Summary
提供了一个方案，用于设置标准的共聚焦激光扫描显微镜，用于 体内 Förster共振能量转移测量，然后进行数据评估。
Abstract
基于敏化发射的Förster共振能量转移（FRET）实验很容易完成，但取决于微观设置。共聚焦激光扫描显微镜已成为生物学家的主力军。商用系统在激光功率调整和探测器灵敏度方面具有高度的灵活性，并且通常组合不同的探测器以获得完美的图像。然而，由于这种灵活性，通常不可能比较来自不同实验和设置的基于强度的数据。生物学家友好的程序具有优势，可以简单可靠地调整激光和探测器设置。
此外，由于活细胞中的FRET实验受到蛋白质表达和供体 - 受体比的变异性的影响，因此必须考虑蛋白质表达水平以进行数据评估。这里描述的是用于可靠和可重复的FRET测量的简单方案，包括用于估计蛋白质表达和调整激光强度和检测器设置的例程。数据评估将通过校准已知FRET效率的荧光团融合来执行。为了提高简单性，已经比较了在细胞中通过测量重组荧光蛋白获得的校正因子。
Introduction
Förster共振能量转移（（F）RET）通常通过荧光光谱观察，尽管该过程本身并不局限于荧光团之间发生。潜在的偶极子-偶极子耦合只需要一个发光的供体分子和一个光吸收受体。这是从归一化供体发射和受体吸光度谱1所需的光谱重叠积分J导出的。然而，由于RET与荧光竞争，能量转移可以通过荧光发射的改变来测量：RET诱导供体猝灭和敏化受体发射。
基于荧光团的RET被称为荧光共振能量转移（FRET），以将其与生物发光共振能量转移（BRET）分开。RET在很大程度上取决于供体和受体之间的距离，其范围广泛为0.5-10 nm2 ，因此与蛋白质及其复合物的尺寸范围相同。其次，RET取决于偶极子-偶极子取向kappa的平方。结合蛋白质结合的荧光团由于分子量和缓慢的旋转弛豫而可以忽略的事实，RET允许分析构象改变3。
所谓的Förster半径基于光谱重叠积分和重叠的波长范围，因此吸收红光的发色团比蓝光吸收染料产生更长的Förster半径。由于FRET测量的动态范围受到0.5×R0 和1.5×R0的限制，FRET对ECFP-EYFP的动态范围为2.5-7.3 nm，因为它的R0 为4.9 nm4。
荧光团的亮度由其摩尔消光系数和量子产率的乘积给出。对于FRET测量，选择亮度几乎相似的荧光团是有利的。这增强了对供体淬火和敏化受体发射的检测。它还有利于显微镜系统的校准。观察常用的FRET对青色和荧光蛋白，青色荧光蛋白的较低亮度变得明显（图1A）。
但是，受体的寿命必须低于供体的寿命，从而确保受体可用于能量转移。如果受体的寿命超过供体的寿命，则当供体再次激发时，受体可能仍处于激发状态。先进的青色荧光蛋白（如mTurquoise）显示出更长的使用寿命，因此有助于增加FRET的可能性（图1B）。FRET的概率还取决于受体的摩尔消光系数。
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Protocol
注意：对于以下方案，如前所述，进行了原生质体的瞬时转染12。下面给出了简要说明。
1. 原生质体的瞬时转染
- 将拟 南芥 生态型哥伦比亚的约4克健康叶子切成1毫米切片，并将它们转移到20毫升酶溶液中（1.5%纤维素酶;0.4%马克酶;0.1%牛血清白蛋白V级分;0.4米甘露醇;20mM KCl;20mM 2-（N-吗啉）乙磺酸（MES），pH 5.7;10mM CaCl2）。
- 真空浸润叶片，然后在室温下搅拌孵育2小时。通过在100× g下离心3分钟收获细胞。
- 用W5溶液（154mM NaCl;125mM CaCl2;5 mM KCl;2 mM MES，pH 5.7）洗涤原生质体，并将其重悬于MMG溶液（0.4 M甘露醇;15 mM MgCl2;4 mM MES，pH 5.7）中。
- 在聚乙二醇（PEG）4000存在下通过渗透冲击在8孔载玻片中进行转染。将20μL原生质体悬浮液与5μL质粒DNA（5μg/ μL）和25μLPE溶液（0.2M甘露醇，0.1M CaCl2，40%PEG 4000）混合。
- 通过轻柔地重新调整渗透条件来逆转渗透冲击。
注：除感兴趣的样品外，还需要单独供体和单独受体的表述来确定供体和受体的光谱渗漏。供体和受体的融合蛋白也必须表达用于校准目的。荧光蛋白表达在花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）的控制下。对于所有测量，使用两个共聚焦激光扫描显微镜（LSM1和LSM2）。LSM1有两种类型的探测器：对于FRET测量，供体信号由GaAsP探测器检测，而FRET和受体发射则用光电倍增管记录。LSM2具有两个光电倍增管，用于检测供体，FRET和受体发射。
