Summary
Ett protokoll tillhandahålls för att ställa in ett standardkonokalt laserskanningsmikroskop för in vivo Förster resonansenergiöverföringsmätningar, följt av datautvärdering.
Abstract
Sensibiliserade emissionsbaserade Fret-experiment (Förster resonance energy transfer) är lätta att göra men beror på den mikroskopiska installationen. Konfokala laserskanningsmikroskop har blivit en arbetshäst för biologer. Kommersiella system erbjuder hög flexibilitet i lasereffektjustering och detektorkänslighet och kombinerar ofta olika detektorer för att få den perfekta bilden. Jämförelsen av intensitetsbaserade data från olika experiment och inställningar är dock ofta omöjlig på grund av denna flexibilitet. Biologvänliga procedurer är till fördel och möjliggör enkel och tillförlitlig justering av laser- och detektorinställningar.
Eftersom FRET-experiment i levande celler påverkas av variabiliteten i proteinuttryck och donator-acceptor-förhållanden, måste dessutom proteinuttrycksnivåer beaktas för datautvärdering. Beskrivs här är ett enkelt protokoll för tillförlitliga och reproducerbara FRET-mätningar, inklusive rutiner för uppskattning av proteinuttryck och justering av laserintensitet och detektorinställningar. Datautvärderingen kommer att utföras genom kalibrering med en fluoroforfusion av känd FRET-effektivitet. För att förbättra enkelheten har korrigeringsfaktorer jämförts som har erhållits i celler och genom att mäta rekombinanta fluorescerande proteiner.
Introduction
Förster resonans energiöverföring ((F)RET) observeras vanligtvis av fluorescensspektroskopi, även om själva processen inte är begränsad till att inträffa mellan fluoroforer. Den underliggande dipol-dipolkopplingen kräver helt enkelt en ljusemitterande donatormolekyl och en ljusabsorberande acceptor. Detta härleds från den erforderliga spektral överlappning integrerad J av normaliserade givaren utsläpp och acceptor absorbans spektra1. Men eftersom RET konkurrerar med fluorescens blir energiöverföringen mätbar genom förändringar i fluorescensutsläpp: RET inducerar givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp.
Fluorofor-baserade RET har kallats fluorescens resonans energiöverföring (FRET) för att skilja den från bioluminescens resonans energiöverföring (BRET). RET beror starkt på avståndet mellan donator och acceptor, som ligger i stor utsträckning i intervallet 0,5-10 nm2 och därmed i samma intervall som dimensionerna av proteiner och deras komplex. För det andra beror RET på dipol-dipolorienterings orientering kappa kvadrat. I kombination med det faktum att rotationsfriheten hos proteinbundna fluoroforer kan försummas på grund av molekylvikten och den långsamma rotationsavslappningen, möjliggör RET analys av konformationsförändringar3.
Den så kallade Försterradien är baserad på den spektralöverlappande integralen och våglängdsområdet för överlappningen, så att röda ljusabsorberande kromoforer resulterar i längre Förster-radier än blå ljusabsorberande färgämnen. Eftersom det dynamiska intervallet för FRET-mätningar begränsas av 0,5 × R0 och 1,5 × R0, har FRET-paret ECFP-EYFP ett dynamiskt omfång på 2,5-7,3 nm på grund av dess R0 på 4,9 nm4.
Ljusstyrkan hos en fluorofor ges av produkten av dess molarutrotningskoefficient och dess kvantutbyte. För FRET-mätningar är det fördelaktigt att välja fluoroforer med nästan liknande ljusstyrka. Detta förbättrar upptäckten av givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp. Det gynnar också kalibreringen av mikroskopisystemet. Om man tittar på de ofta använda FRET-paren av cyan- och fluorescerande proteiner blir den lägre ljusstyrkan hos de cyan fluorescerande proteinerna uppenbar (figur 1A).
