提供了一种用于配置标准共聚焦激光扫描显微镜的方案 在体 荧光共振能量转移测量，随后进行数据分析。
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摘要
摘要
基于敏化发射的福斯特共振能量转移（FRET）实验操作简便，但其结果依赖于显微镜的配置。共聚焦激光扫描显微镜已成为生物学家的常用工具。商用系统在激光功率调节和探测器灵敏度方面具有高度灵活性，并常结合多种探测器以获得理想的图像。然而，由于这种灵活性，不同实验和设备之间基于强度的数据往往无法进行比较。因此，采用便于生物学家操作的标准化流程具有明显优势，可实现激光和探测器参数的简单而可靠的调整。
此外，由于活细胞中的FRET实验会受到蛋白表达水平和供体-受体比例变异的影响，因此在数据分析时必须考虑蛋白表达水平。本文介绍了一种简单且可靠、可重复的FRET测量方案，包括蛋白表达量估算、激光强度和检测器参数调整的操作流程。数据分析将通过已知FRET效率的荧光蛋白融合体进行校准。为了提高操作简便性，本文比较了在细胞内获得的校正因子与通过测量重组荧光蛋白获得的校正因子。
引言
Förster共振能量转移（(F)RET）通常通过荧光光谱法观测，尽管该过程本身并不仅限于在荧光团之间发生。其基本的偶极-偶极耦合仅需一个发光的供体分子和一个吸光的受体分子即可实现。这源于归一化的供体发射光谱与受体吸收光谱之间必需的光谱重叠积分J1。然而，由于RET与荧光过程存在竞争关系，因此可通过荧光发射的变化来测量能量转移：RET会引起供体荧光的猝灭以及受体敏化的发射。
基于荧光团的共振能量转移（RET）被称为荧光共振能量转移（FRET），以区别于生物发光共振能量转移（BRET）。RET 对供体与受体之间的距离具有高度依赖性，该距离通常在 0.5–10 nm2 范围内，因此与蛋白质及其复合物的尺寸处于同一量级。其次，RET 还依赖于偶极-偶极取向因子 kappa 平方。结合蛋白质结合的荧光团由于分子量较大且旋转弛豫较慢，其旋转自由度可忽略不计这一事实，RET 可用于分析构象变化3。
所谓的 Förster 半径取决于光谱重叠积分以及重叠的波长范围，因此吸收红光的发色团所产生的 Förster 半径比吸收蓝光的染料更长。由于 FRET 测量的动态范围受限于 0.5 × R0 和 1.5 × R0 之间，ECFP-EYFP 这对 FR....
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方案
注意：以下实验方案采用先前所述的方法进行原生质体的瞬时转染12。下文提供了简要说明。
1. 原生质体的瞬时转染
- 剪取约4 g健康叶片 拟南芥 将生态型Columbia切成1毫米厚的切片，转移至20 mL酶解液（1.5%纤维素酶；0.4%离析酶；0.1%牛血清白蛋白第五组分；0.4 M甘露醇；20 mM KCl；20 mM 2-(N-吗啉代）乙磺酸（MES），pH 5.7；10 mM CaCl2).
- 将叶片切片进行真空浸润，随后在室温下振荡孵育2小时。在100 ×g 条件下离心3分钟收集细胞 × g.
- 用W5溶液（154 mM NaCl；125 mM CaCl₂）洗涤原生质体2；5 mM KCl；2 mM MES，pH 5.7）重悬原生质体，并将其悬浮于MMG溶液（0.4 M 甘露醇；15 mM MgCl₂）中2；4 mM MES，pH 5.7）。
- 在8孔载片中，通过聚乙二醇（PEG）4000介导的渗透压休克法进行转染。混合 20 µL 原生质体悬浮液的 5 µL 质粒DNA的5 µg/µL）和 25 µL PEG 溶液（0.2 M 甘露醇，0.1 M CaCl₂）
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结果
共聚焦激光扫描显微镜的调整
激光调整结果显示，随着激光强度的增加，发射信号呈线性增强（图2 和 表1）。正如预期的那样，对于氩离子激光器，514 nm谱线的发射强度远高于458 nm谱线，表现为更陡的斜率。在后续实验中，分别选择514 nm谱线和458 nm谱线的激光功率为4.5%和6.5%。这使得两者的发射强度几乎相等，分别为1123（514 nm）和1141（458 nm）。
在激光功率恒定的情况下改变检测器增益，发现两种被分析的检测器均表现出指数型行为。当增益为700 V时，获得的发射光强度相似（图3）。尽管激光谱线的调节得益于线性响应，但检测器的调节可能受到指数型行为的影响，导致在较高电压下增益的微小变化即引起显著差异。遗憾的是，在活细胞测量中感兴趣的正是这一较高的增益范围，因为提高激光功率具有细胞毒性，并会促进光漂白。
.......
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讨论
供体淬灭和敏化受体发射具有线性关系，该关系可用于基于供体或受体的FRET计算。该线性关系的相应因子称为G因子（供体至受体）或ξ因子（受体至供体），二者互为倒数4。通过荧光显微镜测量荧光蛋白之间的FRET时，常需对DSBT和ASBT进行校正，原因是荧光蛋白的吸收和发射光谱较宽。然而，许多校正方法依赖于可测量的ASBT，而ASBT是方案第7部分方程中分母的因子，当α = 0时会导致方程无定义5,6。
建议调整激光强度以避免此类效应。这使得能够使用基于受体的计算方法，并易于检测不合适的供体-受体比例。在本实验方案中，采用了Beemiller及其同事提出的公式，该公式的优势在于可通过一个已知FRET效率的单一参考构建体进行简单校准。探测器的调整至关重要，尤其是在使用两种不同类型的探测器时。过去多年中，使用两个相同光电倍增管并设置相同增益所获得的数据表明，β值恒定为0.617
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披露
我们确保所有作者均已披露任何和所有利益冲突，且不存在竞争性经济利益。
致谢
实验在比勒费尔德大学生物学院的光学显微技术平台（LiMiTec）进行。本工作由比勒费尔德大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8孔载玻片 | Ibidi | 80821 | |
| 浸油 Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | 水的折射率 |
| LSM 1：配备LSM 780扫描头的AxioObserver共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | ||
| LSM 2：配备LSM 5扫描头的AxioObserver共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss |
参考文献
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Mol....
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