2. 激光调节
注意：在这里，458 nm和514 nm的氩离子激光器线已被应用于增强青色荧光蛋白（ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）标记蛋白之间的FRET分析。为了获得可重复的数据采集，将两条线调整为相似的强度。这是通过透射光电倍增管或反射模式实现的。
- 使用透射光电倍增管进行激光调节
- 使用空孔进行调整。
- 选择 线扫描模式 和 直方图视图。
- 将激光强度降至最低，并将检测器增益调整为可检测的背景噪声。
- 以0.5%的步长增加激光强度并记录相应的信号。
- 将例程应用于两条激光线。
- 带反射模式的激光调节
- 使用空孔进行调整。
- 应用反射滤镜，打开 反射模式（如果可用）。
- 确保探测器波长范围覆盖激光器的波长。
- 选择 线扫描模式 和 直方图视图。
- 将激光强度降至最低，并将检测器增益调整为可检测的背景噪声。
- 将目标移动到最低位置。
- 将物镜向上移动，直到盖玻片的反射可见。
- 以0.5%的步长增加激光强度并记录相应的信号。
- 将例程应用于两条激光线。
- 数据评估
- 将数据制成表格并按信号强度对数据进行排序。
- 根据相对激光功率绘制信号强度。
- 选择产生相似信号强度的激光强度。
3. 光电倍增管的调整
注：激光调整后，光电倍增管根据单个增益进行调整，以获得相似的灵敏度。该校准是使用514 nm激光线完成的，该激光线位于目标波长范围的中心。
- 使用空孔进行调整。
- 应用反射滤镜，并切换到反射模式（如果可用）。
- 确保探测器波长范围覆盖激光器的波长（514 nm）。
- 选择 线扫描模式 和 直方图视图。
- 将探测器增益降低到最大值的一半，并将激光强度调整到可检测的背景噪声。
- 将目标移动到最低位置。
- 将物镜向上移动，直到盖玻片的反射可见。
- 以50至100 V的步长增加检测器增益，并记录相应的信号。
- 对两个探测器应用步骤 3.1 到 3.8。
- 数据评估
- 将强度与每个检测器的检测器增益进行对比。
- 选择单个探测器增益以获得相似的灵敏度。
4. FRET图像采集
注意：从设置图像采集的相关示例开始。
- 选择合适的滤光片/二向色镜，例如，为 FRET 对 ECFP/EYFP 选择双二向色镜 MBS 458/514。对所有通道使用相同的二向色镜，以实现逐行扫描。选择用于活细胞成像的水浸物镜。选择 12 位或 16 位扫描以及中等扫描速度。
- 定义检测范围，在ECFP / EYFP的情况下，优选470-510 nm用于供体检测，530-600 nm用于受体/ FRET检测。当使用445 nm或440 nm二极管激光器时，请使用450至510 nm作为检测范围。对于声光分束器 （AOBS），将供体检测定义为 450 至 500 nm 范围内，以防止不必要的受体检测。
- 根据 3.10.2 应用检测器设置。
- 根据2.3.2应用激光设置。如果需要，根据获得的激光功率表修改激光强度。确保信噪比覆盖探测器的整个动态范围（12位扫描的强度范围为0至4095）。
- 保持激光强度和检测器增益恒定。使用针孔直径进行微调。
注意：请记住，针孔直径的变化会影响空间分辨率。 - 执行测量（拍摄至少20个细胞的图像）。
5. 串扰校正的确定
注意：仅表达供体或受体的细胞需要分别确定供体光谱渗出（DSBT）和受体谱渗漏（ASBT）。保留第 4 节中描述的相同设置。
- 使用表达供体荧光团的细胞进行FRET测量。
- 对表达受体荧光团的细胞进行FRET测量。
6. 根据Beemiller等人13对测量进行校准
注意：需要表达已知FRET效率的供体 - 受体融合的细胞。这里使用了EFT效率为0.46的ECFP-5 aa-EYFP融合4。保留第 4 节中描述的相同设置。
- 对表达供体-受体融合的细胞进行FRET测量
7. 数据评估
- 获取单元格的线轮廓，确保每个轮廓包含不超过一个单元格。将配置文件另存为文本文件。
- 使用"数据"部分中的文本文件导入选项将文本文件导入电子表格。
- 通过应用 Max 函数读出最大值。
- 在表中列出获得的值，各有一列供体发射ID，FRET发射IF，受体发射IA，以及至少四个数据集：仅供体，仅受体，供体 - 受体融合和测量。