Acceptorns livstid måste dock vara lägre än givarens livslängd, vilket säkerställer att acceptorn är tillgänglig för energiöverföring. Om acceptorns livstid överskrider donatorns livstid kan acceptorn fortfarande vara i upphetsat tillstånd när donatorn är upphetsad igen. Avancerade cyan fluorescerande proteiner som mTurquoise visar en förlängd livslängd och bidrar därmed till en ökad sannolikhet för FRET (Figur1B). Sannolikheten för FRET beror också på acceptorns molarutrotningskoefficient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För följande protokoll utfördes transienta transfection av protoplaster, som beskrivits tidigare12. Nedan ges en kort beskrivning.
1. Övergående transfektion av protoplaster
- Skär ~ 4 g friska blad av Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia i 1 mm skivor och överför dem till 20 ml enzymlösning (1,5% cellulas; 0,4% macerozym; 0,1% bovint serumalbumin Fraction V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino) etan.
- Vakuuminfiltrera bladskivorna följt av en inkubation med omrörning i 2 h vid rumstemperatur. Skörda cellerna genom centrifugering i 3 minuter vid 100 × g.
- Tvätta protoplasterna med W5-lösning (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) och återanvänd dem i MMG-lösning (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
- Utför transfektionen i en 8-brunnsbild med osmotisk chock i närvaro av polyetylenglykol (PEG) 4000. Blanda 20 μL av protoplastupphängningen med 5 μL plasmid-DNA (5 μg/μL) och 25 μL PEG-lösning (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, 40% PEG 4000).
- Vänd den osmotiska chocken genom en försiktig justering av de osmotiska förhållandena.
OBS: Förutom det urval av intresse krävs uttryck av enbart donator och acceptor ensam för att bestämma spektralblödning av givaren respektive acceptorn. Ett fusionsprotein från donatorn och acceptorn måste också uttryckas för kalibreringsändamål. Det fluorescerande protein uttrycket var under kontroll av en blomkål mosaik virus 35S promotor (pCaMV35S). För alla mätningar användes två konfokala laserskanningsmikroskop (LSM1 och LSM2). LSM1 har två typer av detektorer: för FRET-mätningar upptäcktes givarsignalen av en GaAsP-detektor, medan FRET- och acceptorutsläpp registrerades med en fotomultipliktr. LSM2 har två fotomultipliers, som användes för detektion av givaren, FRET, och acceptor utsläpp.
2. Laserjustering
OBS: Här har 458 nm och 514 nm linjer av en argon-jonlaser tillämpats för FRET-analys mellan förbättrat cyan fluorescerande protein (ECFP) - och förbättrade gula fluorescerande protein (EYFP) -märkta proteiner. För reproducerbar datainsamling justerades båda raderna till liknande intensitet. Detta uppnåddes antingen genom en överföringsfotomultiplikör eller reflektionsläget.
- Laserjustering med en transmissionsfotomultringsdrlik
- Använd en tom brunn för justering.
- Välj linjeskanningsläge och histogramvy.
- Minska laserintensiteten till ett minimum och justera detektorns förstärkning till detekterbart bakgrundsljud.
- Öka laserintensiteten i steg om 0,5% och registrera motsvarande signal.
- Tillämpa rutinen för båda laserlinjerna.
- Laserjustering med reflektionsläge
- Använd en tom brunn för justering.
- Använd ett reflektionsfilter, slå på reflektionsläget, om tillgängligt.
- Se till att detektorns våglängdsområde täcker laserns våglängd.
- Välj linjeskanningsläge och histogramvy.
- Minska laserintensiteten till ett minimum och justera detektorns förstärkning till detekterbart bakgrundsljud.
- Flytta målet till den lägsta positionen.
- Flytta målet tills reflektionen av täcket är synlig.
- Öka laserintensiteten i steg om 0,5% och registrera motsvarande signal.
- Tillämpa rutinen för båda laserlinjerna.
- Utvärdering av data
- Tabulera data och sortera data efter signalintensiteter.
- Plotta signalintensiteterna mot den relativa lasereffekten.
- Välj laserintensiteter som resulterar i liknande signalintensitet.
3. Justering av fotomultringspliplikar
OBS: Efter laser justering, fotomultipliers justeras till enskilda vinster för att erhålla liknande känslighet. Denna kalibrering gjordes med laserlinjen 514 nm, som ligger i mitten av våglängdsområdet av intresse.
