提供了一种用于配置标准共聚焦激光扫描显微镜的方案 在体 荧光共振能量转移测量，随后进行数据分析。
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摘要
摘要
基于敏化发射的福斯特共振能量转移（FRET）实验操作简便，但其结果依赖于显微镜的配置。共聚焦激光扫描显微镜已成为生物学家的常用工具。商用系统在激光功率调节和探测器灵敏度方面具有高度灵活性，并常结合多种探测器以获得理想的图像。然而，由于这种灵活性，不同实验和设备之间基于强度的数据往往无法进行比较。因此，采用便于生物学家操作的标准化流程具有明显优势，可实现激光和探测器参数的简单而可靠的调整。
此外，由于活细胞中的FRET实验会受到蛋白表达水平和供体-受体比例变异的影响，因此在数据分析时必须考虑蛋白表达水平。本文介绍了一种简单且可靠、可重复的FRET测量方案，包括蛋白表达量估算、激光强度和检测器参数调整的操作流程。数据分析将通过已知FRET效率的荧光蛋白融合体进行校准。为了提高操作简便性，本文比较了在细胞内获得的校正因子与通过测量重组荧光蛋白获得的校正因子。
引言
Förster共振能量转移（(F)RET）通常通过荧光光谱法观测，尽管该过程本身并不仅限于在荧光团之间发生。其基本的偶极-偶极耦合仅需一个发光的供体分子和一个吸光的受体分子即可实现。这源于归一化的供体发射光谱与受体吸收光谱之间必需的光谱重叠积分J1。然而，由于RET与荧光过程存在竞争关系，因此可通过荧光发射的变化来测量能量转移：RET会引起供体荧光的猝灭以及受体敏化的发射。
基于荧光团的共振能量转移（RET）被称为荧光共振能量转移（FRET），以区别于生物发光共振能量转移（BRET）。RET 对供体与受体之间的距离具有高度依赖性，该距离通常在 0.5–10 nm2 范围内，因此与蛋白质及其复合物的尺寸处于同一量级。其次，RET 还依赖于偶极-偶极取向因子 kappa 平方。结合蛋白质结合的荧光团由于分子量较大且旋转弛豫较慢，其旋转自由度可忽略不计这一事实，RET 可用于分析构象变化3。
所谓的 Förster 半径取决于光谱重叠积分以及重叠的波长范围，因此吸收红光的发色团所产生的 Förster 半径比吸收蓝光的染料更长。由于 FRET 测量的动态范围受限于 0.5 × R0 和 1.5 × R0 之间，ECFP-EYFP 这对 FRET 探针因其 R0 为 4.9 nm，其动态范围为 2.5–7.3 nm4。
荧光团的亮度由其摩尔消光系数与其量子产率的乘积决定。在进行FRET测量时，选择亮度相近的荧光团更为有利。这有助于增强对供体荧光淬灭和受体敏化发射的检测，也有利于显微镜系统的校准。观察常用的青色荧光蛋白与黄色荧光蛋白的FRET组合，可以明显看出青色荧光蛋白的亮度较低（图1A）。
然而，受体的寿命必须低于供体的寿命，以确保受体能够参与能量转移。如果受体的寿命超过供体的寿命，当供体再次被激发时，受体可能仍处于激发态。先进的青色荧光蛋白（如 mTurquoise）具有较长的寿命，因而有助于提高 FRET 的概率（图1B）。FRET 的概率还取决于受体的摩尔消光系数。
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方案
注意：以下实验方案采用先前所述的方法进行原生质体的瞬时转染12。下文提供了简要说明。
1. 原生质体的瞬时转染
- 剪取约4 g健康叶片 拟南芥 将生态型Columbia切成1毫米厚的切片，转移至20 mL酶解液（1.5%纤维素酶；0.4%离析酶；0.1%牛血清白蛋白第五组分；0.4 M甘露醇；20 mM KCl；20 mM 2-(N-吗啉代）乙磺酸（MES），pH 5.7；10 mM CaCl2).
- 将叶片切片进行真空浸润，随后在室温下振荡孵育2小时。在100 ×g 条件下离心3分钟收集细胞 × g.