注：供体的激发也会导致受体的直接激发，并导致由α值描述的ASBT。 - 使用等式 （1） 使用仅接受方数据集计算 ASBT α值。
（1）
注意：在以下等式中使用所有α值的中位数。供体显示出较宽的发射光谱，导致与受体的敏化发射发生发射串扰。此 DSBT 由β值给出。 - 使用公式 （2） 计算仅供体数据集的供体光谱渗漏β值。
（二）
注意：在以下等式中使用所有β值的中位数。校准因子ξ描述了FRET衍生的供体淬灭和受体敏化发射的线性关系。在以下等式中使用中位数 7.5 和 7.6。 - 使用供体-受体融合数据集计算校准因子ξ，并使用方程（3）计算其FRET效率E（0.46）。
（3）
注意：在以下等式中使用所有 ξ 值的中位数。 - 使用方程（4）和（5）计算感兴趣蛋白质对的FRET效率。
（4）
（5） - 估计表达强度和/或供体-受体比值的影响：将 ID、IF 和 IA 的总和与 FRET 效率绘制。执行线性回归;请注意，图越陡峭，R2 越高，表达水平的影响越大，供体和受体丰度的差异就越大。
（1）
（二）
（3）
（4）
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Representative Results
共聚焦激光扫描显微镜的调整
激光调整显示，随着激光强度的增加，发射线性增加（图2 和 表1）。正如氩离子激光器所预期的那样，514 nm线的发射远高于458 nm线的发射，正如更陡峭的斜率所证明的那样。在随后的实验中，分别为514 nm线和458 nm线选择了4.5%和6.5%的激光功率。这导致1123（514 nm）和1141（458 nm）的发射强度几乎相等。
在恒定激光功率下改变探测器增益揭示了两个被分析探测器的指数行为。在700 V增益下获得类似的发射强度（图3）。虽然激光线的调整受益于线性行为，但探测器的调整可能受到指数行为的影响，导致在较高电压下增益发生微小变化的显着差异。不幸的是，这个更高的范围对于活细胞的测量是有趣的，因为增加激光功率是细胞毒性并促进光漂白。
确定光谱渗漏
首先，用重组纯化的ECFP和EYFP分析供体和受体的光谱渗漏;DSBT β = 0.498，ASBT α = 0.100。表达ECFP或EYFP的细胞也是如此。在LSM 2下，估计的DSBT为β = 1.602±0.207（平均±SD），ASBT为α = 0.119±0.018。中位数为β = 1.506，α = 0.120。在活细胞中获得的数据与用重组蛋白获得的数据之间的这种差异表明，不可能省略活细胞中光谱渗漏的测定。这可能是由细胞色素引起的。
与ECFP相比，图像显示EYFP的亮度更高（图4 和 表2）。通过不同的激光设置补偿亮度差异可增强供体和FRET通道的动态范围。通过测量激光强度提供相对输出（如调整时所做的那样）仍可提高测量的再现性。
对于 LSM 1，β = 0.171 ± 0.044，α = 0.094 ± 0.031，中位数为 α = 0.084，β = 0.180。ASBT的测定取决于激光调整和单个检测器，因此，ASBT的测定表现良好。DBST涉及两个探测器，导致两种显微镜的结果截然不同。应该记住，LSM 2配备了两个光电倍增管，而LSM 1使用GaAsP探测器和光电倍增管，这是两种不同类型的探测器，具有不同的光谱特性和灵敏度。因此，使用两个相同的探测器进行调整效果更好。
测量校准
为了进行校准，应用α和β的中值，并使用ECFP和EYFP的融合作为已知FRET效率的标准（E = 0.46）。重组和纯化的ECFP-EYFP的校准导致ξ值为13.44，而 体内 测量显示ξ值为1.525±1.844。中位数为0.798，揭示了极端异常值和高标准偏差。对于 LSM 1，值为 ξ = 1.978 ± 0.807，中位数为 ξ = 1.883。对于LSM 2和LSM 1，为计算ξ而获得的数据集（表3）在统计学上是相同的，正如学生 的t检验所证明的那样（p >0.2）。
烦恼测量
作为概念证明，使用供体 - 受体融合重复FRET测量。实测的FRET效率为0.47±纯化的蛋白质为0.07，LSM 2的活细胞为0.47±0.06（表4）。活细胞中测量的中位数为E = 0.45。对于LSM 1，FRET效率为0.46±0.09，中位数为E = 0.45（表4）。这些数据证明了使用已知FRET效率的FRET结构进行有效校准。
表达水平和供体-受体比值的影响