- Använd en tom brunn för justering.
- Använd ett reflektionsfilter och växla till reflektionsläge om det är tillgängligt.
- Se till att detektorvåglängdsområdet täcker laserns våglängd (514 nm).
- Välj linjeskanningsläge och histogramvy.
- Minska detektorns förstärkning till hälften av maxvärdet och justera laserintensiteten till detekterbart bakgrundsljud.
- Flytta målet till den lägsta positionen.
- Flytta målet tills reflektionen av täcket är synlig.
- Öka detektorns förstärkning i steg 50 till 100 V och registrera motsvarande signal.
- Tillämpa steg 3.1 till 3.8 för båda detektorerna.
- Utvärdering av data
- Plotta intensiteten mot detektorns förstärkning för varje detektor.
- Välj de individuella detektorvinsterna för att få liknande känslighet.
4. FRET bildförvärv
OBS: Börja med exempel av intresse för att ställa in bildförvärv.
- Välj lämpliga filter/dichroiska speglar, t.ex. en dubbel dichroisk spegel MBS 458/514 för FRET-paret ECFP/EYFP. Använd samma dichroiska spegel för alla kanaler för att aktivera skanning rad för rad. Välj ett mål för vattensänkning för avbildning av levande celler. Välj 12 bitars eller 16-bitars skanning och måttlig skanningshastighet.
- Definiera detektionsområdet, helst 470-510 nm för givardetektering och 530-600 nm för acceptor/FRET-detektion när det gäller ECFP/EYFP. Använd 450 till 510 nm som detekteringsområde när du använder en diodlaser på 445 nm eller 440 nm. Vid acoustooptisk stråldelare (AOBS), definiera donatordetektering i intervallet 450 till 500 nm för att förhindra oönskad acceptordetektering.
- Applicera detektorinställningen enligt 3.10.2.
- Applicera laserinställningen enligt 2.3.2. Revidera laserintensiteten baserat på det erhållna lasereffektbordet vid behov. Se till att signal-till-brus-förhållandet täcker detektorernas hela dynamiska omfång (intensitet från 0 till 4095 för 12-bitars skanning).
- Håll laserintensiteter och detektorvinster konstanta. Använd pinhole diametern för finjustering.
OBS: Tänk på att förändringar i pinhole diametern påverkar rumslig upplösning. - Utför mätningarna (ta bilder av minst 20 celler).
5. Fastställande av crosstalk-korrigeringar
OBS: Celler som uttrycker endast givaren eller acceptorn är skyldiga att bestämma givaren spektral blödning (DSBT) respektive acceptor spektral blödning (ASBT). Behåll samma inställningar som beskrivs i avsnitt 4.
- Utför FRET-mätningar med celler som uttrycker donatorfluoforen.
- Utför FRET-mätningar med celler som uttrycker acceptorfluoforen.
6. Kalibrering av mätningarna enligt Beemiller et al.13
OBS: Celler som uttrycker en donator-acceptor fusion av känd FRET effektivitet krävs. Här har en ECFP-5 aa-EYFP-fusion med en FRET-effektivitet på 0,46 använts4. Behåll samma inställningar som beskrivs i avsnitt 4.
- Utför FRET-mätningar med celler som uttrycker fusion mellan donator och acceptor
7. Utvärdering av uppgifter
- Hämta cellernas radprofiler och se till att varje profil inte innehåller mer än en cell. Spara profilerna som textfiler.
- Importera textfilerna till ett kalkylblad med hjälp av importalternativet för textfiler i avsnittet Data .
- Läs upp maximivärdena genom att använda funktionen Max .
- Ange de erhållna värdena i en tabell, ha en kolumn var för donatorutsläpps-ID, FRET-utsläpps-IF, acceptansutsläpp IA och minst fyra datamängder: endast givare, endast acceptor, fusion mellan givare och acceptor och mätning.
OBS: Excitation av givaren resulterar också i direkt excitation av acceptorn och orsakar ASBT som beskrivs av α värde. - Beräkna ASBT-α värden med data uppsättningen endast accepterare med hjälp av ekvationen (1).
