = microscópio de varredura a laser; FRET = Transferência de energia de ressonância förster; ASBT = aceitador SBT; DSBT = doador SBT. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 3: Intensidades do sinal para calibração. São dados valores máximos registrados e calculados. Os valores corrigidos correspondem às intensidades de sinal FRET menos o SBT. Abreviaturas: SBT = sangria espectral; LSM = microscópio de varredura a laser; FRET = Transferência de energia de ressonância förster. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 4: Intensidades de sinal para medições de FRET. São dados valores de maxima e E registrados. Os valores corrigidos correspondem às intensidades de sinal FRET menos o SBT. Os valores E calibrados foram calculados com calibração por φ. Abreviaturas: SBT = sangria espectral; LSM = microscópio de varredura a laser; FRET = Transferência de energia de ressonância förster; cal. = calibrado. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A emissão de aceitadores de doadores e sensibilizadas são caracterizadas por uma relação linear que permite o cálculo baseado em doadores ou aceitadores de FRET. Os fatores correspondentes de linearidade são chamados fator G (doador para aceitador) ou xi (aceitador ao doador), que são valores recíprocos4. Medir o FRET entre proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência muitas vezes requer correções para DSBT e ASBT devido ao amplo espectro de absorção e emissão das proteínas fluorescentes. No entanto, muitas correções dependem de um ASBT mensurável, que é um fator no denominador das equações na seção de protocolo 7, e uma α = 0 resulta em equações indefinidas5,6.
Recomenda-se um ajuste das intensidades do laser para evitar tais efeitos. Isso permite o uso de cálculos baseados em aceitadores e fácil detecção de relações inadequadas entre doadores e aceitadores. Neste protocolo, foi aplicada a equação de Beemiller e colegas de trabalho, que tem a vantagem da calibração simples por uma única construção de referência da conhecida eficiência fret. O ajuste dos detectores é crítico, especialmente quando dois tipos diferentes de detectores são aplicados. Dados anteriores obtidos com dois fotomultipliers idênticos e ganhos idênticos resultaram em uma constante β = 0,61 para múltiplos experimentos ao longo dos anos7,8,9 e demonstram que o ajuste do detector é vantajoso para a reprodutibilidade. Se os detectores não permitirem um ajuste confiável, uma varredura sequencial com um único detector em um modo quadro a quadro pode ser uma opção para evitar viés das propriedades do detector.
As medidas nas células vegetais são afetadas por muitos pigmentos, que resultam em absorção de luz excitada e autofluorescência de fundo. Os pigmentos celulares são principalmente animados pela luz no UV para a faixa azul4,10. Isso explica a discrepância entre as medidas nas células e aquelas com proteínas purificadas. As proteínas purificadas podem servir como prova de ajuste, pois os valores esperados para as α asBT e DSBT β podem ser derivados do espectro de absorção aceitador e do espectro de emissão de doadores, respectivamente (Figura 6). Os valores de ASBT são semelhantes em células (α = 0,094) e com fluoroforos purificados (α = 0,114) e próximos ao valor esperado de 0,096 devido à baixa absorção celular a 514 nm. O DSBT de β = 0,498 com proteínas purificadas também está próximo do valor esperado de 0,406. O sangramento espectral depende ainda mais da configuração; Lasers de diodo de 445 ou 440 nm reduzem a excitação direta do EYFP e, assim, reduzem o ASBT. Os AOBSs são caracterizados por uma abertura de transmissão menor do que os espelhosdicróicos. Assim, a detecção de EYFP é aprimorada na faixa de 500 a 510 nm e pode resultar em ASBT adicional no canal do doador. No entanto, as propriedades espectrais do EYFP apontam para menos de 1% de emissão do pico máximo, considerando tanto excitação menos eficaz quanto baixa intensidade de emissão. A lacuna do filtro é muito maior com espelhosdicróicos, resultando em uma supressão adicional de tal conversa cruzada aceitadora.
O uso dos valores das proteínas purificadas não reflete a situação na célula. O mesmo vale para a calibração pelo fator φ. Embora o fator de calibração tenha sido semelhante para ambos os LSM, foi muito maior em medições com a proteína recombinante, revelando o impacto dos pigmentos celulares. Deve-se mencionar que nessas medidas, o ruído de fundo foi insignificante, mas detectável e não afetou as intensidades observadas. Em contraste com as medidas da vida útil do doador, os experimentos de emissão sensibilizadas são sensíveis à razão doador-aceitante, de modo que um excesso de doadores resulta na diminuição da eficiência do FRET.
No entanto, a expressão proteica tem estado sob o controle do promotor caMV35S nos atuais experimentos. Este promotor é frequentemente usado para a superexpressão de proteínas em plantas e pode resultar em quantidades não fisiologicamente altas de proteínas13. Sob tais condições, a probabilidade de interação aumenta, e resultados falso-positivos podem ocorrer com maiores concentrações proteicas. A traçar as intensidades de emissão contra a eficiência do FRET resulta em um aumento da eficiência do FRET com o aumento da intensidade de emissão e permite a avaliação dos dados do FRET em relação ao nível de expressão.
Recomenda-se separar experimentos de colocalização de alta resolução das medidas fret. Para a colocalização, são escolhidas configurações ideais para cada fluoróforo, enquanto para registro de FRET, intensidades de emissão e ajuste fino pelo diâmetro do pinhole interferem nas condições ideais de imagem. No entanto, a separação de organelas e informações sobre estruturas subcelulares ainda são englobadas nas medições de FRET.
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Disclosures
Garantimos que todos os autores tenham divulgado todo e qualquer conflito de interesses e que não tenham interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os experimentos foram realizados na Plataforma de Tecnologia de Microscopia Leve (LiMiTec) da Faculdade de Biologia da Universidade bielefeld. Este trabalho foi financiado pela Universidade Bielefeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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