对于分析的数据集，FRET效率不受表达水平的影响。由于供体和受体的融合，该比率也是恒定的。包含以前的数据集揭示了在一种情况下对表达式级别的依赖性（图 5）。标记的空泡ATP酶（V-ATP酶）亚基VHA-A-ECFP和VHA-a-EYFP之间的FRET效率随着信号强度的增加而降低。相反，VHA-E1-ECFP和VHA-C-EYFP之间的相互作用与信号强度无关。在VHA-A和VHA-A的情况下，VHA-A的三个拷贝越来越多地被VHA-A-ECFP取代，这导致与复合物中VHA-a的单一拷贝相比，供体过量。虽然VHA-E1可能以三个拷贝的形式存在，但VHA-C的高溶解度可能会在本例中消除这种效应。在这方面，FRET效率相对较低。这种简单的方法允许测试表达和比率伪影。
图1：荧光蛋白FRET对与青色发光供体的概述。 （A）对于特征良好的FRET对，给出了对的Förster半径以及供体和受体的亮度。（B）供体和受体寿命的比较。灰色星号表示多指数衰减。缩写：FRET = Förster 共振能量转移;CFP = 青色荧光蛋白;GFP = 绿色荧光蛋白;YFP = 黄色荧光蛋白;mX = 单体 X;EX = 增强型 X;SX = 超级 X。 请单击此处查看此图的放大版本。
图2：激光调整。 激光器的发射通过盖玻片的反射记录，并绘制与LSM的声光可调谐滤波器调制的相对激光强度。图中显示了氩离子激光器的458 nm线（A）和514 nm线（B）的发射。缩写： LSM = 激光扫描显微镜;r.u. = 相对单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：探测器增益和发射强度。 在反射模式下，探测器增益分别为300至750 V，探测器1（A）和探测器2（B）分别记录了由此产生的发射强度和300至750 V。缩写 = r.u. = 相对单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：光谱渗漏。 在供体，FRET和受体通道中获得图像。（A）用纯化的荧光蛋白获得的图像;比例尺 = 100 μm;（二）表达荧光蛋白的细胞的相应图像;比例尺 = 10 μm. （C） 所得 SBT 值的图表;平均± SD。缩写：FRET = Förster 共振能量转移;SBT = 光谱渗漏;ECFP = 增强的青色荧光蛋白;EYFP = 增强型黄色荧光蛋白;LSM = 激光扫描显微镜;ASBT = 受体 SBT;DSBT = 供体 SBT。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：表达水平和/或供体-受体比值的影响。 供体、FRET和受体通道中的排放总和已与FRET效率相比较。对于VHA-E1-ECFP和VHA-C-EYFP（A），VHA-A-ECFP和VHA-a-EYFP（B）以及ECFP-EYFP融合（C）已经这样做了。执行线性回归;给出了方程和 R2 。缩写：FRET = Förster 共振能量转移;ECFP = 增强的青色荧光蛋白;EYFP = 增强型黄色荧光蛋白;VHA = 空泡性 ATP 酶亚基。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：ECFP和EYFP的供体和受体渗漏。 荧光蛋白的光谱来自FP数据库14。（A）在敏化发射实验期间，供体和受体的大部分由分别命名为PMT1和PMT2的单个光电倍增管检测。ECFP发射也可以由受体检测器在激发458nm时检测到。计算出的供体光谱渗入PMT2是PMT1检测到的排放量的40.6%。（B）EYFP的发射光谱表明，EYFP在458 nm处表现出直接激发，这常用于青色供体的激发。在514 nm处，预期的激发效率为激发效率的9.6%。缩写： FP = 荧光蛋白;ECFP = 增强的青色荧光蛋白;EYFP = 增强型黄色荧光蛋白;PMT = 光电倍增管。 请点击此处查看此图的放大版本。
表1：激光功率和信号强度。 458 nm线的信号强度以蓝色表示，514 nm线的信号强度以绿色表示。应用于实验的强度以灰色突出显示。 请点击此处下载此表格。
表2：用于SBT测定的信号强度。 给出了记录的最大值和计算α值以及β值。缩写：SBT = 光谱渗漏;LSM = 激光扫描显微镜;FRET = Förster 共振能量转移;ASBT = 受体 SBT;DSBT = 供体 SBT。 请点击此处下载此表格。