(1)
OBS: Använd medianvärdet för alla α värden i följande ekvationer. Givaren visar ett brett emissionsspektrum som resulterar i utsläppskorsning med acceptorns sensibiliserade utsläpp. Denna DSBT anges av det β värdet. - Beräkna givarspektralblödnings-genomblödnings-β värden med data uppsättningen endast för donatorer med hjälp av ekvationen (2).
(2)
OBS: Använd medianvärdet för alla β värden i följande ekvationer. Kalibreringsfaktorn beskriver det linjära förhållandet mellan FRET-härledda givarens släckning och sensibiliserade utsläpp av acceptorn. Använd medianvärdet 7,5 och 7,6 i följande ekvationer. - Beräkna kalibreringsfaktorerna med fusionsdatauppsättningen för donator-acceptor och dess FRET-effektivitet E (0,46) med hjälp av ekvationen (3).
(3)
OBS: Använd medianvärdet för alla ξ-värden i följande ekvationer. - Beräkna fret-effektiviteten hos proteinparet med hjälp av ekvationerna (4) och (5).
(4)
(5) - Uppskatta effekterna av uttrycksstyrka och/eller givar-acceptor-förhållande: plotta summan av ID, IF och IA mot FRET-effektivitetsvinsterna. Utför en linjär regression; Observera att ju brantare grafen och ju högre R2 är, desto högre är effekten av uttrycksnivån eller desto större är skillnaden mellan donator och acceptor överflöd.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Justering av det konfokala laserskanningsmikroskopet
Laserjusteringen visade en linjär ökning av utsläppen med ökande laserintensitet (figur 2 och tabell 1). Som förväntat för argonjonlasrar var utsläppen av 514 nm-linjen mycket högre än utsläppen av 458 nm-linjen, vilket framgår av en brantare sluttning. För efterföljande experiment valdes lasereffekt på 4,5% respektive 6,5% för 514 nm-linjen respektive 458 nm-linjen. Detta resulterade i nästan lika utsläppsintensitet på 1123 (514 nm) och 1141 (458 nm).
Att variera detektorvinsterna med konstant lasereffekt visade ett exponentiellt beteende för båda analyserade detektorer. Liknande utsläppsintensiteter erhölls för en vinst på 700 V (figur 3). Även om justeringen av laserlinjer gynnades av det linjära beteendet, påverkas justeringen av detektorerna sannolikt av det exponentiella beteendet, vilket resulterar i markanta skillnader med mindre förändringar i förstärkningen vid högre spänningar. Tyvärr är detta högre intervall av intresse för mätningar i levande celler, eftersom att öka laserkraften är cytotoxiskt och främjar fotobleaching.
Bestämning av spektralblödning
Först analyserades spektralblödning av givaren och acceptor med rekombinant renade ECFP och EYFP; DSBT β = 0,498 och ASBT α = 0,100. Detsamma gjordes med celler som uttrycker antingen ECFP eller EYFP. Med LSM 2 var den uppskattade DSBT β = 1,602 ± 0,207 (genomsnittlig ± SD) och ASBT var α = 0,119 ± 0,018. Medianvärdena var β = 1,506 och α = 0,120. Denna diskrepans mellan de data som erhållits i levande celler och de data som erhållits med rekombinant protein visar att det är omöjligt att utelämna bestämning av spektralblödning i levande celler. Detta orsakas troligen av cellulära pigment.
Bilderna visar EYFP:s högre ljusstyrka jämfört med ECFP (figur 4 och tabell 2). Att kompensera skillnaderna i ljusstyrka med olika laserinställningar förbättrar donatorns och FRET-kanalens dynamiska omfång. Att tillhandahålla den relativa effekten genom att mäta laserintensiteterna, som görs för justeringen, ökar fortfarande mätningarnas reproducerbarhet.
För LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 med medianvärden på α = 0,084 och β = 0,180. Bestämningen av ASBT beror på laserjusteringen och en enda detektor, och därmed utfördes bestämningen av ASBT väl. DBST involverar två detektorer, vilket resulterar i mycket olika resultat för båda mikroskopen. Man bör komma ihåg att LSM 2 är utrustad med två fotomultringsapparater, medan LSM 1 använder en GaAsP-detektor och en fotomultipliklik, två olika typer av detektorer med olika spektralegenskaper och känslighet. Justeringen fungerar därför bättre med två identiska detektorer.
Kalibrering av mätningen
För kalibrering tillämpades medianvärdena för α och β, och en sammanslagning av ECFP och EYFP användes som standard för känd FRET-effektivitet (E = 0,46). Kalibreringen av rekombinant och renad ECFP-EYFP resulterade i ett ξ värde på 13,44, medan in vivo-mätningarna visade ett ξ värde på 1,525 ± 1,844. Medianen var 0,798, vilket avslöjar extrema avvikande värden tillsammans med den höga standardavvikelsen. För LSM 1 var värdena ξ = 1,978 ± 0,807 med en median på ξ = 1,883. För LSM 2 och LSM 1 var de datamängder som erhållits för beräkning av ξ (tabell 3) statistiskt identiska, vilket framgår av Students t-test (s > 0,2).
FRET-mätning
Som ett bevis på koncept upprepades FRET mätningen med givaren-acceptor fusion. Den uppmätta FRET-effektiviteten var 0,47 ± 0,07 för det renade proteinet och 0,47 ± 0,06 i levande celler med LSM 2 (tabell 4). Medianvärdet för mätningarna i levande celler var E = 0,45. För LSM 1 var FRET-verkningsgraden 0,46 ± 0,09 med ett medianvärde på E = 0,45 (tabell 4). Dessa data visar den effektiva kalibreringen med en FRET-konstruktion av känd FRET-effektivitet.
Effekter av uttrycksnivå och donator-acceptorförhållande
För den analyserade data uppsättningen påverkades FRET-effektivitetsvinsterna inte av uttrycksnivån. På grund av fusionen av givaren och acceptorn var förhållandet också konstant. Införandet av tidigare datamängder visade ett beroende av uttrycksnivån i ett fall (figur 5). FRET-effektiviteten mellan de märkta vacuolar ATPase (V-ATPase) underenheterna, VHA-A-ECFP och VHA-a-EYFP, minskade med ökande signalintensitet. Däremot var samspelet mellan VHA-E1-ECFP och VHA-C-EYFP oberoende av signalintensiteten. När det gäller VHA-A och VHA-a ersätts de tre kopiorna av VHA-A i allt högre grad av VHA-A-ECFP, vilket resulterar i ett överskott av givare jämfört med den enda kopian av VHA-a i komplexet. Även om VHA-E1 kan förekomma i form av tre kopior, kan VHA-C:s höga löslighet avskaffa denna effekt i det här exemplet. Här har FRET-effektivitetsvinsterna varit jämförelsevis låga. Den här enkla metoden gör det möjligt att testa uttrycks-och förhållande artefakter.