- 用W5溶液（154 mM NaCl；125 mM CaCl₂）洗涤原生质体2；5 mM KCl；2 mM MES，pH 5.7）重悬原生质体，并将其悬浮于MMG溶液（0.4 M 甘露醇；15 mM MgCl₂）中2；4 mM MES，pH 5.7）。
- 在8孔载片中，通过聚乙二醇（PEG）4000介导的渗透压休克法进行转染。混合 20 µL 原生质体悬浮液的 5 µL 质粒DNA的5 µg/µL）和 25 µL PEG 溶液（0.2 M 甘露醇，0.1 M CaCl₂）2，40% PEG 4000）
- 通过温和地重新调整渗透条件来逆转渗透休克。
注意：除目标样本外，还需分别表达单独的供体和单独的受体，以确定供体和受体的光谱串扰。此外，必须表达供体与受体的融合蛋白，用于校准。荧光蛋白的表达由花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）驱动。所有测量均使用两台共聚焦激光扫描显微镜（LSM1和LSM2）进行。LSM1配备两种类型的检测器：FRET测量中，供体信号由GaAsP检测器检测，而FRET和受体发射信号则由光电倍增管记录。LSM2配备两个光电倍增管，用于检测供体、FRET和受体发射信号。
2. 激光调节
注意：此处采用氩离子激光器的458 nm和514 nm谱线，对增强型青色荧光蛋白（ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）标记的蛋白质之间的FRET进行分析。为获得可重复的数据采集结果，将两条谱线调节至相似的强度，可通过透射式光电倍增管或反射模式实现。
- 使用透射光电倍增管进行激光调节
- 使用空孔进行调节。
- 选择线扫描模式和直方图视图。
- 将激光强度降至最低，并调节探测器增益至可检测到背景噪声。
- 以0.5%为步长逐步增加激光强度，并记录相应的信号。
- 对两条激光线均应用该操作流程。
- 使用反射模式进行激光调节
- 使用空孔进行调节。
- 安装反射滤光片，如有，开启反射模式。
- 确保探测器的波长范围覆盖激光的波长。
- 选择线扫描模式和直方图视图。
- 将激光强度降至最低，并调节探测器增益至可检测到背景噪声。
- 将物镜移至最低位置。
- 向上移动物镜，直至盖玻片的反射光可见。
- 以0.5%为步长逐步增加激光强度，并记录相应的信号。
- 对两条激光线均应用该操作流程。
- 数据分析
- 将数据制表，并按信号强度排序。
- 绘制信号强度相对于相对激光功率的曲线。
- 选择产生相似信号强度的激光强度。
3. 光电倍增管的调节
注意：激光调整后，光电倍增管被分别调节至各自的增益，以获得相似的灵敏度。该校准使用514 nm激光线完成，该激光线位于目标波长范围的中心。
- 使用一个空孔进行调整。
- 安装反射滤光片，如有条件，切换至反射模式。
- 确保探测器的波长范围覆盖激光波长（514 nm）。
- 选择线扫描模式和直方图视图。
- 将探测器增益降至最大值的一半，并调节激光强度至可检测到背景噪声。
- 将物镜移至最低位置。
- 向上移动物镜，直至盖玻片的反射光可见。
- 以每步50至100 V的幅度逐步增加探测器增益，并记录相应的信号。
- 对两个探测器均执行步骤3.1至3.8。
- 数据评估
- 针对每个探测器，绘制信号强度随探测器增益的变化曲线。
- 选择适当的单个探测器增益，以获得相近的灵敏度。
4. FRET 图像采集
注意：设置图像采集时，应从感兴趣的样品开始。
- 选择合适的滤光片/二向色镜，例如用于FRET配对ECFP/EYFP的双二向色镜MBS 458/514。所有通道使用相同的二向色镜，以实现逐线扫描。对活细胞成像时选择水浸物镜。选择12位或16位扫描模式以及中等扫描速度。
- 设定检测范围，对于ECFP/EYFP，供体检测建议为470–510 nm，受体/FRET检测为530–600 nm。当使用445 nm或440 nm的二极管激光器时，检测范围应设为450–510 nm。若使用声光偏转器（AOBS），应将供体检测范围设为450–500 nm，以避免非预期的受体信号检测。
- 根据3.10.2节设置检测器参数。
- 根据2.3.2节设置激光参数。如有需要，依据获得的激光功率表调整激光强度。确保信噪比覆盖检测器的整个动态范围（12位扫描时信号强度范围为0至4095）。
- 保持激光强度和检测器增益恒定。使用针孔直径进行精细调节。
注意：需注意针孔直径的改变会影响空间分辨率。 - 进行测量（至少采集20个细胞的图像）。
5. 串扰校正的测定
注意：需要分别设置仅表达供体或仅表达受体的细胞，以确定供体的光谱渗漏（DSBT）和受体的光谱渗漏（ASBT）。保持与第4节中所述相同的设置。
- 对表达供体荧光团的细胞进行FRET测量。
- 对表达受体荧光团的细胞进行FRET测量。
6. 根据 Beemiller 等人方法对测量结果进行校准13
注意：需要表达已知FRET效率的供体-受体融合蛋白的细胞。此处使用了FRET效率为0.46的ECFP-5 aa-EYFP融合蛋白4。保持第4节中所述的相同设置。
- 对表达供体-受体融合蛋白的细胞进行FRET测量
7. 数据评估
- 获取细胞的线轮廓，确保每条轮廓仅包含一个细胞。将轮廓保存为文本文件。
- 在 数据 部分使用 文本文件导入 选项，将文本文件导入电子表格。
- 应用 Max 函数读取最大值。