表 3：用于校准的信号强度。 给出了记录的最大值和计算的 ξ 值。校正值对应于 FRET 信号强度减去 SBT。缩写：SBT = 光谱渗漏;LSM = 激光扫描显微镜;FRET = Förster 共振能量转移。 请点击此处下载此表格。
表 4：FRET 测量的信号强度。 给出记录的最大值和 E 值。校正值对应于 FRET 信号强度减去 SBT。校准的E值通过ξ校准计算。缩写：SBT = 光谱渗漏;LSM = 激光扫描显微镜;FRET = Förster 共振能量转移;校准 = 已校准。 请点击此处下载此表格。
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Discussion
供体淬灭和敏化受体发射的特点是线性关系，允许基于供体或受体计算FRET。线性的相应因子称为 G 因子（供体对受体）或 xi（受体对供体），它们是倒数值4。由于荧光蛋白的广泛吸收和发射光谱，通过荧光显微镜测量荧光蛋白之间的FRET通常需要校正DSBT和ASBT。但是，许多校正依赖于可测量的 ASBT，这是协议第 7 节中方程分母的一个因素，α = 0 会导致未定义的方程5，6。
建议调整激光强度以避免此类影响。这使得可以使用基于受体的计算，并且可以轻松检测出不适当的供体 - 受体比率。在该协议中，应用了Beemiller和同事的方程，其优点是通过已知FRET效率的单一参考结构进行简单校准。探测器的调整至关重要，特别是当应用两种不同类型的探测器时。先前使用两个相同的光电倍增管和相同的增益获得的数据导致多年来多次实验的恒定β = 0.617，8，9，并证明探测器调整有利于再现性。如果探测器不允许进行可靠的调整，则在逐帧模式下使用单个探测器进行顺序扫描可能是避免探测器属性偏倚的一种选择。
植物细胞中的测量受到许多色素的影响，这导致激发光吸收和背景自发荧光。细胞色素主要由紫外至蓝光范围内的光激发4，10。这解释了细胞中测量值与纯化蛋白质测量值之间的差异。纯化的蛋白质可以作为调整的证据，因为ASBT α和DSBT β的预期值可以分别从受体吸收谱和供体发射谱中导出（图6）。ASBT的值在细胞（α = 0.094）和纯化的荧光团（α = 0.114）中相似，并且由于514nm处的细胞吸收较低，因此接近0.096的预期值。纯化蛋白质的β = 0.498的DSBT也接近0.406的预期值。光谱渗漏进一步取决于设置;445或440 nm的二极管激光器可降低EYFP的直接激发，从而降低ASBT。AOBS的特点是透射间隙比二向色镜更小。因此，EYFP的检测在500至510 nm的范围内得到增强，并可能导致额外的ASBT进入供体通道。然而，EYFP的光谱特性表明，考虑到激发效果较差和发射强度低，最大峰值的发射率低于1%。使用二向色镜时，滤波器间隙要宽得多，从而进一步抑制了这种受体串扰。
使用纯化蛋白质的值并不能反映细胞中的情况。通过因子 ξ 进行校准也是如此。尽管两种LSM的校准因子相似，但在重组蛋白的测量中，校准因子要高得多，揭示了细胞色素的影响。应该提到的是，在这些测量中，背景噪声可以忽略不计，但可以检测到，并且不会影响观察到的强度。与对供体寿命的测量相反，致敏发射实验对供体-受体比敏感，因此供体过量导致FRET效率降低。
然而，在本实验中，蛋白质表达一直处于CaMV35S启动子的控制之下。该启动子经常用于植物中蛋白质的过表达，并可能导致非生理上高水平的蛋白质13。在这种情况下，相互作用的可能性增加，并且更高的蛋白质浓度可能会出现假阳性结果。然后，根据FRET效率绘制发射强度图，随着发射强度的增加，FRET效率会提高，并允许根据表达水平评估FRET数据。
建议将高分辨率共定位实验与FRET测量分开。对于共定位，为每个荧光团选择最佳设置，而对于FRET记录，发射强度和针孔直径的微调会干扰最佳图像条件。尽管如此，细胞器的分离和亚细胞结构的信息仍然包含在FRET测量中。
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Disclosures
我们确保所有作者都披露了任何和所有利益冲突，并且没有竞争性的经济利益。
Acknowledgments
实验在比勒费尔德大学生物学院的光学显微镜技术平台（LiMiTec）进行。这项工作由比勒费尔德大学资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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