Figur 1: Översikt över fluorescerande protein FRET par med cyanemitterande givare. (A) Parens Försterradier och givarens och acceptorns ljusstyrka ges för väl karakteriserade FRET-par. B) Jämförelse av donatorns och acceptorns livstid. Grå asterisker indikerar ett multiexponentiellt förfall. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; CFP = cyan fluorescerande protein; GFP = grönt fluorescerande protein; YFP = gult fluorescerande protein; mX = monomeriskt X; EX = förbättrat X; SX = super X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Laserjustering. Emissionen av lasrarna registrerades genom reflektionen av täckslipet och plottades mot den relativa laserintensiteten som modulerades av det acoustooptiska tunable filtret för LSM. Emission av 458 nm-linjen (A) och 514 nm-linjen (B) av en argonjonlaser visas. Förkortningar: LSM = laserscanningsmikroskop; r.u. = relativa enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Detektorns förstärkning och emissionsintensitet. De resulterande emissionsintensiteterna registrerades i reflektionsläget för detektorvinster från 300 till 750 V respektive 300 till 750 V för detektor 1 (A) respektive detektor 2 (B). Förkortning = r.u. = relativa enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Spektralblödning. Bilder erhölls i givaren, FRET och acceptor kanalerna. A) Bilder erhållna med renade fluorescerande proteiner. skalstänger = 100 μm; B) Motsvarande bilder för celler som uttrycker fluorescerande proteiner. Skalstänger = 10 μm. (C) Diagram över de erhållna SBT-värdena; medelvärde ± SD ges. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; SBT = spektralblödning; ECFP = förbättrat fluorescerande cyanprotein; EYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; LSM = mikroskanningsmikroskop för laserskanning; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donator SBT. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Effekter av uttrycksnivå och/eller donator-acceptorförhållande. Summan av utsläppen i givar-, FRET- och acceptorkanalerna har plottats mot FRET-effektiviteten. Detta har gjorts för VHA-E1-ECFP och VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP och VHA-a-EYFP (B) och fusionen ECFP-EYFP (C). Linjär regression utfördes; ekvationen och R2 ges. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; ECFP = förbättrat fluorescerande cyanprotein; EYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; VHA = vacuolar ATPase subunit. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Förblödning av ECFP och EYFP. Spektra av fluorescerande proteiner erhölls från FP databasen14. (A) Under sensibiliserade utsläppsexperiment detekteras de stora delarna av givaren och acceptorn av enskilda fotomultringsapparater, med namnet PMT1 respektive PMT2. ECFP-emission kan också detekteras av acceptordetektorn vid excitation med 458 nm. Den beräknade spektralblödningen till PMT2 är 40,6% av de utsläpp som detekteras av PMT1. (B) EYFP:s utsläppsspektrum visar att EYFP visar direkt excitation vid 458 nm, vilket ofta tillämpas för excitation av cyandonatorer. Den förväntade excitationseffektiviteten är 9,6% av excitationen vid 514 nm. Förkortningar: FP = fluorescerande protein; ECFP = förbättrat fluorescerande cyanprotein; EYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; PMT = fotomultiplier. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Lasereffekt och signalintensitet. Signalintensiteterna för 458 nm-linjen ges i blått, signalintensiteterna för 514 nm-linjen i grönt. De intensiteter som tillämpas för experimentet markeras i grått. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Signalintensiteter för SBT-bestämning. Inspelad maxima och beräknade α och β värden anges. Förkortningar: SBT = spektralblödning; LSM = mikroskanningsmikroskop för laserskanning; FRET = Förster resonans energiöverföring; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donator SBT. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: Signalintensiteter för kalibrering. Inspelade maxima- och beräknade ξ-värden anges. Korrigerade värden motsvarar FRET-signalintensiteterna minus SBT. Förkortningar: SBT = spektralblödning; LSM = mikroskanningsmikroskop för laserskanning; FRET = Förster resonans energiöverföring. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4: Signalintensiteter för FRET-mätningar. Inspelade maxima- och E-värden anges. Korrigerade värden motsvarar FRET-signalintensiteterna minus SBT. Kalibrerade E-värden beräknades med kalibrering med ξ. Förkortningar: SBT = spektralblödning; LSM = mikroskanningsmikroskop för laserskanning; FRET = Förster resonans energiöverföring; cal. = kalibrerad. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Givarsläckning och sensibiliserade acceptor utsläpp kännetecknas av ett linjärt förhållande som möjliggör antingen givaren- eller acceptorbaserad beräkning av FRET. Motsvarande linjäritetsfaktorer kallas antingen G-faktor (givare till acceptor) eller xi (acceptor till donator), som är ömsesidiga värden4. Mätning av FRET mellan fluorescerande proteiner genom fluorescensmikroskopi kräver ofta korrigeringar för DSBT och ASBT på grund av den breda absorptionen och emissionsspektra av fluorescerande proteiner. Många korrigeringar beror dock på en mätbar ASBT, vilket är en faktor i nämnaren för ekvationerna i protokollavsnitt 7, och en α = 0 resulterar i odefinierade ekvationer5,6.