- 将获得的值列成表格，分别为供体发射 ID、FRET 发射 IF、受体发射 IA 设置单独的列，并至少包含四组数据：仅供体、仅受体、供体-受体融合蛋白以及待测样本。
注：供体的激发也会导致受体的直接激发，从而引起由 α 值描述的受体直接激发背景信号（ASBT）。 - 使用仅受体数据集，根据公式（1）计算 ASBT 的 α 值。
（1）
注：在后续公式中使用所有 α 值的中位数。供体具有较宽的发射光谱，会导致与受体敏化发射之间的发射串扰，即供体光谱渗漏（DSBT），该效应由 β 值表示。 - 使用仅供体数据集，根据公式（2）计算供体光谱渗漏（DSBT）的 β 值。
（2）
注：在后续公式中使用所有 β 值的中位数。校准因子 ξ 描述了 FRET 引起的供体淬灭与受体敏化发射之间的线性关系。在后续公式中使用 7.5 和 7.6 的中位数。 - 使用供体-受体融合蛋白数据集及其 FRET 效率 E（0.46），根据公式（3）计算校准因子 ξ。
（3）
注：在后续公式中使用所有 ξ 值的中位数。 - 使用公式（4）和（5）计算目标蛋白对的 FRET 效率。
（4）
（5） - 评估表达强度和/或供体-受体比例的影响：将 ID、IF 和 IA 的总和对 FRET 效率作图。进行线性回归分析；注意，曲线斜率越陡、R2 值越高，表明表达水平的影响越大，或供体与受体丰度差异越显著。
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结果
共聚焦激光扫描显微镜的调整
激光调整结果显示，随着激光强度的增加，发射信号呈线性增强（图2 和 表1）。正如预期的那样，对于氩离子激光器，514 nm谱线的发射强度远高于458 nm谱线，表现为更陡的斜率。在后续实验中，分别选择514 nm谱线和458 nm谱线的激光功率为4.5%和6.5%。这使得两者的发射强度几乎相等，分别为1123（514 nm）和1141（458 nm）。
在激光功率恒定的情况下改变检测器增益，发现两种被分析的检测器均表现出指数型行为。当增益为700 V时，获得的发射光强度相似（图3）。尽管激光谱线的调节得益于线性响应，但检测器的调节可能受到指数型行为的影响，导致在较高电压下增益的微小变化即引起显著差异。遗憾的是，在活细胞测量中感兴趣的正是这一较高的增益范围，因为提高激光功率具有细胞毒性，并会促进光漂白。
...
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讨论
供体淬灭和敏化受体发射具有线性关系，该关系可用于基于供体或受体的FRET计算。该线性关系的相应因子称为G因子（供体至受体）或ξ因子（受体至供体），二者互为倒数4。通过荧光显微镜测量荧光蛋白之间的FRET时，常需对DSBT和ASBT进行校正，原因是荧光蛋白的吸收和发射光谱较宽。然而，许多校正方法依赖于可测量的ASBT，而ASBT是方案第7部分方程中分母的因子，当α = 0时会导致方程无定义5,6。
建议调整激光强度以避免此类效应。这使得能够使用基于受体的计算方法，并易于检测不合适的供体-受体比例。在本实验方案中，采用了Beemiller及其同事提出的公式，该公式的优势在于可通过一个已知FRET效率的单一参考构建体进行简单校准。探测器的调整至关重要，尤其是在使用两种不同类型的探测器时。过去多年中，使用两个相同光电倍增管并设置相同增益所获得的数据表明，β值恒定为0.617
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披露
我们确保所有作者均已披露任何和所有利益冲突，且不存在竞争性经济利益。
致谢
实验在比勒费尔德大学生物学院的光学显微技术平台（LiMiTec）进行。本工作由比勒费尔德大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8孔载玻片 | Ibidi | 80821 | |
| 浸油 Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | 水的折射率 |
| LSM 1：配备LSM 780扫描头的AxioObserver共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | ||
| LSM 2：配备LSM 5扫描头的AxioObserver共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss |
参考文献
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593(2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413(2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28(2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672(2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162(2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
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