En justering av laserintensiteter rekommenderas för att undvika sådana effekter. Detta gör det möjligt att använda acceptorbaserade beräkningar och enkel upptäckt av olämpliga kvoter för donator-acceptor. I detta protokoll har ekvationen för Beemiller och medarbetare tillämpats, vilket har fördelen av enkel kalibrering genom en enda referenskonstruktion av känd FRET-effektivitet. Justeringen av detektorerna är avgörande, särskilt när två olika typer av detektorer appliceras. Tidigare data erhållna med två identiska fotomultrider och identiska vinster resulterade i en konstant β = 0,61 för flera experiment under åren7,8,9 och visar att detektorjustering är fördelaktigt för reproducerbarhet. Om detektorerna inte tillåter en tillförlitlig justering kan en sekventiell skanning med en enda detektor i ram-för-bild-läge vara ett alternativ för att undvika partiskhet från detektoregenskaper.
Mätningar i växtceller påverkas av många pigment, vilket resulterar i excitation ljusabsorption och bakgrundsautoscens. Cellpigmenten är främst upphetsade av ljus i UV till blått område4,10. Detta förklarar diskrepansen mellan mätningarna i celler och de med renade proteiner. De renade proteinerna kan fungera som ett bevis på justering eftersom de förväntade värdena för ASBT α och DSBT β kan härledas från acceptorabsorptionsspektrumet respektive givarutsläppsspektrumet (figur 6). Värdena för ASBT är likartade i celler (α = 0,094) och med rena fluoroforer (α = 0,114) och nära det förväntade värdet på 0,096 på grund av den låga cellulära absorptionen vid 514 nm. DSBT på β = 0,498 med renade proteiner ligger också nära det förväntade värdet på 0,406. Spektralblödningen beror ytterligare på inställningen; diodlaser på 445 eller 440 nm minskar den direkta excitationen av EYFP och minskar därmed ASBT. AOBS kännetecknas av ett mindre överföringsgap än dichroiska speglar. Således förbättras detektion av EYFP i intervallet 500 till 510 nm och kan resultera i ytterligare ASBT i givarkanalen. EYFP:s spektralegenskaper pekar dock på mindre än 1 % utsläpp av den maximala toppen, med tanke på både mindre effektiv excitation och låg utsläppsintensitet. Filtergapet är mycket bredare med dichroiska speglar, vilket resulterar i en ytterligare undertryckande av en sådan acceptor crosstalk.
Att använda värdena från renade proteiner återspeglar inte situationen i cellen. Detsamma gäller för kalibreringen av faktorn ξ. Även om kalibreringsfaktorn har varit liknande för båda LSM, var den mycket högre i mätningar med det rekombinanta proteinet, vilket avslöjar effekten av cellulära pigment. Det bör nämnas att bakgrundsbullret i dessa mätningar var försumbart men detekterbart och inte påverkade de observerade intensiteterna. I motsats till mätningar av donatorns livslängd är sensibiliserade utsläppsexperiment känsliga för förhållandet mellan givare och acceptor så att ett överskott av givare resulterar i minskad FRET-effektivitet.
Proteinuttrycket har dock kontrollerats av CaMV35S-promotorn i de nuvarande experimenten. Denna promotor används ofta för överuttryck av proteiner i växter och kan resultera i ofysiologiskt höga mängder proteiner13. Under sådana förhållanden ökar sannolikheten för interaktion, och falskt positiva resultat kan uppstå med högre proteinkoncentrationer. Att plotta utsläppsintensiteten mot FRET-effektiviteten resulterar sedan i en ökad FRET-effektivitet med ökad utsläppsintensitet och möjliggör utvärdering av FRET-data med avseende på uttrycksnivån.
Det rekommenderas att separera högupplösta colocalization experiment från FRET mätningar. För colocalization väljs optimala inställningar för varje fluorofor, medan för FRET-inspelning stör utsläppsintensiteter och finjustering av pinholediametern optimala bildförhållanden. Separationen av organeller och information om subcellulära strukturer omfattas dock fortfarande av FRET-mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi ser till att alla författare har avslöjat alla intressekonflikter och inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Experimenten utfördes vid Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) vid fakulteten för biologi, Bielefeld University. Detta arbete har finansierats av Bielefeld University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
